JPH10504962A - 被検体の検出に用いる組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 二本鎖核酸の二重らせんは、種々の異なる型のイムノアッセイ（例えば、サンドイッチアッセイ、競合アッセイ等）において普遍的な収集可能で且つ解離可能な結合システムとして機能する。アッセイの型に応じて、前記アッセイシステムに含まれる特異成分の少なくとも１つが、二本鎖核酸（すなわち、実質的に相補的な配列を含んでなる２つのオリゴヌクレオチド）を形成する１対の配列のうちの第一の配列に付着結合される。前記アッセイは、ハイブリッド形成条件下で二本鎖核酸二重らせんを形成する前記１対の配列の他方の配列であるオリゴヌクレオチドが付着結合されている支持体の存在下で行われる。２つの相補的オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成により二重らせんを形成させると、前記１対のオリゴヌクレオチドの第一の配列が付着結合されるアッセイシステム成分を、それによって溶液相から効率的に除去し且つ支持体上に収集することができる。支持体に結合されたオリゴヌクレオチドは多数連続アッセイに再使用できる。また、所定の支持体に結合されたオリゴヌクレオチドは本発明に従って種々の異なる被検体の分析に使用できる。多くの場合、アッセイシステムは被検体の量を定量することを促進する標識を含むが、他方で、被検体の量は外来性標識を使用せずに測定することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 被検体の検出に用いる組成物及び方法発明の背景 本発明は一般的に生化学的技術に関する。特に、本発明は生化学的技術におい て重要な化合物の定性及び定量アッセイ(assay)に有用な組成物及び方法に関す る。 種々様々な方法が、液体試料中の１種又はそれ以上の化合物〔一般に被検体(a nalyte)と呼ぶ）〕の濃度を測定するために開発されている。これらの方法の多 くの方法においては、被検体に特異的に結合する抗体又はその断片（フラグメン ト）が使用される。特に、固体支持体に固定された抗体が種々のサンドイッチ型 アッセイ及び競合アッセイで使用されている。 抗体又はその断片の使用には、この試薬が標的被検体に対して特異的であると いう明白な利点があるが、それにもかかわらず従来公知のアッセイシステム(ass ay systems)については著しい不都合がある。例えば、抗体が支持体に結合され ると、抗体と被検体との間の反応は不均一免疫化学反応において生じ得るのみで ある。しかしながら、均一液相中のかかる反応の力学がさらにより好ましいもの であることはよく知られている。さらに、固体支持体に固定された抗体は、多数 のアッセイには再使用できない場合が多い。さらにまた、特定の被検体それぞれ について、固体支持体に固定された抗体を含有する特有の製品を提供する必要が ある。固体支持体成分が種々の様々なアッセイに使用でき、しかも有効性を失う ことなく再使用できるアッセイシステムを提供することが有利なことは明らかで ある。 本発明の目的は、従来の方法及び組成物の欠点がない新規な検定方法及びそれ に使用する組成物を提供することにある。発明の概要 本発明に従えば、二本鎖核酸二重らせんは、種々様々な型のイムノアッセイ（ 例えば、サンドイッチ法、競合法など）において一般的で、再使用可能で、収集 可能(harvestable)で且つ切り離し可能な連結システムとして機能する。アッセ イの種類に応じて、アッセイシステムに含まれる特異成分の少なくとも１つは、 二本鎖核酸（すなわち、実質的に相補的な配列を含んでなる２つのオリゴヌクレ オチド）を形成する一対の配列の一方の配列(member)に付着結合される。本発明 に従って、アッセイは、ハイブリッド形成条件下で二本鎖核酸二重らせんを形成 する前記一対の配列の他方の配列であるオリゴヌクレオチドが付着結合する支持 体の存在下で実施される。２つの相補的オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成 によって二重らせんを形成すると、アッセイシステムの成分であって、一対のオ リゴヌクレオチドの一方の配列が付着結合する成分は、それによって液相から効 率的に除去され、支持体上に収集(harvest)される。支持体に結合されたオリゴ ヌクレオチドは多数の連続アッセイにおいて再使用できる。さらにまた、所定の 支持体結合化オリゴヌクレオチドは、本発明に従って種々様々な被検体の分析に 使用できる。発明の詳細な説明 本発明の一つの好ましい態様によれば、アッセイシステムはサンドイッチアッ セイを含んでなる。本発明によるサンドイッチアッセイの好ましい態様において は、成分全部が液相中に存在する均一免疫反応を用いて、被検体と前記被検体用 の免疫試薬との間で免疫化 学複合体(conjugate)を形成させる。一般に、この方式はあまり普通には用いら れないが、均一相中の免疫化学反応速度が極めて好ましいことから都合がよい。 しかしながら、本発明の目的には、不均一系（すなわち、固相成分との複合体の 形成が生じる系）がある場合には使用し得ることもまた考えられる。これらの不 均一系はより一層普通に用いられるが、反応速度が遅く、従って比較的高価な抗 体を多量に必要とするという理由から、本発明ではあまり望ましくない。サンド イッチアッセイは感度が高い。その理由は、被検体がない場合は検出される信号 が存在しないからである。従って、サンドイッチアッセイは低い濃度（すなわち 、約10^-8Ｍ以下の濃度）で存在する被検体について使用するのに特に適している 。さらに、サンドイッチアッセイは大きい分子（例えばタンパク質）の濃度を測 定するのに特に適している。 本発明のこの態様によれば、サンドイッチアッセイにおいて、被検体に特異的 に結合する２種類の免疫試薬が使用される。第一の免疫試薬は、二本鎖核酸を形 成する一対の配列の一方の配列であるオリゴヌクレオチドを含有する。第二の免 疫試薬は適当な標識試薬を含有する。前記標識試薬の濃度は当該技術において一 般的に知られているような方法で容易に測定し得る。 前記の２種類の免疫試薬のそれぞれはまた適当な免疫反応剤も含有する。本発 明の目的のために、免疫反応剤(immunoreactant)とは、被検体に特異的に結合す るタンパク質（すなわち、50個を越えるアミノ酸からなるアミノ酸配列）又はペ プチド（すなわち、50個以下のアミノ酸からなるアミノ酸配列）であると定義さ れる。典型的には、前記免疫反応剤は、被検体に対するモノクロナール抗体又は ポリクロナール抗体あるいはその部分（例えば、Fab'断片）である（これらは被 検体に特異的に結合する）。しかしながら、当業者によって認められるように、 抗体と抗原の結合に相当する特定の複合体の形成は、一般的に免疫化学的複合体 の形成に関与するとは考えられていない別の特定のタンパク質- 又はペプチド- に基づく結合系（例えば、レセプタータンパク質又はその断片及びそれ用のリガ ンド）を使用することによって達成してもよい。それにもかかわらず、かかるタ ンパク質又はペプチドは本発明の目的に使用するのに適した免疫反応剤の範囲に あるとみなされる。また、標的被検体に特異的に結合する種々の免疫反応剤（例 えば、組み替えDNA 技術を使用して生成される免疫反応剤）の類縁体又は変異体 は、本発明の範囲内にあるとみなされる。 サンドイッチ検定法においては２種類の免疫反応剤と被検体との複合体を形成 することが必要であるので、一般的に被検体の種々のエピトープに特異的に結合 する免疫反応剤を使用するのが適切である。すなわち、被検体に非競争的に結合 する２種類の異なるモノクロナール抗体(又はその部分)(従って、被検体の異な る部位に結合すると思われる)を、第一及び第二の免疫反応剤の形成に使用する のが適当である。当業者には周知であるように、種々のエピトープに適したモノ クロナール抗体をそれ自体公知の方法で通常的に生成させ得る。次いで、２種類 の抗体は本発明で使用するのに適していることを確認するために定法により選別 し得る。 溶液中の２種類の免疫試薬と被検体との間で複合体を形成する均一反応の速度 は通常、液相の物質と固体物質（例えば、固体支持体に固定された免疫試薬）と の間の反応の場合よりも著しく速い。従 って、本発明のこの態様によれば、サンドイッチ型複合体の形成はアッセイシス テムの各成分を固体支持体と接触させる前に溶液中で行うことが好ましい。それ にもかかわらず、アッセイシステムの成分全部を同時に結合すること又は前記の 各成分と別の１種又はそれ以上の成分とを任意の順序で結合させることは、本発 明の範囲に入るとみなされる。 ２種類の免疫試薬と溶液中の被検体との間で複合体を形成させるサンドイッチ アッセイの好ましい態様によれば、複合体と未結合物質とを含有する反応混合物 は、次いで固体支持体と接触させ得る。前記固体支持体にはハイブッリド形成条 件下で二本鎖核酸二重らせんを形成する一対の配列の他方の配列であるオリゴヌ クレオチドが付着結合される。２つの相補的オリゴヌクレオチドのハイブリッド 形成により二重らせんを形成させると、前記の２つのオリゴヌクレオチドのうち の一方を含有する複合体が固体支持体上に効率的に収集される。複合体形成によ って結合された標識免疫試薬だけが二重らせん形成法によって固体支持体上に収 集される。免疫複合体に結合されていない標識化物質は液相中に残り、前記支持 体及び前記支持体に固定された物質から容易に分離し得る。 標識の濃度は、用いた標識に適した慣用の方法で測定して被検体の濃度の測定 値を提供し得る。複合体を収集するのに使用される二重らせんを形成する二本鎖 核酸は、適当に変性させ得（例えば、水又は低塩緩衝液を添加することによって ）、標識複合体は標識の濃度を測定する前に固体支持体に付着結合されたオリゴ ヌクレオチドから放出させ得る。あるいは、標識の濃度は、免疫複合体を支持体 に固定させたままで測定し得る。 本発明の別の態様においては、競合アッセイシステムが提供される。これもま た当業者により容易に認められるように、これらの競合アッセイは、試料中のさ らに小さい被検体（例えば、有機分子）又は複数の被検体の存在を検出するのに （例えば、患者の体液試料中の薬剤分析に）特に有用である。複数の被検体のサ ンドイッチアッセイもまた本発明に従って可能である。競合結合の態様によれば 、１種類の免疫試薬のみが使用される。サンドイッチアッセイの態様におけるよ うに、相補的な第一及び第二のオリゴヌクレオチドもまた使用される。アッセイ システム全てにおいて、オリゴヌクレオチド配列の一方が適当な支持体に結合さ れる。 競合アッセイの一つの態様においては、第一のオリゴヌクレオチドが被検体に 結合されるか又は免疫反応剤に対して標的被検体と競合する被検体類縁体に結合 される。第二のオリゴヌクレオチドは支持体に結合される。好ましい一つの態様 においては、第二のオリゴヌクレオチドは適当なセンサーに結合させ得る。一例 として薬物分析法を使用して、異なるオリゴヌクレオチドを、濃度を測定すべき 一群の薬物分子（又はその類縁体）のそれぞれに結合させ得る。競合アッセイの この態様においては、適当な標識（例えば、フルオレセイン）が薬物分子のそれ ぞれについての免疫反応剤（例えば抗体又はレセプター）に結合される。試料か らの薬物分子のそれぞれと、その対応競合剤（それに付着結合したオリゴヌクレ オチドを有する）との、免疫試薬（免疫反応剤と標識を含有する）に対する競合 反応の後に、それぞれのセンサーは先の態様におけるように二重らせんの形成に よってその相補的オリゴヌクレオチドを収集する。結合され、標識された抗体は 、試料中の個々の薬物の濃度に応じた量 で阻害される。次いで、競合阻害の量は、適当な方法（例えば、支持体がセンサ ーを含んでいるこれらの態様において適当なセンサーで測定することによって） で、典型的にはセンサー表面から残存溶液を洗浄した後に測定される。 競合アッセイの別の態様においては、免疫試薬は、被検体に特異的に結合する 免疫反応剤であって且つそれに付着結合した第一のオリゴヌクレオチドを有する 免疫反応剤の形態で使用される。この態様においては、適当な標識が被検体競合 剤(analyte competitor)に付着結合される。その最も簡単な形態では、競合剤は 被検体分子であってそれに対して標識が直接に又は適当なリンカー基を介して付 着結合される被検体分子を含有してなるのが適当である。あるいは、免疫反応剤 に競合的に結合する被検体の類縁体が標識に付着結合される。被検体と被検体競 合剤は両者ともに免疫反応剤に対して競合し、被検体と被検体競合剤の両者と免 疫反応剤とによって形成された複合体が、支持体に結合された第一のオリゴヌク レオチド（免疫試薬の一部分を形成する）と第二のオリゴヌクレオチドとの間の 二重らせん形成によって支持体に結合される。次いで、被検体の濃度は、被検体 の不存在下で得られたベースラインの値に対して、支持体と標識の結合における 減少(reduction)を測定することによって決定される。あるいは、溶液中に残る 標識の量を測定し得るのは勿論である。 前記と幾つかの場合においては、種々の被検体を含有する溶液から前記被検体 を分離することが望ましい。これらの被検体を前記溶液（その可能な干渉成分を 含有する）から分離した後に、前記溶液に存在するその量は、アッセイシステム のいくつかの成分に結合さ れた標識を使用せずにそれ自体公知の方法で決定し得る。さらにまた、いくつか の被検体（例えば、ヘモグロビン及びヘモグロビンAlc）については、特定のタ ンパク質の固有吸光率を定量に使用できる。すなわち、免疫試薬及び免疫反応剤 と被検体との吸光度の差が、存在する被検体の直接測定値を与える。さらにまた 、ある場合には、試料中の被検体を全て予備標識することが可能である。例えば 、タンパク質はCy５を用いて予備標識でき、それぞれのタンパク質は蛍光測定に よって定量できる。従って、本発明のいくつかの態様によれば、相補的オリゴヌ クレオチド配列の対が、関心とする被検体の収集を促進するのに使用される。こ れらの態様においては、被検体用の免疫試薬被検体であって、被検体に特異的に 結合する免疫反応剤と、それに付着結合された第一のオリゴヌクレオチドとを含 有してなる被検体用の免疫試薬が使用される。第一のオリゴヌクレオチド配列に 相補的な第二のオリゴヌクレオチド配列は、支持体に結合される。前記免疫反応 剤と被検体との間で形成される免疫化学複合体は、前記のようにして第一のオリ ゴヌクレオチドと第二のオリゴヌクレオチドとの間の二重らせんの形成によって 収集される。前記支持体を溶液から取り出し、二重らせんを切り離して免疫複合 体を放出させた後に、被検体が溶液中に効率的に放出される。このようにして放 出させた被検体の定量は、適当な方法（例えば、被検体に付着結合された標識の 吸光度、蛍光などの測定）で定量し得る。これまでに説明した別の態様に関する ように、このアプローチは複数の被検体の定量に使用するのに適している。いく つかの場合には、成分の分離（例えば、クロマトグラフィー又は電気泳動によっ て）は検出の前に必要であるか又は適当であり得る。 本発明に従ってアッセイシステムの全てにおいてオリゴヌクレオチドとして使 用するためには、ホモポリマー系（すなわち、ポリdA・ポリdT及びポリdG・ポリ dC、ここでdA、dT、dG及びdCはそれぞれデオキシアデノシン、デオキシチミジン 、デオキシグアノシン及びデオキシシチジンである）及びヘテロポリマー系の両 方が極めて効率的に働くことが示されている。特に、ヘテロポリマーは単一の試 料中の複数の被検体の検出を、収集用の配列の特定の対の使用と、それぞれの被 検体の置換によって可能にする。適当なオリゴヌクレオチドとしては、慣用のDN A 及びRNA 塩基、DNA／RNA 塩基類縁体〔例えば、Frauendorf，A．& Engels，J. W.,の論文、Studies in Natural Products Chemistry,13,257(1993)；Milligan ，J.らの論文、J．Medicinal Chem.,36,1923(1993)参照〕及びペプチド核酸〔例 えば、Hanvey，J.C.らの論文、Science,258,1481(1992)；Burchard t，O．らの 論文、Trends in Biotechnology,11,384(1993)参照〕を含んでなるオリゴヌクレ オチドが挙げられるが、これらに限定されるものではない。一般に、塩基対を形 成し得るオリゴヌクレオチド（例えば、ワトソン−クリックの二重らせん又はフ ーグスティーンの三重らせんの形成）が本発明に従って使用するのに適している 。 収集するための適切なハイブリッド形成を確実にするためには、オリゴヌクレ オチドは少なくとも６個の塩基、好ましくは約10個の塩基、さらに好ましくは少 なくとも約20個の塩基、最も好ましくは約30個の塩基の長さをもつことが好まし い。当該技術において十分に理解されているように、形成された二重らせんの強 度はオリゴヌクレオチドの対の組成によってある程度まで決定され、特に安定な 二重らせんは例えば修飾した塩基又はペプチド核酸を使用して短い （すなわち、６〜１０個の塩基）オリゴマーを用いて形成し得る。 一般に、オリゴヌクレオチド対はそのそれぞれの配列の少なくとも部分にわた って完全に相補的であることがさらに好ましい。配列のこれらの相補的部分は、 少なくとも６個の塩基、好ましくは少なくとも約10個の塩基、さらに好ましくは 少なくとも約20個の塩基、最も好ましくは少なくとも約30個の塩基を含んでなる べきである。もちろん、当該技術においてよく理解されているように、適切な低 い緊縮条件を使用して、２つのオリゴヌクレオチドの間にわずかの誤対合がある 場合であってもハイブリッド形成を達成することができる。しかしながら、便宜 上、完全に相補的な配列を使用することが好ましい。一般に、支持体に結合され たオリゴヌクレオチドの量は、アッセイシステムの他成分中の過剰のオリゴヌク レオチドである。 本発明の一つの様相によれば、抗体又はその断片（特にFab'断片）が適当な結 合剤によってオリゴヌクレオチドに結合されている新規なオリゴヌクレオチド− 抗体複合体が提供される。種々様々な連結化学剤を使用し得る。一つのアプロー チに従って、ホモ二官能性の試薬（例えば、1,4-フェニレンジイソシアネート） が使用される。この好ましいアプローチに従って、ヘテロ二官能性の試薬が使用 され、かかる試薬は、オリゴヌクレオチドのアミノ基に特異的な第一の反応性基 （例えば、N-ヒドロキシコハク酸イミド）と、抗体又はその断片のチオール基に 特異的な第二の反応性基（例えば、マレイミド）とを含んでいる。かかるヘテロ 二官能性の試薬を使用すると実質的に高い収率が得られる。これに対して、ホモ 二官能性の試薬は抗体又はその断片の多数のアミノ基並びにオリゴヌクレオチド と反応し得（従って、生成物の混合物をもたらす）、適当なヘテロ二官能性の試 薬は特異的に反応して１対１の抗体／オリゴヌクレオチドの複合体を形成する。 Fab'断片は１個のチオール基しか持っていないので、この断片はオリゴヌクレ オチドとの複合体の形成に使用するのに特に適している。さらにまた、Fab'断片 −オリゴヌクレオチド・複合体は、全抗体−オリゴヌクレオチド・複合体に対す る本発明のイムノアッセイにおいて、特に競合結合アッセイにおいて優れた結果 を与える場合が多い。これは、Fab'断片はハプテン又は被検体について一つの結 合領域しか持っていないので、全抗体（これは前記ハプテン又は被検体について ２個の結合領域をもつ）に比べて競争結合反応においてより大きい感度を提供す るということによって合理的に説明し得る。 抗体／オリゴヌクレオチド・複合体の調製に使用される一つの好ましいヘテロ 二官能性の試薬は、N-スルホスクシンイミジル 4-(N- マレイミドメチル）シク ロヘキサン-1- カルボキシレート(スルホ-SMCC)である。しかしながら、当業者 によって容易に認められるように、種々の従来公知のアミノ基及びスルホヒドリ ル基指向架橋剤も本発明に従って同様に使用できる。かかる架橋剤は、例えばWo ng，S.S.の著作、Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking，CRC Press，Boca Raton，FL(1991)，pp.147-164 に記載されており、その記載は全て 本明細書に参考文献として参照される。この型の代表的な架橋剤としては、下記 の化合物：すなわちN-スクシンイミジル 3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート ；N-スクシンイミジルマレイミドアセテート；N-スクシンイミジル 3- マレイミ ドプロピオネート；N-スクシンイミジル 4- マレイミドブチレート；N-スクシン イミジル 6- マレイミドカプロエート；N-スクシンイミジル 4-(N-マレイミドメ チル)シクロヘキサン-1- カルボキシレート；N-スクシンイミジル 4-(p-マレイ ミドフェニル)ブチレート；N-スルホスクシンイミジル 4-(p-マレイミドフェニ ル)ブチレート；N-スクシンイミジル o- マレイミドベンゾエート；N-スクシン イミジル m- マレイミドベンゾエート；N-スルホスクシンイミジル m-マレイミ ドベンゾエート；N-スクシンイミジル p- マレイミドベンゾエート；N-スクシン イミジル 4-マレイミド-3- メトキシベンゾエート；N-スクシンイミジル 5- マ レイミド-2- メトキシベンゾエート；N-スクシンイミジル 3- マレイミド-4- メ トキシベンゾエート；N-スクシンイミジル 3- マレイミド-4-(N,N-ジメチル)ア ミノベンゾエート；マレイミドエトキシ[p-(N-スクシンイミジルプロピオナト) フェノキシ]エタン；N-スクシンイミジル4-[(N- ヨードアセチル)アミノ]ベンゾ エート；N-スクシンイミジル 3- マレイミド-4-(N,N-ジメチル)アミノベンゾエ ート；マレイミドエトキシ[p-(N-スクシンイミジルプロピオナト)-フェノキシ] エタン；N-スクシンイミジル 4-[(N- ヨードアセチル)アミノ]ベンゾエート；N- スルホスクシンイミジル 4-[(N- ヨードアセチル)アミノ]ベンゾエート；N-スク シンイミジルヨードアセテート；N-スクシンイミジルブロモアセテート；N-スク シンイミジル 3-(2-ブロモ-3-オキソブタン-1- スルホニル)プロピオネート；N- スクシンイミジル 3-(4-ブロモ-3- オキソブタン-1- スルホニル)プロピオネー ト；N-スクシンイミジル 2,3- ジブロモプロピオネート；N-スクシンイミジル 4 -[(N,N- ビス(2- クロロエチル)アミノ]フェニルブチ レート；p-ニトロフェニル 3-(2-ブロモ-3- オキソブタン-1- スルホニル)プロ ピオネート；p-ニトロフェニル3-(4-ブロモ-3- オキソブタン-1- スルホニル)プ ロピオネート；p-ニトロフェニル 6-マレイミドカプロエート；(2- ニトロ-4- スルホン酸- フェニル)-6-マレイミドカプロエート；p-ニトロフェニルヨードア セテート；p-ニトロフェニルブロモアセテート；2,4-ジニトロフェニル-p-(β- ニトロビニル)ベンゾエート；N-3-フルオロ-4,6- ジニトロフェニルシスタミン メチル3-(-4- ピリジルジチオ)プロピオンイミデートHCl 塩；エチルヨードアセ トイミデートHCl 塩；エチルブロモアセトイミデートHCl 塩；エチルクロロアセ トイミデートHCl 塩；N-(4- アジドカルボニル-3- ヒドロキシフェニル)マレイ ミド；4-マレイミドベンゾイルクロリド；2-クロロ-4- マレイミドベンゾイルク ロリド；2-アセトキシ-4- マレイミドベンゾイルクロリド；4-クロロアセチルフ ェニルマレイミド；2-ブロモエチルマレイミド；N-[4-{(2,5- ジヒドロ-2,5- ジ オキソ-3- フラニル)メチル}チオフェニル]-2,5-ジヒドロ-2,5- ジオキソ-1H-ピ ロール-1- ヘキサンアミド；エピクロヒドリン；2-(p- ニトロフェニル)アリル- 4- ニトロ-3- カルボキシフェニルスルフィド；2-(p- ニトロフェニル)アリルト リメチルアンモニウムヨージド；α，α- ビス[{p-クロロフェニル)スルホニル} メチル]アセトフェノン；α，α- ビス[{p-クロロフェニル)スルホニル}メチル] -p-クロロアセトフェノン；α，α- ビス[{p-クロロフェニル)スルホニル}メチ ル]-4-ニトロアセトフェノン；α，α−ビス[(p-トリルスルホニル)メチル]-4- ニトロアセトフェノン；α，α- ビス[{p-クロロフェニル)スルホニル}メチル]- m-ニトロアセトフェノン；α，α- ビス[(p-トリ ルスルホニル)メチル]-m-ニトロアセトフェノン；4-[2,2- ビス{(p-トリルスル ホニル)メチル}アセチル]安息香酸；N-[4-[2,2-2{(p- トリルスルホニル)メチル }アセチル]ベンゾイル]-4-ヨードアニリン；α，α- ビス[(p-トリルスルホニル )メチル]-p-アミノアセトフェノン；N-[{5-(ジメチルアミノ)ナフチル}スルホニ ル]-α，α- ビス[(p-トリルスルホニル)メチル]-p-アミノアセトフェノン；及 びN-[4-{2,2-ビス{(p-トリルスルホニル)メチル}アセチル]ベンゾイル-1-(p-ア ミノベンジル)ジエチレントリアミンペンタ酢酸が挙げられる。 本発明の種々の態様は、いくつかの代表的なアッセイについてさらに詳しく論 ずることによって例証し得る。サンドイッチアッセイの一例においては、被検体 (例えば、TSH)の個々のエピトープに結合する抗体(Ab₁及びAb₂という)の使用に ついて例証する。これらの抗体のうちの一つAb₁は、それ自体公知の方法でオリ ゴヌクレオチド（例えは、ポリdT）に適切に連結される。別の抗体Ab₂は同様に 、使用する抗体が特異的に結合する被検体の濃度を測定するのに使用すべき適当 な標識試薬（例えば、HRP）に適切に連結される。 サンドイッチアッセイでは、被検体と、オリゴヌクレオチドに連結された免疫 反応剤と、標識試薬に連結された免疫反応剤との間で複合体が形成される。当業 者には明らかであるように、全ての型のアッセイにおいて溶液中の複合体の形成 は、広範な条件の下で行い得る。効率的な測定を可能にするのに十分な濃度で溶 液中の複合体を形成させるのに必要な時間は、被検体と免疫反応剤（１種又は複 数）との濃度に大きく依存する。一般に、複合体の形成は、被検体の所定の濃度 についてより高い免疫反応剤濃度でより容易に生じる。従って、被検体に対して 過剰量の免疫反応剤、最も好ましくは少なくとも２倍過剰量の免疫反応剤が存在 するのが好ましい。サンドイッチアッセイ方式を使用して都合よく測定し得る被 検体濃度の範囲は特に広いものであり、約10^-3Ｍ〜約10^-22Ｍの濃度で存在する 被検体をサンドイッチアッセイにより測定し得る。 種々の型のアッセイの全てを使用する適当な濃度の複合体の形成は２〜３秒の 速さで生じ得るし、又は24時間程の長時間を必要とし得る。複合体形成の工程は 、好ましくは約６時間未満、最も好ましくは約３時間未満の時間を要する。また 、複合体の形成は広い温度 範囲にわたって生じ得、その範囲は免疫反応剤の変性温度までの上限で制限され る。複合体の形成は、好ましくは約15℃〜約70℃の範囲の温度、最も好ましくは （便宜上は）室温で行われる。また、pHはかなり広い範囲にわたって変化させ得 、またその限定因子もまた免疫反応剤の変性である。pHは標準的には約２〜約11 の範囲、好ましくは約４〜約10の範囲、最も好ましくは７付近である。当該技術 において周知であるように、種々の物質、例えばウマ又はウシ胎児血清タンパク 質を添加することが、溶液中で諸物質を保持するために及び非特異的相互反応を 最小限にするのに有効であり得る。しかし、かかる添加剤は臨界的ではない。複 合体の形成は典型的には、場合によって適当な非水性成分（例えば、アルコール 、エーテル、グリゴールなど）を約25％まで含有していてもよい水溶液中で行わ れる。 複合体を相補的オリゴヌクレオチドのハイブリッド形成用の支持体と接触させ ると、前記複合体は二重らせんを形成することによって支持体に反対に結合され る。本発明に従って使用される相補的オリゴヌクレオチド同士の間で複合体を形 成させるのに最適な条件の決定は、本質的に日常的な方法で実験的に決定し得る 。一般に、当該技術において周知であるように、塩（NaCl、KCl、NH₄Cl、第４級 アンモニウム塩類等）を約0.1 Ｍ〜約３Ｍの濃度で存在させることが、ハイブリ ッド形成を促進させるのに好ましい。あるいは、複合体の形成についての前記の 条件が同様に二重らせんの形成に適している。 特に、１対の相補的オリゴヌクレオチドについて二重らせんの形成が50％生じ る温度（融解温度、すなわちＴm という）は所定のオ リゴヌクレオチド対について常法により測定し得る。Ｔm は、配列の長さや組成 、及びオリゴヌクレオチドに用いられる特定の塩基の結合親和性を含めて多数の 因子により左右される。所定のオリゴヌクレオチド対について、Ｔm は温度を変 化させることによって及び特定の波長（例えば、254nm）で吸光度を測定するこ とによって、常法により分光分析により決定し得る。オリゴヌクレオチド対につ いてＴm が決定されると、一般的には、50％を越える結合が得られるようにＴm 以下の温度を使用することが望ましい。一般に、二重らせんの形成は複合体の形 成と同じ範囲内の温度で生じる。二重らせんの形成量を増大させるためには、よ り低い温度が好ましい。 次いで、支持体と、それに結合された物質とが未結合物質を含んでいる溶液か ら物理的に分離し得る。次いで、支持体と非特異的に会合するが複合体を形成し ていない試薬が、例えば支持体を穏やかに洗浄することによって容易に取り出し 得る。洗浄工程の間に適当な条件（例えば、洗浄溶液中の適当な塩濃度）を使用 することが、形成された複合体が成熟しないうちに解離されないことを確実にす るのに適当である。 最後に、結合された複合体は、適当な変性条件を使用して支持体から遊離させ 得る。次いで、標的化合物と会合した標識の量は、結合させた複合体を放出させ る前に又はその後で標識（例えば、酵素標識、着色標識、蛍光標識、化学発光標 識等）の性質によって決定される適当な手段によって測定される。 種々様々な支持体が本発明に従って使用し得る。種々の慣用のアッセイ方法に おいて使用するために、粒状又は粉末状の固体支持体が特に適している。これら の固体支持体は典型的には約１μｍ〜約 １インチの範囲の粒度をもつ。この種の支持体の調製に適した材料としては下記 のもの：すなわちポリビニリデンメタクリレート（例えば、ドイツ国ダルムシュ タット所在のMerk社からフラクトゲル（Fractogel）として、またペンシルバニ ア州フィラデルフィア所在のTosoHaas社からトヨパール（Toyopearl）として商 業的に入手し得る）；ポリプロピレン；ポリスチレン；ガラスビーズ；セルロー ス系材料、例えばセルロース系濾紙（例えば、カリフォルニア州アーケーディア 所在のStereogene Bioseparation，Inc.社から商業的に入手しえ得るアクチゲル （Actigel）及びバイオバインド（Biobind））；及びポリビニリデンフルオリド すなわちPVDF（カリフォルニア州サンフランシスコ所在のMillipore 社からイモ ビロン（Immobilon）として商業的に入手し得る）が挙げられるが、これらに限 定されるものではない。また、固体支持体は膜や繊維を含め、これらに限定され ないが種々の形態で使用し得る。さらに、支持体は種々の材料（例えば、ピペッ トチップ、マイクロタイタープレート壁、試験管等）の表面に塗布され得る。支 持体として使用するのに好適なものは、ポリビニリデンメタクリレート及びポリ ビニリデンフルオリドである。 代表的なポリビニリデンメタクリレート製品（例えば、前記の製品フラクトゲ ル及びトヨパール）は、バイオプロセッシングクロマトグラフィーにおいて使用 するのに適していると当業者に周知の親水性の大孔質充填剤である。前記製品は ビニルアルコールと共重合させたメタクリレート基材の支持体であり、そのメタ クリル主鎖構造は球状ビーズを硬質にする。これらの製品は、pH１〜14及び100 ℃までの温度で安定であり、耐化学侵食性であり、しかも微生物に よって分解されない。前記パッキングは種々の細孔サイズ範囲で利用できる。本 発明で使用するのに特に適したものはトヨパールHW-75 及び Fractogel-75F で あり、これらは約45μｍの粒度をもつ〔ペンシルバニア州フィラデルフィア所在 のTosoHaas社の“TosoHaas TSK-GEL Toyopear”(1989 年３月発行)〕。これらに 相当する特性をもつ別の適当な材料はもちろん当業者には容易にわかるであろう 。 本発明に従って使用される代表的なポリビニリデンフルオリド材料は前記のIm mobilon AV Affinity Membraneである。この製品は化学的に活性化された親水性 微孔質膜であり、これには種々のリガンドが共有結合により固定化される。固相 マトリックスは、生物学的活性の保持に関して共有結合固定化用の高い容量(＞1 00 μｇ／cm²)を提供する。基礎膜材料は低水準の非特異的タンパク質吸着量(＜ １μｇ／cm²)をもつ非相互作用性ポリマー（親水性ポリビニリデンジフルオリド ）である。前記の膜の外面及び内面全体は、アミノ基を有する物質の共有結合固 定化を可能にするために化学的に誘導される〔カリフォルニア州サンフランシス コ所在のMillipore 社の“Immobilon AV Affinity Membrane”(1988 年６月発行 )〕。また、別の相当する材料は当業者には明らかであろう。 さらにまた適当な別の固体支持体材料は光ファイバーである。化学選択性の固 定化試薬を有するファイバー光化学センサーは、迅速で、感度がよく且つ特異的 な分析器具である可能性をもつ。これらのセンサーは異なる屈折率をもつ２種類 の透明媒体の間の界面の光透過性を利用する。適切な条件下では、光は内部全反 射によって光導波路（例えば、水溶液中に浸した水晶ロッド）内に伝播すること ができる。この方法の一部として、消失性の波(evanescent wave)が水性相中に 波長の一部分を透過し、導波管表面の外の薄い消失性の波の帯域内に置かれた分 子と光学的に相互作用する。特に、ファイバー表面に結合された蛍光分子は、こ の消失性の波の帯域内に入り得、しかも消失性の波によって励起され得る。光フ ァイバーに共有結合的に結合されたオリゴヌクレオチドは、本発明に従って蛍光 標識を含んでいる免疫化学複合体を収集するのに使用し得る。このプロセスの結 果、蛍光標識（これは被検体濃度を表示する）は前記ファイバー表面で次第に消 えてゆく波の帯域にもたらされ、ファイバー軸に沿って光を伝播することによっ て励起される。得られる蛍光発光は前記ファイバーによって捕捉され、内部全反 射によって前記ファイバーの末端に配置された検出器に伝えられる。 本発明をファイバー光学検出器に適用することについての唯一の利点は、光フ ァイバーを二重鎖核酸複合体の単純な変性によって再生し得、このようにして別 の被検体試料の測定のための準備を容易にすることである。明確に異なる励起及 び／又は発光波長をもつ種々の蛍光分子を使用することによって、複数の被検体 の同時測定を行うことができる。あるいはまた、同時測定は種々のファイバー又 ファイバーの束をそれぞれ特定の被検体に対応する種々のオリゴヌクレオチドで 被覆することによって行うこともできる。均一相から出る信号を収集した後に、 ファイバーの個々のセットは、ある一定の時間で活性化し得、蛍光を測定して個 々の被検体の濃度を測定し得る。 オリゴヌクレオチドは種々の公知の方法を用いて支持体に結合し得る。一つの アプローチに従って、オリゴヌクレオチドは他の目的 のオリゴヌクレオチドの合成に慣用されるような方法で支持体上で直接に合成さ れ、粒状及び膜状の支持体はともにオリゴヌクレオチド合成用の基材として適切 に使用し得る。あるいは、反応性官能基（例えば、アミノ基又はチオール基）を 有するオリゴヌクレオチドを、それと反応性の適当な官能基を有する支持体上に 固定化させて、オリゴヌクレオチドと支持体との間で共有結合を形成させ得る。 さらに別のアプローチは、親和性結合によってオリゴヌクレオチドを支持体に結 合させることを伴う。例えば、ビオチニル化オリゴヌクレオチドをアビジン又は ストレプトアビジンを含有する支持体上に固定化し得る。もちろん、当業者には 明らかであるように、別の技法を同様に使用してオリゴヌクレオチドを支持体に 結合し得る。 相補的オリゴヌクレオチドの二重らせんを解離させるためには、種々様々な方 法を適切に使用し得る。オリゴヌクレオチドの対に最適な条件は慣用の実験方法 で都合よく決定し得る。多くの場合、脱イオン水を解離剤(cleaving reagent)と して使用し得る。これは、収集の時点で存在する高いイオン強度をもつ媒体と比 べて、低いイオン強度の媒体中に存在する増大した電荷−電荷の反発力により、 ハイブリッドのＴm を低下させることによると考えられる。ハイブリッド化対の 解離が所望するような速さ又は量でない場合には、濃厚な（例えば７Ｍ）尿素又 はホルムアミド溶液（例えば、30％〜60％水溶液）を解離に使用するのが適当で あり得る。これにより一般的にほぼ定量的な遊離が得られ、しかも多数のサイク ルにわたって同じ支持体を連続して再使用することを促進するという利点も得ら れるが、酵素標識にはそのような処理に感度を有するものもある。また、解離は 脱イオン水を使用して高められた温度でほぼ定量的に 行い得る。 使用すべき検出方法は標識の種類によって決定される。適度の感度には、蛍光 標識を使用できる。蛍光(fluor)は、チャンバー内で固相に結合させながら、又 は解離性結合を解離させ得る溶液中に放出させた後に測定し得る。放出された標 識の測定は多くの場合、結合された標識の測定よりも正確で都合のよいものであ り得る。下記の蛍光標識：フルオレセイン、ローダミン及びその誘導体、クマリ ン及びその誘導体、ヘキサメチルインドトリカルボシアニン及びその誘導体、並 びにジエチルチアカルボシアニン及びその誘導体を含めて種々様々な従来公知の 蛍光標識を適当に使用し得るが、これらに限定されない。標識は第二の免疫試薬 を形成する免疫反応剤（又はある場合には、被検体又はその競合類縁体）に、こ れらの標識に慣用され且つ当業者には容易にわかるような従来公知の化学的方法 により適切に結合される。適当な方法は、例えば前記のWong論文に記載されてい る。 一つの具体的態様によれば、固相は光ファイバーからなり得、また標識は蛍光 分子からなり得る。標識の濃度の測定は次第に消失する波のバイオセンサー技術 を使用してファイバー光学検出装置で適切に行い得、その後で免疫複合体を、支 持体から除去して再使用するための支持体を調製し得る。多数連続アッセイにお いて単一のバイオセンサーを使用できることは、従来の方法に比べて著しい利点 である。同様のアプローチが別の種類の標識（例えば、酵素標識）とともに使用 し得る。 より感度のよい試験には、酵素反応による信号の増幅がより強く且つより容易 に測定し得る応答を提供することから、酵素標識が用 いられる場合が多い。しかしながら、酵素標識は典型的は適当な反応容器、例え ば自動化装置の反応室中で又は二重らせんの解離によって反応室から遊離させた 後に、結合された酵素とともに基質溶液をインキュベーションする（相当な時間 を要する場合が多い）ことを必要とする。使用する周知の代表的酵素標識として は、次の酵素標識：すなわちアルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキ シダーゼ、β- ガラクトシダーゼ等が挙げられる。 これらの高い感度、迅速な応答及び測定の方法によって分解される傾向から、 化学発光標識が臨床自動化学装置に使用するのに特に適している。かかる化学発 光標識は例えば、Campbell，A.K.の著作、Chemiluminescence ：Principles an d Applications in Biology and Medicine，Ellis Horwood，England(1998)に記 載されており、本明細書に参考文献として参照される。この目的に適しているも のとして当該技術において周知の標識としては、アクリジニウムエステル、ルミ ノール及びその誘導体、ジオキセタン誘導体、エクオリン並びにルシフェリンが 挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの標識のうちのいくつ か（例えば、アクリジニウムエステル）とともに、適当なトリガー試薬（例えば 、アクリジニウムエステル標識についてはアルコール性過酸化水素）を添加して 、標識を反応室内で固相に結合させながら光を放出させ得る。あるいはまた、標 識を有する複合体を、先ず二重らせんから放出させ、次いで別の測定室中でトリ ガー試薬と溶液中で反応させ得る。光放出反応の後に、この種のほとんどの標識 は事後の信号を提供することができない。これは固体支持体の再使用に関して標 識のキャリオーバーの危険を最小限にする。 サンドイッチアッセイの操作全体を下記のスキームＩに一般的に図示する（代 表的な被検体TSH は甲状腺刺激ホルモンであり、標識 HRP はセイヨウワサビペ ルオキシダーゼである）。 本発明の一つの好ましい態様によれば、免疫化学複合体の収集に際して形成さ れる二重らせんを切り離すのに鎖置換法が使用される。このアプローチでは、オ リゴヌクレオチドハイブリッドが、過剰量のその補体に対するハイブリッド対の 一方の競争結合によって解離される。これは固体支持体の混合物を同時に使用す ることを可能にする。それぞれの固体支持体は、相補的オリゴヌクレオチドを含 んでなる標識含有免疫化学反応複合体を収集するために前記固体支持体に結合さ れた異なるオリゴヌクレオチドを有する。次いで、標識含有免疫反応複合体それ ぞれの放出を連続的に行ない会合した標識の選択的測定を可能にし得る。第一の アプローチにおいては、鎖置換は第一のオリゴヌクレオチド（すなわち、第一の 免疫試薬を形成させるために第一の免疫反応剤に結合されたオリゴヌクレオチド ）の配列に本質的に対応するオリゴヌクレオチド配列を使用して行われる。この アプローチに従って、置換剤が過剰量使用されて支持 体に対する結合において第一の免疫試薬と競争する。例えば、dT25-HRP（dT25は 25個のデオキシチミジン単位である）及びフラクトゲル-dA30（dA30は30個のデ オキシアデノシンである）が結合対として使用され、またdT25-HRPがフラクトゲ ル-dA30 からdT25を使用する競合置換によって放出された。置換は実質的に過剰 のdT25を添加することによって観察される。 別のアプローチにおいては、鎖置換剤として、第二のオリゴヌクレオチド（す なわち、支持体に結合されたオリゴヌクレオチド）に本質的に対応するオリゴヌ クレオチド配列が使用される。上記の例においては、これは放出剤としてdA- オ リゴヌクレオチド（例えば、dA30）の使用を伴う。このアプローチは幾つかの優 れた利点を提供する。最初に、第一のオリゴヌクレオチドに対応する置換剤が、 支持体の空いた部位に結合することは、第一のオリゴヌクレオチドに対応するす でに結合されている配列を置換することよりも一般に容易である。さらにまた、 第一のオリゴヌクレオチドに対応する置換剤によって置換された第一のオリゴヌ クレオチドを含有する複合体は、その後に支持体上の残存する利用可能な部位に 結合され得る。従って、免疫化学複合体を置換する前に、第一のオリゴヌクレオ チドに次々に正しく対応するオリゴヌクレオチドを用いて支持体上の利用可能な 部位全部をブロックするのが特に都合がよい。第二のオリゴヌクレオチドに対応 する置換剤は支持体に結合することができないが、免疫化学複合体の置換を介し てのみ結合できる。従って、第二のオリゴヌクレオチドに対応する置換剤は、免 疫化学複合体に対する競争において、結合された第二のオリゴヌクレオチドより も有効であり得る。最後に、第二のオリゴヌクレオチド配列による 対応する試薬による置換は、固体支持体を再使用する準備をさせ、これに対して 第一のオリゴヌクレオチドに対応する配列による置換の後には、支持体は得られ た置換剤／支持体二重らせんを変性させることによる再生を必要とする。これは 自動化臨床化学装置を用いて連続イムノアッセイを行う際の特定の利点である。 このアプローチを以下のスキームIIに示す。 別の態様においては、競合アッセイ法において別の被検体を用いて本発明の方 法を例証するために、フェノバルビタールを基材とする系を用いた。従って、フ ェノバルビタール抗体Fab'-dC20 複合体とフラクトゲル−dG25とが調製された。 アッセイはスキームIII（スキーム中、Pbはフェノバルビタールであり、Pb-Fは フェノバルビタール−フルオレセイン複合体である）に示すようにして行った。 信号を放出させるために、最初に前記の系を７Ｍ尿素を使用して標準化し、そ して許容し得る標準曲線を得た。その後に、鎖置換法を使用して許容し得る標準 曲線も得た。この鎖置換法はTSH とフェノバルビタールの両方の系について有効 に働いた（それぞれ、１分間で約20％放出を与え、12分間で約50％の放出を与え る）。 これまでに説明した方法が多くの場合において都合がよいことは明らかである が、ある場合には解離プロセスは所望するよりも遅いものであり得る。従って、 本発明のこの要旨の別の態様によれば、オリゴヌクレオチドは放出プロセスを高 めることをさらに意図し得る。この態様に従って、ヘテロポリマー状オリゴヌク レオチドを用いるのが好ましい。置換すべき試薬担持オリゴヌクレオチドに対す る置換剤の相補性の領域は、置換剤を含んでいる二重らせんをより安定にさせる ように、固体支持体上のオリゴヌクレオチドに対する試薬担持オリゴヌクレオチ ドの相補性の領域よりも十分に大きいものである。一般に、置換剤と試薬担持オ リゴヌクレオチドとの間の重なりの程度は、支持体に結合されたオリゴヌクレオ チドと試薬担持オリゴヌクレオチドとの間の重なりよりも少なくとも塩基３個分 、さらに好ましくは少なくとも塩基約５個分、最も好ましくは少なくとも塩基約 ８個分まで大きいものであるべきである。 一つの代表的な態様を以下に例示する。オリゴヌクレオチド フラクトゲル固体支持体に結合される。オリゴヌクレオチド 免疫反応剤に結合される。オリゴヌクレオチド 置換剤として使用される。Ｌは検出標識を表し、Ｉは免疫化学複合体： を表す。 この系は著しく加速された反応速度を与え、10分間でほとんど完全な放出を与え 、１分間で約80％の放出を与える。予期されるように、より高い温度を使用する と、37℃＞30℃＞22℃の順で放出の速度をさらに向上させた。相当するホモポリ マー系における放出は置換剤オリゴヌクレオチド125 μｇを必要とするのに対し 、この増強系は置換剤2.5 μｇと125 μｇとの間には有意な差を示さなかった。 また、支持体に結合されたオリゴヌクレオチド中への１個の塩基誤対合の組み込 み(incorporation)は収集に影響しないが、放出を加速することも認められた。 この増強置換法はフェノバルビタールアッセイに適合した。１分間の置換はフ ェノバルビタール０〜80μg/mlの範囲にわたり極めて申し分のない標準曲線を与 えた。置換剤オリゴヌクレオチド2.5 μg 使用と125 μg 使用との間には有意な 差はなかった。条件を最適化することによって、均一インキュベーション１分、 収集１分及び置換１分で許容し得る標準曲線が得られた。固体支持体は信号に有 意な変化を生ずることなく少なくとも８回使用できることが示された。 本発明の特に好ましい態様に従って、２種以上の被検体が前記アプローチの１ つ又はそれ以上を使用して同時に測定される。増強鎖置換法は多数の被検体を同 時に測定するのに特に適している。この特に好ましい態様に従って、複数の被検 体それぞれに対応する信号は適当な相補的オリゴヌクレオチドを用いて連続的に 溶出することによって選択的に放出させることができる。放出後に、固体支持体 は再使用するために容易に調製される。多数の被検体の能力(capability)は、多 数の反応様式を伴う単一の均一免疫化学反応の後に、単一の試料から多数の複数 の被検体を分析するのに利用し得る。 典型的なシステムを、テオフィリンとフェノバルビタールという２種類の被検 体の同時測定について規定した。被検体それぞれをフルオレセイン標識に複合さ せた。テオフィリンモノクロナール抗体は第一のオリゴヌクレオチド(Oligo-1) に複合させ、フェノバルビタールモノクロナール抗体は第二のオリゴヌクレオチ ド(Oligo-2)に複合させた。テオフィリンアッセイについて特異的な固相は、フ ラクトゲル固体支持体上で0ligo-1 に相補的なオリゴヌクレオチド(Oligo-1')を 合成することによって調製した。フェノバルビタールアッセイについて特異的な 固相は、フラクトゲル固体支持体上でOligo-2 に相補的なオリゴヌクレオチド(O ligo-2')を合成することによって調製した。次いで２つの固体支持体をアッセイ の前に一緒にした。また、適当な２種類の置換オリゴヌクレオチド(それぞれOli go-1'' 及びOligo-2'')も調製した。 ２種類の被検体を含有する試料を、２種類の被検体フルオレセイン複合体と２ 種類の抗体−オリゴヌクレオチド複合体とを用いて同時に均一免疫反応にかけた 。次に、免疫反応混合物を一緒にした複 数の固相上に収集した。一緒にした複数の固相を洗浄した後に、置換するオリゴ ヌクレオチドを連続的に加え、洗浄液で分散させた。次いで、得られた溶液相の フルオレセインを測定した。読み取り値は試料中の被検体濃度の測定値の逆の値 を与える。次いで、２種類の固相試薬は、所望ならば７Ｍ尿素で洗浄し、次いで 緩衝液で洗浄することにより、再使用するために調製し得る。 この複数の被検体のシステムを、スキームIV（但し、Thはテオフィリンであり 、Pbはフェノバルビタールであり、Ｆはフルオレセインである）に図示する。 勿論、被検体それぞれの濃度は対応する複合体を固体支持体から連続的に放出さ せた後に適切に測定し得る。さらにまた、固体支持体はアッセイが完結した後に は再使用する準備ができている。特に好ましい態様においては、前記の増強置換 オリゴヌクレオチドは、集した複合体の連続的な放出を促進するのに使用し得る 。このアプロ ーチを使用して、テオフィリンとフェノバルビタールの両方について許容し得る 標準曲線を得た。両方ともに単一試料中に存在し、測定は同時免疫反応の後に連 続的に行われる。 また、３種類の被検体（フェノバルビタール、テオフィリン及びTSH）の同時 測定も行っており、これら３種類の被検体の全部について許容し得る標準曲線が 得られた。この方式では、フェノバルビタールとテオフィリンのアッセイはフル オレセインを標識として使用する競合結合アッセイであり、これに対しTSH の検 定はHRP を標識として使用するサンドイッチアッセイである。これは、種々の標 識を使用する種々の方式の複数のアッセイが同時被検体アッセイの概念に相当す ることを例証している。 当業者には容易にわかるように、例示のために本明細書で説明した複数のアッ セイ方式は決して限定的な(exclusive)ものでもないし、それらが必ずしも代わ りうる(alternative)ものでもない。種々様々なアッセイ方式を種々の被検体濃 度の測定法で採用し得る。慣用の手動測定法の他に、本発明のアッセイ法は例え ば臨床分析装置本体に対して付属品をもつ自動化装置を使用して行い得る。 ディップスティック(dipstick)アッセイ方式では、適当な大きさ(dimennsion) をもつシート又はプラスチック片の形状のディップスティックは、相補的オリゴ ヌクレオチドと標識とを含有する免疫化学複合体の収集に使用するための結合オ リゴヌクレオチドを有している。次いで、標識は、例えば適当なオリゴヌクレオ チドを使用して置換することによって又は尿素溶液を用いてオリゴヌクレオチド を解離させる(cleave)ことによって放出させ得る。あるいはまた、多数のウェル (well)をもつマイクロタイタープレート又は多数の別 個の領域をもつ膜が収集装置として機能し得る。被検体は種々の手段、例えば蛍 光、化学発光、電気化学発光、電荷結合デバイス(CCD)カメラ集成装置等で検出 し得る。 単一試料中の多数の被検体は同様に多数の種々の方法で測定できる。一つのア プローチによれば、多数のディップスティック（それぞれは結合した特異的オリ ゴヌクレオチドを有する）を適当な免疫反応複合体を選択的に収集するのに使用 する。次いで、それぞれのディップスティックを洗浄し、溶液に入れて標識化被 検体を放出させる。所望ならば、信号はディップスティック上で読み取ることが できる。あるいはまた、多数のオリゴヌクレオチドを単一のディップスティック 上に配置する。個々の被検体を適当なオリゴヌクレオチドで置換することによっ て選択的に放出させる。 バイオセンサー方式では、バイオセンサー（これは膜又は検出装置それ自体の 前面であり得る）はそれに結合された第二のオリゴヌクレオチドを有する。次い で相補的第一のオリゴヌクレオチドに複合されている生特異的(biospecific)試 薬を、適当な反応容器（例えばマイクロタイターウェル）又はフロー系(flow sy stem)中で試料及び標識した試薬と適当に結合させる。短時間の均一反応（これ は一般的に迅速に進行する）のた後に、バイオセンサーを反応容器中で試料と接 触させるか又はフロー系を前記センサーと接触させる。短時間で接触させて収集 した後に、センサーを第一の反応容器から取り出し、オリゴヌクレオチドハイブ リッド結合を防止するのに十分なイオン強度をもつ洗浄溶液を含有する第二の反 応容器に浸す。同様に、フロー系の態様では、洗浄液をセンサー表面に流す。検 出信号が蛍光標識である場合には、洗浄工程を必要とせずに測定す ることが可能であり得る。あるいは、読み取りは洗浄工程の後に直接に行い得る 。検出信号を得るために化学反応を必要とする場合には、次いで、センサーを必 要な付加的な試薬（１種又は複数）に暴露し、次いで信号を読み取る。読み取り を行った後に、形成されたハイブリッドを解離させるためにセンサー表面を適当 に処理して（例えば、置換剤及び／又は解離溶液で洗浄し、次いで脱イオン水又 は他の洗浄溶液で洗浄する）次の測定のために調製する。次いで、除去し得る生 特異的試薬はそれぞれの所望の試験に供給されるので、同じ検出デバイスを種々 の試験を行うのに使用し得る。 検出デバイス表面に又は前記表面のすぐ近くに被膜を使用すると、より大きい 感度を付与するという利点を有する。特に、蛍光又は化学発光測定においては、 検出器に対する信号源と検出器とが実質的に接近して連結されるという利点があ る。また、別の検出方式を用いて、（バルク溶液で生じる反応よりもむしろ）局 部反応を観察すると高められた感度を収得し得る。 当業者に容易に認められるように、この特定のアプローチは多数の実行に対し て容易に適している。特に、生特異的試薬はセンサーに必ずしも必須ではないの で、幾つかの態様はバイオセンサーの一般的な定義の範囲に厳密には適合しない 。再使用し得る収容要素（member）は例えば測定用セル又はキュベットの内側に 被膜の形状で使用し得る。試薬は前記セル又はキュベットの中に又はその中を通 してポンプで送液され、検出デバイスは前記キュベットの中で又はそれを通して あるいはキュベットの外にポンプ排出される溶液中で読み取りを行う。１組の特 別に被覆したキュベット又は被覆された壁をもつマイクロタイタープレートを取 り付けた自動化臨床化学装 置を、この方法で不均一免疫アッセイを行うのに都合よく使用し得る。この目的 には、キュベットが反応サイクル中に適切に使用される。 特に好ましい態様においては、流路に沿って直列に配置した又は反応容器の側 面を通して挿入された１群の蛍光センサーを用いることにより、単一の試料につ いて多数の測定が行われる。それぞれのセンサーは、膜の液相に面した側に結合 されたオリゴヌクレオチドを有する膜を通して前記溶液と接触する。それぞれの 膜は異なるオリゴヌクレオチドを含有していてもよい。使用すべき生特異的試薬 （例えば、抗体又は競合結合性ハプテン）のそれぞれは、複数の膜の一つに結合 されたオリゴヌクレオチドの一つに相補的な異なるオリゴヌクレオチドに連結さ れる。１組の標識された生特異的試薬〔それぞれは同じ蛍光標識（例えば、フル オレセイン）に結合されている〕も提供される。試料は、オリゴヌクレオチドを 結合した生特異的試薬及び標識された生特異的試薬と均一溶液中で反応させる。 免疫化学複合体が形成され、反応溶液がセンサーと接触すると、それぞれ異なる 生特異的試薬（適量の結合された標識種を有する）は対応するセンサーの表面上 の膜に結合する。次いで、それぞれのセンサーで信号が得られ、信号は特定の被 検体の濃度の測定値を与える。この態様で使用するためには、蛍光を次第に消え る波として検出することができるファイバー光学プローブの形態のセンサーが特 に有用である。 ヘテロプロセッサー(heteroprocessor)方式においては、複数の固体支持体の 一つ又は組み合わせが適当なプローブ（例えば、使い捨て可能なピペット又はシ リンジチップの内部に）に入れられる。 本発明の具体的な利点はかかるプローブを再使用できることである。かかるプロ ーブの従来の用途の大部分は１回の使用に限定されている。（１回使用の被覆ピ ペットチップの例は米国セントルイス所在のbioMeriux Vitek，Inc．から出され ているVIDAS Immunoanalysis System で使用されるものである。）均一免疫化学 反応は、例えばマイクロタイターピペットのウェル中で実施し得る。前記ウェル から得られる溶液と、収集用のチップ中の支持体とを、前記溶液を連続的に吸引 及び排出することによって繰り返し接触させる。収集の完結に十分な時間の後に 、洗浄液を同様に吸引及び排出させる。次いで、所定の被検体用の免疫化学複合 体反応鎖を、適当なオリゴヌクレオチドを連続的に吸引及び排出させる適当な方 法（例えば、置換剤）で放出させる。このようにして多数の被検体が同じプロー ブから収集される。それぞれの被検体はそれと対応する置換オリゴヌクレオチド と接触することによって放出される。 流動装置(flow-through system)においては、収集性オリゴヌクレオチドを含 有する固体支持体が管内に配置される。被検体を含有する試料が管内を通して移 動し、次いで連続的に洗浄及び置換される。管への溶液の送液は、例えば採取管 から空気を回収するために蠕動型又は他の型のポンプを使用して適切に達成され る。あるいは、空気圧を使用して流体を管内に押し出し得る。多数の管をバルブ 装置とともに都合よく使用し得るし、又は複数の連続した管を採集部分に取り付 け得る。あるいは、１組の管を排気可能なチャンバーに入れたターンテーブルに 取り付ける。蠕動型（又は別種の）ポンプが排気によって液を適当な管に押し出 すのに使用される。管内を通る液の移動は、供給管(source tube)に空気を押し 込むためには 蠕動型又は別種のポンプを使用して達成し得る。多数の供給管をバルブ装置とと もに使用し得るし、又は複数の連続した供給管を連続的に取り付けることができ る。あるいは、１組の供給管を、例えば、適当な管から液を固体支持体を含有す る出口ラインに加圧して圧送し得、加圧可能なチャンバーに入れたターンテーブ ルに配置し得る。 本発明は添付の例を参照してよりよく理解し得る。例は単なる例示を目的とす るものであり、本明細書に添付の請求範囲に定義されるような本発明の範囲を限 定することを意図するものと解釈されるべきではない。例１ Fab'- オリゴヌクレオチド複合体の調製 腹水症体液から得られる抗体をプロテインＡアフィニティーカラムを使用して 精製するために、プロテインＡカラムを10カラム容量の結合用緩衝液で平衡化さ せた。プロテインＡ支持体、結合用緩衝液（カタログNo.21007）及び溶出用緩衝 液（カタログNo.21009）はイリノイ州ロックフォード所在のPierce社から入手し た。装入し得る腹水症体液の量（ゲル１ml当たり抗体６mg）を算出し、次いで結 合用緩衝液で１：１に希釈した。試料を装入し、10カラム容量の結合症用緩衝液 を流した。このカラムを溶出用緩衝液（５カラム容量）で溶出した。得られた溶 出液を0.1 Ｍクエン酸ナトリウム(pH=3.5)で透析した（４回）。 (Fab')₂を調製するために、ペプシン１mgを0.1Mクエン酸ナトリウム(pH=3.5)1 00μl に溶解し、これにIgＧ試料25mgを加えることによって、抗体のペプシン消 化を行った。前記試料を37℃で４時間 インキュベートした。３Ｍトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを用いてpH を７に調整した。等容量の飽和(NH₄)₂SO₄を使用して(Fab')₂を沈殿させた。試料 を４℃で１夜振盪した。前記試科を４℃で60分間10,000RPM で遠心分離した。得 られた物質を0.1 Ｍ NaHCO₃(pH=8.2)３mlに再溶解し、0.1 Ｍ NaHCO₃で透析した （４回）。 ３mlの(Fab')₂(約８mg又は11 Abs₂₈₀)に0.5 Ｍジチオエリトリトール(DTE)760 μl と0.5 Ｍ EDTA 40μl とを加えた。DTE は滴下した。得られた溶液を室温で １時間インキュベートした。前記試料を1.5 ×30cmのG25 カラムに装入し、５m Ｍ EDTA(pH7.0)を含有する0.1M PBS（１回）でFab'を溶出した。 抗体又はその断片と結合させるための配列 リゴヌクレオチドの5'-NH₂誘導体（Oligo-NH₂）を調製するために、60Abs₂₈₀の オリゴヌクレオチドを水500 μl に溶解した。スルホスクシンイミジル 4-(N-マ レイミドメチル)シクロヘキサン-1- カルボキシレート(Sulfo-SMCC ;Pierce社か ら商業的に入手し得る）7mg を0.2 Ｍ NaHCO₃(pH=8.2)500 μl に溶解した。混 合した後に、溶液を室温で１時間インキュベートした。試料をG₂₅カラム(1.5×5 0cm)に充填した。SMCC−オリゴヌクレオチドを水で溶出した。 Fab'- オリゴ複合体を調製するために、82.5Abs₂₆₀のSMCC−オリゴ(〜10ml)に NaCl 2.78gを加え、次いで1000μl の10×PBS を加えた。10×PBS はNaCl 80g、 KCl 22g、Na₂HPO₄ 14.4g 及びKH₂PO₄ 2.49gを水１リットルに溶解することによ って調製した(pH=7.4)。溶液を攪拌してNaClを溶解し、次いで6.6mg のFab'と混 合した。最 終濃度は３Ｍ NaCl 及び２m Ｍ EDTA であった。マサチューセッツ州ビバリー所 在のAmicon Inc．社から得られるCentricon-３フィルター（全部で８個のCentri con）に２mlのアリコートを入れた。試料を6000RPM 及び23℃で２時間遠心分離 した。試料を12℃でさらに３時間6000RPM で遠心分離し、次いで遠心分離器中に １夜放置した。管全部を一緒にし、Centricon-３フィルターを0.1Mトリス(pH ＝ 8.0)100 μl .5mM EDTA及び一緒にした洗浄液で洗浄した。次いで、生成物を、 カリフォルニア州Hercules所在のBioRad社から得られるP100 バイオゲル（Biog el）15×50cmカラムを使用して精製した。カラムを水で溶出し、260nm/280nm の 吸光度比が約1.25のものを含有する溶出画分を一緒にした。生成物をBioRad社か ら得られるDEAEバイオゲル1.5 ×10cmカラムでさらに精製し、0.1 Ｍトリス／Na Clの段階的濃度勾配（すなわち、0.1M NaCl、0.25M NaCl、0.5M NaCl 及び１M N aCl、全て５m ＭのEDTApH8.6 を含有する）を用いて溶出した。得られた複合体 のAbs₂₆₀／Abs₂₈₀の比は通常は1.5 〜1.7 であった。単離した生成物の収率は85 ％であった。 Fab'- オリゴ複合体の品質を調べるために、Fab'- オリゴ複合体の幾つかを５ Abs₂₈₀/ml まで濃縮した。次いで、Beckman Instruments 社から得られる電気泳 動用のSPE-IIパラゴンゲルキット（Paragon Gel KiT）（アガロースゲル）を製 造メーカーの指示書に従って用いて、生成物をクマシーブルーで染色した。ゲル によりFab'-オリゴ複合体の形成が確認された。例２ DITC リンカーを使用する抗体−オリゴヌクレオチド複合体の精製 例１の方法でプロテインＡを使用して腹水症体液から抗体を精製した。前記抗 体と反応させるためのオリゴヌクレオチドを調製するために、1,4-フェニレンジ イソシアネート(DITC)3.8mg をジメチル ホルムアミド(DMF)1.5mlに溶解した。71Abs₂₆₀のオリゴ-NH₂を0.1 Ｍホウ酸ナト リウム(pH9.3)100μl に溶解した。上記の２種類の溶液を十分に混合し、暗所で 室温で２時間インキュベートした。得られた反応混合物を６mlのn-ブタノール／ 水（１：１）で抽出し、有機層を除去した。等容量のn-ブタノールを加え、容量 が約100 μl になるまで抽出を続けた。抽出液を一緒にし、高速真空により乾燥 して生成物(DITC-オリゴ)を得た。 得られたDITC- オリゴヌクレオチドを0.1 Ｍホウ酸ナトリウム(pH 9.3)200 μ l に再溶解した（合計で73Abs₂₆₀）。濃縮したPb-IgＧ（フェノバルビタールに 対するIgＧ抗体）389 μl を加え、溶液を十分に混合し、暗所中で室温で１夜イ ンキュベートした。得られた生成物をP100カラムを用いて0.1 Ｍトリス（ヒドロ キシメチル）アミノメタン(ｐH 7.5)、５m Ｍ EDTA で溶出して精製した。第二 のピーク中の画分を一緒にした。次いで、生成物を、0.05Ｍトリス(pH8.6)を用 いて平衡化したDEAEバイオゲルA カラムを用いて精製し、例１に記載のようにし てNaClの段階的濃度勾配、0.1 Ｍトリス(pH8.6)、５m Ｍ EDTA を用いて溶出し た。0.25M NaClで溶出した画分を一緒にした。得られた生成物、Pb-IgG- オリゴ ヌクレオチド（オリゴヌクレオチドに複合した抗体とフェノバルビタール）の品 質をBeckman Instruments 社から得られるSPE-IIパラゴン（Paragon）ゲルを流 すことによって確認した。得られたゲルにより所望の複合体が約30％の収率で生 成したことが確認された。 例３ フラクトゲル−オリゴヌクレオチドの調製 Millipore 社（カリフォルニア州サウスサンフランシスコ所在）から得られる 15μモルカラムにフラクトゲル-OH(150mg)を充填した。オリゴヌクレオチドを標 準的ホスホロアミダイト化学〔Gait，M.J.の著作、Oligonucleotide synthesis :A practical approach，IRL Press，Oxford，U.K.(1984)〕を使用して合成した 。固体支持体をバイアル管(vial)に入れ、濃アンモニア６mlを加え、バイアル管 を密封し、次いで65℃で４時間加熱した。上清をデカントし、上記支持体を水20 mlで洗浄した。これを洗浄液の260nmでの読み取り値が0.0 に近くなるまで反復 した。この工程によりヌクレオシドからの保護基の除去が確実になされた。例４ セルロースポリＡを固体支持体として使用するTSH のイムノアッセイ このアッセイ法では、TSH 標準液（０、0.1、0.5、2.5、10、25及び50μIU/ml ）200μl をHarrisらの米国特許第4,871,683 号明細書に記載の種類のMCS 膜カ プセル中でHRP-Ab₂100 μl 及びポリdT-Ab₁ 20 μl と混合した。前記明細書の 記載全部が本明細書で参照される。混合物を振盪しながら37℃で１時間インキュ ベートした。セルロース−ポリdAスラリー60 μl を加え、37℃で１時間振盪し ながら免疫化学複合体を収集した(harvested)。得られた生成物を１M NaClで３ 回洗浄した。HRP 用のオルソフェニレンジアミン(ODP)を加え、混合物を室温で3 0分間インキュベートした。その色は492nm で赤であった。得られた結果を表１ に報告する。 例５ セルロースポリＡを固体支持体として使用するTSH の化学発光イムノアッセイ TSH 標準（例４に記載のものと同じもの）200 μl を、MCS カプセル中でHRP- Ab₂ 100 μl 及びポリdT-Ab₁ 20 μl と混合した。混合物を振盪しながら37℃で １時間インキュベートした。セルロース−ポリdAスラリー 60 μl を加え、37℃ で１時間振盪しながら免疫化学複合体を収集した。得られた生成物を１M NaClで ３回洗浄した。それぞれのカプセルに水200 μl を加え、カプセルを40℃で10分 間加熱した。次いで、上清をガラス管に移した。アメルライト（Amerlite）増強 化学発光信号試薬〔Arlington Heights 社（イリノイ州所在）製〕400 μl をそ れぞれのガラス管に加え、Berthold Analytical Instruments(メリーランド州Ga itherburg 所在)から入手し得るバーソルドルミノメーター（Berthold Luminome ter）を用いて１分後に光強度を測定した。得られた結果を表２に報告する。 例６ 増強標準置換法を使用するTSH のサンドイッチイムノアッセイ このアッセイ法では、下記の配列をもつオリゴヌクレオチドを使用した。 前記のようにして、上記オリゴヌクレオチドを固体支持体(SS)又は抗体(Ab₁) に連結するか、あるいは直接に置換剤： として直接使用した。 一連のカプセル中で、TSH-標準(０、0.25、１、５、15及び50μIU/ml ：200 μ l)を、TSH-Ab₂-HRP(100 μl)＋TSH-Ab₁-オリゴヌクレオチド(0.01Abs₂₈₀)に加え た。混合物を連続的に振盪しながら37℃で30分間インキュベートした。それぞれ のカプセルにフラクトゲル−オリゴヌクレオチド(TSH配列、配列番号４)５μl 充填容量を加え、カプセルを37℃で15分間振盪した。次いで、カプセルから液全 部を取り出し(blown out)、支持体を１M NaCl（これもまた取り出す）で３回洗 浄した。TSH-置換剤鎖(１Abs₂₆０：１M NaCl中に200μl)を加え、カプセルを37 ℃で２分間振盪した。内容物を試験管に取り出し、100 μl を色発現（基質とし てOPDを使用する）用にピペットで取り出し、吸光度を測定した。固体を１M NaC l（これもまた流し出す）で２回洗浄した。 再使用するための固体支持体を調製するために、７Ｍ尿素200 μ l をそれぞれのカプセルに加え、カプセルを37℃で15分間振盪し、次いで内容物 を取り出した。次いで、固体支持体を１M NaClで６回洗浄して別のアッセイ用の 固体支持体を調製した。 得られた結果を表３に報告する。 例７ フェノバルビタール-Fの合成 アミノ- フェノバルビタール58.92mg(0.137 ミリモル)を、トリエチルアミン2 0μl を含有する無水エタノール２mlに溶解した。フルオレセインイソチオシア ネート（異性体Ｉ、ウィスコンシン州ミルウォーキー所在のAldrich Chemicals 社から入手し得る）65.50mg(0.126 ミリモル)を加え、混合物を室温で１夜攪拌 した。反応混合物にシリカゲルを加え、前記混合物を蒸発させた。残留物を、シ リカゲルカラムクロマトグラフィー（２×20cm）により溶出液としてMeOH／CH₂C l₂(10 〜40％、v/v)濃度勾配を使用して精製した。所望の生成物を含有する画分 を一緒にし、蒸発させて生成物80mgを得た（収率80％）。 例８ テオフィリン-Fの合成 アミノ- テオフィリン238mg（１ミリモル）を、トリエチルアミン200 μl を 含有する無水DMF ５mlに溶解した。フルオレセインイソチオシアネート(異性体 Ｉ)389mg（１ミリモル）を無水DMF 750 μl に溶解し、次いでこの溶液を先の溶 液に加えた。反応混合物を室温で１夜攪拌した。反応混合物の溶媒を除去乾燥し た。得られた残留物をメタノールに溶解し、シリカゲル１g を加えた。メタノー ルを除去し、残った橙色粉末を溶出液としてCH₂Cl₂／MeOH(80/20、v/v)を使用し て、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにかけた。生成物を収率69.4％(435.5 mg)で得た。 例９ ヘテロプロセッッサーを使用するフェノバルビタール単一被検体のイムノアッセ イ ヘテロプロセッサーは、一連のシリンジプランジャーの動きを特定の時間的な 配列で制御する装置である。固体支持体を正しい位置に保持するために一端にポ リエチレンフィルターを有する一連の特殊なピペットチップを前記シリンジに取 り付けた。プランジャーを引き上げると、液体はピペットチップを通って引き上 げられ、固体支持体に接触する。ピペットチップを通る液体の容量は50μl から 500 μl まで変化させることができ、典型的には前記装置は100 μl にセット される。プランジャーを押し下げると、液体はピペットチップから試料カップに 押し戻される。 下記のオリゴヌクレオチド配列を使用した。 アッセイは以下のように設計した。 一連の試料カップ(Beckman Instruments社から入手できる)中で、試料又は標 準液（検量液）20μl をそれぞれのカップのPb-F 500ng及び0.05Abs₂₈₀のPb-Fab '-オリゴヌクレオチドに加えることによりインキュベーションを行った。(Pb-Fa b'- オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドと複合された、抗体Fab'断片と フェノバルビ タールである。)試料を室温で５分間インキュベートした。 収集は、充填されたフラクトゲル−オリゴヌクレオチド(Pb 配列配列番号１) ５μl を含むヘテロプロセッサーチップの下に試料カップを置き、ヘテロプロセ ッサーチップが試料溶液に浸るように試料カップを上げることにより行った。収 集工程は15分間上下運動を繰り返すことにより行った。次いで、試料カップを取 り除き、ヘテロプロセッサーチップを１M NaClで2 回洗浄した。 それぞれの空のカップに200 μl の1M NaCl 中のPb- 置換剤（配列番号３）１ Abs₂₆₀をピペットで測り取り、そのカップをヘテロプロセッサーチップの下に置 くことによって置換を行った。支持体と置換体の間で３分間接触させた後に、上 記カップを取り除いた。それぞれのカップから溶液100 μl をピペットで測り取 り、それを0.1 Ｍトリス(pH=7.5)1.9mlで希釈し、十分に混合した。次いで、発 光分光分析計(λ_ex＝480 ；λ_em＝520)を使用して、蛍光を測定した。 別の分析用に上記固体支持体を洗浄し、調製するために７Ｍ尿素200 μl を新 しいカップに入れ、ヘテロプロセッサーを10分間作動させ、その後に前記支持体 を１M NaClで５回洗浄した。 アッセイの結果を表４に報告する。 例10 流動装置を使用するフェノバルビタールのイムノアッセイ この例は、加圧した液の流れを１組の電磁弁の開閉機構によって制御する自動 流動(flow-through)装置における本発明の方法の実施について例証する。前記の 加圧液を固体支持体を入れてあるカラムに通し、そこで本発明の免疫反応を行う 。カラムの出口は、液を画分収集装置又は廃液収集装置のいずれかに送液できる 三方弁に連結する。 流動装置を使用する本発明のアッセイを実施するために、Pb−置換剤(配列番 号３)(１Abs₂₆₀／アッセイ)、洗浄液(1M NaCl)及び清浄用緩衝液（７Ｍ尿素）そ れぞれを別々の電磁弁に連結した。ブルー緩衝液(0.1M トリス、0.6Mクエン酸ナ トリウムに溶解した50％ウシ胎児血清、250 μl ／アッセイ）を小さなテフロン 管中でPb-FITC(500 ng／アッセイ)、Pb- 標準液（０、５、10、20、40及び80μg /ml）及びPb-Fab'-オリゴヌクレオチド(0.05Abs₂₈₀／アッセイ)と混合し、混合 物を室温で５分間インキュベートした。上記テフロン管を電磁弁に連結した。次 いで、プログラムを開始させた。先ず、得られた複合体をカラムに送り込んだ。 15分後に、固体支持体を洗浄液で洗浄した。次いで、Pb−置換剤を送り込み、２ 分後に試料を画分収集出口を通して収集した。清浄用緩衝液を10分間導入し、固 体支持体を完全に清浄化した。最後に、固体支持体を２分間洗浄し、次回のアッ セイ用に準備した。 得られた結果を表５に報告する。 例11 ロボットワークステーションを使用するフェノバルビタールのアッセイ この例は、ロボットワークステーションを使用する本発明の方法の実施につい て説明する。かかる装置の一つ〔商品名バイオメク（Biomek）（登録商標）とし てBeckman Instruments 社から入手できる〕は試薬のピペット秤量、送液及び混 合の作業が完全に制御され、自動化されている自動実験ワークステーションであ る〔“Biomek 1000 Automated Laboratory Workstation”、Beckman Instrument s，Inc．社(カリフォルニア州フラートン所在)(1989年)〕。Biomek装置で本発明 の方法を使用してイムノアッセイを行うために、丸い１枚のポリエチレンフィル ターを切断し、ピペット内の固体支持体を保持するためにピペットチップの内部 に押し込んだ。試薬の混合中の発泡を除くために、１：250 希釈の消泡剤2410（ Dow Corning 社製）をブルー緩衝液（0.1Mトリス、0.6Mクエン酸ナトリウム中に 溶解した50％ウシ胎児血清）に加えた。便宜上、この例では1.5ml の遠心管24本 を入れたプレートを使用した。他の集成配置（例えば、96- ウェルのマイクロタ イタープレート）も本装置において都合よく使用し得る。 遠心管は以下のように配列した。 管A1： ブルー緩衝液＋標準液又は試料(250μl/アッセイ)； 管A2： 蛍光標識(Pb-F 又はTheo-F)100μl； 管A3： オリゴに複合した抗体(Pb-Fab'- オリゴヌクレオチド 又はTheo-Fab'-オリゴヌクレオチド)100μl； 管A5及びA6：洗浄用１M NaCl（それぞれ１ml）； 管B1： 複合体混合管 管B2： 置換鎖500 μl 管B3： ７Ｍ尿素750 μl； 管B4〜B6： 洗浄用１M NaCl（それぞれ１ml） アッセイの順序は以下のようにして作動するようにプログラムされている。最 初に、溶液250 μl を管A1から取り出し、管B1へ送液した。溶液100 μl を管A2 から取り出し、管B1に送液した。溶液100 μl を管A3から取り出し、管B1に移し た。管の内容物を混合し、5 分間保持した。次いで、固体支持体を含有するピペ ットチップ中で管B1の内容物をポンプで繰り返し上下に吸排することにより収集 を15分間行った。固体支持体を管A5及びA6からの溶液で洗浄した。置換を管B2中 の置換剤を用いて3 分間行った（混合しながら）。次いで、二重らせんを管B3中 で10分間切り離した（混合しながら）。最後に、固体支持体を再使用するために 管B4、B5及びB6中で洗浄した。 上記の装置(set up)を使用して得られた結果を用いて、フェノバルビタール標 準曲線を得た。得られた結果を表６に報告する。 例12 ヘテロプロセッサー方式を使用するテオフィリン単一披検体のイムノアッセイ ヘテロプロセッサーは、一連のシリンジプランジャーの動きを制御する装置で ある。固体支持体を正しい位置に保持するために一端にポリエチレンフィルター を有する一連の特殊なピペットチップを前記シリンジに取り付けた。プランジャ ーを引き上げると、液体はピペットチップを通って引き上げられ、固体支持体に 接触する。ピペットチップを通る液体の容量は50μl から500 μl まで変化させ ることができ、典型的には（この実験におけるように）、前記装置は100 μl に セットされる。プランジャーを押し下げると、液体はピペットチップから試料カ ップに押し戻される。プランジャーの上下運動の繰り返しが、液体と、チップ内 部に含有される固体支持体との効果的な接触を提供する。 本実験では下記のオリゴヌクレオチド配列を使用した。 アッセイは以下のように設計した。 一連の試料カップ(Synchron)中で、試料又は標準液(検量液)100 μl をそれ ぞれのカップの125ng のTheo-FITC 及び0.03Abs₂₈₀のTheo-Fab'-オリゴヌクレオ チド（オリゴヌクレオチドと複合された、テオフィリンと抗体Fab'断片）に加え 、混合物を室温で５分間インキュベートすることによりインキュベートを行った 。 収集は、充填されたフラクトゲル−オリゴヌクレオチド(Theo 配列 配列番号 ７)を10μl を含むヘテロプロセッサーチップの下に試料カップを置き、ヘテロ プロセッサーチップが試料溶液に浸るように試料カップを上げることにより行っ た。収集工程は15分間行った。次いで、試料カップを取り除いて、ヘテロプロセ ッサーチップを１M NaClで2 回洗浄した。 それぞれの空のカップに、1M NaCl 200 μl に溶解した１Abs₂₆₀のTheo- 置換 剤（配列番号９）をピペットで測り取り、そのカップをヘテロプロセッサーチッ プの下に置くことによって置換を行った。ヘテロプロセッサープログラムを３分 間作動させた後に、上記カップを取り除いた。それぞれのカップから溶液100 μ l をピペットで測り取り、それを0.1Mトリス(pH=7.5)1.9ml で希釈し、十分に混 合した。次いで、発光分光分析計(λ_ex＝493 ；λ_em＝515)を使用して、蛍光を 測定した。 別のアッセイ用に上記固体支持体を洗浄し、調製するために、新しいカップに ７Ｍ尿素200 μl をピペットで測り取り、ヘテロプロセッサープログラムを10分 間作動させた。その後に、前記支持体を１M NaClで５回洗浄した。 得られた結果を表７に報告する。 例13 オリゴヌクレオチドの膜への固定 オリゴヌクレオチド-NH₂(100Abs₂₆₀／2ml)を連結用緩衝液(0.5M リン酸カリウム pH7.5)に溶解した。１×10cmの一枚のイモビロンAV膜（マサチューセッツ州ベ ッドフォード所在の、Millipore 社から商業的に入手し得る）を前記オリゴ溶液 に入れ、室温で１夜振盪した。膜の未反応基は、キャップ形成(capping)溶液〔 モノエタノールアミン、1.0M重炭酸ナトリウム中に10％(v/v)、pH 9.5〕10ml中 で攪拌しながら室温で２時間、膜をインキュベートすることによりキャップした 。 上記の膜を洗浄液(PBSに溶解したTween-20の0.1 ％溶液で１回)10mlで攪拌し ながら30分間洗浄して、過剰の連結されていないリガンドを除去した。この工程 をもう一度反復した。次いで、膜を乾燥し、４℃で保存した。例14 アビジン- ビオチンの相互作用によるオリゴヌクレオチドの膜への固定 アビジン75mgを連結用緩衝液(0.5M リン酸カリウムpH7.5)75mlに溶解した。４ ×５cmの一枚のイモビロンAV膜をアビジン溶液に入 れ、室温で１夜振盪した。膜の未反応基は、キャップ形成溶液〔モノエタノール アミン、1.0M重炭酸ナトリウム中に10％(v/v)、pH 9.5〕90ml中で攪拌しながら 室温で２時間、膜をインキュベートすることによりキャップした。次いで、前記 の膜を洗浄液（PBS に溶解したTween-20の0.1 ％溶液で１回）100mlで攪拌しな がら30分間洗浄して、過剰の連結されていないリガンドを除去した。その処理を １回繰り返した。次いで、膜を無水コハク酸で処理してアビジン上の陽性電荷を 中和し、オリゴヌクレオチドの非特異的結合を最小限にした。これは膜を乾燥し 、0.5Mリン酸塩緩衝液(pH 8.0)60ml を加え、次いで無水コハク酸溶液(DMF６ml 中に溶解した無水コハク酸1.2g)を滴下し、室温で１時間振盪することにより達 成された。次いで、Ｋ₂CO₃でpHを8.6 に調整した。この溶液を室温で２時間振盪 し、次いで４℃で１夜保存した。得られた膜を1M NaCl、0.1Mトリス(pH 7.5)及 び0.1 ％Tween-20（100ml／洗浄）で５回洗浄し、次いで0.1Mトリス(pH 7.5)(15 0ml／洗浄)で２回洗浄した。次いで、膜を乾燥し、４℃で保存した。 アミノオリゴヌクレオチド（水30μl 中に30Abs₂₆₀）をCentricon-３遠心分離 器を使用して濃縮した。オリゴヌクレオチド溶液を0.5M重炭酸塩（10μl）を使 用して50m Ｍの炭酸塩濃度に調整し、また1M NaCl(10μl)を使用して0.1M NaCl 濃度に調整した。２mgのBiotin-XX-NHS(カリフォルニア州パロアルト所在のClon tech Laboratories から入手し得る)をDMF 25μl に溶解した。上記のオリゴヌ クレオチド溶液とビオチン溶液とを混合し、室温で１夜インキュベートした。得 られた生成物を、G-25 DNAグレードセファッデクスカラムを用いて水で溶出する ことにより精製した。最初のピークはビ オチン化オリゴヌクレオチド（約25Abs₂₆₀）であった。 60Abs_{260 の}ビオチニル化オリゴヌクレオチドを、３mlの反応緩衝液(10mM トリ スpH7.4、１mM EDTA、50mM NaCl)に溶解した。この溶液に前記アビジン膜を浸漬 し室温で３時間インキュベートした。膜を10mlの反応緩衝液で洗浄した（３回） 。次いで、膜を１M NaClで洗浄液の吸光度が260nm で０と読み取れるまで洗浄し た。膜を乾燥し、４℃で保存した。例15 ヘテロプロセッサーにおいてイモビロンAV膜を使用するフェノバルビタールのイ ムノアッセイ Pb- 標準液（０、５、10、20、40及び80μg/ml：20μl/アッセイ）、Pb-F（25 0ng）及びPb-Fab'-オリゴ（0.05Abs₂₈₀）を一連の試料カップに加えた。次いで 、カップを室温で15分間インキュベートした。次いで、試料カップを、Immobilo n-オリゴ(Pb 配列 配列番号１、１cm²、0.1Abs₂₆₀/cm²)を入れたヘテロプロセ ッサーチップの下に試料カップを置き、ヘテロプロセッサーチップが試料溶液に 浸るように試料カップを上げることにより行った。収集工程は30分間行った。次 いで、試料カップを取り除き、ヘテロプロセッサーチップを１M NaClで２回洗浄 した。空のカップそれぞれに200 μl の1M NaCl に溶解した１Abs₂₆₀のPb- 置換 剤（配列番号３）をピペットで測り取り、そのカップをヘテロプロセッサーチッ プの下に置いた。ヘテロプロセッサープログラムを５分間作動させた後に、上記 カップを取り除いた。それぞれのカップから溶液100 μl をピペットで測り取り 、それを0.1Mトリス(pH=7.5)1.9ml で希釈した。十分に混合した後に、発光分光 分析計(λ_ex＝493 ；λ_em＝515)を使用して、蛍光を測定した。 別のアッセイ用に上記支持体を洗浄し、調製するために、７M 尿素200 μl を 新しいカップにピペットで測り取り、ヘテロプロセッサープログラムを10分間作 動させた。その後に、前記支持体を１M NaClで５回洗浄した。 得られた結果を表８に報告する。 例16 ２種類の被検体の同時イムノアッセイ この例では、フェノバルビタールとテオフィリンとについて同時アッセイを行 った。フラクトゲル固体支持体(SS)又は抗体すなわちFab'断片に結合した予め同 定した配列と、置換剤として とを使用して、下記のアッセイデザインを使用した。 一連のカプセル中で、テオフィリン標準液(０、2.5、５、10、20及び40μg/ml； 150 μl)、フェノバルビタール標準液(０、５、10、20、40及び80μg/ml；20μl )、Theo-F(100ng)、Pb-F(250ng)、Theo-Ab-オリゴ(0.05Abs₂₈₀)及びPb-Fab'-オ リゴ(0.05Abs₂₈₀)の混合物を調製した。次いで、混合物を37℃で３分間連続的に 振盪しながらインキュベートした。次いで、それぞれのカプセルに、支持体フラ クトゲル−オリゴヌクレオチド(Pb)(配列番号１)(充填容量５μl)と、フラクト ゲル−オリゴヌクレオチド(Theo)(配列番号７)(充填容量10μl)とを加えて、37 ℃で５分間振盪することによっ て収集を行った。液全部を取り出し、固体支持体を１M NaCl（これもまた後で取 り出す）で３回洗浄した。固体支持体から複合体を置換するために、Theo- 置換 剤鎖(配列番号９)(１M NaCl中１Abs₂₆₀)を加え、混合物を37℃で２分間振盪した 。液体を蛍光測定用の試験管に取り出した。固体支持体を１M NaCl（これもまた 取り出す）で２回洗浄した。次いで、Pb- 置換剤鎖(配列番号３)(１M NaCl中１A bs₂₆₀)を加え、混合物を37℃で２分間振盪した。液体を蛍光測定用の試験管に取 り出した。再使用するための固体支持体を調製するために、それぞれのカプセル に７Ｍ尿素200 μl を加え、カプセルを37℃で15分間振盪し、次いで内容物を取 り出した。次いで、固体支持体を１M NaClで６回洗浄して別のアッセイ用の固体 支持体を調製した。 得られた結果を表９に報告する。 例17 ３種類の被検体の同時イムノアッセイ 一連のカプセル中で下記のもの：すなわちテオフィリン標準液(０、2.5、５、 10、20及び40μg/ml；150 μl)、フェノバルビタール標準液(０、５、10、20、4 0及び80μg/ml；20μl)、TSH 標準液(０、0.25、１、５、15及び50 uIU/ml ;20 0 μl)、Theo-F(100ng)、Pb-F(250ng)、TSH-Abl-HRP(100 μl)、Theo-Ab-オリゴ ヌクレオチド（配列番号８）複合体(0.05Abs₂₈₀)、Pb-Fab'-オリゴヌクレオチド （配列番号２）複合体(0.05Abs₂₈₀)及びTSH-Ab₂-オリゴヌクレオチド（配列番号 ５）複合体(0.01Abs₂₈₀)の混合物を調製した。次いで、混合物を連続的に振盪し ながら37℃で１時間インキュベートした。次いで、収集のために、支持体フラク トゲル−オリゴヌクレオチド(それぞれ配列番号１、７、４)(Pb: 充填容量５μl 、Theo: 充填容量10μl、TSH:充填容量５μl)をそれぞれのカプセルに加え、次 いで37℃で15分間振盪した。液全部を取り出し、固体支持体を１M NaCl（これも また後で取り出す）で３回洗浄した。置換のために、まずTSH-置換剤鎖(配列番 号６)(１Abs₂₆₀：１M NaCl中200 μl)を加え、管を37℃で２分間振盪した。液体 を試験管に取り出した。即ち、発色（基質としてOPD を使用する）のために100 μl をピペットで測り取り、吸光度を測定した。次いで、固体支持体を１M NaCl （これもまた取り出す）で２回洗浄した。次いで、Thco-置換剤鎖(配列番号９)( １M NaCl中１Abs₂₆₀)を加え、混合物を37℃で２分間振盪した。液体を蛍光測定 用の試験管に取り出し、支持体を１M NaClで２回洗浄し、洗浄液を取り出した。 最後に、Pb- 置換剤鎖(配列番号３)(１M NaCl中１Abs₂₆₀)を加え、混合物を37℃ で２分間振盪した。液体を蛍光測定用の試験管に取り出した。再使用するための 固体支持体を清浄化するために、それぞれのカプセルに７Ｍ尿素200 μl を加え 、内容物を37℃で15分間振盪し、液体を取り出した。次いで、固体支持体を１M NaClで６回洗浄して別のアッセイ用の固体支持体を調製した。 得られた結果を表10に報告する。 得られた全ての標準曲線は単一の被検体について得られた標準曲線と類似してい た。TSH のアッセイはサンドイッチアッセイであり、一方、フェノバルビタール 及びテオフィリンのアッセイは競合アッセイ方式を使用した。このようにこの例 は、本発明の方法がサンドイッチ及び競合アッセイの両方、それぞれ個々に又は その組み合わせについて良好に作動することを実証している。例18 ２種類の被検体のアッセイにおける固体支持体の再使用可能性 この例は、フェノバルビタール(Pb)及びテオフィリン(Theo)の２重アッセイの いくつかのサイクルによる固体支持体の再使用可能性を実証する。 下記の配列を固体支持体(SS)若しくはFab'断片と結合して使用するか又は置換 剤鎖： として使用した。 一連のカプセル中で下記のもの：すなわちテオフィリン標準液(2.5μg/ml；150 μl)、フェノバルビタール標準液(10 μg/ml；20μl)、Theo-F(100ng)、Pb-F(25 0ng)、Theo-Ab-オリゴ複合体(0.05Abs₂₈₀）及びPb-Fab'-オリゴ複合体(0.05Abs_{2 80} )を混合した。次いで、混合物を連続的に振盪しながら37℃で３分間インキュ ベートした。次いで、それぞれのカプセルにフラクトゲル−オリゴ配列（充填容 量５μl のPb配列、充填容量10μl のTheo配列）を加えて、37℃で５分間振盪す ることによって収集を行った。液全部を取り出し、固体支持体を１M NaClで３回 洗浄し、次いでこれも取り出した。置換するために、Theo- 置換剤鎖(１M NaCl 中１Abs₂₆₀)を加え、混合物を37℃で２分間振盪した。液体を蛍光測定用の試験 管に取り出した。次いで、支持体を１M NaClで２回洗浄し、液を取り出した。Pb - 置換剤鎖（１M NaCl中１Abs₂₆₀）を加え、混合物を37℃で２分間振盪した。次 いで、液体を蛍光測定用の試験管に取り出した。 再使用するための固体支持体を調製するために、それぞれのカプセルに７Ｍ尿素 200 μl を加え、カプセルを37℃で15分間振盪し、次いで液体を取り出した。次 いで、支持体を１Ｍ NaCl で６回洗浄して別のアッセイ用の固体支持体を調製し た。 得られた結果を表11に報告する。 前記の結果から示されるように、本発明の支持体は多数アッセイにおいてその 有効性を著しく損なうことなく再使用できる。例19 オリゴヌクレオチド配列を使用する多数の被検体の同時アッセイ オリゴヌクレオチド(1Abs₂₆₀を含有する容量2 μl)をナイロン膜上の異なる領 域にスポットする。数分後、オリゴヌクレオチドを紫外線を使用して膜に架橋す る。0.1Mトリス緩衝液(pH 7.5)中で膜を洗浄した後に、均一反応混合物からの信 号を収集するために複数のオリゴヌクレオチドの配列を調製した。 均一反応は例16に記載のようにして種々の被検体を含有する血清、被検体- フ ルオレセイン複合体及び対応する抗体- オリゴヌクレオチド複合体を反応させる ことによって行った。オリゴヌクレオチドを含有するナイロン膜を、37℃で５分 間インキュベーター中でて均一反応と接触させた。次いで、膜を1M NaCl で洗浄 し、膜を吸い取り紙を用いて乾燥した。 膜を黒いプラスチックプレート上に置き、0.1Mトリス緩衝液(pH7.5)で覆い、C CD カメラを使用して個々のスポットの蛍光を測定した。例20 光ファイバーを使用するイムノアッセイ 石英ロッド(1 x 60 mm)にトルエン中で3-アミノプロピルトリエトキシシラン を使用して50℃でアミノ基を導入した。次いで、アミノ基誘導ファイバーを、0. 01M N,N-ジメチルアミノピリジンを含有するジクロロメタン中で１M 無水コハク 酸で処理してスクシニル化した。得られた石英ロッド上のカルボキシル基に水溶 性カルボジイミドを使用してアミノオリゴヌクレオチドを連結した（Wangの前記 の論文、第195 頁）。エタノールアミンを使用してアミンの残った活性部位を塞 いだ。 前記の各例に記載のようにして均一免疫反応を行った後に、蛍光信号が光ファ イバー上に収集され、結合された蛍光をファイバー光導波路検出器を用いて測定 した。測定後に、ファイバーを７Ｍ尿素で洗浄してオリゴヌクレオチド二重らせ んを解離させ、それによってファイバーを再生して再使用できる準備をした。一 般に、次第に消失する波の型のセンサーを用いて、標識された化合物が収集され ている試料を除去又は洗い去ることなく測定を行うことが可能である。その後の 解離工程で再使用するためのセンサーを調製し、それは一般にファイバー光学セ ンサーがなくてはできなかった。 上記の記載から、当業者は本発明の本質的な特徴が容易に確認でき、また本発 明の主旨及び範囲から離れることなく本発明を種々の用途及び条件に適合させる ことができる。態様の改変及び均等物の置換は提案又は予期させ得ることである と考えられ、しかも特定の用語を本明細書で使用しているが、それらは記述のた めを意図するものであり、限定の目的を意図するものではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 被検体及び第一のオリゴヌクレオチド配列に結合する第一の免疫反応剤 を含有する第一の被検体用免疫試薬； 被検体及び標識に結合する第二の免疫反応剤を含有する第二の被検体用免疫試 薬；及び 第一のオリゴヌクレオチド配列に対して相補的で、そのオリゴヌクレオチドが 支持体に結合されている第二のオリゴヌクレオチド配列 を含有してなる被検体のアッセイシステム。 ２． (a) 被検体を、被検体及び第一のオリゴヌクレオチド配列に結合する第 一の免疫反応剤を含有する第一の被検体用免疫試薬、並びに被検体及び標識に結 合する第二の免疫反応剤を含有する第二の被検体用免疫試薬と、前記被検体、前 記第一の免疫試薬、及び前記第二の免疫試薬を含有する溶液中で接触させて、そ れによって免疫複合体を形成させ； (b) 前記溶液を、前記第一のオリゴヌクレオチド配列に相補的な第二のオリゴ ヌクレオチド配列が結合されている固体支持体に、前記第一のオリゴヌクレオチ ド配列と第二のオリゴヌクレオチド配列とのハイブリッド形成に適した条件下で 接触させ、それによって二重らせんを形成させ；そして (c) 前記二重らせんに含まれる標識の濃度を測定して被検体の濃度を得る 各工程を有してなる被検体の濃度の測定方法。 ３． 前記固体支持体光ファイバー請求項２記載の方法。 ４． ファイバー光導波路検出器を用いて前記標識を測定するこ とによって工程(c)を行う請求項２記載の方法。 ５． (d) 前記のハイブリッド化させた第一のオリゴヌクレオチド配列と第二 のオリゴヌクレオチド配列を解離させる工程、及び (e) 工程(a)、(b)及び(c)を反復する工程 をさらに含む請求項２記載の方法。 ６． 工程(a)と(b)とを同時に行う請求項２記載の方法。 ７． 工程(a)を工程(b)より先に行う請求項２記載の方法。 ８． 工程(b)を工程(a)より先に行う請求項２記載の方法。 ９． 標識の濃度を二重らせんを解離させずに測定する請求項２記載の方法。 １０． 二重らせんを標識の濃度を測定する前に解離させる請求項２記載の方法 。 １１． 二重らせんをイオン水、尿素溶液及びホルムアミド溶液からなる群から 選択される解離剤を用いて解離させる請求項１０記載の方法。 １２． 二重らせんが、第一及び第二のオリゴヌクレオチド配列の一方に配列上 対応して置換剤の競合結合によって解離される請求項１０記載の方法。 １３． 置換剤が第一のオリゴヌクレオチドに配列上対応する請求項１２記載の 方法。 １４． 置換剤が第二のオリゴヌクレオチドに配列上対応する請求項１３記載の 方法。 １５． 第一のオリゴヌクレオチド配列に実質的に配列上対応して置換剤の競合 結合によって二重らせんを解離させることをさらに含んでなり、ここで前記置換 剤が、第二のオリゴヌクレオチド配列に 相補的な配列であって、第二のオリゴヌクレオチド配列に相補的な第一のオリゴ ヌクレオチド配列の一部分よりも少なくとも塩基３個分だけ長い配列を含むもの である請求項２記載の方法。 １６． 被検体及び標識に特異的に結合する第一の免疫反応剤を含有する被検体 用免疫試薬； それに結合されている第一のオリゴヌクレオチド配列を有する免疫試薬に、遊 離の被検体とともに競争的に結合する被検体競合剤；及び 第一のオリゴヌクレオチド配列に相補的で、そのオリゴヌクレオチドが支持体 に結合されている第二のオリゴヌクレオチド配列 を含有してなる被検体のアッセイシステム。 １７． 被検体競合剤が、それに結合された第一のオリゴヌクレオチド配列を有 する被検体分子である請求項１６記載のアッセイシステム。 １８． 被検体競合剤が、それに結合した第一のオリゴヌクレオチド配列ととも に免疫反応剤に特異的に結合する被検体の類縁体である請求項１６記載のアッセ イシステム。 １９． (a) 溶液相中の被検体を、前記被検体及び標識と特異的に結合する免疫 反応剤を含有する被検体用免疫試薬と反応させて免疫複合体を形成させる、 ここで、前記溶液は被検体競合剤とそれに結合された第一のオリゴヌクレオチド 配列とをさらに含有するものであり、前記被検体競合剤は免疫試薬に遊離の被検 体とともに競合して結合するものであり； (b) 前記溶液を、第一のオリゴヌクレオチド配列に相補的な第 二のオリゴヌクレオチド配列が結合されている固体支持体に、第一のオリゴヌク レオチド配列と第二のオリゴヌクレオチド配列のハイブリッド形成に適した条件 下で接触させ、それによって二重らせんを形成させる； (c) 前記二重らせんに含まれる標識の濃度を測定する、そして (d) 測定した濃度を、被検体がない場合に被検体競合剤と第一のオリゴヌクレ オチド配列を結合させることによって得られた濃度と比較して、被検体の濃度を 得る 各工程を有してなる被検体の濃度測定方法。 ２０． 被検体及び第一のオリゴヌクレオチド配列に特異的に結合する第一の免 疫反応剤を含む被検体用免疫試薬； 前記免疫試薬及びそれに結合された標識に遊離の被検体とともに競合して結合 する被検体競合剤；及び 第一のオリゴヌクレオチド配列に相補的で、そのオリゴヌクレオチドが支持体 に結合されている第二のオリゴヌクレオチド配列を含有してなる被検体のアッセ イシステム。 ２１． (a) 溶液相中の被検体を、前記被検体及び第一のオリゴヌクレオチド配 列に特異的に結合する免疫反応剤を含む被検体用免疫試薬と反応させて免疫複合 体を形成させる、 ここで前記溶液は被検体競合剤とそれに結合された標識とをさらに含有するもの であり、前記被検体競合剤は前記免疫試薬に遊離の被検体とともに競争して結合 するものであり； (b) 前記溶液を、第一のオリゴヌクレオチド配列に相補的な第二のオリゴヌク レオチド配列が結合されている固体支持体に、第一のオリゴヌクレオチド配列と 第二のオリゴヌクレオチド配列とのハ イブリッド形成に適した条件下で接触させ、それによって二重らせんを形成させ る； (c) 前記二重らせんに含まれる標識の濃度を測定する；そして (d) 測定した濃度を、被検体がない場合に被検体競合剤と免疫試薬を結合させ ることによって得られた濃度と比較して被検体の濃度を得る 各工程を有してなる被検体の濃度測定方法。 ２２． 被検体及び第一のオリゴヌクレオチド配列に特異的に結合する第一の免 疫反応剤を含む被検体用免疫試薬；及び 第一のオリゴヌクレオチド配列に相補的で、そのオリゴヌクレオチドが支持体 に結合されている第二のオリゴヌクレオチド配列 を含有してなる被検体のアッセイシステム。 ２３． (a) 溶液相中の被検体を、前記被検体及び第一のオリゴヌクレオチド配 列に特異的に結合する免疫反応剤を含む被検体用免疫試薬と反応させて免疫複合 体を形成させ； (b) 前記溶液を、第一のオリゴヌクレオチド配列に相補的な第二のオリゴヌク レオチド配列が結合されている固体支持体に、第一のオリゴヌクレオチド配列と 第二のオリゴヌクレオチド配列とのハイブリッド形成に適した条件下で接触させ 、それによって前記溶液から免疫複合体を収集する二重らせんを形成させ；そし て (c) 前記二重らせんに含まれる被検体の濃度を測定する 各工程を有してなる被検体の濃度測定方法。 ２４． 抗体又はその断片； オリゴヌクレオチド；及び 前記抗体又はその断片を前記オリゴヌクレオチドに付着結合させる 結合剤 を含有してなる組成物。 ２５． (a) 複数の被検体を、各免疫試薬が単一の被検体及び第一のオリゴヌク レオチド配列に結合する第一の免疫反応剤を含有する複数の第一の免疫試薬、並 びに各第二の免疫試薬が単一の被検体及び標識に結合する第二の免疫反応剤を含 む複数の第二の免疫試薬と、前記複数の被検体、第一の免疫試薬、及び第二の免 疫試薬を含有する溶液中で接触させ、それによって複数の免疫複合体を形成させ ； (b) 前記溶液を、各第二のオリゴヌクレオチド配列が前記第一のオリゴヌクレ オチド配列の対応する一つに相補的なものである複数の第二のオリゴヌクレオチ ド配列が結合している固体支持体に、前記第一のオリゴヌクレオチド配列の全部 とそれに対応する第二のオリゴヌクレオチド配列とのハイブリッド形成に適した 条件下で接触させ、それによって二重らせんを形成させ；そして (c) 前記二重らせんに含まれる標識を検出して、複数の被検体の有無を測定す る 各工程を有してなる複数の被検体の同時測定方法。 ２６． 二重らせん中の標識の濃度を測定し、それによって被検体の濃度を測定 するさらに工程(c)を含む請求項２５記載の方法。