KR20110064572A - 2종 이상의 표적 물질을 분석하는 방법 및 이를 이용한 미세유동 구조물, 미세유동 장치 - Google Patents

2종 이상의 표적 물질을 분석하는 방법 및 이를 이용한 미세유동 구조물, 미세유동 장치 Download PDF

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Abstract

2종 이상의 표적 물질에 각각 특이적으로 반응하는 제1 물질이 코팅된 제1 반응챔버에, 2종 이상의 표적 물질을 포함하는 시료 및 상기 2종 이상의 표적 물질과 특이적으로 반응하며 표지 인자가 결합된 제2 물질을 주입하여 반응시키고,
상기 제1 반응챔버 내의 미반응 물질은 세척하여 제거하며, 상기 제1 반응챔버 내의 반응 결합물을 증류수로 분리하여 임상 화학 시약이 수용되어 있는 제2 반응챔버로 이동시켜 발색반응을 유도하여 흡광물질로부터 신호를 측정하여 2종 이상의 표적 물질을 분석하는 방법이 제공된다.
본 발명에 따르면 동시에 2 이상의 검출 반응이 가능하며, 표적 물질에 대한 분석이 안정적이고 균일하게 이루어진다.

Description

2종 이상의 표적 물질을 분석하는 방법 및 이를 이용한 미세유동 구조물, 미세유동 장치{Microfluidic structure for multi-assay and microfluidic device comprising same}
본 발명은 2종 이상의 표적 물질에 각각 특이적으로 반응하는 제1 물질이 코팅된 제1 반응챔버에, 2종 이상의 표적 물질을 포함하는 시료 및 상기 2종 이상의 표적 물질과 특이적으로 반응하며 표지 인자가 결합된 제2 물질을 주입하여 반응시키고,
상기 제1 반응챔버 내의 미반응 물질은 세척하여 제거하며, 상기 제1 반응챔버 내의 반응 결합물을 증류수로 분리하여 임상 화학 시약이 수용되어 있는 제2 반응챔버로 이동시켜 발색반응을 유도하여 흡광물질로부터 신호를 측정하여 2종 이상의 표적 물질을 분석하는 방법에 관한 것이다.
종래의 하나의 시료를 대상으로 여러 종류의 표적 물질을 분석하기 위해서는, 하나의 반응씩 순차적으로 이루어졌으므로 숙련된 기술자와 분석장비 등이 필요하고, 결과를 얻기까지 상당히 오랜 시간이 소요되며, 한 번의 실험에 여러 종류의 단백질을 동시에 검사할 수 없으므로, 각각에 대해 동일한 과정의 실험을 별도 로 여러 번 수행하여야 함으로 인한, 번거로움과 시간 및 비용 면에서 비효율적이지 못하다는 등의 문제점을 가지고 있다.
또한 여러 종류의 표적 물질을 동시에 검출하는 경우, 각 spot에 다른 항원 또는 항체가 고정되도록 장치하여 한 챔버 내에서 반응하여 검출하게 된 시스템으로 제조과정이 복잡하고 안정성이 유지되기 어려운 점이 있다. 또한 Spot에 대한 정량화가 균일성을 얻기 힘들며 lot to lot variation이 상대적으로 크다.
또 다른 방법으로 서로 다른 형광체로 표지된 항체 등을 사용할 경우, 비교적 재현성이 높고 정량분석이 가능하나 여러 종류의 표적 물질의 분석을 동시에 적용하기 어렵다는 문제점이 있다.
본 발명의 실시예들에 개시된 내용은 과거로부터 요청되어온 기술적 과제를 해결하고자 한다. 구체적으로 2종 이상의 표적 물질을 동시에 분석하는 방법을 제공한다. 또한, 이를 이용한 미세유동 구조물 및 원심력 기반의 미세유동 장치를 제공한다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위하여 심도 있는 연구를 거듭한 결과, 각각 다른 임상 화학 시약이 수용되어 있는 제2 반응챔버를 이용하는 경우 동시에 여러 종류의 표적 물질을 검출, 분석할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 예시적 구체예에 따르면, 2종 이상의 표적 물질에 각각 특이적으로 반응하는 제1 물질이 코팅된 제1 반응챔버에, 2종 이상의 표적 물질을 포함하는 시료 및 상기 2종 이상의 표적 물질과 특이적으로 반응하며 표지 인자가 결합된 제2 물질을 주입하여 반응시키고, 제1 반응챔버 내의 미반응 물질은 세척하여 제거하고, 제1 반응챔버 내의 반응 결합물을 증류수로 분리하여 임상 화학 시약이 수용되어 있는 제2 반응챔버로 이동시켜 발색반응을 유도하여 흡광물질로부터 신호를 측정하여 2종 이상의 표적 물질을 분석하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 예시적 구체예에 따르면, 다수의 시료 챔버; 2종 이상의 표적 물질에 각각 특이적으로 반응하는 제1 물질이 코팅된 제1 반응챔버; 제1 반응챔 버에 연결되며, 임상 화학 시약이 수용된 제2 반응챔버; 챔버들을 연결하는 통로; 및 통로의 개폐를 위한 밸브;를 포함하는 미세유동 구조물을 제공한다.
본 발명의 다른 예시적 구체예에 따르면, 본 발명에 따른 미세유동 구조물을 포함하고, 회전체의 회전에 따른 원심력을 이용하여 미세유동 구조물 내의 유체를 이송하는, 원심력 기반의 미세유동 장치가 제공한다.
본 발명의 다른 예시적 구체예에 따르면, 미세유동 장치를 이용하여, 하기 공정을 포함하는 2종 이상의 표적 물질을 분석하는 방법이 제공된다.
2종 이상의 표적 물질을 포함하는 시료 및 상기 2종 이상의 표적 물질과 특이적으로 반응하며 표지 인자가 결합된 제2 물질을 상기 제1 반응챔버에 주입하여 상기 2종 이상의 표적물질을 제1 물질 및 제2 물질과 접촉시켜 반응시키는 공정;
상기 제1 반응챔버를 세척하여 미반응 물질을 제거하는 공정;
상기 제1 반응챔버에 증류수를 주입하여 반응 결합물을 다시 분리시키는 공정; 및
상기에서 분리된 용액을 원심력에 의해 제2 반응챔버로 이송하여 발색반응을 유도하는 공정.
이하, 본 발명의 이점들과 특징들 및 이를 수행하는 방법들이 하기 바람직한 예시적 구체예들에 대한 상세한 설명 및 첨부된 도면들을 참조함으로써 더욱 용이하게 이해될 수 있을 것이다. 하지만, 본 발명의 하나이상의 예시적 구체예들은 많은 다양한 형태로 실시될 수 있으며, 여기서 언급한 예시적 구체예들로만 한정되어 구성되는 것은 아니다.
본 발명의 예시적 구체예에 따른 방법은 2종 이상의 표적 물질에 각각 특이적으로 반응하는 제1 물질이 코팅된 제1 반응챔버에, 2종 이상의 표적 물질을 포함하는 시료 및 상기 2종 이상의 표적 물질과 특이적으로 반응하며 표지 인자가 결합된 제2 물질을 주입하여 반응시키고, 제1 반응챔버 내의 미반응 물질은 세척하여 제거하고, 제1 반응챔버 내의 반응 결합물을 증류수로 분리하여 각각의 임상 화학 시약이 수용되어 있는 제2 반응챔버로 이동시켜 발색반응을 유도하여 흡광물질로부터 신호를 측정하여 2종 이상의 표적 물질을 분석한다.
본 발명에서 "표적 물질"이란, 생물학적 샘플로부터 분석하고자 하는 대상 물질로서, 예를 들면, 생체를 이루는 분자레벨의 물질일 수 있다. 본 발명에서 표적 물질 및 상기 제1 반응챔버에 고정화되는 상기 표적물질에 특이적으로 반응하는 물질은 모두 상기 생물 분자 (biomolecule)일 수 있다. 이러한 생물 분자는 예를 들어, 단백질, 항원, 항체, 효소, DNA, PNA, RNA, 호르몬, 화학물질 등을 모두 포함한다.
상기 표적 물질 (target biomolecules)은 분석물 (analyte)에 해당하고, 제1 반응챔버에 코팅된 물질은 상기 표적 물질을 포획하기 위하여 표적 물질에 특이적으로 반응할 수 있는 물질로서, 이 코팅 물질의 특징은 상기 표적 물질과 특이적 결합을 이루는 것에 있다. 따라서, 단백질 상호작용 (protein-protein interaction), 항원-항체 반응, 효소-기질 반응 등을 이용하는 것이 바람직하다.
나아가, 이러한 단백질 수준의 물질 이외에 핵산 수준의 유전물질에 있어서도, 서열 특이적 반응을 이용할 수 있다. 즉, 핵산 서열을 제1 반응챔버 내에 고정시키고, 상동성 시료 핵산 서열이 결합하도록 할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 상기 제1 반응챔버 내부에 고정화되어 있으면서, 상기 2종 이상의 표적 물질에 각각 특이적으로 반응하는 2종 이상의 물질은 서로 교차반응성 (cross reactivity)이 없는 것이 바람직하다.
"교차반응성"이란 상기 제1 반응챔버에 코팅된 물질이 2종 이상의 표적 물질에 결합하는 반응을 할 때에 그 물질에 특이적인 표적 물질과 반응하는 동시에 유사한 구조 또는 일부 동일한 구조를 가지고 있는 물질과 반응하는 것을 의미한다. 예를 들면, 항체가 비표적 (non-target) 항원을 인식하여 결합하게 되는 것을 말한다.
제1 반응챔버 내부에 코팅되는 2종 이상의 물질은 표적 물질과 각각 특이적으로 반응하면서, 상호간에 교차반응성이 없어야 하는데, 예를 들어 항원-항체 반응을 이용하는 경우, 제1 항원은 자신의 표적이 아닌 다른 표적 물질인 타 항체가 인지하는 에피토프 (epitope)는 포함하지 않아야 한다.
한편, 본 발명에 개시된 내용을 통해 제2 물질은, 상기 표적 물질과 상기 제 1 반응챔버에 고정화된 표적 물질에 특이적으로 반응하는 물질 간의 결합 반응과 동시 또는 이후의 결과물에 처리하는 용액으로서, 표지인자를 함유하고 있다. 상기 표지가 효소인 경우, 상기 표지로부터의 신호 검출은, 상기 제1 반응챔버에서 이송된 반응혼합액을 제2 반응챔버로 이송하면 제2 챔버내의 상기 효소의 흡광 기질 (chromogenic substrate)이 상기 효소 존재하에서 흡광 물질로 전환되고, 이로부터 광 신호를 검출함으로써 이루어질 수 있다. .
상기 "제2 물질"은, 각각의 표적 물질에 대한 검출(detection)을 가능하게 해주는 물질을 지칭하는데, 서로 다른 표지인자가 결합되어 있고, 상기 2종 이상의 표적 물질에 각각 특이적으로 반응한다. 상기 제2 물질은 표적 물질에 각각 특이적으로 반응할 수 있는 제1 물질과 동일하거나 상이한 활성을 갖는 것일 수 있다.
또한, 상기 제2 물질에 결합되어 있는 표지인자는 서로 다른 대상을 검출하여 그 결과를 보여줄 수 있는 물질이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 효소일 수 있다.
특히, 본 발명의 바람직한 하나의 예에서는, Alkaline Phosphatase(ALP), Amylase(AMY), Uricase, Alanine aminotransferase(ALT), 또는 Aspartate Aminotransferase(AST)와 같이 효소의 종류를 달리하여 사용할 수 있다.
그러므로, 본 발명에서 제2 반응 챔버의 수는 표적 물질의 종류의 개수와 동일하게 구비될 수도 있지만, 표지 인자의 특성에 따라 하나의 챔버만을 사용할 수도 있다. 즉, 흡광으로 다른 파장으로 동시에 반응을 진행 할 수 있는 경우에는 검출기 (detector)의 파장을 바꾸어서 한 챔버에서 여러 개의 물질을 측정할 수도 있 다.
도 1은 본 발명의 예시적 구체예에 따른 2종 이상의 표적 물질을 동시에 검출하는 공정 (process)을 대략적으로 설명한 흐름도이다. 먼저, 2종 이상의 표적 물질 (예를 들어, 항체)을 각각 인지하면서, 서로 교차 반응성 (cross reactivity)이 없는 2종 이상의 표적물질에 특이적으로 반응하는 물질 (예를 들어, 항원)을 제1 반응챔버의 내부에 고정화한다. 이 때, 상기 고정되는 물질들은 특별한 정렬 없이 부착되어도 무관하다. 상기 물질을 상기 제1 반응챔버의 내부에 고정화하는 것은, 기판 상에 물질, 예를 들면, 생물분자를 고정화하는 알려진 방법에 의하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 상기 제1 반응챔버의 내부면의 일부 또는 전부를 반응성 기, 예를 들면, 아미노실란 화합물 등을 사용하여 아미노 기를 도입하고, 여기에 상기 반응성 기와 반응성이 있도록 활성화된 상기 물질을 커플링 반응시킴으로써 상기 물질이 고정화될 수 있다. 상기 활성화는 상기 물질의 카르복실기를 에스테르 또는 무수물의 형태로 활성화하는 것일 수 있다.
한편 제2 반응챔버 내에는 제2 물질에 결합된 표지인자에 의해 발색반응이 유도되는 임상 화학 시약을 수용하도록 한다.
그런 다음, 2종 이상의 표적 물질들을 포함하는 시료와 2종 이상의 표적 물질과 특이적으로 반응하며 표지 인자가 결합된 제2 물질을 제1 반응챔버로 동시 또는 순차적으로 주입한다. 순차적으로 주입하는 경우 제2 물질 주입 전에 세척 과정이 포함될 수 있다. 이때 제1 물질과 제2 물질은 모두 교차 반응성 (cross reactivity)이 없기 때문에 각각 자신들이 특이적으로 반응하는 표적 물질과 결합하게 된다. 다음으로, 상기 제1 반응챔버를 세척하여 결합되지 않은 물질을 제거한다.
그 후, 상기 제1 반응챔버의 복합체를 증류수로 elution하여 분리된 물질을 제2반응챔버로 이동한다. 이 때 제2 반응챔버 내에 미리 수용되어 있는 임상 화학 시약에 의하여 예를 들면 하기와 같은 반응이 일어난다.
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동일 또는 다른 제2 반응챔버 내에 수용되어 있는 다른 임상 화학 시약에 의하여, 또 다른 발색 반응이 동시에 진행된다. 하나 또는 2개 이상의 제2 반응 챔버로부터 흡광 신호를 측정하여, 2종 이상의 표적물질의 존재를 동시에 검출한다.
도 2a는 여러 개의 검출하고자 하는 항원이나 항체가 있을 경우 본 발명에 따른 분석 방법을 나타낸다. 한 챔버 내에 여러 개의 특이성이 다른 항원이나 항체를 코팅하고 한 챔버 내에서 반응을 시킨다. 그런 후 결합하지 않은 여타의 물질은 washing하여 제거한 후, 결합되어 있는 항원항체 결합을 DW로 분리 시켜 각각의 임상 화학 시약이 들어있는 챔버로 동시 이동시켜 챔버내 존재하는 임상 화학 시약과 반응한 뒤 검출기로 detection하여 각각의 물질의 함량 및 존재 여부를 알 수 있는 정량, 정성분석을 실시한다.
도 2b는 서로 다른 DNA 절편이 있을 경우 본 발명에 따른 분석 방법을 나타낸다. 서로 상보적인 oligonucleotide에 여러 가지 발색반응을 유도하는 효소나 단백질, 화학물질 등의 표지인자를 결합한 후 서로 다른 DNA 절편이 있는 용액에 넣어 서로 상보적 결합을 수행한다. 서로 결합이 되지 않은 것은 세척하여 제거하고 결합한 DNA 절편은 DW로 elution 시켜서 각각의 발색 반응을 유도하는 성분이 포함된 각각의 well이나 챔버에 각각 넣고 발색반응을 유도한다. 각 서로 다른 파장에서 흡광물질에 대해 검출하게 되며 각 흡광도에 따른 DNA농도가 결정되며 흡광물질의 유무에 따른 specific DNA 정량이 가능하다.
한편 본 발명의 미세유동 구조물은 다수의 시료 챔버; 2종 이상의 표적 물질에 각각 특이적으로 반응하는 제1 물질이 코팅된 제1 반응챔버; 제1 반응챔버에 연결되며, 임상 화학 시약이 수용된 제2 반응챔버; 챔버들을 연결하는 통로; 및 통로의 개폐를 위한 밸브;를 포함한다.
또한 본 발명에 따른 미세유동 장치는 상기와 같은 미세유동 구조물을 포함하고, 상기 회전체의 회전에 따른 원심력을 이용하여 미세유동 구조물 내의 유체를 이송한다.
랩온어디스크 (Lab-on-a-Disc)는 별도의 구동시스템 없이 원심력만을 이용해 시료, 시약 등의 유체를 이송할 수 있어 소형화가 가능하다는 것이 장점이다. 이에, 본 발명자들은 디스크형태의 장치를 이용하여 다양한 표적 물질을 더욱 신속하게 분석하기 위해 더욱 효율적인 디스크 설계방법에 대하여 거듭 연구하였으며, 특히 다종의 표적물질을 포함하는 시료 챔버 등과 표적물질과 상기 표적물질에 특이적으로 결합하는 물질 사이의 결합 반응이 일어나는 제1 반응챔버, 임상 화학 반응 이 일어나는 제2 반응챔버 등과의 상관관계를 검토하고, 반응 횟수와 장비의 소요에 따른 분석 시간 및 비용, 공간 효율성 등을 다각적으로 검토하였다.
그 결과, 도 3에서 보여지는 것처럼, 본 발명의 예시적 구체예에 따른 미세유동 장치 (100)에서는 하나의 제1 반응챔버 (170) 내에 2종 이상의 표적 물질이 고정화되어 있어서 1개의 제1 반응챔버 (170)를 사용하여 1회의 공정에 의해 분석이 가능하며, 제2 반응챔버(180) 내에 임상 화학 시약이 수용되어 있으므로, 다종의 표적물질에 대한 검출이 동시에 가능하다는 장점이 있다. 즉, 본 발명은 원심력 기반의 진단 분석에서 하나의 반응용기 (하나의 제1 반응챔버)에 2종 이상의 표적 물질에 특이적으로 결합하는 물질이 고정화되어 있는 영역 (zone)을 두어, 동시에 여러 개의 반응이 가능하도록 하며, 제1 반응챔버 내의 복합체의 다종의 표적물질 검출이 동시에 이루어질 수 있도록 제2 반응챔버 내에 임상 화학 시약이 수용되어 있는 미세유동 구조물 및 이를 포함하는 원심력 기반의 미세유동 장치를 제공할 수 있다. 상기 영역은 상기 제1, 2 반응챔버의 내부 표면의 일부 또는 전면이 될 수 있다.
도 3은 분석에 필요한 각종 버퍼액, 기질 또는 제2 물질 (140, 150) 등을 저장하고, 다양한 생물학적, 화학적 반응을 수행하기 위한 챔버들, 표적 물질을 저장하는 저장 챔버 (110), 처리된 유체 및 버퍼액 등을 이동시키기 위한 유체 통로, 이들 통로의 개폐를 제어하기 위한 밸브 장치들이 포함된 본 발명의 미세유동 장치의 일 예시적 구체예에 대한 구성도다.
도 3을 참조하면, 본 발명의 일 예시적 구체예에서 사용된 회전체는 원형의 디스크 형상의 플랫폼 (platform)일 수 있다. 상기 플랫폼은 성형이 용이하고, 그 표면이 생물학적으로 비활성인 아크릴, 플라스틱 소재로 만들어질 수 있다. 다만, 이에 한정되는 것은 아니고, 화학적, 생물학적 안정성과 광학적 투명성 그리고 기계적 가공성을 가지는 소재이면 족하다.
상기 회전체는 바람직하게는, 플라스틱, PMMA, 유리, 운모, 실리카, 실리콘 웨이퍼의 재료 등의 다양한 재료로부터 선택될 수 있다. 특히, 플라스틱이 경제적 이유, 가공의 용이성 때문에 선호된다. 사용 가능한 플라스틱 재료로는 폴리프로필렌, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐알콜, 플리에틸렌, 플리메틸메타크릴레이트, 폴리카보네이트 등을 들 수 있다. 이들 중 특히 폴리프로필렌과 폴리카보네이트가 더욱 바람직하며 폴리카보네이트가 가장 바람직하다.
상기 회전체 상에는 다수의 시료 챔버; 상기 2종 이상의 표적 물질에 각각 특이적으로 반응하는 물질이 2종 이상 고정화된 제1 반응챔버 (170); 제1 반응챔버 내의 표지인자에 의해 발색 반응이 유도되는 임상 화학 시약이 구비된 제2 반응챔버(180); 챔버들을 연결하는 통로; 및 상기 통로의 개폐를 제어하는 밸브 등으로 구성된 미세유동 구조물이 배치될 수 있다.
상기 다수의 시료 챔버에는 버퍼액 챔버, 제2 물질 용액 챔버 (140, 150), 및 2종 이상의 표적 물질을 함유한 생물학적 시료 챔버 (110)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 챔버가 포함될 수 있다 (140, 150).
본 발명의 다른 예시적 구체예에 따르면, 또한 상기 미세유동 구조물이 구비된 미세유동 장치를 이용하여, 2종 이상의 표적 물질을 포함하는 시료 및 상기 2종 이상의 표적 물질과 특이적으로 반응하며 표지 인자가 결합된 제2 물질을 상기 제1 반응챔버에 주입하여 상기 2종 이상의 표적물질을 제1 물질 및 제2 물질과 접촉시켜 반응시키는 공정; 제1 반응챔버를 세척하여 미반응 물질을 제거하는 공정;
상기 제1 반응챔버에 증류수를 주입하여 반응 결합물을 다시 분리시키는 공정; 및
상기에서 분리된 물질을 원심력에 의해 제2 반응챔버로 이송하여 발색반응을 유도하는 공정;을 포함하는 2종 이상의 표적 물질을 동시에 분석하는 방법을 제공한다.
구체적인 용어에 대한 설명은 상기와 같다.
표지 인자가 결합된 제2 물질을 함유하는 용액, 2종 이상의 표적 물질들을 함유하고 있는 시료로 각각 해당 챔버들을 채우고, 디스크 회전체의 회전에 의한 원심력으로 상기 유체들을 제1 반응챔버로 이동시킨다. 이때 상기 제1 반응챔버로 이송된 상기 시료 중의 2종 이상의 표적 물질과 상기 제1 반응챔버에 고정화된 상기 표적물질에 특이적으로 반응하는 제1 물질, 제2 물질을 서로 접촉시켜 결합 반응이 일어난다. 다음으로, 상기 제1 반응챔버를 세척하여 결합되지 않은 물질을 제거한다.
그 후, 상기 제1 반응챔버를 증류수로 elution하여 분리된 용액을 원심력에 의해 제2 반응챔버로 이동한다. 이 때 하나 또는 2개 이상의 제2 반응챔버 내에 미 리 수용되어 있는 각각의 임상 화학 시약이 표지인자에 의하여 발색반응한다. 이들의 흡광 신호를 측정하여, 2종 이상의 표적물질의 존재를 검출한다.
제2 물질에는 서로 다른 표지인자 (marker)가 결합되어 있으므로 이러한 표지인자의 확인을 통해 표적 물질을 동시에 다중 검출할 수 있다.
실시예 1
1. 2종의 항원-항체 반응을 이용한 2종 표적물질의 동시 분석
표적물질로 PSA 및 인간 IgG를 사용하고, 상기 두 표적물질에 대한 항체인 항-PSA 항체 및 항-IgG 항체를 제1 반응챔버의 내부 표면에 고정시켰다.
상기 항-PSA 항체 및 항_IgG 항체를 코팅 버퍼 (50mM Carbonate-bicarbonate buffer, pH9.6)에 1종 당 830ng/100μl 농도로 준비하여 제1 반응챔버에 100μl씩 분주하여 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 반응이 종료되면 100μl의 코팅 용액을 제거한 후, 비특이적 결합 반응 (non-specific binding)을 줄이기 위해서 제1 반응챔버에 차단 버퍼 (blocking buffer) (10mM phosphate, 0.14M NaCl, 1% BSA, pH7.4) 200μl를 분주하였다. 그 후, 37℃에서 2시간 보관 뒤 차단 버퍼를 제거하였다.
2개의 제2 반응챔버 내에 HRP 효소에 대한 임상 화학 시약인 TMB를 포함하는 용액 및 AP 효소에 대한 임상 화학 시약인 pNPP를 포함하는 용액을 주입하였다.
그 다음, 항-PSA항체에 대해 반응하는 표적 물질인 PSA를 농도별로 처리하고, 또 다른 항체인 항-IgG 항체에 대한 표적물질 IgG는 일정 농도 (100ng/챔버)를 주입하여 결합시켰다. 이 때 표적 물질 PSA에 대하여 HRP 효소가 접합된 항-PSA 항체 (제1 반응챔버에 고정화된 항-PSA와는 결합하는 항원 부위, 즉 특이성이 다름) 및 표적물질 IgG에 대하여는 AP 효소가 접합된 항-IgG 항체 (제1 반응챔버에 고정화된 항-IgG 항체와는 결합하는 항원 부위, 즉 특이성이 다름)를 상기 표적 물질의 주입과 함께 주입하였다.
상기 공정을 완료한 후, 결합하지 않은 물질을 세척 버퍼 (10mM Phosphate, 0.14M NaCl,0.05% Tween-20, pH7.4)로 세척 한 후, 증류수로 결합된 복합체를 다시 분리하였다. 분리된 용액을 두 개의 제2 반응챔버로 동일량 이동하였다.
일정한 시간 동안 인큐베이션한 후 반응을 중지시키고, 제1 표적 물질 PSA 및 제2 표적물질 IgG를 검출하였다. 상기 PSA의 검출은 450nm에서 흡수되는 정도를 측정하여 각 농도에 따른 흡광도를 측정하였고, 상기 IgG의 검출은 405nm에서 흡광도를 측정함으로써 이루어졌다.
본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 내용을 바탕으로 본 발명의 범주 내에서 다양한 응용 및 변형을 행하는 것이 가능할 것이다.
본 발명의 실시예들에 따른 미세유동 구조물은 효소에 의하여 흡광 물질로 전환되는 2종 이상의 기질이 수용된 제2 반응챔버를 사용하여 동시에 다중분석이 가능하기 때문에 반복되는 프로세스 및 시간을 절약할 수 있어 유용하다.
도 1은 본 발명의 일 예시적 구체예에 따른 2종 이상의 표적 물질을 동시에 검출하는 공정 (process)의 흐름도의 일 예이다.
도 2a, b는 본 발명의 다른 예시적 구체예에 따른 2종 이상의 표적물질이 동시에 분석되는 예이다;
도 3은 본 발명의 다른 예시적 구체예에 따른 미세유동 장치의 구조를 개략적으로 도시한 개략도이다.

Claims (20)

  1. 2종 이상의 표적 물질에 각각 특이적으로 반응하는 제1 물질이 코팅된 제1 반응챔버에,
    2종 이상의 표적 물질을 포함하는 시료 및 상기 2종 이상의 표적 물질과 특이적으로 반응하며 표지 인자가 결합된 제2 물질을 주입하여 반응시키고,
    상기 제1 반응챔버 내의 미반응 물질은 세척하여 제거하고,
    상기 제1 반응챔버 내의 반응 결합물을 증류수로 분리하여 임상 화학 시약이 수용되어 있는 제2 반응챔버로 이동시켜 반응을 유도하여 검출물질로부터 신호를 측정하여 2종 이상의 표적 물질을 분석하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 2종 이상의 제1 물질 및 제2 물질은 각각 교차반응성이 없는 것을 특징으로 하는 2종 이상의 표적 물질을 분석하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 표적 물질, 제1 물질 또는 제2 물질은 단백질, 항원, 항체, 효소, DNA, PNA, RNA, 호르몬 및 화학물질로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 2종 이상의 표적 물질을 분석하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 표적 물질, 제1 물질 또는 제2 물질은 항원, 항체 또는 단백질인 것을 특징으로 하는 2종 이상의 표적 물질을 분석하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 2종 이상의 제2 물질은 서로 다른 표지인자가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 2종 이상의 표적 물질을 분석하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 표지인자는 ALP, AMY, Uricase, ALT 및 AST로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 2종 이상의 표적 물질을 분석하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 제1 반응챔버에 2종 이상의 표적 물질을 포함하는 시료 및
    상기 2종 이상의 표적 물질과 특이적으로 반응하며 표지 인자가 결합된 제2 물질을 순차적으로 또는 동시에 주입하는 것을 특징으로 하는 2종 이상의 표적 물질을 분석하는 방법.
  8. 다수의 시료 챔버;
    2종 이상의 표적 물질에 각각 특이적으로 반응하는 제1 물질이 코팅된 제1 반응챔버;
    상기 제1 반응챔버에 연결되며, 임상 화학 시약이 수용된 제2 반응챔버;
    상기 챔버들을 연결하는 통로; 및
    상기 통로의 개폐를 위한 밸브;를 포함하는 미세유동 구조물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 제2 반응챔버는 2개 이상인 미세유동 구조물.
  10. 제8항에 있어서, 상기 2종 이상의 제1 물질 및 제2 물질은 각각 교차반응성이 없는 것인 미세유동 구조물.
  11. 제8항에 있어서, 상기 표적 물질, 제1 물질 또는 제2 물질은 단백질, 항원, 항체, 효소, DNA, PNA, RNA, 호르몬 및 화학물질로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 2종 이상의 표적 물질을 분석하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 표적 물질, 제1 물질 또는 제2 물질은 항원, 항체 또는 단백질인 것을 특징으로 하는 미세유동 구조물.
  13. 제8항에 있어서, 상기 다수의 시료 챔버는 버퍼 챔버, 프로브 용액 챔버 및 2종 이상의 표적 물질을 함유한 생물학적 시료 챔버로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 챔버를 포함하는 것인 미세유동 구조물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 프로브 용액은 2종 이상의 표적 물질과 특이적으로 반응하며 표지 인자가 결합된 제2 물질을 함유하는 것인 미세유동 구조물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 제2 물질은 각각 서로 다른 표지인자가 결합되어 있는 것인 미세유동 구조물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 표지인자는 ALP, AMY, Uricase, ALT 및 AST로 이루어진 군에서 선택되는 것인 미세유동 구조물.
  17. 회전체 및 제8항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 미세유동 구조물을 포함하고, 상기 회전체의 회전에 따른 원심력을 이용하여 미세유동 구조물 내의 유체를 이송하는, 원심력 기반의 미세유동 장치.
  18. 제17항에 따른 미세유동 장치를 이용하여, 하기 공정을 포함하는 2종 이상의 표적 물질을 분석하는 방법:
    2종 이상의 표적 물질을 포함하는 시료 및 상기 2종 이상의 표적 물질과 특이적으로 반응하며 표지 인자가 결합된 제2 물질을 상기 제1 반응챔버에 주입하여 상기 2종 이상의 표적물질을 제1 물질 및 제2 물질과 접촉시켜 반응시키는 공정;
    상기 제1 반응챔버를 세척하여 미반응 물질을 제거하는 공정;
    상기 제1 반응챔버에 버퍼를 주입하여 반응 결합물을 다시 분리시키는 공정; 및
    상기에서 분리된 물질을 원심력에 의해 제2 반응챔버로 이송하여 검출반응을 유도하는 공정.
  19. 제18항에 있어서, 상기 검출 반응 후 검출 물질로부터 신호를 측정하여 표적물질을 분석하는 공정을 더 포함하는 미세유동장치를 이용하여 2종 이상의 표적 물질을 분석하는 방법.
  20. 제18항에 있어서, 상기 제2 반응챔버는 2개 이상인 미세유동장치를 이용하여 2종 이상의 표적 물질을 분석하는 방법.
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