JPS60501573A - 新規な視覚化ポリマ−及びこれらのポリマ−の診断薬への応用 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 新規な視覚化ポリマー及びこれら のポリマーの診断薬への応用 １１亘ｌ見 本発明は、薬剤診断法及びこの診断を得るための物質に関する。更に明確にいえ ば、該物質は、蛋白質、酵素、及び化学的に標識したポリオール、ポリオレフィ ン、炭水化物、及び天然又は合成のポリペプチドといった分子の視覚化重合体（ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｐｏｌｙｍｅｒ、ｓｏｆ　ｍｏｌｅＣｕｌｅｓ） であって、生物材料と結合することができそして検出した生物材料の量を実質的 に化学増幅することができるものである。

生物材料の存否を検出し及び／又は定量する医学的診断方法の要件には、極く少 ない分量のものを同定すること、及び、類似の種を含む複合混合物から該材料− の単一の種（ｓｐｅｃｉｅｓ）を−選択すること、が包含される。

過去において、放射標識、ラジオパイオアツセイ、及びイムノアッセイ技術とい った方法が、このような診断用医薬の基礎をなしていた。例えば、蛋白質、リピ ソド、炭水化物、ステロイド、核酸、薬剤、発癌性物質、抗生物質、無機塩類そ の他といった分子種（ｍｏｌｅ−ｃｕｌａｒ　５ｐｅｃｉｅｓ）の広範なスペク トルを検出し及び／又は定量するためには、免疫学的試薬が広く用いられてきた のである。今日の臨床医薬のほとんどの領域において、多価抗体及びモノクロナ ール抗体が非常に重要な診断手段であることは確かである。

過去４０年間に、特異的な抗原−抗体間の相互作用を蛍光計又は比色計を用いて 可視化するため、沢山の手法が開発されてきた。免疫診断学的手法の有用性は、 検出されるべきターゲット抗原又は分子との感応性と特異性によって左右される ことがしばしばであるので、これらの検出パラメーターを増大させるための新し い方法の出現が、強く待望されているゆえんである。このような目的達成を志向 した論文、著作で科学文献、特許文献は満ち満ちている。免疫学的方法の利点及 び欠点についての詳細な議論については、免疫細胞化学の標準的教科書ならばど れにでも掲載されている；例えば、次の文献を参照されたい。

Ｌ、Ａ、スターンバーガー、「免疫組織化学（Ｉｍｍｕｎｏ−ｈｉｓｔｏｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙ）　Ｊ　、第２版、ジョン　ウィレー　アンド　サンーズ、ニュー ヨーク、１９７９年。

免疫学的検出方法としては、形成された免疫複合体を測定するための直接又は間 接的視覚化技術を利用することができる。一般的には、これらの検出方法は、免 疫複合体の存在を、この複合体との結合物を利用することによって視覚的に指示 するものであり、該複合体との結合−物は、色、蛍光、放射能、酵素作用その他 といった検出可能で且つ定量可能な信号を生成するものである。複合体当りの信 号の強度が強ければ強いほど、ターゲット分子の微量な存在に対する感度が更に 良くなるはずである。

これらの方法のうち、最も簡単で最も小さな感度を有するものは直接免疫蛍光法 である。この方法において、−次抗体（又は特異的リガンド−結合蛋白質）は、 信号体として機能するローダミンまたはフルオレスセインといった蛍光色素と化 学的に結合している。間接免疫蛍光法においては、−次抗体は標識しないで用い 、これを、蛍光標識した二次抗体を用いて検出するものであるが一般的には、こ の間接法は、直接法の約２〜４倍も検出感度が上昇するもの止いえる。「ハプテ ン−抗体サンドインチ」法を用いると、感度が更に３〜４倍も上昇することが報 告されている；カミスーリ　（Ｃａｍｍｉｓｕｌｉ）他、［ジャーナル　イムノ ロジーＪ、２１７巻、１６９５頁（１９７６）、ウォーレス（１＋１ａｌｌａｃ ｅ）他、「ジャーナル　イムノロジカルメソソズ」、２５巻、２８３頁（１９７ ９）参照。この方法によれば、２．４−ジニトロフェノールといった小さなハプ テン決定因子を、１０〜１５分子ずつ、−次抗体分子の各々に化学的に結合して おく。次いで、ハプテン分子というよりもむしろ一次抗体それ自体と複合体化し た蛍光標識化二次抗体を用いることによって、各抗原部位に対して二次視覚化蛋 白質を更に数多く結合させることができ、その結果、更に感度が上昇することに なるのである。

ナカネ、その他は：ナカネ、その他、「ジャーナルヒストケミカル　サイトケミ ストリーＪ　、２２．１０８４（１９７４）、ウィルソン、その他、「免疫蛍光 及びそれに係る染色技術Ｊ　、Ｗ、Ｋｎａｐｐ、Ｈ，Ｈｏ１ｕｂａｎ及びＧ。

Ｗｉｃｋ、　Ｅｄｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／ノースオランダ　バイオメディカル　 プレス、第２１５頁参照のこと；二次抗体を単量化した（ｍｏｎｏｍｅｒｊｃ） 西洋ワサビ　ペルオキシダーゼと結合せしめ、テストサンプル中における抗原の 部位、分量をそれぞれ明らかにするために、ペルオキシダーゼ酵素の触媒活性を 利用した。これと同じ様な酵素測定法が、二次抗体と結合せしめた腸内又は細菌 アルカリホスファターゼを用いて開発された；　アブラミース、「イムノケミス トリーＪ、６，４３、（１９６９）；メイスン　その他、［ジャーナル　クリニ カル　パソロジーＪ、３１．４５４　（１９７８’）参照のこと。

この方法における酵素信象は、次の２つの方法の内のどちらか１つによっ・で生 じるものといえよう。すなわち、可溶性の酵素基質を酵素によって玉皇ｉ立着色 した生成物に転換せしめ、そうすることによって、巨視的にこれを直接具て又は 光学顕微鏡を用いて検査して、抗原の局在を直接確かめることができる。もう１ つは、無色の基質を酵素によって可溶性の着色生成物接比色分析によって抗原濃 度を定量するのに使用できるものである。この後者の方法は、世界中の臨床検査 所で広く使われている酵素結合免疫吸着分析法（ＥＬＩＳＡ）の基礎をなすもの である； スターンバーガー、「イムノヒストケミストリー」、第２版、ジョン　ウィル− アンド　サンズ、ニューヨーク（１９７９）ｉ　エングヴアル他、「イムノケミ ストリー」、８．８７１　（１９７２）　ｉ　エングヴアル他、［ジャーナル　 イムノロジーＪ、１０９．１２９（１９７２）−；　ゲスダン他、「ジャーナル ヒストケミストリー　アンド　サイトケミストリー」、２７．１１３１　（１９ ７９）；　ヴオラー他、「酵素結合イムノアプソーヘント　アッセイ　（ＥＬ　 Ｉ　ＳＡ）　Ｊ、ダイナチック　ラボラトリーズ　ｌｎｃ、＋　アレキサンドリ ア（１，９７９）参照のこと。

これら酵素に基づく検出方法は、一般的にいえば、直接又は間接免疫蛍光法より も感度が高いものであるカベその理由は、酵素による基質の転換が速いために、 長時間に亘って測定可能な生成物が連続して蓄積されるからである。

酵素免疫測定法の感度を更に高めるために、スターンバーガーは、；スターンバ ーガー他、「ジャーナルヒストケミストリー　サイトケミストリー（Ｊ、Ｈｉｓ ｔｏ−ｃｈｅｍ、　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、　）　Ｊ　１８．３１５、（１９７０） 参照；　３段階のベルオキシターゼー抗ペルオキシダーゼ（ＰＡＰ）測定法を開 発した。−次抗体と二次抗体、これは−次抗体と抗ペルオキシダーゼ抗体間の橋 渡しをなすものであるが、これらを添加した後、酵素反応が発現する前に、ペル オキシダーゼ−抗ペルオキシダーゼ抗体コンプレックス（ＰＡＰ複合体）をサン プルに加えるのである。ＰＡＰ複合体は、２つの免疫グロブリン（抗ペルオキシ ダーゼ抗体）と３分子の活性ペルオキシダーゼ分子とを有しているので、本当− の効果としては、抗原部位に更に酵素が提供されることとなり、その結果、検出 信号が増幅されるのである。ＰＡＰ検出システムは極めて有用なものではあるけ れども、それには制約があるのである。それは、最適のＰ　Ａ、　Ｐ複合体の結 合を確保するためには、該二次「橋渡し」抗体を飽和レヘルで使用しなげればな らないことである。また、二次抗体が双方を橋渡しくｂｒｉｄｇｅ）するように 、抗ペルオキシダーゼ及び−次抗体は、同一のもの又は免疫学的に交叉反応しう る種でなければならない。

ここ数年間、次・のことが教示されてきた。すなわち、水に少量溶けるビタミン であるビオチンと、卵白から得られる６８，０００ダルトンの糖蛋白であるアビ ジンとの間の特異的且つ強力な相互作用が、抗原又はリガンド検出システムの開 発に利用できること、が教示されてきたのである。ヴオラ−（Ｖｏｌｌｅｒ）他 、［酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）ｊ、ダイナチック　ラボラトリーズ （Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）　Ｉｎｃ、＋　アレキサン ドリア（Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ）　（１９７９）におけるバイエル（Ｂａｙｅｒ 　）及びウィルチェック（Ｗｉｌｃｈｅｋ　）を参照のこと。ビオチンは、確立 された化学反応でよ（使用される蛋白質、糖蛋白質、多糖類、ステロイド及び糖 脂質中に存在するアミノ、カルボキシル、チオール、またはヒドロキシ基と共有 結合することができるものである；　以下を参照のこと。ゲスダン（Ｇｕｅｓｄ ｏｎ）他、「ジャーナル　ヒストケミストリー　アンド　サイトケ　ミ　ス　ト 　リ　−　（Ｊ、旧　ｓｔｏｃｈｅｍ、ａｎｄ　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、　Ｎ　、　 ２　７．１１３１、（１９７９）；　スターンバーガ　（Ｓｔｅｒｈ−−ｂｅｒ ｇｅｒ　）他、「ジャーナル　ヒストケミストリーサイトケミストリー」、１８ ．３１５　（１９７０）　；バイエル（Ｂａｙｅｒ　）他、「メリンス　ハイオ ケミカルアナリシズ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、八ｎａ１．ｊ、２５． １（１，９８０）；　バイエル他、「ジャーナル　ヒストケミストリー　サイト ケミストリー」、２４．９３３、（１９７６）；　ハイラマン（Ｈｅｉｔｚｍａ ｎｎ　）他、「プロシーディング　ナショナル　アカデミ−サイエンス　（Ｐｒ ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　）　Ｕ　Ｓ　Ａ、　７　１　、　３５３ ７（１９７４）。また、ビオチンは、酵素的手法によって、ＤＮＡ　：　ＲＮＡ 及び補酵素といった前記以外の高分子物質中に導入することができ、該手法は、 ビオチンでラヘルしたヌクレオチド　プレカーサーを利用するものである；　レ ンジャー（ｊａｎｇｅｔ　）他、［プロシーディング　ナショナル　アカデミ− サイエンスＵＳＡｊ−１７８，６６３３、（１９８１）参照のこと。

同様に、アビジンは、標準的な化学反応によって、分子種（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｐｅｃｉｅｓ　）の宿主に結合することができる；　以下を参照のこと。スタ ーンバーガー、「免疫組織化学Ｈｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　 Ｊ　、第２版、ジョン　ウィル−アンド　サンズ−（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙａｎ ｄ　５ｏｎｓ）　、ニューヨーク（，１９７９）；　ナカネ（Ｎａｋａｎｅ　） 他、「ジャーナル　ヒストケミストリーサイトケミストリー」、２２．１０８４ ．−（１９７４）；ゲスクン他、「ヒス１−ケミストリー　アンド　サイトケミ ストリー」、２７．１１３１　（１９７９）；　バイエル他、［メソソズ　バイ オケミカル　アナリシズ」、２６、■、（１，９８０）。これは、免疫学、免疫 病理学、及び分子生物学において使用するための検出システムを計画するに当り 、大きな融通性を余裕をもって見込んだものである。

１９８１年にフス（Ｈｓｕ）は；　フス他、「アメリカンジャーナル　クリニカ ル　バソロジ−（Ａｍｅｒ、　Ｊ。

Ｃｌ１ｎ、Ｐａｔｈ、）」、７５．７３４　（１９８１）　ｉ　フス他、「ジャ ーナル　ヒストケミストリー　サイトケミストリー」、２９．５７７　（１９８ １）参照のこと；抗原検出のために、アビジン−ビオチン化した西洋ワサビ　ペ ルオキシダーゼ複合体（Ａ　Ｂ　Ｃ）を使用することを報告している。彼等の３ 段階法においては、−次抗体をインキニーベートした後に、ビオチン標識二次抗 体とのインキニーベート期間が続き、次いで、一定量のビオチン化したペルオキ シダーゼとアビジンとを予じめインキニーベートしておくことによって生成せし めたＡＢＣ複合体とのインキニーベート期間が続くのである。アビジンは、１分 子当り、ビオチン−結合部位を４つ有しているので、ビオチン化した（ｂｉｏ− ｔｉｎｙ　１ａｔｅｄ）二次抗体との相互作用能力が干渉されることなく、少な くとも３つのペルオキシダーゼ酵素をアビジンに付加させることができる。フス とその共同研究者達は；　フス他、「アメリカン　ジャーナルクリニカル　パソ ロジー」、７Ｓ、７３４（１９８１）；フス他、「ジャーナル　ヒストケミスト リー　サイトケミストリー」、２９．５７７、（１９８１）参照のこと；　組織 中の抗原を検出するにあたり、このへＢＣ検出法は、免疫ペルオキシダーゼシス テムまたはＰＡＰシステムのいずれよりも、４〜８倍感度が高いことを報告して いる。マトリ　（Ｍａｄｒｉ　）他は；　マトリ他、［ラボラトリ−インベステ ィゲイション（Ｌａｂ、　Ｉｎ−ｖｅｓｔ、　）　」、４　Ｂ、９Ｂ（，１９８ ３）参照のこと；上記観察事項を確認し、そして、ＥＬ　Ｉ　ＳＡシステムを用 いる抗原の検出に当って、免疫ペルオキシダーゼ技術又はＰＡＰ技術のいずれよ りも、このＡＢＣ法は感度が４倍も高いことを教示した。試験したすべての判定 基準に対して、現在までの臨床診断ラボラトリ−で使用されている検出手法のな かで、このＡＢＣ法が最も高い感度を示すものである。

しかしながら、ＡＢＣ法の感度の限界は、蛋白質又は核酸といったターゲット分 子の３０〜１１００ｐにあるように思われる。これは、細胞当りの単一分子の検 出に必要な上限値よりも相当高いものである。その他の感度がより低い方法の限 界の方が、これよりも高いのである。したがって、本発明の目的は、既知の可視 化（ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ　）技術が有する感度よりも実質的にすぐれた 感度を有する改良された可視化方法を開発することである。また、他の目的は、 商品の寿命が長く、安定で、しかも操作が容易な可視化システムを開発すること である。最後に、他のすべての診断技術の場合と同様に、究極的な目的は、すべ ての被検細胞における１つの種の単一分子を検知検出する能力の開発ということ になるであろう。

１１鬼互１ これらの目的、及びその他の目的は、本発明によって成就されたのである。そし て本発明は、無機又は有機のターゲット分子の存在を視覚によって確認する方法 。この方法に使用する視覚化ポリマー　（ｖｉｓｕａｌ　１ｚａ−ｔｉｏｎ　ｐ ｏｌｙｍｅｒ）と検出−視覚化複合体、及び、この方法を実施するための検出キ ットに関するものである。

本発明によれば、ターゲット分子の存在は、ターゲット分子を可視化ポリマーと 結合せしめて、これを目で見ることができる。可視化ポリマーは、可視化モノマ ーの複数ユニットを、重合によって又はカップリング剤によって共有結合せしめ てなるものである。ターゲット−ポリマー結合は、ターゲット分子に対して選択 的であり且つ可視化重合体を担持した検出剤を介して、行われる。

可視化ポリマーは、検出したり一ゲソト分子の量を実質的に化学増幅するもので ある。該ポリマーの各ユニ・７トは、それぞれ少なくとも１個の視覚部位を有す るものであり、そして、これらのユニットは、それらが本来的に持っている視覚 部位の活性を保持するように、結合しているのである。１つのユニットは１つの 視覚化モノマーであるが、それは、色、蛍光、ルミネッセンス、放射能の局在、 又は電子稠密物質の局在を発生ないし生成することができるものである。これら のユニットとしては、酵素、標識化した（ｔａｇｇｅｄ）天然又は合成のポリペ プチド、標識化したポリオール、標識化したポリオレフィン、又は、標識化した 炭水化物の中から選べばよい。

これらのユニットは、重合によって直接結合せしめるか、又は、カンプリング剤 によって間接的に結合せしめる。直接重合又はカンプリング剤は、隣接するユニ ットの化学基又はモノマーのバックボーン部分（ｂａｃｋｂｏｎｅ　ｍｏｉｅｔ ｙ　）を結合するものである。ポリマーの各ユニット用に使用する化学基又はバ ックボーン部としては、アミノ基、１，２−ジオール基の酸化型、カルボキシ基 、メルカプタン基、ヒドロキシ基、又は、炭素−水素結合から自由に独立して選 ばれることになろう。

千ツマーユニットの可視化部位の活性を保存維持するには、可視化部位から少な くとも原子を１個離して、各ユニットのバックボーン部分若しくは化学基を結合 せしめるか、又は、重合結合を形成せしめればよい。

各々のタイプのカンプリング剤を用いて又は各々のタイプの直接重合法を用いて 視覚化ポリマーを調製し、そして、視覚化部位の活性が付加形成されたか否かを テストして、該活性の保存維持を確かめればよい。上記の代替法としては、もし も、視覚化部位の全体の゛化学構造が決定され得るのであれば、この構造の一部 をなすものではないモノマー部分を、カンプリング剤又は重合プロセスによって 結合せしめてもよい。例えば、活性部位を分析して、それがリジンまたは糖を含 むのではなくて、グリシン、セリン、及びヒスチジンを含んでいることが分った 場合には、リジンまたは糖を、結合用の化学基として使用すればよいのである。

モノマーの可視化部位は、生物活性部位であることができる。例えば、適合した 基質と反応させる場合にう。このようにして、可視化部位は、色、蛍光、ルミネ ッセンス、放射能、又は高い電子濃度からなる可溶性体又は不溶性体を発生せし めるのに利用することができるものであり、これらは、測定することが可能であ って、検知したターゲット分子の量と相間々係を有するものである。

これらの部位（ｓｉｔｅ）は、化学的に創製すすることもできる。天然又は合成 のポリペプチド、ポリオール、ポリオレフィン、又は炭水化物と、蛍光性化学基 、染料、放射性基、光子放射体（ルミネッセント基）又は電子稠密部分から選択 される可視化標識と、を結合性しめれば、視覚化が可能なモノマー単位が生成さ れよう。標識（ｔａｇ　）は、各ユニットに対して当量の比率で存在せしめてよ い。しかしながら、１隼位当り、標識の数は沢山あった方が好適である。

可視化重合体（ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｐｏｌｙｍｅｒ　）のニー’−ソ トは、直接型合法結合又はカップリング剤結合のいづれかによって、結合される ものである。直接重合法は、隣゛接するユニットにおける有効なハックポーン部 分（ｂａｃｋ−ｂｏｎｅ　ｍｏｉｅｔｙ）又は化学基間において、相互結合（’ ｉｎｔｅｒｂｏｎｄｉｎｇ）を生成せしめるものである。゛例えば、西洋ワサビ 　ペルオキシダーゼといった酸化酵素は、酸化的架橋（ｃｒｏｓｓ−１ｉｎｋｉ ｎｇ　）によってモノマー単位を重合するのに使用することができる。

また別の方法としては、二官能性又は多官能性有機架橋試薬から誘導したカップ リング剤を、ユニットの適宜なバンクポーン単位又は化学基と結合させる方法が ある。これに関連して、「カップリング剤（ｃｏｕｐｌ−４ｎｇ　ａｇｅｎｔ　 ）　Ｊとは、結合後の連鎖（ｌｉｎｋａｇｅ　）をいい、「架橋試薬（ｃｒｏｓ ｓ−１ｉｎｋｉｎｇ　ｒｅａｇｅｎｔ　）という用語は、結合（ｂｏｎｄｉｎｇ 　）前の連鎖化合物（ｌｉｎｋａｇｅｃｏｍｐｏｕｎｄ　）のことをいうことに する。

架橋試薬は次の一般式■を存する： 式Ｉの反応基Ａ、Ｂ及びＥは、水素、カルボン酸基、酸ハライド、活性エステル 、混合無水物、アシルイミダゾール、Ｎ−（カルボニルオキシ）イミド基、イミ ノエステル、第１アミン、アルデヒド基、アルファハロメチルカルボニル基、ヒ ドラジン基、アシルヒドラジド基、アジド基、又はＮ−マレイミド基からなる群 から自由に選ばれるものである。Ａ、Ｂ及びＥの内、少なくとも２つは水素以外 のものである。Ａ、Ｂ及びＥと同様な反応基（ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｇｒｏｕｐ） を３つ以上有する多官能性架橋試薬も、同じく本発明の範晴に包含される。更に 付は加えたこれらの反応基は、先に定義したＡ、Ｂ及びＥから自由に選ばれるも のである。

式ＩのＲ１は、少なくとも炭素原子を３個有する脂肪族基、又は少なくとも炭素 原子を６個有する芳香族基である。

結合すべきモノマー単位のハックポーン　ユニットまたは化学基としてどのよう なものを選択するかによって、式Ｉの反応基の選択が変ってくることになる。

化学基又はバックボーン部分の種類に応じて、それぞれが、式■の対応する適宜 な１つ又はそれ以上の反応基と反応することになろう。アミノ基は、カルボン酸 基、酸ハライド、活性化エステル、混合無水物、アシルイミダゾール、Ｎ−（カ ルボニルオキシ）イミド基、イミノエステル、アジド又はアルデヒド基と反応す ることになろう。酸化した１、２−ジオール基（ジアルデヒド）は、１級アミン 、ヒドラジン基、アジド又はアシル　ヒドラジド基と反応することになろう。カ ルボキシル基は、１級アミン、ヒドラジン基、アンド又はアシルヒドラジド基と 反応することになろう。メルカフタン基は、α−ハロメチルカルボニル基又はＮ −マレイミド基と反応することになろう。ヒドロキシル基は、カルボン酸基、酸 ハライド、活性エステル、混合無水物、アシルイミダゾール、又はＮ−（カルボ ニルオキシ）イミドと反応することになろう。炭素−水素結合は、アジド（ナイ トレン）と反応することになろう。

本発明方法によれば、ターゲット分子に特異的な検出剤（ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　 ａｇｅｎｔ　）が利用される。この検出剤は、可視化ポリマーを直接に又は間接 的にターゲットのところへ運んでやるものである。検出剤としては、抗体、レク チン、ＤＮＡレプレッサー蛋白、立体特異性受容体−蛋白質、高親和性酵素、配 列特異性ポリヌクレオチド結合蛋白質、アビジン、ストレプトアビジン、ホルモ ン、又は相補的ポリヌクレオチド配列を使用することができる。

検出剤は、ポリマーとの直接共有結合によって直接的に、又は介在する共有結合 基を通して間接的に、視覚化重合体を担持することができる。また検出剤は、そ の配列は直接的でも間接的であらてもよいけれども、介在するりガント結合複合 体を通して、ポリマーを担持（ｃａｒｒｙ　）することもできる。直接配列の場 合、検出剤は、リガンド結合化合物としての役割も果し、そして対応するりガン トは可視化ポリマーに共有結合するものである。間接配列の場合、第１リガント は検出剤に結合し、第２リガンドはポリマーに結合して、これらの第１及び第２ リガンドは、それらがリガンド結合化合物との複合体を形成する橋渡しとして機 能するように、リガンド結合化合物とサンドインチ状となるのである。

リガンド結合化合物としては、抗体、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン 、高親和性酵素、配列特異性ポリヌクレオチド結合蛋白質、又は相補的ポリヌク レオチド配列が含まれる。リガンドとしては、それぞれのタイプの化合物と複合 体を形成するのに適したものが使用されよう。リガンドとしては、抗原、特異的 糖類、ビオチン、イミノビオチン、特異的基質、ポリヌクレオチド、又は相補的 ポリヌクレオチドがそれぞれ包含される。

本発明に係る、検出剤−可視化ポリマー担持配列（ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ　） として好適なものは、間接配列であるが、その間接配列において、検出剤は抗体 、相補的ポリヌクレオチド配列、又はレクチンである；　リガンド結合化合物は 、アビジンまたはストレプトアビジンであり、そして第１及び第２リガンドは、 ビオチン若しくはイミノビオチン、アルカノイル基が４〜２０個の炭素鎖からな るＮ−（オメガ　アルカノイル）アミド〔ビオチン若しくはイミノビオチン〕、 及びオリゴマーが２〜３０ユニツトの長さを有するポリオール、ポリアミド若し くはポリビニル基であるところのＮ−（オメガ−オリゴマー）アミド〔ビオチン 若しくはイミノビオチン〕から自由に選択されるものである。これらすべてのリ ガンド複合体において、可視化ポリマー対アビジンまたはストレプタビジンの比 率としては、約３対１とするのが好ましい。

この好適な間接配列において、検出剤がレクチンの場合には、ターゲット分子は これに対応する適宜な糖ということになろう。それが抗体である場合には、ター ゲット分子は、該抗体と複合体を形成するところの抗原又はハプテンということ になろう。それがポリスクレオチド配列である場合には、ターゲット分子は、こ の検出剤と交雑するところの相補的ポリヌクレオチド配列ということになろう。

本発明に係る方法としては、上述した好適な間接配列（ｉｎｄｉｒｅｃｔ　ａｒ ｒａｎｇｅｍｅｎｔ）を利用するのが好適である。

ターゲット分子の検出法として特に好適な方法は、上記した好適な配列から作り 上げられる；しかしながら、ここでは第２の橋渡し成分が使用されているのであ る。複合体、すなわちアビジンまたはストレプトアビジン−（ビオチン　リガン ド）−可視化ポリマー、はビオチン標識第２抗体と複合体を形成するよう用いら れる。第２抗体は、ターゲットに対して特異的であるところの第１抗体検出剤用 の一般試薬である。第１抗体をターゲットと共にインキニーベートすると、抗原 −抗体コンジュゲートが形成される。そこで、このコンジュゲートと共に第２抗 体をインキニーベートするのである。この第２番目のインキニーベーシヨンの次 に、可視化ポリマー複合体を加えて、第２抗体と結合せしめ、そ゛して目で見え るようにするのである。

本発明に係る別の好適な方法は、好適な間接的複合リガンド配列も利用するもの である。この配列においしてターゲットは、この相補的配列と交雑するところの 対応する天然のポリヌクレオチド配列である。検出剤及び視覚化重合体は、ビオ チンまたはイミノビオチンでラベルされたものである。アビジンまたはストレプ トアビジン−（ビオチン　リガンド）−視覚化ポリマーの複合体が生成される。

標識したポリヌクレオチド検出剤を、複合化した生物学的混合物に添加するが、 この混合物には、検出すべき天然のポリヌクレオチド配列が含まれているのであ る。添加してそのままにしておくと交雑化が生じ、続いて該複合体を添加して、 交雑化し且つ標識化されたポリヌクレオチド検出剤に結合せしめ、そして目で見 えるようにするのである。

特に好適な担持配列（ｃａｒｒｙｉｎｇ　ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）は、上記し た２つの好適な方法の配列を包含する。

リガンド担持化合物と対応するりガントに結合する視覚化ポリマーとの間の複合 体も、本発明の範晴に包含される。これらの複合体は、本発明の担持配列のとこ ろで上述したとおりである。

好適な検出方法及び好適な可視化ポリマーは、複数ユニットの酵素又は複数ユニ ットの天然若しくは合成のポリペプチドあるいはポリオレフィンを包含するもの であり、これらは、蛍光基、染料、ルミネッセント基、又は電子稠密基（ｅｌｅ ｃｔｒｏｎ　ｄｅｎｓｅ　ｇｒｏｕｐ）から選ばれる標識に化学的に結合されて いる。好適な酵素には、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ガラクト シダーゼ、グルコースオキシダーゼ、酸性ホスファターゼ、及びルシフェラーゼ が包含される。好適なポリペプチドには、ジカルボン酸とジアミンのポリアミド 、ポリイミド、そして、グリシン、リジン、アスパラギン酸、システィン、オル ニチン等といったα−アミノ酸の共重合体及びオリゴマーが包含される。

ポリオレフィンには、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリマレイン酸、 ポリ　（ヒドロキシエチルアクリル　エステル）その他が包含される。これらの ポリペプチド及びポリオレフィンは、フルオレセイン、ローダミン、ジアゾ染料 、コロイド状金、ルシフェリン、放射性ヨウ素等といった基で標識されよう。

視覚化ポリマー製造のための、好適なカップリング剤−化学基結合配列には、次 のものが包含される：１、　炭素原子４〜２０個の脂肪族ジカルボン酸がら誘導 されるジアシルまたはジ（イミノエステル）誘導体であって、ポリマーのユニッ トとして機能するモノマーのニブシロンまたは１級アミン基と一緒になって、ア ミドまたはアミジン結合を形成するもの。

２、　炭素原子数４〜２０の脂肪族ジカルボン酸又は炭素原子数４〜２０の脂肪 族ジヒドラジンがら誘導される反応性のジアシルまたはジヒドラジド誘導体。こ れは、１．２−ジオールが酸化されてジアルデヒドになるときにポリマーのユニ ットとして機能する千ツマ−の１．２−ジオール基と一緒になって、アミド基又 はヒドラゾン基を形成するか、あるいは、ポリマーのユニットとして機能するモ ノマーのカルボン酸基と−緒になって、アミド基を形成するものである。

３．　アルキル基の炭素原子数が４〜２０であるところのＮ−アルキル　ビス（ マレイミド）の反応性オレフィン誘導体であって、ポリマーのユニットとして機 能するモノマー中に存在するメルカプタン基と一緒になって、ジスルフィド基を 形成するもの。

４、Ｎ−マレイミド基またはイミノエステルのいずれかで置換された又はＮ−（ カルボニルオキシ）イミド基で置換された脂肪族の反応性へテロニ官能試薬（脂 肪鎖は炭素原子数が４〜２０個の長さを有する）であって、ポリマーのユニット として機能するモノマーのメルカプタン基と一緒になってスルフィド基を形成す るか、または、ポリマーのユニットとして機能する隣接モノマーのアミノ基と一 緒になってアミジン若しくはアミド基を形成するもの。

５、　シッフ塩基で保護されたアミノ基で置換された、又はカルボン酸のアシル 若しくはイミジエステル基で置換された脂肪族の反応性へテロ三官能性試薬（脂 肪鎖は炭素原子数が４〜２０個の長さを有する）であって、ポリマーのユニット として機能する千ツマ−のアミノ基と一緒になってアミド若しくはアミジン結合 を形成し、そして、シッフ塩基からなる保護基を外した後には、ポリマーのユニ ットとして機能する隣接モノマーのカルボキシル基と結合するカルボニル　ジイ ミダゾールまたはジイミドによってアミド結合を形成するもの。

６、　三官能性リジルリジン試薬（１ｙｓｙｌ　ｌｙｓｉｎｅｒｅａｇｅｎｔ　 ）であって、ポリマーのユニ、トとして機能するモノマー中に存在する酸化され た１、２−ジオール基又はカルボン酸基と一緒になって、それぞれ、イミノ結合 又はアミド結合を形成するもの。

本発明は、同じく、特に生物材料中のターゲット分子の存在を分析するための検 出キットにも関するものである。このキットは、ターゲット分子に特異的な前述 した検出−可視化複合体又はその成分か−らなる混合物を一定量計量したものと 、同じ可視化ポリマーを標準量計量したものとを含むものである。このキットは 、比色、蛍光、ルミネッセント、又は放射能インジケーターの形態としてもよく 、この場合、試験用の景及びスタンダードは、比色分析、蛍光分析、ルミネッセ ント分析又は放射能分析のために、適当な容器に入れ、水溶液の形になっている 。また、このキットは、ターゲット分子を可視化することができるよう、ニトロ セルローズのような試験紙及び標準紙の形態にしてもよい。

図面の簡単う【膚し朋□ 図面は、本発明にしたがって行った検出試験の結果を図示したものである。

第１図は、ポリ酵素／アビジン複合体を用いてニトロセルローズ上に斑点を生ぜ しめてビオチン標識ＤＮＡを検出したところを図示したものである。

第２図は、ビオチンを用いないＤＮＡプローブを用いて比較研究を行ったところ を図示したものである。

第３図は、ポリ酵素／アビジン複合体を用いるサウザーン　プロット法（Ｓｏｕ ｔｈｅｒｎ　Ｂｌｏｔ　Ｍｅｔｈｏｄ）によってビオチン標識ＤＮＡの検出を行 ったところを図示したものである。

第４図は、本発明に係る比色による可視化及び可視化ポリマーを用いるサウザー ン　プロット法によって、ヒトのα及びβグロビン遺伝子を相補的交雑（ｃｏｍ −ｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ｈｙｂｒｉｄｊｚａｔｉｏｎ）により検知したところ を図示したものである。

第５図は、本発明にしたがって、酵素（Ａ）及びポリ酵素（Ｂ）を用いて、ビオ チン化した蛋白質を視覚化することによって得られた検出結果の比較を図示した ものである。

第６回は、蛋白質を検出するためのＰＡＰ検出技術の結果を図示したものである 。

第７図は、本発明にしたがって蛋白質を検出するためのポリＡＢＡＰ技術の結果 を図示したものである。

発明の詳細な説明 本発明に係る可視化ポリマー及び複合体は、生物材料中に存在し得る無機又は有 機のターゲット分子のごく少量の存在を検出し、化学的に増幅するものである。

一般的にいうと、この検出は、ポリマー、その複合体、及び検出すべきターゲッ ト分子の間での相互作用に基づいて行われるものである。ポリマーは、特定のタ ーゲット分子と結合することができその他は排除するところの複合体担持配列（ ｃｏｍｐｌｅｘ　ｃａｒｒｙｉｎｇ　ａｒｒａｎｇｅ−ｍｅｎ　ｔ　）中に担持 される。ターゲット分子と担持配列との間で形成される結合体（ａｓｓｏｃｉａ ｔｉｏｎ　）中に存在するポリマーの量を測定することによって、ターゲットの 定量が行われる。各結合体中におけるポリマーの多数のユニットによって、信号 の増幅が行われる。

ポリマーの千ツマーユニットは、重要な特徴を有するものであって、ターゲット 担持配列結合体の可視化を行うものである。これらのユニットは、定量のための 手段として利用することのできる基質と反応することができ、又は可視化標識を 含むことができる。この測定は、容易に固定することのできる基質生成物又は分 光信号を形成することによって行ってもよいし、また、その他のタイプの非破壊 定量分析法によって測定してもよい。好適には、可視化は、色、蛍光、ルミネッ センス、放射能、高密度電子、及びその他の分光測定の形態の形成に基づいて行 われることになろう。

該ユニットが酵素の場合、これらは、このような分光測定を行うことのできる生 成物を形成することができる。例えば、これらは、基質の反応を触媒して、着色 した、蛍光性の、ルミネッセントな、電子密度の高い、又は放射性の生成物を形 成することができるのである。

またこれとは別に、標識したユニットは、分光測定用の手段として直接利用する ことができる。例えば、天然若しくは合成のポリペプチド、ポリオール、ポリオ レフィン、又は炭水化物を、着色、蛍光、ルミネッセンス、電子密度、又は放射 能といった各性質を有する化学基で標識してもよいのである。そこで、これらを 分光測定に使用すればよいのである。

上記した各性質を有する酵素、及び標識化したポリペプチド、ポリオール、ポリ オレフィンまたは炭水化物は、分光分析用の手段としてよく知られているもので ある。適当なスペクトロメーターに置くと、酵素基質又は標識がスペクトルの変 化をひき起し、それが存在するターゲットの量を指示することになるのである。

この方法は、通常、可視化と称され、スペクトルの変化は、可視化グループ（基 質又は標識）によって形成される信号と呼ばれる。

検出すべきクーゲットの量は、通常は非常に少量であろうし、複合体−クーゲッ トの結合からの信号がこれと当価の基盤にたって出るのであれば、その信号も同 し様に非常に弱いものになるはずである。しかしながら、担持配列及びその視覚 化ポリマーは、その信号を化学的に増幅し、その結果、極く少量のターゲットか ら、強くてしかも測定しやすい信号が得られることになるのである。増幅はポリ マーによって行われるのであるが、その理由は、ポリマーが視覚化モノマーの多 数のユニットから成っているからである。各々のユニットからの信号は、ポリマ ーによって維持される。

その結果、その信号は、各ユニットからの各信号の総和になるのである。また、 担持配列が沢山のポリマーを含むようにしてもよい。必要なことではないけれど も、この多数配列は、これが更に増幅を行うことができるので、好ましいもので ある。

本発明に係る視覚化ポリマーは、沢山のモノマー単位から成るものであり、これ らのモノマーユニットは、相互に直接結合するか、または、各ユニットの化学基 又はバックボーン部分に結合したカップリング剤を介して、間接的に相互に連鎖 してポリマーを形成するのである。また、これらのユニットは、それぞれ、視覚 化信号を出す部位を１個又はそれ以上保有するものである。すなわち、それは、 酵素作用のための部位であってもよいし、あるいは、視覚化標識を１個又はそれ 以上付けた部位であってもよいのである。このポリマーの視覚化信号活性は、そ れぞれのモノマーユニットから発生される信号によって左右されるものである。

したがって、部位の活性が実質的に低下しないように、１個又はそれ以上の可視 化部位は、もとの形のままで実質的に保持しておかねばならないことになるので ある。したがって、モノマーユニットの化学的修飾は、１個又はそれ以上の該部 位が実質的に影響を受けないよう、実施されなければならないことになる。

この目的を達成するためには、直接結合又はカップリング剤による連鎖は、１又 はそれ以上の可視化部から少なくとも１個の原子、好ましくは少なくとも３〜５ 個の原子だけ離して、各ユニットのバックボーン部分又は化学基を結合しなけれ ばならない。また、カップリング剤を用いる連鎖又は結合に使用するための化学 基又はハックボーン部を選択する際には、これらのものが、該部位内に存在しな いこと、ないしは、該部位の構造及び３次元の配列に必要のないものであるとい う制限が必要である。これらの選択は、標識した天然もしくは合成のポリペプチ ド、ポリオール、ポリオレフィン、又は炭水化物の場合よりも、酵素蛋白質の場 合の方がより重要である；　しかじ、標識蛍光、ルミネッセンス、着色、放射能 、又は高密度電子の生成を妨げることは避けねばならない。

一般的にいえば、これら部位の保存維持に対する要件は、いくつかの方法によっ て満たすことができる。

もしも、モノマー構造を作っている残りの化学的部分又は生化学的サブ構造（ｓ ｕｂｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）のタイプが既知である場合には、可視化部位とはなら ないものを、カンプリングのための反応生化学基又はバックボーン部分を含有す る構造として選択すればよい。しかしながら、通常は、適当な反応性化学基又は バックボーン部分を選択するためには、セミエンペリンク法（ｓｅｍｊ−ｅｍｐ ｅｒｉｃ　ｍｅｔｈｏｄ）が使用されよう。

該サブ構造／残り法によれば、モノマー単位の化学構造を研究することができる であろう。視覚化部位の作用には必要のないモノマー　バックボーン−置換グル ープ及び官能構造（例えば、糖基、脂質、オリゴマー側鎖その他）は、同定する ことができよう。典型的には、これは、これらサブ構造の修飾又は除去によって 、そしてまた、その結果得られた生成物の活性を研究することによって、決定す ることができるはずである。

そこで、これらのサブ構造中に本来的に存在していた化学基又はバンクポーン部 分を、カンプリング剤との間接連鎖又は直接結合に利用することができるのであ る。例えば、酵素活性には必要のない糖蛋白中の糖基は、これを酸化して′ジア ルデヒド基とし、そしてヒドラジン　カップリング剤と反応せしめて、視覚化ポ リマーを形成することができるのである。

蛋白質のアミノ酸配列のようにモノマーの化学的配列が決められる場合には、こ れを直接結合又は間接連鎖（ｉｎｄｉｒｅｃｔ目ｎｋｉｎｇ）のガイドに利用す ることもできる。活性部位に対する配列及び三次元構造を分析すれば、千ツマ− の構造的サブユニットのどれが、該部位の機能化に必須か否か、そして／又は、 どのサブユニｙ　ｔ・がその中に存在していないかを知ることができよう。これ らのサブユニットの反応性化学基又はハックポーン部分を、カップリング剤を用 いる連鎖又は結合（ｂｏｎｄｉｎｇ　）のために使用してもよい。例えば、千ツ マ−が蛋白質であり、システィンで終了するジペプチド側鎖がそれに含まれてい ることが分った場合、このシスティンのメルカプタン基は、ビス（Ｎ−ブチレニ ルマレイミド）との反応によって、他の類似の蛋白質のシスティンに架橋（ｃｒ ｏｓｓ−１ｉｎｋ）することができるのである。

セミエンペリック法によれば、モノマーの反応性化学基及びハノクボ＝ン部分は 、適当な分光分析及び化学分析によって決定することができる。これらの中には 、ＮＭＲ１ＩＲ１化学的誘導（ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｄｅｒｉｖａｔｉ−ｚａｔｉ ｏｎ）　、電気泳動、滲透圧、アミノ酸分析、元素分析、質量分析その他が包含 される。同定された基及び部分には、アミノ基、メルカプタン基、カルボキシル 基、ヒドロキシル基、糖基、炭水化物基、エステル基、脂質基、及び、アミド結 合、不安定な炭素−炭素結合、炭素−水素結合その他が包含される。上記以外の 測定、例えば、酵素の場合におりる、誘導と部位活性との関係、ｐＨと部位活性 との関係、及び部位反応のタイプの測定を行えば、活性部周辺における該基や部 分の存在の可能性に基づく官能基の優先順位を決定する手助けとなろう。典型的 な優先順位は次のとおりであろう：１、　イプシロンまたは１級アミノ基、２． 　ＩＪ！基、３゜カルボキシル基、４．　メルカプタン基、５．　ヒドロキシル 基、６．　脂質基。もしも、リジン残渣のアミノ基といったアミノ基の誘導によ って、部位活性を欠いた誘導生成物が得られた場合には、上述した優先順位は変 ってきて、アミノ基が１番最後になるであろう。

通常のエンペリック手法によれば、友応性化学基又はハックポーン部分を選択す ることによって、いくつかの型（ｖｅｒｓｉｏｎ　）のポリマーを製造すること ができよう。そこで、いくつかの型の活性を試験し、そして最も活性の高いもの を選択するのである。典型的には、化学基又はハノクボ＝ン部分を選択すること によって、視覚化部位の活性に少なくとも影響を与えると思われるものには３つ 又は４つのタイプが含まれることになろう。もしも最初のいくつかのものについ ての結果が満足できないのであれば、場合によっては、反応性化学基又はハック ポーン部分の各タイプをそれぞれ試してもよい。ポリマーのそれぞれの型をエン ペリックに調査することによって、最も活性の高い型を同定することができよう 。

化学基／骨核部の結合配列にきわめて鋭敏な、可視化部位を有する単量体単位は 酵素である。触媒的部位は典型的に基質に密接に適応する配座を持っているだろ うし、その触媒的部位の三次元配置を乱す化学的変性はその重合体活性に逆の作 用を及ぼすかもしれない。

前述の方法に従えば、酵素部の活性は維持されうる。

さらに、酵素の触媒的部位は、それを基質と可逆的に結合させることによって、 結合ないし連結の際保護されうる。

付加された天然または合成ポリペプチド、ポリオール、ポリオレフィンあるいは 炭水化物は、化学基／骨核部結合配列に対して感度のかなり低い可視化部位をも っているものである。タグとして働く、けい光性基、染料、発光性基、放射性基 または電子濃化性基は、典型的に、近接の化学基または骨核部が直接あるいは間 接にカップリング剤と結合ないし連結する際、活性に変化を生しないものである 。ただし、直接結合剤あるいはカップリング剤がタグとも反応するか、そうでな くともその可視化活性を低下させるような妨害作用を行うことがあるかどうか、 十分な注意がなされなければならない。さらに、タグが、可視化重合体−標的会 合形成後活性基に変えられるものであるとすれば、化学基または骨核部連結位置 はその変換を妨害すべきではない。

一般に、化学基や骨核部は可視化部位とは最小１個の原子で隔てられているべき である。酵素タンパク質単量体は好ましくは可視化部位から約３〜５原子離れて 結合ないし連結することになる。

可視化重合体構造はカンプリング剤によって直接分子間結合されているか、また は架橋連結されている、単量体の多重単位である。重合体の構造的、機能的特性 は単量体単位のそれに類似のものである。重合体当たりの単位の数は、カップリ ング剤の程度、生成重合体の安定性、重合体鎖長当たりの化学基または骨核部の 反応性および単量体骨核に沿った化学基または骨核部の位置に依存するものであ る。

一般に、重合体中に組み込まれる単−位の数は、重合体当たり２〜３といった小 さいものから、３０〜１００といった大きいものまでいろいろある。重合体鎖長 が、その重合体を水溶液に極度に溶は難くしたり、あるいは機械的開裂に対して 極端に敏感になるようなオーダーのものではない限り、もっと高い多重化も可能 である。

重合体は直鎖状であってもよく、また分岐状であってもよい。２つの隣り合う単 位間のカンプリングは１つでも複数でもよい。カップリングは単位類に沿ってど の点で生じｔもよく、隣り合う単位が末端−末端に位置しても、あるいは部分的 に、または全面的に重なり合っていてもよい。結果として、重合体の三次元構造 はこれらの形をすべてもっていてもよい。それは直鎖状であってもよいが、もっ と典型的には直鎖状単位と分岐状単位の組み合わせになるだろう。典型的には部 分的重なりが生ずるだろうが、多重カンプリングも存在するだろう。

化学基または骨核部の接近しやすさも重合体の長さに影響を与えることになる。

それらが単量体構造内部に埋没していれば、立体障害によって大きな数の単量体 単位のカンプリングが妨げられることになりがちである。炭素原子約１０個より 大きい数の鎖長を有するカップリング剤を使ってこの影響を減らしてもよい。

もっとよくある調整においては、反応性化学基または骨核部は容易に接近できる ようになっており、単量体鎖の最近接末端内にあるか、あるいは接近可能な側鎖 または基の内部にあって、単量体の三次元構造の内部領域から外へ向かっｔ伸び ているのである。このタイプの基または部分は単量体単位の高多重化のカンプリ ングに向かいやすいものである。典型的には、ある鎖長のカンプリング剤の直接 結合を採用してもよい。しかし、接近容易な基または部を、重合体の単位を遠ざ けておくような反応剤とカップルさせることはときには有効な−ことがある。こ れは基質あるいは反応基の接近を容易にし、重合体の単位間の逆相互作用を防く ことになる。典型的には、約４から約２０の炭素をもつ炭素鎖長の反応剤が好ま しいことになる。

単量体単位を一緒に連結するカップリング剤は前述の式■の二官能性または多官 能性有機架橋剤からとられる。ここに、カップリング剤という用語は、化学基ま たは骨核部とそれがカップリングした形の中の基を示すものとする。架橋剤とい う用語は、それが化学基または骨核部と反応する前の、その化学的な形を示すも のとする。

カップリング剤／架橋剤の使い分けは、力・ツブリングされるべき反応性化学基 または骨核部と、重合体内の単位量干渉を避けることになる反応剤鎖長との使い 分けに依存することになる。図式Ｉは反応剤と化学基または骨核部の反応に対す る一般方式を説明するものである。

図式Ｉの反応１〜６のおのおのにおいて、式■の二官能性または多官能性架橋剤 が用いられる。この反応剤に対する一般式は次のようである： ここに、Ａ、ＢおよびＥは上に規定したような反応性基であ夕、Ｒ１は上に規定 したようなものである。それぞれの反応において、Ａに対する特定の反応性基と その単量体化学基また・は骨核部との反応が示される。

基ＢとＥは規定されていないが、同じであってもよく、他の反応性基のどれかか ら選ばれてもよく、あるいはＢとＥの一方が水素であってもよい。このようにし て、それぞれの反応は、反応性基が同じであるホモ（二または多）官能性反応剤 および反応性基を異にするヘテテロ（二または多）官能性反応剤による架橋反応 を説明している。

式ＩのＲ１は通常はぼ直線状であるが、多少分岐していてもよい。好ましくは、 Ｒ１は式−（ＣＨｚ）ｊ−のアルケニル基；式−ＣＨ（（ＣＨｚ）ｋ）　２　Ｃ Ｈ−のシクロアルケニル基；または式＝（ＣＨｚ）Ｉ　ＣｂＨａ−（ＣＨｚ）ｍ −のアリル基であり、ここにｊは約２から約３０の整数、には約Ｏから６の整数 で、ｋの和は４，５，６．７または８であり、ｌとｍは別個に選ばれた０から約 ２０までの整数である。とくに好ましいＲ１基は３ないし１４のｊをもつアルケ ニル基と０ないし５の１とｍをもち、パラ位に置換したアリル基を含むものとす る。望ましい実施ａｍはプロピレニル、ブチレニル、ヘキシレニル、ノニレニル 、ランデシレニル、ドデシレニル、シクロへキシレニル、フェニレニルまたはキ シレニルを含む。

図式Ｉの反応ＩＡ、ＩＢおよびＩＣは遊離アミン化学基のカップリングを示す。

通常、これはタンパク質単位のアルファアミノ酸残基のイプシロンまたは第１級 アミン基であるものである。イプシロンアミノ基を含むアミノ酸の例はリジンと アルギニンがある。第１級アミン基をもつアミノ酸の例はタンパク質中に見いだ される典型的な２０のアルファアミノ酸を含む。その他アミノ糖またはアミノヌ クレオチドなどの別種の単量体にあるアミン基もこの反応でカンプリングされう る。

反応ＩＡを行うのに使われる式ＩＩＡの反応剤は、アミンと反応してアミドをつ くる公知のカルボン酸誘導体を含む。酸ハライド、混合無水物、活性化エステル 、カルボニルジイミダゾールから誘導されたアシルイミダゾール、ジイミド脱水 剤による対応するカルボン酸とＮ−ヒドロキシサクシンイミドの脱水反応によっ て生成したＮ−オキササクシンイミド、有機溶媒中ジイミド、五酸化リンなどの 脱水剤によるアミド生成、およびオキシ塩化リンが含まれる。これらの基は反応 式ＩＡではＸとして示されている。

一般に、これらの酸誘導体は対応するカルボン酸とＸ基反応剤との縮合反応によ って合成しうる。これらは穏和な条件下に水性ないし極性有機溶媒を用いて、反 応ＩＡに従ってアミン化学基と反応しうる。これらの反応剤の方法および使用法 は公知であり；たとえばＲｅａｇｅｎｔｓ　Ｆｏｒ　Ｏｒｇａｎｉｃ　５ｙｎｔ ｈｅｓｉｓ″、Ｌ、Ｆｉｅｚｅｒ、　Ｍ。

Ｆ’ｔｅｚｅｒ、Ｖｏｌ、１〜８　、Ｉ＋１ｉｌｅｙ　ｏｆ　Ｓｏｎ；　”　Ｃ ｒｏｓｓ　ＬｉｎｋｉｎｇＲｅａｇｅｎｔｓ　”　（１９８０年版）　、Ｐｉｅ ｒｃｅ　ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＲｅａｇｅｎｔ　Ｃａｔａｌｏｇ、Ｐｉｅｒｃ ｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ　ＩＩＩ。

およびその中に記載されている諸文献、または“Ａｄ−ｖａｎｃｅｄ　Ｏｒｇａ ｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ″Ｊ、Ｍａｒｃｈ、ＭｃＧｒａｗ　Ｈ４１ｌ（１９ ６Ｂ）を参照すればよい。

反応ＩＢは式１１Ｂのイミノエステル塩反応剤をアミン化学基とカップリングさ せてアミジンカソプリング剤連結をつくる反応を示している。この方法も公知の 技法である。この反応剤は対応するニトリルの酸性加アルコール分解でうろこと ができる。アミジン生成反応は穏和な条件下に水性ないし極性有機溶媒中で行え る。方法や技法は公知であり；例としてＬｏｃｋｈａｒ　ｔら、Ｃａｎ、Ｊ、Ｂ ｉｏｃｈｅｍ、、５３　、　８６１−８６７　（１９７５）とＰｉｅｒｃｅ　Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｃａｔａｌｏｇおよびその中の諸文献 を挙げておく。

反応ＩＣはアミン化学基の、弐ＩＩＣのアルデヒド反応剤との縮合によるビス５ ｃｈｉｆｆ塩基（イミン）生成を示す。例としてグルタルアルデヒドその他の組 織固定反応剤がある。条件は極性有機溶媒の使用と穏和な温度の適用である。こ れらの方法は公知の技法である。

図式Ｉの反応２Ａ、２Ｂおよび２Ｃはアルデヒド官能部のアミンやアミン誘導体 反応剤との縮合カップリングによるイミンやイミン誘導体の生成を示す。これら の反応剤と反応は、反応してＳｃｈ　ｉ　ｆ　ｆ塩基（イミン）をつ（る式１２ Ａの第１級アミン反応剤については反応２Ａ；反応して置換ヒドラジンをつくる 式１２Ｂの置換ヒドラジン反応剤については反応２Ｂ；そして反応してアシルヒ ドラゾンをつくる式１２Ｃのアシル、ヒドラジド反応剤については反応２Ｃを参 照。アルデヒド官能部は単量体内の１，２−ジオール（グリコール）基の酸化的 開裂によって生成されるものであるが、華量体単位鎖の開裂を起こすようなグリ コール基の酸化的開裂反応は使えない。通常、グリコール基は単量体骨核に付属 した側鎖上にみいだされるものである。例として炭水化物やデンプンならびにジ ヒドロキシアルキル、シクロアルキルおよびアシルアルキル基が含まれる。

反応２Ａ、２Ｂおよび２ｃに対する条件は水性ないし極性有機溶媒の使用と穏和 ないし中庸の温度の適用である。これらの方法や技法はよく知られたやり方であ り、たとえば＋Ｂａ５ｉｃ　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃ ｈｅｍ−ｉｓｔｒｙ　”　、、Ｒｏｂｅｒｔｓ　ａｎｄ　Ｃａ５ｅｒｉｏ、Ｗ、 八、Ｂｅｎｊ−ａｍｉｎ　（１９６５）または“口ｕａｌｉｔａｔｉｖｅ　Ｏｒ ｇａｎｉｃ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　”　、　５ｈｒｉｎｅｒ’ａｎｄ　Ｆｕｓｏｎ 、Ｗｉｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　（１９６６）を参照。

図式１１の反応３Ａと３Ｂはメルカプタン化学基の架橋剤Ｔ３Ａおよび■３Ｂと のカンプリングによるサルファイド基連結重合体の生成を示ず。反応３Ａはメル カプタン化学基のアルファハロメチルカルボニル反応剤Ｔ３Ａとの縮合反応であ り、ここにＹはハロゲンで〜あり、カルボニルメチレンサルファイドＰ３Ａが生 成する；たとえばＨ４ｘｏｎ　ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１４．４２５　 （１９７５）参照。反応３Ｂはメルカプタン化学基のマレイミド反応剤■３Ｂと のカップリングによるサクシニル３−サルファイドＰ３Ｂの生成である。

メルカプタン基はシスティン、グルタチオン、シスチンまたは同種のアミノ酸単 位の一部として単量体単位内にみいだされるものである。それらはまたＩ！類ま たは脂質の誘導体としても存在しうる。

反応３Ａのための条件は水性ないし極性有機溶媒と、ピリジンのような酸受容体 ならびに穏和から中庸までの温度であろう。反応３Ｂのための条件は水性ないし 極性有機溶媒、要すれば穏和な酸触媒、そして穏和から中庸までの温度であろう 。これらの方法や技法は公知のやり方であり、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ ｃａｌ　Ｃａｔａｌｏｇとその中に記載された文献参照。

反応４Ａと４Ｂはカルボン酸化学基とアミンまたはアシルヒドラジド反応剤との 縮合カップリングを示す。

反応剤■４Ａはジイミドまたはカルボニルジイミダゾールなどの化合物を使って 直接カルボン酸基と力、プリングできる。これについては反応ＩＡに関する前記 の説明を参照のこと。それはまた混合酸無水物、活性化エステルまたは酸ハライ ドなどのカルボン酸誘導体をつくってカップリングさせてもよい。反応剤１４Ｂ はカルボジイミドなどの脱水剤を用いてカルボン酸基とカップリングさせること ができる；反応ＩＡ参照。

単量体゛単位のカルボン酸含を置換基はカルボン酸基を直接供給することもある し、酸化してそれを供給してもよい。これらには、アスパラギン酸、グルタミン 酸などのアミノ酸残基のほかに、糖の側鎖、脂質、炭水化物の酸化形が含まれ、 不飽和カルボン酸もある。これらの方法は公知の技術であって、たとえば“　Ｏ ｒｇａ−ｎｉｃ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ″、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、Ｃｏ １１．Ｖｏｌ、　Ｉ−Ｖを参照のこと。

反応５はヒドロキシ官能部の、活性化カルボン酸反応剤■５とのエステル化を示 す。これらは式１１Ａに与えられたのと同じ反応剤を含むものである。この合成 法では、遊離の活性なアミン基をもつ単量体単位があれば、これらはまず除去可 能な保護基で保護しておくことができる。たとえば５ｃｈｉｆｆ塩基、すなわち アミン基のｐ−メトキシヘンズアルデヒドまたはヘンズアルデヒドなどの芳香族 アルデヒドとの縮合生成物をつくらせると、これはアセトン中希塩化水素で除去 できるのである。その他の公知のアミン保護基も使える。

これらのなかには、ジニトロフルオロトルエン、ｔ−ブトキシ基およびオルガノ シラン類がある。

保護したあとで、活性化された酸性反応剤を用いてエステル化を行う。この方法 でエステル化する単量体単位残基はセリン、スレオニン、ヒドロキシリジン、チ ロシン、チロキシン、ヒドロキシプロリンその他のアミノ酸残基を含むものであ る。その他の残基は炭水化物、デンプン、脂質およびヒドロキシル置換基をもつ 不飽和残基を含む。これらはヘキソース、ペントース、デキストラン、アミロー ス、グリセリン類、脂肪族誘導体、メチルヒドロキシメタクリレート、ヒドロキ シメチルアクリレートその他の同種化合物を含む。

エステル化に対する条件は水性ないし極性有機溶媒と、穏和から中庸の温度を含 む。これらの方法や技法は公知のやり方であり；たとえば、有機合成に関する前 出の論文類を参照のこと。

反応６はアジド反応剤■６からのナイトレンの炭素水素結合への挿入反応を示す 。この反応は非特異的であって単位内のどこでも起こりうる。ナイトレンの寿命 は短いから、接近しやすい炭素水素結合がまず攻撃されることになる。この反応 は付加された天然または合成ポリペプチドポリオール、ポリオレフィンおよび炭 水化物ならびに酵素で、接近容易なＣ−Ｈ結合をもち、部分活性基を含まないも ののカップリングにはとくに有用である。

反応のための条件は極性有機溶媒の使用と、３００〜ｂ たとえばＢ１５ｓｏｎ、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、＋　２５３．１８７４− ！８８０　（１９７８＞またはＰｉｅｒｃｅ　ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＣａｔａ ｌｏｇおよびその中の文献を参照のこと。

反応７は単量体単位の直接結合による重合である。

それは酵素的酸化架橋、光化学的フリーラジカル発生およびベルサルファイド、 過酸化水素および三重項酸素などの反応剤による架橋またはフリーラジカル開始 反応で行うことができる。

図　式　Ｉ ｉＡ、　ＲＮＨ２＋　Ｘ０Ｃ−Ｒ’（ＢＥ）　→ＲＮＨＣＯ−Ｒ’（ＢＥ）ｒ　 ＩＡ　ＰＩＡ １Ｂ、　ＲＮ）＋２　＋　ＩＮ　＝Ｃ（ＯＭｅ）　Ｒ’（ＢＥ）−ＲＮＨＣ（− ＮＨ）−Ｒ’（ＢＥ）Ｉ　ＩＢ　ＰＩＢ ＩＣ，ＲＮＨ２十　〇）ＩＣＲ’（ＢＥ）　→　ＲＮ＝ＣＨＲ’（ＢＥ）２Ｂ、 　ＲＣＨＯ＋　Ｈ，Ｎ−ＮＨ−Ｒ’（ＢＥ）　−ＲＣＨ−ＮＮＨ−Ｒ’（ＢＥ） １２Ｂ　Ｐ２Ｂ ２Ｃ，ＲＣＨＯ＋　Ｈ２ＮＮＨＣＯ−Ｒ’（ＢＥ）　→ＲＣＨ＝ＮＮＨＣＯ−Ｒ １＜ＢＥ）Ｉ　２ＣＰ２Ｏ ３Ａ、　Ｈ３Ｎ　＋’ＹＣＨ２ＣＯＲ’（ＢＥ）→Ｒ５ＣＨ２Ｃ０Ｒ’（ＢＥ） Ｉ　３Ａ　Ｐ３Ａ １［ １３Ｂ　Ｐ３Ｂ ４Ａ、　ＲＣＯ２Ｈ＋　ＨｚＮ　−Ｒ’（ＢＥ）　→　ＲＣＯＮＨ−Ｒ’（ＢＥ ）Ｉ４Ａ　Ｐ４Ａ ４Ｂ、ＲＣＯ□Ｈ＋　ＨＪＮＨＣＯＲ’（ＢＥ）→　ＲＣＯＮＩＮ）ＩＣＯＲ’ 　（ＢＥ）Ｉ４Ｂ　Ｐ４Ｂ ５、ＲＯＨ＋　Ｘ’０Ｃ−Ｒ’（ＢＥ）　→　ＲＯＯＣ−Ｒ’（ＢＥ）Ｉ　５　 、Ｐ　５ ６　、ＲＣＨ＋　Ｎｓ　Ｒ’（ＢＥ）　→　Ｒ−Ｃ−Ｒ’（ＢＥ）７．２Ｒ十　 直接法　−Ｒ−Ｒ 図式■のノート Ｒは単量体単位である。式Ｉの二または多官能性架橋剤は各反応に示されている 。式Ｉの反応性基のひとつ（Ａ）　は各反応について規定された。式Ｉのその他 の反応性基（Ｂ、Ｅ）は反応１−７のＡに対して示された規定のどれから選ばれ てもよく、あるいは（Ｂ、Ｅ）のうちひとつは水素であってもよい。ホモおよび ヘテロニ官能性および多官能性反応剤が含まれる。各反応の式■と式ＰのＲ１は 少なくとも２個の炭素からなる脂肪族基か芳香族基である。好ましくは、Ｒ１は 、アマケニル基、−（Ｃ’ＬＮ　；またはアシル基、−（ＣＨｚ）ｋ−ＣＪａ− （ＣＨｚ）ｌ−である：ただしｊは約２から約３０、ｋと１は別個に０ないし約 ２０である。

第１表は図式Ｉの式１１Ａ、１３ＡおよびＩ５中にあるＸ、Ｙおよびｘ′として 働くことのできる基のタイプをリストしたものである。

第　１　表 １、Ｘ基は次のものを含む： ハライド、とくにｔＪ、１３ｒ、Ｉ ２．４−ジニトロフェノキシ（活性化エステル）ｐ−）ルエンスルホニロキシ ピバロイロキシ ｔ−ブトキシカルボニロキシ アセトキシ。

２、Ｙ基は次のものを含む： α、Ｂｒ、Ｉ。

３、ｘ′基は次のものを含む： ハライド、とくにα、Ｂｒ、１ ２．４−ジニトロフェノキシ（活性化エステル）ビバロイロキシ １−、ブトキシカルボニロキシ アセトキシ。

単量体単位は適当な基質上反応して着色、けい光、発光、電子濃化または放射性 生成物を生ずるような酵素であってもよい。また、その酵素は着色、けい光また は発光基質と反応してそれを消滅させるものであってもよい。色、けい光または 発光の発生または消滅心ま直接の酵素触媒の結果生ずるものであってもよく、ま たは酵素が中間体をつくり、その中間体が反応連鎖の中に入って色、けい光また は発光の発生または消滅に関与するものであってもよい。

電子濃化性または放射性基質が使われる場合には、酵素（よそれを固定化するよ うに働くものとする。これは基質を酵素に対して不溶で化学的に反応性のものる こするか、固定化のための物理的特性を付与すること心こよって行うことができ る。このタイプの可視化重合体では、酵素反応によって固定化された放射性の量 または電子濃化物質の存在量の電子顕微鏡測定Ｇこより微量の標的の分析を行う ことになる。この種の酵素の例むまペルオキシダーゼ、アルカリ性または酸性ホ スファターゼ、ガラクトシタ−ゼ、グルコースオキシタ゛−ゼ、ＮＡＤＰアーゼ 、ルシフェラーゼ、カルボキシペプチダーゼ 単量体単位はまた天然または合成ポリペプチド、ポリオール、ポリオレフィンま たは炭水化物頻で、０ずれもイ］加れれたものであってもよし）。これらしよポ ＩＪアミド骨核、ポリエーテル骨核、ポリビニル骨）亥、または多糖類骨核をヘ ースとするものであってもよし）。ポリアミドについては、骨核をつくるのＧこ 用０るアミノ酸またはジアミン化合物とシカフレポン酸（よ無官能性で一゛′　 待表昭６０　−　５　０１５　７　３　（１のあってもよく、すなわち適当な官 能性基に終わるメチレン単位額であってもよく、あるいはそれは側鎖官能性を供 給することになる基で置換されてもよい。例としては、アミノ酸にはグリシン、 アラニン、セリン、リジン、アスパラギン酸その他がある。ジカルボン酸とジア ミンの例はアリレン基中に少な（とも６個の炭素原子をもつか、アルキレン基中 に１〜２０個の炭素原子をもつアリレンまたはアルキレンジカルボン酸、および アリレン基中に少なくとも６個の炭素原子をもち、アルキレン基中に１〜２０個 の炭素原子をもつアリレンまたはアルキレンジアミンを含む。１例はポリ（３− アミノプロピオン酸）、ポリグリシン、ポリ（グリシル−リシン）、ポリ　（Ｎ −　（アミンへキシル）アリピックアミド）、ポリ　（Ｎ−（アミノブチル）テ レフタルアミド）その他を含んでいる。

ポリエーテルについては、ヒドロキシル置換基をもった、あるいはもたないエポ キシドと／またはオキシ環状化合物が骨核形成体として用いうる。酸性縮合がオ キシド化合物を結び付けることになる。また、ポリオールはヒドロキシ置換基付 きのポリ　（ビニル）骨核をもっていてもよい。これらはアルキルアルコール、 ブチンジオールその他のビニル／フリーラジカル重合によってつくってもよい。

ポリビニル化合物には、化学基置換のある、またはないビニル化合物が骨核形成 体として用いうる。アクリルアミド、アクリル酸、マレイン酸、硫化アルキル、 アクリロニトリル、アクリル酸メチル、アクリル酸ヒドロキシエチル、アルケニ ルアミン、アクロレイン等の化合物のビニル／フリーラジカル重合がポリオレフ ィン単量体をつくることになる。

多糖類については、単糖形成体のへミケタール縮合によるグリコシド結合が炭水 化物骨核生成プロセスとして用いうる。メトキシセルロース、ポリ　（グルコー ス）デンプン、デキストリン、ポリマルトース、アミロースなどの炭水化物が例 として挙げられる。

化学的タグは、天然または合成ポリペプチドポリオール、ポリオレフィンおよび 炭水化物中に存在する置換基と化学的に結合する、公知の、着色、け０光、発光 、放射性および電子濃化プローブを含む。これら番よ図式Ｉや第１表に概述した 単量体の適当な官能基と反応する、カルボン酸誘導体置換基、スルホン酸置換基 、イミノエステル置換基、マレイミド置換基、アルデヒド置換基、アジド置換基 およびアミン置換基をもつグローブを含む。そのプローブは単量体の化学基また 番ま骨核部と１回だけ反応できるように、二官能性よりＧよむしろ単官能性であ るものとする。カラータフ゛の例４アジドインジゴ染料と、塩化スルホニル置換 基をもったコンゴーレッドがある。けい光タグの側番まアジドまたは塩化スルホ ニル反応性置換基をもったフｌレオレセン、３−アジド−（２．７）−ナフタレ ンジスルホネートとローダミンを含む。放射性タグの例はヨウ素化できる木材試 薬（メチルｐーヒドロキシヘンジズイミテ−トｘＩｃｅとｐ−ヨードヘンゼンス ルホニルクロライドを含む。電子濃化タグの例はコロイド状金、コロイド状銀、 フェリチン、金属結合タンパク質および反応性鉛塩を含む。

本発明の可視化重合体の単離と精製は、重合体単離に用いられる公知の技術で実 施することができる。これらは透析、親油性化、クロマトグラフィー、電気泳動 、遠心分離、電解質調整または溶媒親脂質性による沈デンその他を含む。

可視化重合体と検出剤の担持配列は直接でも間接でもよい。直接担持配列は二官 能性または多官能性架橋剤によって可視化重合体に共有的に結合した検出剤をも つものである。一般に、結合は重合体の単量体単位の連結に対して与えられた図 式Ｉおよび方法に従うものである。これらの方法はー・般に公知であり；たとえ ばに、Ｐｅｔｅｒｓら、Ａｎｎ．　Ｒｅｖ．　現−９−ｃｌ＋ｅｍ−、、４　６ 　、５　２　３５　５　１　（１　９　７　７）　；　Ｆ．Ｗｏｌｄ，　“Ｍｅ ｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｅｎｚｙ−ｍｏｌｏｇｙＸＸＶ”　ＰＰ　６２３　６５１　 （１９７２）またはＭ．Ｄａｓ．ら、Ａｎｎ，　Ｒｅｖ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　 Ｂｉｏｅｎｇ．＋　８　１６５−１９３　（１９７９）参照。可視化重合体でと 同しように、検出剤の化学基または骨核部との共有結合は、その標的を検出する 能力を妨害しない範囲の試薬で起こるべきものである。これは上に与えられた方 法のどれか、とくにエムペリツク（ｅｍｐｅｒｉｃ　）な方法によって測定すれ ばよい。

間接的な担持配列は２つのタイプがありうる。第１のタイプでは、検出剤が多価 で、可視化重合体にも標的にも親和性をもっているものである。たとえば、それ は可視化重合体の単量体単位と架橋反応する多価抗体をとりあげ、適量の抗体と 重合体を使うことによって抗体の親和性部位の少なくともひとつが解放された状 態にあるようにして、行うことができる。可視化重合体はまた多価検出剤と錯体 をつくる配位子に結合させてもよい。これは同種の担持配列をつくることになる 。

第２のタイプの間接的な担持配列では、検出剤と可視化重合体との間に、中間体 の配位子結合性化合物が介在しているのである。それは特定の配位子に対する高 度の親和性を発揮するものであって、抗体、レクチン、アビジン、ストレプトア ビジン、ＤＮＡレプソサタンパク質、高親和性酵素、連鎖特異性ポリヌクレオチ 、ド結合タンパク質または補体ポリヌクレオチド連鎖を含むものである。試薬と 重合体は適当な配位子で相応して標識化されているものである。配位子は図、式 Ｉの二または多官能性架橋剤Ｒ’（ＡＢＥ）類似の連結剤によっテ検出剤と重合 体に結び付いてもよい。連結剤の検出剤や重合体への結び付きは図式Ｉに従う反 応剤力。

プリングに対して与えられた方法に従うものとする。

また、配位子は図式Ｉの二または多官能性架橋剤Ｒ’　（ＡＢＥ）の反応性基に 置き換えてもよい。

代わりに、配位子は検出剤や重合体に直接的に共有結合していてもよい。すなわ ち、配位子はアミン基、メルカプタン基、カルボン酸基、ヒドロキシ基、アルデ ヒド基または（、−Ｈ基を含んでいてもよい重合体や検出剤の化学基に結合して もよい。図式Ｉに従って与えられた技法や反応剤はこの目的のために用いられる ものであり、配位子上に存在する反応性基の種類によって適当な反応が選ばれる ものである。

本発明の担持配列および錯体の調製法は前述の背景に与えられた周知の技法に従 う。例をあげると、ビオチン、イミノビオチン、ポリヌクレオチド連鎖、酵素基 質、糖、アルキル基に１〜２０炭素原子を有する２゜４−ジニトロフェノール、 ２．４−ジニトロフェニルアルキルカルボン酸などのハプテン類、およびそれら のカルボン酸誘導体などの配位子の使用を含む。）１ブテン類のその他の例はア ルキル基中に１〜２０個の炭素原子をもつ２，４−ジニトロフェニルアルキルア ミン、フェニルア、ルセネート、イニストールおよびトリニトロベンゼンヲ含ム 。

このタイプの担持配列と錯体の好例は、特異性天然ポリヌクレオチド連鎖用検出 剤としてのポリヌクレオチドの補体ストランド使用に基づいている。配位子結合 化合物としてアビジンまたはストレプトアビジンが使われ、配位子として官能化 されたビオチンまたはイミノビオチン誘導体が使われる。ビオチンまたはイミノ ビオチンを可視化重合体やポリヌクレオチド検出剤に結合するには直接でもよく 、あるいは連結剤の基を利用するのもよい。これらの方法は技術的には公知であ ってＨｌａｎｇｅｒ　ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ’１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、７８．６６３３−７　（１９８１）参照のこと；そして二官能性架橋剤 の一端がビオチンまたはイミノビオチンと反応したであろうことを別とすれば、 図式Ｉに示した方法に従う。従って、錯体はアビジンまたはストレプトアビジン −（ビオチンまたはイミノビオチン配位子）−可視化重合体を含んでいる。さら に付は加えれば、担持配列はビオチンまたはイミノビオチン標識化ポリヌクレオ チド検出剤を含んでいる。

この例を利用する本発明の方法は以下のように実施することができる。検出すべ き天然ポリヌクレオチドの単離された二重ストランド、たとえばウィルスのＤＮ Ａを、各ストランドに沿う任意の点でＤＮＡアー・ゼを用いて分解ないし切断す る。標識化されたヌクレオチド単量体は次いでポリメラーゼ酵素と、型としての その他の会合ストランドを用いて断片に翻訳される。

あるいはまた、補体ストランドを直接ビオチンラヘル化合物で標識化することも できる。次いで標識化されたポリヌクレオチドの補体対は、検出すべきポリヌク レオチドを含むと予測される未知の天然ポリヌクレオチドの変性混合物で変性さ れ、混合される。もしそれがあれば、ハイブリッド形成が起こり、標識化した二 重ストランドは重合体錯体で可視化されうる。

錯体の第２の好例はＰＡＰまたはＡＢＣ錯化法のための背景説明に与えられた方 法、あるいはＬ　ａ　ｎ　ｇ　ｅ　ｒらの上述法から誘導される。この例では、 アビジンまたはストレプトアビジンが中間体配位子として用いられ、抗体、レク チン、または連鎖特異性ポリヌクレオチド結合タンパク質が検出剤として用いら れ、そしてビオチンまたはイミノビオチン化合物がアビジンまたはストレプトア ビジンとともに可視化重合体錯化配位子および検出剤として用いられる。

これら２つの好ましい例のどちらかで、ビオチンまたはイミノビオチン化合物は それぞれアミド結合またはエステル結合またはエステル結合形成カンプリング剤 を使うことによって、重合体と試薬のアミンまたはヒドロキシ基と直接カップリ ングさせてもよい。これらの方法は図式■の反応１と５に従う。それはまた上述 したような連結剤基を通じてカップリングさせてもよい。連結剤基は、２つの反 応性基のうちひとつがビオチンまたはイミノビオチンとカンプリングするアミノ またはアシルヒドラジド基であるという点を除けば、図式Ｉの二官能性架橋剤（ Ｒ’ＡＢＥ）に類似のものである。

本発明の可視化重合体は標的分子の微小量の検出に用いうるちのである。これら の分子は組織や体液などの生物体中にも、人工あるいは合成系中にもみいだされ うる。例示すれば、血液、リンパ液、尿、便、器官組織、たとえば肺、肝臓、皮 膚、じん臓その他、微生物、植物組織、培養細胞、ハイブリ・ノド細胞、組み換 えＤＮＡをもつ細胞、合成ポリペプチド混合物、固定化酵素系、合成りＮＡその 他の生物体物質がある。

標的分子は検出剤との親和性を生じうる無機あるいは有機種を構成する可能性が ある。好適な標的は前記の生物体物質およびその系中にみいだされるものである 。例をあげると、タンパク質、脂質、炭水化物、リン脂質、脂肪、ヌクレオチド 、ヌクレオシド、ヌクレオシド塩基、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、発がん 性物質、医薬品、抗生物質、治療剤、制御物質、重合体、シリコーン樹脂、有機 金属化合物、重金属、金属−タンパク質錯体、有毒無機塩類、その他生物有機体 によってつくられたり、それに影響を与える試薬あるいは化合物、またはそれら から誘導された物質がある。

一般に、検出剤と標的の組み合わせや培養の方法は周知である。それらは親和性 および免疫診断法に用いられる方法に従い；たとえば１１．Δ、５ｔｅｒｎｂｅ ｙｅｒ、“Ｉｍ−ｍｕｎｏｈ、ｉｓｔｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　”　（上述）を 参照のこと。例示すると、緩衝水溶液中に計量された試薬と標的混合物を室温か ら約３７℃の温度で、５分〜１８時間保持すると、接合が起こる。同じ条件下で 可視化重合体またはその錯体を加えると可視化が生ずる。最後に、試薬を可視化 重合体に結合させようとするならば、同じ手法に従えばよい。

前述の検出目的に可視化重合体を使うことは、ごく微量の標的分子の検出が可能 になるので有利である。

それは病気の状態を示す体液やＭｉ繊織中生物体生成物の同定のための分析技術 として、診断医学研究所で採用できるものである。それらの例をあげると、成長 ホルモンの異常分泌、がんを示ずヒトゴナドトロピンの存在、ウィルス侵入の検 出、ホルモンの定量および正常な酵素レヘルの定量がある。また、それは正規の 体液および組織の化学分析を行うのに使うことができるし、生化学的物質の同定 用ツールとして生化学的研究室で採用してもよい。

可視化重合体は合成タンパク質またはポリヌクレオチドの研究に使って、合成、 半合成または天然タンパク質や合成、組み換えまたは天然ポリヌクレオチドを同 定することができる。インシュリン、インターフェロン、入ＣＴＨ、ゴナドトロ ピン、オキシトシン、士垂体ホルモン、ＬＨ，ＦＳＨなどの有用タンパク質の調 製ないしは大量生産の過程において、組み換えＤＮＡまたはハイブリドーマと同 じ技術を用いて各種の応用がみいだされるのである。

検出剤と可視化重合体錯体の担持配列は前記分析を行うのに用いた形のものでよ い。重合体が標的との担持配列会合から多重シグナルを与えるから、化学的増幅 かえられることになる。重合体と配位子結合化合物との錯体が使われる担持配列 の好ましい形においては、重合体の検出剤各分子への多重価の多価配位によって 、重合体によるシグナル増幅は一層太き（成るのである。

従って、抗体または補体ポリヌクレオチド連鎖検出剤、検出剤と重合体上にビオ チンまたはイミノビオチン標識、そしてアビジンまたはストレプトアビジンを使 う好ましい実施態様においては、フェムトモル（１０−１５）量の検出が可能と なる。これはまたある程度は、ビオチン標識化合物と重合体のカップリング剤の 両方に対して、鋭敏な皐量体華位系と適当な炭素鎖長の連結剤とを使用すること にも依存するのである。ひとつの例ばスヘリン酸の活性ジアシル誘導体とイプシ ロンアミノ基結合してえられた可視化重合体とカップリングした酵素アルカリ性 ボスファターゼまたはホースラディツシュ（西洋わさび）ペルオキシダーゼの使 用と、炭素鎖長６〜１４の連結剤部をもつビオチン標識の使用本発明の重合体、 錯体および担持配列は固体または液体検出システムおよびキットの完成部分とし て配合することができる。この方法で比色、けい光、発光および放射性システム が調製できる。このようなシステムとキットは検出用諸成分を含むものであって 、すなわち、重合体、その配位子との錯体、配位子結合化合物、および検出剤な らびに適当な化学品、試薬および一定に計量された溶液、さらに標準化された濃 度などからなる。たとえば、基質との酵素作用によって着色物質を生ずるのに重 合体を使う可視化手法を行うならば、そのシステムとキットはこの分析を行うに 必要な化学品、基質および反応剤を含むことになる。これらの物質は計量化され て存在するから、着色生成物による吸光は標準Ｂｅｅｒ則の数学式に従って、検 出すべき標的の濃度測定に使うことができる。吸光度対濃度の標準グラフを利用 することもできるが、通常は、対照および規準として重合体の基質との標準反応 が用いられるものである。

けい光、発光および放射分析は同しようなやり方で行うことができる。標的と会 合した担持配列中の重合体によって生したけい光、発光または放射活性の強度は 適当な電子機器によって測定されるものである。必要な反応剤や化学品もまた存 在するものである。計量化された各成分を用いれば、強度値は標準のＢｅｅｒ則 の数学式を使って標的の量と関係付けることが可能である。

これらの系において、検出剤−可視化重合体錯体の濃度は、検出すべき標的全部 と会合するのに十分な量がテスト溶液中に用いられるのである。好ましくは、そ の濃度は過剰量であるのがよい。標的は沈降、遠心分離、あるいはその他の分離 法、たとえば高圧液体りロマトグラフィー、ゲル浸透クロマトグラフィー、電気 泳動、沈でん、薄層クロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフィーその他同 効技法などの技術によってほぼ分離することが可能である。しかし、本発明の目 的のためにはこれは必要不可欠のものではない。標的−検出剤複合体の生成によ ってシグナル生成反応が始まり、次いで可視化重合体−検出剤会合配列が形成さ れ、この配列から可視化シグナルを測定することになる。シグナル強度を標準図 表と比較して標的の量を決めるのである。免疫分析の分野で知られている複合体 −錯体交換法などの他の技法も使うことができる。

前述の液体および固体分析法のすべてについて、定性的検出も行うことができる 。この目的は定量ではなくて、検出すべき標的の存否をきめることであるから、 標準化を用いる必要はない。定性的技法は一般に前述の定量的技法のやり方に準 じて行えばよい。

本発明は実施例を用いてさらに詳細に説明することにする。これらの実施例は限 定的なものではなく、実施例にＪよって示されたのと類似の他のやり方は本技術 に携わる者にとっては容易に知られるものである。測定値はすべて特記しない限 りはメーター制で記されている。

実　施　例 実施例中に用いられた略号と頭字語は次の通りである。

Ｂｌｏ−４−ｄＵＴＰ、Ｂｉｏ−１１−ｄＵＴＰおよびＢｉｏ−１６−ｄＵＴＰ 　；ＴＴＰの類似体で、それぞれ４．１１および１６個の炭素からなる連結体ア ームによってピリミジン環のＣ−５位に連結されたビオチン分子を含む。

Ｂｉｏ　４−ＤＮＡ、Ｂｉｏ−１１ＤＮＡおよびＢｉ。

−１６−ＤＮＡはそれぞれＢｉｏ−４、Ｂｉ’ｏ−１ｆまたはＢｉｏ−１６ｄ　 ＵＴ　ＰＷ４似体で調製したＤＮＡプローブ。

ＤＮＡはポリ　（デオキシリボ核酸）。

ＩｇＣは免疫グロブリンＧ画分。

１）ＳＳはジサクシニミジルスベレート。

ＢＡＣ３Ｅはビオチニル−イプシロン−アミノカプロン酸Ｎ−ヒドロキシサクシ ンイミドエステル。

ＮＭＺＴ緩衝液は４８頁で定義されている。

ポリＡＢＡＰ錯体はアビジン−ビオチン化アルカリ性ホスファターゼ重合体錯体 ＤＡＢは３．３−ジアミノベンジジン ＥＡＣはエチルアミノカルバゾール 次の実施例は腸のアルカリ性ホスファターゼの可視化重合体の合成とアビジン（ またはストレプトアビジン）酵素重合体錯体の構成を示すものである。これらの 重合体はこれまで知られている免疫試薬あるいは親和性試薬より２０〜５０倍も 高感度な可視化を与えるものである。またニトロセルロースフィルター上に固定 化した標的連鎖にハイブリッド化したあと、ビオチン標識化ＤＮＡプローブを可 視化する迅速かつ高感度なやり方と、ガラススライドに適用後組織切片中のタン パク質抗原を検出する方法も説明される。

ここに選ばれた実施例と手法はヒトの胎盤ＤＮＡに関連した遺伝子連鎖および悪 性しゅよう関連のペプチドホルモンの検出に本発明を応用したものである。これ らはヒトの胎盤ＤＮＡ中のアルファならびにベータグロビン遺伝子とヒトの絨毛 膜ゴナドトロピンである。

ヒトの遺伝子の分析は遺伝障害の出生前診断に用いうるし、ｈＣＧＴの分析はが んのしゅよう胎（ｏｎｃｏｆｅ−ｔａｌ　）マーカーとして用いうる。

親和性精製ラビット抗ビオチンＩｇＧはＬａｎｇｅｒ　−５ａｆｅｒ、　Ｐｒｏ ｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　７９゜４３８１　（１９８２ ）記載に従って調製された。ボートの抗ビオチンＩｇＧの硫酸アンモニウム画分 はＥ　ｎｚ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｉｎｃ、、Ｎ、Ｙ、によって供給された。ビオチン化うビット 抗ゴートＩｇＧ、ビオチニル化ゴート抗ラビットＩｇＧ、およびアビジンＤＨ− ビオチニル化ホースラディツシュペルオキシダーゼ錯体（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣキット）　はＶｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓｊｎｃ、＋Ｂ’ｕ ｒｌｉｎ−ｇａｍｅ、ＣＡから購入またはギフトとして提供された。

ストレプトアビジン、Ｆｌｏｆｆｍａｎ、　Ｐｒｏｃ、１Ｊａｔ１．　Ａｃａｄ 。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７７．４６６６４１９８０）　はＢｅｔｈｅｓ−ｄａ　Ｒｅ５ ｅａｒｃｌｉ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅ ｒｇ、　Ｍ　ＤかＥｎｚｏ’　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｉｎｃ、のどちらががら入手し た。カーフの腸内アルカリ性ホスファターゼ（Ｃａｔ、Ｎｏ、５６７−７５２） とパンクレアチンＤＮＡ５ｅタイプ■はＢｏ−ｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｈｅｉ ｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｔｎｄがら購入した。

ビオチニルイプシロン−アミノカブロンＭＮ〜ヒドロキシサクシンイミドエステ ルはＣｏ５ｔｅｌｌｏ　ラ、Ｃｌ１ｎ。

Ｃｈｅ’ｍ、、２５．１’５７２（１’８７９）に従って合成された。ジサクシ ニミジルスベレートはＰｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉ　−ｃａｌ　Ｇｏ、、Ｒｏｃｋ ｆｏｒｄ、ＩＩＩの製品であった。制限酵素エンドヌクレアーゼと大腸菌ＤＮＡ ポリメラーゼ■はＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ、、Ｂｅｖｅ ｒｌｙ、ＭＡがらえられた。

アガロース（タイプ■）、牛の血清アルブミン（ＢＳＡ、画分■）、５−ブロモ −４−クロロ−３−インドリルホスフェートｐ−トルイジン塩、カタベリン遊離 塩基、３．３１−ジアミノヘンジジンテトラ塩酸塩、フィニル（タイプ４００） 、エチルアミノカルバゾール、にしんの精子ＤＮＡ　（タイプ■）、ニトロブル ーテトラゾリウム（グレード■）、およびポリビニルピロリドン　（ＰＶＰ−４ ０）　はＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｇｏ、、Ｓｔ、Ｌｏａ、ｉ’ｓＭＯか ら入手された。ヒトのグロビン遺伝子連鎖を含むプラスミドはエール大学のＳｈ ｅｒｍａｎｗｅｉｓｓｍａｎ博士から提供を受けた。ＪＷＩ　Ｏ１は０．４ｋｂ ｐ　ｃＤＮＡアルファ−グロビンブローンであり、ｐＨｂｃ６はｐＢＲ３２２中 にヘ−タグロビン遺伝子を含む５．２ｋｂｐ遺伝子断片である；　Ｆｕｋｕｍａ ｋｉ、Ｃｅ１ｌ　、２８．５８５（１９８２）、またプラスミドｐＭＭ９８４は 完全な５．１ｋｂゲノムのパーポウイルス、マウスの微小ウィルス（ＭＶＭ）が ｐＢＲ３２２中にクローン化されたものである。このプラスミドはＭＶＭ連鎖イ ンサート内に単−Ｘｈｏ１部位を含んでいる。ヒトの胎盤ＤＮＡはエール大学の ５ｃｏｔｔ　Ｖａｎ　Ａｒ５ｄｅｌｌ　提供であった。

腸内アルカリ性漣スファクーゼの重合とビオチェ１カーフの腸内アルカリ性ホス ファターゼをジサクシニミジルスへレート（１）ＳＳ）架橋によって重合した。

１０■／−溶液として市販されている酵素をシラン化ガラス製反応容器またはシ ラン化ＥｐｐｅｎｄＯｒｆチューブ中、水冷ＮＭＺＴ緩衝液（３Ｍ　ＮａＣｆ、 １ｍＭ　ＭｇＣｌ２．０、１ｍＭ　ＺｎＣｌ２．３０ｎＭ）リエタノールアミン 、ｐ。

７．６）で１■／ｍｌに希釈した。以後の全反応は４℃で行われた。穏やかにか くはんしながら、ＤＳＳの５■／ｍｌジメチルホルムアミド溶液を２つの同しア リコート（３０〜６０秒間隔）に加えた（酵素溶液１０ミクロール／ｍｌ）。酵 素に対して１９モル倍過剰のＤＳＳを含むこの溶液を２０分間かくはんすると、 雲状の沈デンが生じた。１０ミクロ−ルアリコートのカダベリン遊離塩基（ＮＭ ＺＴ緩衝液中０．１　ｗｒ　／　ｍｌ　）を１０分間隔で４回反応混合物に加え た。次いで、各反応−当たりさらに３０ミリクロールのカダベリン溶液を加えて ＤＳＳ−カダベリン溶液を当モルにした。さらに１０分間かくはん後、未希釈の カダヘリン遊離塩基２ミクロールを加え、混合物をさらに３０分間か（はんした 。

次いでえられた透明な溶液をＮＭＺＴ緩衝液に対して徹底的に透析した。（重合 とがダヘリン処理はしばしば２回繰り返されたが、この追加工程は、１回目およ び２回目重合の酵素錯体の標的連鎖検出感度がほぼ等しいから、重合体の大きさ をそれほど増大したとも思えなかった。） 透析ハング中に存在する酵素１■当たり２０■／ｍｌのＢＡＣ３Ｅジメチルホル ムアミド溶液１０ミクロールを加えて、単量体形ないし重合体形のアルカリ性ホ スファターゼを６０倍モル過剰のビオチニル−イプシロン−アミノカプロン酸Ｎ −ヒドロキシザクシンイミドニス゛チル（Ｂ　Ａ　ＣＳ　Ｅ）と反応させた。バ ッグを４℃で２時間ロータリーシェーカー上で振とうさせたあと、反応混合物を 再びＮ　Ｍ　Ｚ　Ｔ緩衝液に対して徹底的に透析した。最終濃度０．０２％（Ｗ ／Ｖ）になるまですｌ・リウムアジドを加え、ビオチニル化酵素を使用するまで ４℃で貯蔵した。

、：Ｌ見ジンービオチニノ？化アルカリ性ホスファターゼビオチニル化酵素重合 体をわずかに過剰のアビジンと混合して、フィルター上でハイブリッド化したビ オチニル化プローブと直接相互作用しうる錯体をえた。

Ｓ／Ｎ比を最適化するタンパク質混合物はニトロセルロース上にスポットしたア ビジン−ＤＨとビオチニル化したボートのＩｇＧ間の識別に関して、各種のタン パク質混合物の能力を分析することによって経験的にめた。タンパク質レシオは ビオチニル化１ｇＧとは強く反応するが、アビジン−ＤＨスポットからのシグナ ルは、あるにしてもきわめて少なくなるように調整された。ポリＡＢＡＰ錯体の 成分組成は、アビジン−Ｄ　Ｈ’１７８度を一定としてビオチニル化酵素重合体 の量を変えながら、ニトロセルロース上にスポットしたＢｉ。

−１５−ＤＮＡサンプルに対して、高感度ならびに特異性に関してさらに最適化 された。最大特異性および感度を確保するために、酵素重合体の新註・ノドごと に最適議ンバク質レシオが確定された。アビジン−Ｄ　Ｈまたはストレプトアビ ジンを使って酵素錯体をつくったが、どちらのビオチン結合性タンパク質でつく った錯体も同し結果を与えた。

用いたポリＡＢＡＰ錯体は次のようにして合成した：アビジンーＤ　Ｈ（１，８ ｍｇ／ｍりをＡ　Ｐ　７．５緩衝液（０，Ｉ　Ｍ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＪ、、ｐＨ ７，５，０，１Ｍ　Ｎａ（Ｊ、　２ｍＭＭｇＣ１ｚ　、０．０５％（Ｖ／Ｖ）　 ）リド７Ｘ−１００）で希釈し、７．２マイクロｇ／ｍｌにした。ウシの血清ア ルブミン（３％：Ｗ／Ｖ）のＡ　Ｐ　７．５緩衝液溶液であらかじめすすいだき れいなホウケイ酸ガラス管にタンパク質を加えた。次いで、ビオチニル化アルカ リ性ホスファターゼ重合体（０，９２ｔＩｇ／　Ｊ、ＮＭＺＴ緩衝液）を加えて 最終濃度１．８マイクロｇ７ｍｉとし、少なくとも１゜分装置いて錯体形成を進 めてから使用に供した。

劣甚糞士 Ｄｏｔのしみ−（ｂ　ｌ　Ｏｔ　）　（７）　８ｍ　！！ｉ！Ｘｈｏｌ消化によ り線状化した、又はＢｉｏ−１１又はＢｌｏ−１６−ｄＵＴＰの基質で欠損（ｎ ｉｃｋ）翻訳したブーｙスミドｐＭＭ９８４．ＤＮＡを、０．３　Ｎ　ＮａＯＨ 及び剪７断錬精子Ｄ　Ｎ　Ａ　１．５■／−を含有するｐＨ７，５のトリス二（ Ｊ５０ｍＭで一連の希釈を行なった。適当な希釈液を氷上で冷３ＮＨＣ１で中和 し、５マイクロリツトルのアリコートをサランランプの上面上のＢＡ−８５ニト ロセルロースの゛フィルターのシー）　（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ及び５ｃｈｅｕ ｌｌ　、Ｋｅｅｎｅ　ＸＮ　Ｈ）上に直接、スポットした。

フィルターを風乾し、８０°Ｃで４時間、焼き、切断して斑点当りプラスミドＤ 　Ｎ’Ａ　Ｏないし１２８ｐｇの範囲内の一連の希釈液を含有するストリップを 作った。

５ｏｕｔｈｅｒｎのしみの調製 適当な６額厚みのアガロースゲルを水平電気泳動装置で作り、ＤＮＡ資料をＡｌ ｗｉｎｅ、等、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ。

６８．２２０　（１９８０）が記述しているようにして電気泳動に付した。ＤＮ Ａを、Ｗａｈｌ等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｒ、　Ｕ　Ｓ　Ａ、７６．３６８３　（１９７９）の鮫肌プリン化工程を行 った後、５ｏｕｔｈｅｒｎが記述し、Ｔｈｏｍａｓ、　Ｊ。

ようにして、あらかじめ２０ＸＮａ（Ｊ／クエン酸塩を飽和させたニトロセルロ ースのシート（ＢＡ−８５又は５ａｔｏｒｉｕｓ　１１３３６　）に移した。ゲ ルの下の液溜めとしての、２０ＸＮａ（Ｊ／クエン酸塩で飽和した３ｃｆｆＩ厚 みの発泡スポンジを用いて完全な移行を確実にした。

ヌ」Ｅｌ」ニニ１− Ｒｉｊ　ｂ　ｙ等、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　、１１３．２３７　（１９７７） が記述したのと実質上、同様にして、プローブを欠損翻訳により作った。検出す べき二本鎖ＤＮＡの単離体を、ヌクレオチド残基を５′ホスホリル末端から除去 しながら、ＤＮＡ鎖中の欠損又は破損の３“ヒドロキシ末端のヌクレオチド残基 カップリング反応を接触する大腸菌ＤＮＡポリメラーゼを用いて欠損翻訳した。

この相補性ＤＮＡ鎖は鋳型として役立った。この方法はＤＮＡ二本鎖への標識ヌ クレオチド残基の添加を可能にした。ついで鎖を変性したところ、各序列は未知 よ、　混合物中の天然ＤＮＡ鎖の相手との交雑に対する相補として役立った。

二　この方法により、反応混合物（２０−２００マイクロリツトル）は４０マイ クロｇ／−のＤＮＡ、２００単位／ｍ１（７）ＤＮＡポリメラーゼＩ　、ｏ、　 ＯＱ　５　フィクロｇ／ゴのＤＮＡアーゼ（欠損をつける酵素）、ｐ）１７．５ の５０ｍＭのトリス−α、５　ｍＭ（７）Ｍｇｃｌ＝　、５０　？　イクＯｇ／ ｍ！＋７）ＢＳＡ、各に５（Ｊ”’？イクロｍのｄｃａｐ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ 及びＴＴＰ　（Ｐ−Ｌビオケミカルズ、Ｉｎｃ、、ミルウォーキー、ＷＮ）又は Ｂｉｏ”　ｄＵＴＰ同族体を含有した。Ｂｉｏ　−４−ｄ　ＵＴＰ、　Ｂｉｏ　 −１１−ｄＵＴＰ及びＢｌｏ−１６−ｄＵＴＰをＬａｎｇｅｒ、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ　Ｓ　Ａ　、７　Ｂ、６６３３　（１９８１−） に依る方法に依り合成した。Ｂｉｏ−ｄＵＴＰ同族体を含有する欠損翻訳反応は １４℃で２時間、培養し、一方ＴＴＰを用いる応のいくっがは２００Ｃｉ／ｍｌ のアルフｙ　−”Ｐ　−’ｄ　ＣＴ　Ｐ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ、４１０Ｃｉ／ミ リモル）を含有した。高い特定的放射能プローブは、５マイクロｍのＴ’ＴＦ’ 及びアルファー”Ｐ−ｄＡＴＰ及び１０００Ｃｉ／　ミリモル（八＋ｎ’ｅｒｓ ｈａｍ）を用いて上述のようにして作った。

ｌ」Ｌ交９ｍ’＆’墾９　ｍ　＋７１　Ｉｋ　（＋ビオチン標識交雑プローブを 用いた場合、下に概説した一般的記録（ｐｒｏｔｏｃｏｌ　）が最適であること が見出された。フィルターを、４５％（Ｖ／Ｖ）の脱イオシホルムアミド（電導 度１０　ＭＨＯ、ｐＨ６，５以下）、５ＸＮａ（ＪＣｉ’ｔ　Ｄｅｎｈａｒｔ溶 液；　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏ　ｈｙｓ、Ｒｅｓ、ｃｏｍｍ、、　２３．６４１ 　（１９６６）、ｐＦ＋６．５．２５ｍＭのＮａＰＯ，緩衝液及び超音波処理し た錬の精子ＤＮ’Ａ（２５０−５００マイクロｇ　／　ｍｌ　＞を含有する混合 物を用いて、密閉プラスチック袋中で、Ｗａｈｌ等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、７６．３６８３　（１９７９）に依り、４２°Ｃで２−４時間、予備交 雑した。交雑緩衝液は４５％（ν／ν）のホルムアミド、５Ｘ　ＮａＣｌ　Ｃｉ ｔ、　Ｉ　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、Ｉ）Ｈ６，’５の２５ｍＭのＮａＰＯ４ ，１０％の硫酸化デキストラン（５０％（、Ｗ／ｖ）原料からの２０％の最終審 として添加）　、２５０−５００ｇ／−の超音波処理した錬の精子のＤＮＡ及び Ｂｉｏ　−１６−ｄ　ＵＴＰで欠損翻訳した、２００−５００ｎｇ／ｍＺのＤＮ Ａプローブ−を含有した。担体及びプローブのＤＮＡは添加直前に熱変性した。

フィルター１００ｄ当り１０ｍｆの交雑混合物を用い、交雑反応を３０−１８０ 分間、（密閉袋中で）４２℃で培養した。単一コピーの哺乳類の遺伝子の序列を 解析するため、交雑を概して、０．８Ｘ１０−”　コント（Ｃｏｔ）になるよう に行った（例えば、プローブ濃度３５０ｎｇ／Ｔｎｌ、交雑時間１２０分）。交 雑の後、フィルターを、２　Ｘ　Ｎａ（Ｊ　／Ｃｉ’ｔ　’　−０，１％ＮａＤ ｏｄＳＯａテ２回、０、２　Ｘ　ＮａＣＪ　／ｃｔｔ　−０，１％ＮａＤｏｄＳ Ｏ，で２回、計４回、室温で、各洗浄当り２−３分間、洗浄した。０．１６Ｘ’ 　ＮａＣＪ　／’Ｃｉｔ　−０，１％ＮａＤｏｄＳＯ４で５０℃で２回、厳しい 洗浄（各回、１５分間）を行なった後、室温で２回洗浄した。フィルターを風乾 し、ＸＡＲＸ線フィルム（コダソク、ロソチェスター、ＮＹ）を用いて自動放射 線透過写真術に付するか、又は下記のようにビオチンの分析を行なった。

ビオ−ＤＮＡプローブの比色検出 乾燥ニトロセルロースのフィルターのじみを＾Ｐ７．５緩衝液中の牛血清アルブ ミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）の３％（−ハ）溶液中で４２℃で１５分間、培養しし、風乾 し、８゜’ｃ　テ３０−６０分間、焼き、ついでＢＳＡ−ＡＰ７．５緩衝液中で ４２℃で２０−３０分間、再加水した。小さいフィルターのストップは１３Ｘ１ ００’ｍ＋ｉのガラス管中で処理し、一方、より大きいシートはポリエチレンの トレースは熱封ポリプロピレンの袋中で処理した。

フィルターを室温で５分間、酵素錯体にさらした；フィルター各１００ｃｉに対 し錯体を２−５−用いた。フィルターを、２５０ｍ１のＡ　Ｐ　７．５中で３回 、Ａ　Ｐ　９．５ＣｐＨ９，５の０．１　Ｍ　）リス−ＨＣ１，０，１ＭのＮａ Ｃ１，５ｍＭ（ＩＪＭｇＣｌｚ　）　中で２回、急速に洗浄した。アビジンペル オキシダーゼ（ＡＢＣ）錯体を用いた場合は、ＡＰ７．５及びＡ　Ｐ　９．５緩 衝液の代りに２Ｘ　ＮａＣ１／　Ｃｉｔを用いた。

ＡＢＡＰ又はＡＢＡＰ錯体を用いて発色させるため、フィルターを、０．３３Ｉ ＠／ｍｌのＮＢＴ及び０．１７■／−のＢＣＩＰを含有するＡ　Ｐ　９．５の緩 衝液中で室温で０．５ないし２４時間、培養した；　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｅ、 　２３．１８０６　（１９７０）参照。上記ホスファターゼ基質溶液を下記のよ うにして作った：試薬各１５−について、ＮＢＴ５■をマイクロ遠心分離管中で １．５−〇糾９．５中に懸濁させ、１−２分間、激しく渦流をつくり、マイクロ 遠心分離状で短時間、遠心分離し、上澄みを、ポリプロピレン管中で３５℃に加 温した］、０ｍ７のＡＰ９．５中に注入した。残留ＮＥＴペレットを１．５　ｍ ｌのＡＰ９．５緩衝液で２回、抽出し、上澄みを最初の溶液と合した。管を最終 の０．５ｍｌのＡ　Ｐ　９．５ですすぎ、このも（２，５ｍｇ　）を５０マイク ロのＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解し、静かに混合しながら、上記ＮＥＴ 溶液中に滴加した。試薬混合物を渦流にしたり、又は激しく振とうしないように 注意しなければ□ならない、何故ならば、そのために好ましくない沈殿物ができ る可能性があるからである。この試薬は概して新らしく作ったが、暗所で室温で 少なくとも２４時間、安定であった・ フィルターを、フィルター１００ｄ当り１０１０−ｌ５　（７）溶液を用いて、 密閉ポリプロピレン袋中で上記基質溶液と共に培養した。非特定的背地を減少さ せるため、発色は暗所又は柔かい光の中で進行しなければならない。単一コピー の哺乳類の遺伝子序列は概して３０分以内に可視となる、ただし、高度発色交雑 信号は数時間の培養時間を要する。発色を、ｐＨ７，５の１０ｍＭのトリス−Ｈ Ｃ７，１ｍＭのＥ　Ｄ　Ｔ’Ａ中でフィルターを洗浄することにより、停止させ た。発色したしみを乾燥状態で又は小量の、ＰＨ９，５の２０−〇のトリス−Ｈ ｃｌ、５ｍＭのＥＤＴＡを含有する熱封袋中に貯蔵した。色の強度は、ニトロセ ルロースのシートを乾燥させると失われるが、緩衝液で再び漏らすと、フィルタ ーが強い光に長時間、さらされることなく、貯蔵されている限り、色の強度が回 復されることになろう。

検出すべき既知量のＤＮＡを用いる先述の方法及びビオチン標識ＤＮＡを可視化 するための標準、免疫学上の、かつ親和性の方法を用いて、比較感度結果を決定 した。Ｂｌｏ−４−ｄＵＴＰ、Ｂｉｏ−１１−ｄＵＴＰ又はＢ″１ｏ１６−ｄＵ ＴＰで標識をつけた、標的（ＰＭＭ９８４プラスミド）のＤＮＡの一連の二倍希 釈液を一定量の担体錬精子のＤＮＡ（７，５マイクロｇ）と混合し、ニトロセル ロースのストリップ上に直接、スポットした。ついで、これらのストリップを種 々の検出素子試薬と共に培養し、各方法の感度を決定した。ががる実験結果を第 ２表中に要約しである。可視化用の、手持ちＵＶ光源を用いる間接免疫ケイ先決 は検出限界が標的ＤＮＡのＩｎｇ付近である（第２表、１及び２行）比較的鈍感 な方法であった。基質としてＤＡＢ又はＥＡＣを用いる間接免疫ペルオキシダー ゼ法はより良好であったが（第２表、３及び４行）、それでもＢｉ。

＝１１−ＤＮＡ標的については僅かに１５ｌ５０−２００ｐか見えなかった。Ｓ ｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒのペルオキシダーゼ−抗ペルオキシダーゼ分析法（Ｓｔｅ ｒｎｂｅｒｇｅｒ等、ム）ｊ　ｉｓｔｏｃｈｅｍ、ρｙｔｏｃｈｅｍ、＋　１８ ．３１５　（１９７０）　）は感度を、間接免疫ペルオキシダーゼ法の場合の２ 倍見えるように改善した。然しなから、この方法も単一コピー咄乳類ＤＮＡ序列 の解析にとって十分な感度のものではなかった。これらの免疫学的方法の各々に ついては、ビオチンの“カップリング腕”の長さを４原子から１１原子に増加す ると標的の検出能が４倍、増加した。対照的に、Ｂｌｏ−４−ＤＮＡはアビジン とビオチニル化ワサビダイコンペルオキシダーゼとの錯体（ＨｓｕのＡＢＣ錯体 、Ｈｓｕ等、Ｊ、Ｉ（ｉｓｔｏｃｈｅｍ、ｃｙｔｏｃｈｅｍ、、２９．５７７（ １９８］１）により全く検出されなかった。然しながら、ＡＢＣ錯体は、等しい 効率で、かつ感度限界が簡単な一段反応で１１００ｐより少で、Ｂｉｏ　１ｌ− ＤＮＡ及びＢｉｏ　１６−ＤＮＡを示現した（第２表、６−７行）。アビジン− ＤＨとビオチニル化膓アルカリ性ホスファターゼを用いて作られた錯体（ＡＢＡ Ｐ錯体）はペルオキシダーゼを用いて作ったＡＢＣ錯体よりも感度が良好でさえ あったが（第２表、１０行）、検出限界は標的ＤＮＡの２０ないし３Ｏｐｇの範 囲内にあった。多重０サンドウイ、チング技術を用いて信号の強さを増加しよう とするすべての試みは信号を増強しないか又はそれを著しく減少させた。

このことは、第一次検出素子として抗ビオチンＴｇＧ又はＡＢＣ型錯体を用いた 場合にも観察された（第２表、８−９行）。先述の方法に依り合成され、錯体中 に高水準の酵素活性を保持した、本発明の膓アルカリ性ホスファターゼ重合体を ポリＡＢＡＰと名付ける。

ニトロブルーテトラゾリウム及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホス フェートの基質混合物と一緒に用いた時、この錯体は３−４時間の酵素培養によ り１１−２ｐの標的ＤＮＡを検出した。この検出水準は他の方法の内で最も感度 良好なものの１（１−１５倍の感度であった。

平均“遺伝子”の大きさが５　Ｋｂｐである二倍体哺乳類細胞についての６６− １ＯｐのＤＮＡの場合、７．５マイクロｇのＤＮＡ試料中の独特の細胞序列を解 析するのに１２ｐｇの感度が必要となろう。本発明のポリＡＢＡＰ錯体は１１− ２ｐのＤＮＡを検出した、従ってこの能力を有する。

第　２　表 ニトロセルロースのフィルターに吉合したビオチン−ポリヌクレオチド　の　出 におけるビオチン−豊足募基１立ｍｕ見皇 ｌ、　旧ｏ−４抗ビオチン１ｇＧ十ＦＩＴＣ−２°　Ａｂ　−２０００−４００ ０２、８ｉｏ−１１抗ピオチン１ｇＧ＋ＦＩＴｃ−２°　Ａｂ　−５００−１０ ００３、８ｉｏ−４抗ビオチンＩｇＧ＋ＩＩＲＰ−２°　Ａｂ　ＤＡＢ／ＥＡＣ ５００−１００（１４、８ｉｏ−１１抗ピオチシ１ｇＧ＋ＨＲＰ−２°　八ｂ　 ＤＡＢ／ＥＡＣ１５０−２００５、８ｉｏ−４，ＡＢＣ（アビジンＤＨ−Ｂｉｏ 　）ＩＲＰ）　ＤＡＢ／ＥＡＣ検出物１６、Ｂｉｏ−１１ＡＢＣＤＡＢ／ＥＡＣ ７５−１５０７、Ｂｉｏ−１６八ＢＣＤＡＢ／ＥＡＣ７５−１５０９、８ｉｏ− １６ＡＢＣ＋Ｂ１ｏ−ＤＮＡ＋ＡＢＣＤＡＢ／ＥＡ’Ｃ１００−２００及びポリ ＡＢＡＰ酵素検出素子錯体を用い、検出すべきＤＮＡの既知量を用いて６０分間 、培養して得られり典型的Ｄｏｔのしみ分析結果を示している。ペルオキシダー ゼ（ＡＢＣ）反応（レーン１）は概して、殊にペルオキシダーゼ基質を用いた培 養が３０−６０分より長かった場合には、ＡＢＡＰ又はポリＡＢＡＰ錯体（それ ぞれ、レーン２と３）よりも一層、高い非特定的背馳を与えた。然しなから、ポ リＡＢＡＰ検出素子を用いると、ｌｆｌｇの標的ＤＮＡは、３−４時間の酵素培 養について著しい背地ノイズ無しに可視化できる。

ＮＢＴ／Ｂ　ＣＩ　Ｐ基質混合物はホスファターゼ活性の、認められる程の最終 生成、物阻止を示さなかったので、その信号強度を、基質培養期間を１２４時間 まで伸ばすことにより、一層増加させることができた。

ｐｇ量のビオチン標１ＤＮＡを検出する能力のある酵素錯体を発色させた後、交 雑プローブとしてＢ　ｉｏ　−１１−又はＢｉｏ〜１６−ＤＮＡを用いる最適条 件を検討した。２個のＰＭＭ９８４ＤＮＡプローブ（その１個は３２Ｐだけの標 識をつけたものであり、他は３２ｐ及びビオチン−ヌクレオチドの標識をつけた ものであり、かつ両者は同一の特定放射能のプローブである）を５ないし１００ ０ｎｇ／ｍｌの範囲内の種々のプローブ濃度で交雑させた。この種々のプローブ 濃度における結果を第２図、１−６行に示しである；各グラフの頭部のストリッ プの番号は標的濃度である。３２ｐ−標１１ｉＤＮＡを用いて交雑させたストリ ップの自動放射線透過写真は２５ｎｇ／ｍ！より高いすべてのプローブ濃度にお いて著しい非特定的背馳を示したく第２Ｃ図、ストリップないしフィルムの４日 間の暴露）。対照的に、３２ｐ−標識Ｂｉｏ　−１６Ｄ　Ｎ　Ａプローブを用い て交雑させたストリップの自動放射線透過写真は７５０　ｎｇ／−ｍｌまでのプ ローブ濃度において実質上、どのような非特定的背地ノイズも与えなかった（第 ２Ｂ図、ストリップないしフィルムの４日間の暴露）。この結果は、ノイズ比に ついての良好な信号が非常に高い濃度のＢｉ’ｏＤＮＡプローブを用いて得るこ とが出来、従って、任意の所望のＣｏｔ値を達成するのに必要な交雑時間を著し く減少できることを示している。

先述の方法に依り作った、本発明のポリ、ＡＢＡ、Ｐ錯体を用いて可視化したｆ ｆ２ｐ−標識Ｂｉｏ−１６ＤＮＡプローブからの発色信号（第２Ａｌ］）は第２ Ｂ図の自動放射線透過図よりも一層、感度がよく、かつ第２Ｃ図にほぼ等しいこ とを示している。然しながら、この発色は完結するのに４．５時間を要しただけ であ、る。従って、この試験における本発明のポリＡＢＡ’Ｐ錯体は既知の検出 法よりも早く、かつ高感度を有する。

本発明のポリＡＢＡＰ検出系が、５ｏｕｔｈｅｒｎのしみの型中の序列を可視化 する能力が先ず、再構成実験において解析された。種々の量の線状化ＰＡＴ１５ ３プラスミドＤＮＡを剪断担体ＤＮＡの１０マイクロｇの試料に加え、混合物を １．４％のアガロースゲル上で電気泳動させた。第３Ａ図は、電気泳動後のゲル のこれらの７個のレーン及び臭化エチジウムで染色したプラスミドＤ　Ｎ　Ａ　 ０．６マイクロｇを含存し、電気泳動後の所望のプラスミド帯の位置を示してい る、マーカーとしてのレーンＭのゲルを示している。３．６ｋｂのプラスミド帯 を含有するゲルの７個のレーンの領域をニトロセルロースのフィルターに移し、 フィルターヲＢ１ｏ−１６−標識プラスミドのプローブと交雑させた。上記系の ポテンシャルを臨界的に試験すくため、交雑を、高いＣｏｔを得る、非常に厳し い条件（５０％ホルムアミド中）、最高よりも低い結果を与えることが知られて いる条件の下に行なった。にも拘わらず、Ｎ　Ｂ　Ｔ　／ＢＣＩＰ基質溶液中の ２時間の培養後、ポリＡＢＡＢ錯体は第３Ｂ図に示す如く、３．１ｐｇのように 少ないプラスミドＤＮＡを含存する帯を明りょうに検出した。信号強度も標的序 列の量に比例した。

ＤＮＡ混合物中の特　ＤＮＡの検出 本発明の検出素子系が未知混合物中の特定ポリヌクレオチドの序列を検出する能 力を下記の方法により実験した。人間の胎盤ＤＮＡをＥｃｏ　ＲＩ又はＨｉｎｄ 　ｍで消化し、１％のアガロースゲル中での電気泳動後、ニトロセルロースのフ ィルターに移した。ついでこのＤＮＡをＢｌｏ−１６−標識アルファーグロビン 又はＢｌｏ−１６−標識ベーターグロビンのプローブと２時間、交雑させた。こ れらのプローブは上記胎盤ＤＮＡ中のアルファ及びベータグロビン遺伝子（ＤＮ Ａ）と相補性であった。上記アルファーグロビンのプローブ（クローンＪＷＩ　 Ｏ１）はアルファーグロビン遺伝子序列の僅かに４００個のヌクレオチドを含有 するＣＤＮＡクローンであった；上記ベータグロビンのプローブ（ｐ、　ＨＢ　 Ｃ６）は５．２ｋｂのゲノムクローンであった。

第４図はこの結果を示している。レーン１と３はＥｃｏ　Ｒ１消化物であり、レ ーン２と４はＨｉｎｄ　ｍ消化物であり、レーン１と２はプローブＪＷＩ　０１ と交雑させたものであり、レーン３と４はプローブＰＨＢＣ６と交雑させたもの である。レーン５は剪断ｆｉＤＮＡ１０マイクロｇ中にラムダファージＨｉｎｄ 　ＩＩＩ及びＰＭＭ９８４ＰＳＴ１消化物を各々、７５０ｐｇ含有し、ラムダ及 びＰＭＭ９８４のプローブと交雑させたものである。刊行文献と良く一致する寸 法を持つ制限断片が観ＩＪ９．９５９　（１９８０）参照。

すべてのレーンは第４図に示す如く、数時間の酵素培養後のポリＡＢＡＰにより 可視化された。ヘーターグロビンのプローブに交雑させた、小さい方の２．５ｋ ｂのＥｃｏ　Ｒ１断片（第４図、レーン３）はヘーターグロビンのプローブと交 叉−交雑させた５“領域のデルタグロビン遺伝子からのＥｃｏ　Ｒ１断片である 可能性が最も強い、上記Ｃｅ１ｌ参照。アルファーグロビンのプローブと交雑し た上記３個のＨｉｎｄ　ｍの断片（第４図、レーン２）はレーン１，３及び４に おいて見られる他の帯よりも弱い信号を示しているが、これは驚くべきことでは ない、何故ならば、これらの断片の各々はプローブ中に存在する４００個のヌク レオチドの、小さい一組だけと交雑しているからである。然しなから、上記ポリ ＡＢＡＰ検出系を用いて独特の哺乳類の遺伝子序列を可視化できることは明らか である。Ｂｌｏ−ＤＮＡのプローブとポリＡＢＡＰ検出素子系とを組合わせると 、かくして５ｏｕｔｈｅｒｎ　、、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ又はｄｏｉ−Ｌみ交雑解析 用の迅速かつ感度のよい非等方性の方法が提供される。

ゲル電気泳動により分離した蛋白質をニトロセルロースのフィルターのシートに 移し、特定の蛋白質を、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ　Ｓ　Ａ　 、　７８．６６３３　（１９８１）に記載された方法に依り作ったビオチン標識 検出系と結合した特定の、標識−抗血清により位置づけることができる。ビオチ ン−標識抗体検出用の４つの酵素系を比較した。

方　法 ビオチニル化ヤギ抗−ウサギエｇ　Ｇ　（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒ ｉｅｓｓ　Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、、ＣＡ　）を、ＺＸＳＳＣ中の０．５χＷ／ Ｖ牛血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、。

セントルイス、ＭＯ）の担体蛋白質溶液中で一連の希釈を行なった。０．８ない し１１００ｐの標識蛋白質を含有する一連の８個の点滴及び担体（ビオチン無し ）蛋白質溶液の１個の点滴をフィルターのストリップに乗せた。ついでフィルタ ーを８０°Ｃで１時間、焼き、蛋白質をニトロセルロースのストリップに固定さ せた。

複製ストリップを、ＩＸＡＰ７．５緩衝液中の３％ＰＳＡ中で、又は０．１％の トリトンＸ−１００を持つＰＢＳ中の２％のＢＳＡ中で予備培養することにより “ブロック”した。ブロックしたストリップを８０℃で４５分間、乾燥し、ブロ ッキング試薬中で４２℃で３０分間、講加水した。ビオチニル化蛋白質“標的” の量を４個のアビジンの各々により検出できた；ついでビオチニル化酵素錯体を 第３表に略記した酵素反応を用いて分析した。

第　３　表 検出素子Ｐ体　酵素　酵素　溶液□ 酵素反応を、室温で１５又は１５０分の培養後、フィルターのストリップをｐＨ ７，５の１０ｍＭのトリス：ｃｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ中で洗浄することにより停 止させた。

４つの分析の結果は下記の如くである。ペルオキシダーゼ錯体を・ホスファター ゼ錯体と比較して、ペルオキシダーゼ反応が迅速であり、かつペルオキシダーゼ の２個の試料の感度が全く異なっていることが見出された。ＡＢＣ錯体は１５分 間の反応後、１３ｐｇを検出でき、一方、Ｄｅｔｅｋ　ＩＩは同一の時間後、１ ．６ｐｇを可視化した。このことを第５Ａ図、レーン１と２に示してある。この 差違は単純に使用基質の関数であり得る。

ホスファターゼ錯体は１５分間の反応後、同様の検出能を持った、即ちＡＢＡＰ について１３ｐｇでありポリＡＢＡＰについてｓｐｇであった。第５図、レーン ３と５、参照。然しなから、ホスファターゼ反応は２．５時間の反応の経過にお いてより多くの信号を発し続けたが、一方、ペルオキシダーゼ反応はこの延長反 応においてせいぜい２倍増加したに過ぎなかった、第５Ｂ図参照。更に、２．５ 時間のＤｅｔｅｋ　ＩＩ反応はニトロセルロースのひどい背馳汚染及び担体蛋白 質の斑点Ｎ０８９からの虚偽の陽性反応を生じた（第５Ｂ図、レーン２）。

２．５時間後の検出限界は１３ｐｇ（ＡＢＣ１第５Ｂ図、レーン１）、約３　ｐ ｇ　（Ｄｅｔｅｋ　Ｈ、第５Ｂ図、レーン２）、３−６ｐｇ（Ａ３−６ｐ第５Ａ 図、レーン３）及び０．８ｐｇ　（ポリＡＢＡＰ、第５Ｂ図、レーン４）であっ た。

検出感度に対する酵素重合の特定的影響が、１５又はＬ５０分の後のＡＢＡＰ及 びポリＡＢＡＰ検出系の第５図の結果を比較することにより示される。これらの 培養は明らかに、本発明の重合体の酵素錯体については、８ないし１６倍の信号 増加があることを示している（第５Ａ及びＢ［ｇ、レーン３及び４）。

人間の胎盤性腺刺激ホルモンの免疫細胞化学的検定におけるアビジン−ビオチニ ル化アルカリ性ホスファターゼ錯体の利用 免疫細胞化学におけるアルカリ性ホスファターゼのビオチニル化重合体の有用性 を決定するための比較研究を行なった。アルカリ性ホスファターゼ法（ポリＡＢ ＡＰ）のアビジン−ビオチニル化重合体を、Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒのペルオキ シダーゼ抗−ペルオキシダーゼ（ＰＡＰ）法、Ｓ　ｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ等、Ｊ 、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、　％Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、　、１．８．３１５６（１’９ ７０）と比較した。

人間の胎盤性腺刺激ホルモンを含有する、ガンにかかった器官からの組織切片を 下記の如く載せガラス上に作った： 切片を各々、５分間、二回、キシレン中で１等級別アルコールを通じて蒸留水に 水加した。ペルオキシダーゼ抗ペルオキシダーゼ（ＰＡＰ）法用の切片を、内発 的ペルオキシダーゼをブロックするため、３０分間、Ｐ、Ｂ、Ｓ、中の１．５χ Ｈ，０で処理した。ＡＢＡＰ法用の切片は処理せずに次工程に移された。

切片を下記のサプレッサー系で処理した：ＰＡＰＰＡＰ法用片を、ｐＨ７，５の ０．０５　Ｍ　ｌ−リスＨ（Ｊ緩衝液′中の３％ＢＳＡ中の１０％の正常ブタ血 清で２０分間、処理した。

ポリＡＢＡＰ法用に、切片を、ｐＨ７，５の０．０５　Ｍのトリス、ＨＣ１緩衝 液中の３％ＢＳＡだけで２０分間、処理した。切片を載せガラスにのせた。

−次抗体（ウサギ抗−ＨＣ，Ｇ、　Ａｃｃｕｒａｔｅ　Ｃｈｅｍ　ａｎｄＳｃｉ ｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃｏｒｐ　）をｐＨ７，５のトリス、゛ＨＣ１緩衝液中で１　 ：　１０００から１　：　１，０００．ＯＯ’０に希釈し、二つの載せガラスに 加えた、一方は室温で１時間、他方は室温の湿潤室中で一夜であった。載せガラ スをｐＨ７，５のトリス、Ｈ（ｊ緩衝液で３回、洗浄した。

ついで二次血清を加えた。

ＰＡＰ法用に、ブタ抗ウサギ抗血清（ＡｃｃｕｒａｔｅＣｈｅｍｉｃａｌ　ａｎ ｄ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃｏｒｐ、　）の１：２０希釈液を室温で半時間、 組織切片に加えた。ポリ　ＡＢＡＰ用に、ｐ）１７．５のトリス、Ｈ（Ｊ緩衝液 で希釈したビオチニル化ヤギ抗−ウサギ抗血清（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏ−ｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、）のｉ：４’ｏｏ希釈液を室温で半時間、加えた。更 に、ビオチン標識ブタ抗−ウサギ抗血清をつくり、別の実験の組織切片に加えた 。ついで載せガラスを各々、５分間、トリス、ＨＣ１緩衝液で三回、洗浄した。

ついで検出系を加えた。

ＰＡＰ系用に、ウサギＰＡＰの１　：”’５０希釈液をトリスｌ（ＣＩ緩衝液中 でつくり、室温で１時間、載せガラスに加えた。ポリＡ”ＢＡ’Ｐ系用に、２０ ｕｎのアビシフＤＨを、ｐＨ７，５））リスＨｃ１緩衝液２．５−を入れたホウ ケイ酸塩ガラス試験管に加え、重合、アルカリ性ホスファターゼ２．５ｕ７！を 加え、混合物を５分間、錯体化させておいた。ついで錯体を室温で１時間、載せ ガラスに加えた。載せガラスをｐＨ７，５のトリスＨ’　ＣＩ緩衝液で室温で３ 回洗浄した。

ＰＡＰ法用に、載せガラースをジアミノヘンジジンた。ポリＡＢＡＰ法用に、載 せガラスを、５０ｍＭのＭｇ（Ｊ２を含む０．　Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１中の、ｐＨ９ ，５の０．０５　ＭのトリスＨ（ｌｊ緩衝液で希釈したナフトールＡＳホスフェ ート及びＦａｓｔ　Ｒｅｄ　ＴＲ塩中で発色させた・。

載せガラスをのせ、カバーガラスでカバーし、光鏡検法で検査した。

結果を載せガラスの画像としての第６及び７図に示しである。

第６図は１　：　１６，０００希釈度におけるＰＡＰ法の結果を示している。

第７図は１　：　１６，０００希釈度におけるポリＡＢＡＰ法の結果を示してい る。　′ −夜の培養により、かつ−次抗体に応して、本発明のポリＡＢＡＰ法はＰＡＰよ りも４ないし２０倍の感度をもつことが見出された。一時間の短い一次抗体の培 養の場合には、本発明方法は４ないし６倍の感度をもった。−夜の培養の際に認 められた増加感度はポリＡＢＡＰ法が、その感度を増加する能力に関連がある、 一方、ＰＡＰ法はほぼ元の力価のままである。

オス６り白どノタワ・］　ζｎ） Ｆ／Ｇ、　ｆ 十良合ブカ乙列（ｐｒｔ）　ＡＡＬＱ匈ム矛リ　−す　４づ置台７由乙夛・ｊ　 （ｐｇ）幣甲艷讐７？　魯轡ヤ↑ヤｉ？　畔臀？ｐ７（：）／［ＥＥｍ二二二− ］／　／ ２ＧＥ工＝＝＝二二コ　２　２　・− ３漣工：ｑ、コ　３−　３５ｍ１＃、鐙、。

Ｍ　／　２：ｊ４５　６７ 手続補正書（方式） 昭和６０年６月１４日 特許庁長官　志　賀　学　殿 １．２Ｉ￥件の表示 国際出願番号　ＰＣＴ／ＵＳ　８４１００８８８２、発明の名称 新規な視覚化ポリマー及びこれらのポリマーの診断薬への応用３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住　所　アメリカ合衆国、コネティカッ）　０６５１１．ニューヘマン、ホイッ トニー　アベニュー　２６０、ピー・オー・ボックス６６６ 名　称　エールユニバーシティ 代表者　パックマン、ジョン　タブリュー国　算　アメリカ合衆国 ４、代理人　〒１０５ ６、補正の対象 （１）特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の特許出願人及び発明者の 欄 （２）特許協力条約に基づく国際出願願書の翻訳文のＩＴ、■、■、■欄（３） 明細書の翻訳文　（４）請求の範囲の翻訳文（５）図面の翻訳文　（６）委任状 及び訳文７、補正の内容 国際調青報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　互いに直接結合された可視化単量体の多重単位、あるいは化学基や該多重 単位の主鎖部分を介してカンプリング剤によって結合された可視化単量体の多重 単位からなる可視化重合体と標的とを結合させることによってＪ生物学的物質中 の無機又は有機の標的分子の存在を可視化する方法であって、上記可視化単量体 は少なくとも１個の可視化坐席を持ち、且つ酵素、標識天然又は合成ポリペプチ ド、標識ポリオール、標識ポリオレフィン、又は標識炭水化物であること； 上記化学基はアミン基、酸化１，２−ジオール基、カルボキシ基、メルカプタン 基、ヒドロキシ基、又は炭素−水素結合であること； 上記主鎖部分はアマイド結合、炭素−炭素結合、炭素−酸素結合又は炭素−水素 結合であること；及び １記化学基又は主鎖部分は上記単量体の可視化坐席から少なくとも１原子離れて いる位置において上・記単量体内に位置づけられていること；よりなる生物学的 物質中の無機又は有機の標的分子の存在を可視化する方法。 ２、　上記標識がけい光化学基、染料、放射性基、光子エミッター、又は電子濃 密部分から選択される、請求範囲第１項に依る方法。 ３、　上記標的が生物学的生物により作られるか、又は生物学的生物に対して効 果を有する、請求の範囲第１項に依る方法。 ４、　上記標的が蛋白質、脂質、炭水化物、ホルモン、ステロイド、ポリヌクレ オチド、核酸、ヌクレオ蛋白質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、プリン又はピリ ミジン塩基、医薬物質、糖、発ガン物質、環体物質、ヘプテン、抗原、重金属、 有機金属化合物、金属−蛋白質錯体又は毒性無機塩である、請求範囲第３項に依 る方法。 ５、　上記カンプリング剤が反応性、二又は多重、ホモ又はヘテロ官能性、有機 架橋剤から得られる、請求範囲第２項に依る方法。 ６、　上記架橋剤が式Ｉ 式中、Ａ、Ｂ及びＥは水素、カルボン酸基、酸ノ＼ライド基、活性化エステル、 混合無水物、アシルイミダシール、Ｎ’−（カルボニルオキシ）イミド基、イミ ノエステル、第一級アミン、アルデヒド基、アルファハロメチルカルボニル基、 ヒドラジン基、アシルヒドラジド基、アジド基又はＮ−マレイミド基から独立し て選ばれる。Ａ、Ｂ及びＥの少なくとも二つは水素以外のものであり；かつＲ１ は少なくとも２個の炭素の脂肪族基又は少なくとも６個−の炭素の芳香族基であ る、請求の範囲第５項に依る方法。 ７、　上記標的を、上記可視化重合体を有する１−１記標的用検出剤と結合させ る、請求の範囲第１項に依る方法。 ８、　上記検出剤が抗体、レクチン、ＤＮＡＮプリ、サー蛋白質、アビジン、ス トレプトアビジン、ホルモン、立体特異性レセプター蛋白質、高親和性酵素、序 列特定性ポリヌクレオチド結合蛋白質、又は相補性ポリヌクレオチド序列である 、請求の範囲第７項に依る方法。 ９、　上記検出剤が、該検出剤に共有結合した第一配位子と、上記可視化重合体 に共有結合した第二配位子と、上記第−及び第二配位子と錯体化された配位子結 合化合物とからなる中間配位子結合錯体を介して上記重合体を特徴する請求の範 囲第７項に依る方法。 １０　上記化合物が抗体、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン、高親和性 酵素、序列特定性ポリヌクレオチド結合蛋白質又は相補性ポリヌクレオチド序列 である、請求の範囲第９項に依るｈ−法。 １１、上記検出剤が抗体であり、−ト記化合物がアビジン又はストレプトアビジ ンであり、かつ上記第一・及び第二配位子が、Ｎ−（オメガアシル）アミド〔ビ オチン又はイミノビオチン〕　（ただし、アシル基は４乃至２０個の炭素のもの である）、又はＮ−（オメガ−オリゴマー）アミド〔ビオチンまたはイミドビオ チン〕　（ただし上記オリゴマーは長さが２乃至３０単位のポリオール、ポリア ミド又ムよポリビニル基である）から独立して選択される、請求範囲第９項に依 る方法。 】２．第一標的特定性抗体を用いて上記標的を検出し、標的／第一抗体接合体を 形成させ、上記ビオチン標識配位子を持ち、かつ−ト記第−抗体に対して一般的 である第二抗体を一ト記接合体と共に培養し、かつ上記可視化重合体を上記第− 及び第二配位子及び上記配位子結合化合物を介して上記第二抗体と錯体化させて なる、請求の範囲第１１項に依る方法。 １３、可視化重合体対アビジン又はストレプトアビジンの分子比が約３対１であ る、請求の範囲第１１項に依る方法。 １４、上記検出剤がレクチンであり、上記化合物がアビジンまたはストレプトア ビジンであり、かつ上記第−及び第二配位子がＮ−（オメガアシル）アミド（ビ オチン又はイミノビオチン）（だだし上記アシル基は４乃至２０個の炭素のもの である）、又はＮ−（オメガ−オリゴマー）アミド〔ビオチン又はイミノビオチ ン〕　（ただし、上記オリゴマーは２乃至３０華位のポリオール、ポリアミド又 はポリビニル基である）から独立して選択される、請求範囲第９項に依る方法。 １．５．　ｉ記可視化重合体対アビジンまたはストレプトアビジンの分子比が約 ３対１である、請求の範囲第１４項に依る方法。 １６、」−記検出剤が相補性ポリヌクレオチド序列である、請求の範囲第９項に 依る方法。 １７、上記化合物が抗体、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン又は高親和 性酵素である、請求の範囲第１６項に依る方法。 １８、上記化合物がレクチンであり、かつ上記第−及び第二配位子が結合性糖で ある、請求の範囲第１６項に依る方法。 １９、上記化合物がアビジン又はストレプトアビジンであり、かつ上記第−及び 第二配位子がＮ−（オメガアシル）アーミド（ビオチン又はイミノビオチン）（ だだし、上記アシル基は４乃至２０個の炭素のものである）、又はＮ−オメガ− オリゴマー）アミド〔ビオチン又はイミノビオチン〕　（ただし、上記オリゴマ ーは長さが２乃至３０単位のポリオール又はポリアミド又はポリビニル基である ）、又はアルケニル基中に３乃至２０個の炭素をもつＮ−（アルケニル）アミド （ビオチン又はイミノビオチン）から独立して選択される、請求の範囲第１６項 に依る方法。 ２０、可視化重合体対アビジン又はストレプトアビジンの分子比が約３対１であ る、請求の範囲第１９項に依る方法。 ２１、上記可視化重合体が有機、二原子個結合基により上記検出剤に結合してい る、請求の範囲第７項に依る方法。 ２２、上記有機、二原子価結合基がビーホモ−又はへテロ官能性有機架橋剤から 得られる、請求の範囲第２１項に依る方法。 ２３、上記検出剤が抗体、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン、ＤＮＡリ プレッサー蛋白質ホルモン立体特異性レセプター蛋白質、高親和性酵素、序列特 定性ポリヌクレオチド結合蛋白質又は相補性ポリヌクレオチド序列である、請求 の範囲第２１項に依る方法。 ２４、上記化学基が式Ｉの上記架橋剤とアマイド結合を形成するイプシロン又は 第１級アミノ基である、請求の範囲第６項に依る方法。 ２５、上記単量体単位がベルオキシダ・−ゼ、ルシフェラーゼ、グルコースオキ シダーゼ、ガラクトキシダーゼ、酸ホスファターゼ又はアルカリ性ホスファター ゼである、請求の範囲第２４項に依る方法。 ２６、上記化学基はジアルデヒド基に酸化され□る１、２−ジオールであり、か つ上記架橋剤は上記ジアルデヒド基と、ヒドラゾン、アマイド又はアシルヒドラ ジド又はイミン結合を特徴する請求の範囲第６項に依る方法。 ２７、上記化学基はメルカプタンであり、かつ上記架橋剤はアルファハロメチル カルボニル基又はＮ−マレイミド基を用いてサルファイド結合を特徴する請求の 範囲第６項に依る方法。 ２８、少なくとも１個の可視化座席を持つ可視化単量体の多重単位からなり；上 記単位は化学基−又は隣接する該単位の主鎖部分を介して直接、−緒に結合して いるか、又は化学基又は隣接する上記単位の主鎖部分に共有結合したカンプリン グ剤により結合しており；上記単量体は酵素、標識天然又は合成ポリペプチド、 標識ポリオール、標識ポリオレフィン又は標識炭水化物であり；上記化学基はア ミン基、酸化１゜２−ジオール基、カルボキシ基、メルカプタン基、ヒドロキシ 基又は炭素−水素結合であり；上記主瞳部分はアマイド結合、炭素−炭素結合、 炭素−酸素結合又は炭素−水素結合であり；かつ上記化学基又は主鎖部分は上記 単量体の可視化座席から少なくとも１原子離れている位置に位置づけられている 、可視化重合体。 ２９、上記標識がケイ充塞、染料、放射性基、光子エミッター又は電子濃密基か ら選ばれる、請求の範囲第３０、上記カップリング剤が二又はマルチ−（ホモ− 又はへテロ−）官能性有機架橋剤から得られる、請求の範囲第２９項に依る重合 体。 ３１、上記架橋剤が下式■を持ち、 式中、Ａ、Ｂ及びＥは水素、カルボン酸基、ハロゲン化酸基、活性化エステル、 混合無水物、アシルイミダゾール、−Ｎ−（カルボニルオキシ）イミド基、イミ ノエステル、第一級アミン、アルデヒド基、アルファハロメチルカルボニル基、 ヒドラジン基、アシルヒドラジド基、アジド基又はＮ−マレイミド基から独立し て選ばれ；Ａ、Ｂ及びＥの少なくとも２個は水素以外のものであり；かつＲ１は 少なくとも２個の炭素の脂肪族基又は少なくとも６個の炭素の芳香族基である、 請求の範囲第３０項に依る重合体。 ３２、上記単量体がペルオキシダーゼ、ガラクトキシダーゼ、ルシフェラーゼ、 グルコースオキシダーゼ、酸ホスファターゼ又はアルカリ性ホスファターゼから 選ばれる酵素である、請求の範囲第３１項に依る重合体。 ３３、上記架橋剤が脂肪族基中に４乃至２０個の炭素を持つ脂肪族−１，オメガ ージアシルオキシジサクシニミドである、請求の範囲第３２項に依る重合体。 ３４、請求の範囲第２６項に依る、記述の可視化重合体を持つ検出剤を有し、こ の検出剤は抗体、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン、ＤＮＡリプレッサ ー蛋白質、ホルモン、立体特異性レセプター蛋白質、高親和性酵素、序列特定性 ポリヌクレオチド結合蛋白質又は相補性ポリヌクレオチド序列である、検出−可 視化配置。 ３５、上記検出剤は、該検出剤に共有結合した第一配位子、配位子結合化合物及 び上記可視化重合体に共有結合した第二配位子からなる中間体配位子結合錯体を 介して上記重合体を持ち；上記検出剤、化合物及び重合体は上記化合物への配位 子として作用する上記第−及び第二配位子と錯体を特徴する請求範囲の第３４項 に依る検出−可視化配置。 ３６、上記検出剤は抗体、レクチン又は相補性ポリヌクレオチド序列であり、上 記化合物はアビジン又はスイミノビオチン）　（ただし、上記アシル基は長さが 約２乃至２０個の炭素のものである）、又はＮ−オメガ−オリゴマー）アミド〔 ビオチン又はイミノビオチン〕　（ただし、上記オリゴマーは長さが約２乃至３ ０単位のポリオール、ポリアミド又はポリビニル基である）、又はＮ−（オメガ アシルニル）アミド　（ビオチン又はイミノビオチン）（ただし、上記の或アル ケニル基は長さが約３乃至２０個の炭素のものである）から独立して選ばれる、 請求の範囲第３４項に依る配置。 ３７、　Ｊ：、記重合体が−１−記検出剤と直接結合しているか、又は錯体とな っている、請求の範囲第３４項に依る検出−可視化配置。 ３８、上記検出剤が二又はマルチ−（ホモ又はへテロ）官能性有機架橋剤から得 られる結合基により上記重合体に共有結合している、請求の範囲第３７項に依る 配置。 ３９、配位子に共有結合した、請求の範囲第２８項に依る可視化重合体と、上記 配位子と結合した配位子結合化合物とからなる可視化重合体錯体。 ４０、−上記化合物がレクチン、アビジン、ストレプトアビジン、高親和性酵素 、序列特定性ポリヌクレオチド結合蛋白質又は相補性ポリヌクレオチド序列であ る、請求の範囲第３９項に依る錯体。 ４１、上記化合物がレクチン、アビジン又はストレプトアビジンである、請求の 範囲第３９項に依る錯体。 ４２、上記化合物がアビジン又はストレプトアビジンであり、かつ上記配位子が Ｎ−（オメガアシル）アミド（ビオチン又はイミノビオチン）（ただし、上記ア シル基は長さが約２乃至２０個の炭素のものである）、又はＮ−（オメガ−オリ ゴマー）アミド〔ビオチン又はイミノビオチン〕　（ただし、上記オリゴマーは 長さが約２乃至３０単位のポリオール、ポリアミド又はポリビニル基である、請 求の範囲第４１項に依る錯体。 ４３、上記化合物がレクチンであり、かつ上記配位子が二またはマルチ−（ホモ 又はヘテロ）官能性有機架橋剤を介して上記重合体に結合した糖である、請求の 範囲第４１項に依る錯体。 ４４、検出剤成分の緩衝水溶液及び請求の範囲第３９項に依り記載された可視化 重合一体錯体成分の緩衝水溶液の計量量及び上記可視化重合体の水性混合物の標 準量からなり、上記剤成分及び上記重合体錯体成分は一緒になった時、会合可能 である、生物学的物質中の標的分子の解析用検出キット。 ４５、上記検出剤は抗体、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン、ＤＮＡリ プレッサー蛋白質、ホルモン、立体特異性レセプター蛋白質、高親和性酵素、序 列特定性ポリヌクレオチド結合蛋白質又は相補性ポリヌクレオチド序列である、 請求の範囲第４４項に依るキット。 ４６、請求の範囲第３４項に依り記載した検出剤−可視化重合体の計量量を含む 、生物学的物質の標的分子の解析用検出キット。 ４７、上記配位子がＮ−（オメガアシル）アミド　（ビオチン又はイミノビオチ ン）である、請求の範囲第４２項に依る錯体。 ４８、上記単量体がワサビダイコンペルオキシダーゼ又はアルカリ性ホスファタ ーゼである、請求の範囲第３２項に依る重合体。 ４９、」二記単量体単位がイプシロンアミン基と結合するジサクシニミジル基質 から得られるカンプリング剤により結合される、請求の範囲第４”８項に依る重 合体。 ５０、上記単量体がペルオキシダーゼであり、かつ上記単位が酸化１，２−ジオ ール基と結合するトリ　（リジル）リジンから得られるカンプリング剤により結 合される、請求の範囲第４８項による重合体。 ５１、上記単位が、酸化性酵素を用いる酸化性−架橋を介５２、上記酸化性酵素 がワサビダイコンペルオキシダーゼである、請求の範囲第５１項に依る重合体。 浄書（内容に変更なし）