JPH07265076A - 免疫検査法 - Google Patents
免疫検査法Info
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- JPH07265076A JPH07265076A JP6059259A JP5925994A JPH07265076A JP H07265076 A JPH07265076 A JP H07265076A JP 6059259 A JP6059259 A JP 6059259A JP 5925994 A JP5925994 A JP 5925994A JP H07265076 A JPH07265076 A JP H07265076A
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- antigen
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 複数の目的物質である抗原または抗体を同時
に、簡単に、高感度に検出する。 【構成】 複数の目的物質と反応する抗体または抗原を
各々異なるＤＮＡ鎖により標識し、ＤＮＡ鎖の一部を増
幅することにより、複数の目的物質を検出する。
に、簡単に、高感度に検出する。 【構成】 複数の目的物質と反応する抗体または抗原を
各々異なるＤＮＡ鎖により標識し、ＤＮＡ鎖の一部を増
幅することにより、複数の目的物質を検出する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は免疫検査法（イムノアッ
セイ）に関するものであり、特に、微量な複数の目的物
質を高感度に検出する免疫検査法に関するものである。
セイ）に関するものであり、特に、微量な複数の目的物
質を高感度に検出する免疫検査法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】抗原又は抗体を高感度に同定、定量する
ために抗原抗体反応の高い特異性を利用することが行わ
れており、一般的に免疫検査法（イムノアッセイ）とい
われている。この免疫検査法は、抗原抗体反応により生
じる沈澱物や凝集体を光学的に検出する免疫比濁法（Ｔ
ＩＡ）と、分別検出の容易な物質で標識した抗体又は抗
原を用いる標識化免疫法に大別される。特に後者には、
その標識物によって種々の系が考えられており、代表的
なものとしては放射性同位元素を含むものを標識とする
ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素を標識とするエ
ンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、蛍光体を標識とす
る蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ又はＦＡＴ）等がある。
ために抗原抗体反応の高い特異性を利用することが行わ
れており、一般的に免疫検査法（イムノアッセイ）とい
われている。この免疫検査法は、抗原抗体反応により生
じる沈澱物や凝集体を光学的に検出する免疫比濁法（Ｔ
ＩＡ）と、分別検出の容易な物質で標識した抗体又は抗
原を用いる標識化免疫法に大別される。特に後者には、
その標識物によって種々の系が考えられており、代表的
なものとしては放射性同位元素を含むものを標識とする
ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素を標識とするエ
ンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、蛍光体を標識とす
る蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ又はＦＡＴ）等がある。
【０００３】現在適用されている検査を見てみると、Ｔ
ＩＡ法を使用しているものには血清中の蛋白質であるト
ランスフェリンやＣＲＰ、免疫グロブリンＩgＧ、Ｉg
Ａ、ＩgＭ、自己免疫関連としてリウマチ因子、更に血
液学的な検査としてはプラスミノ−ゲンの定量化、アン
チトロンビンIIIの定量化等がある。一方、標識化免疫
測定法として、ＲＩＡ法は内分泌学検査（例えばエリス
ロポエチン、プロスタグランディンなど）からウイルス
学検査（例えばＨＢｓ抗体、ＨＣＶ抗体など）、腫瘍関
連検査（例えばＡＦＰ、ＣＥＡなど）、生化学検査（例
えばトリプシン等）と広い範囲に及び、ＥＩＡ法は血液
学検査（例えばプロテインＳ、ＦＰＡなど）、免疫血清
学検査（例えば免疫複合体、マイクログロブリンなど）
ＦＡＴはウイルス抗体の検査（例えばＥＢＶ、ヘルペス
など）、免疫血清学検査（例えば抗核抗体など）に使用
される。
ＩＡ法を使用しているものには血清中の蛋白質であるト
ランスフェリンやＣＲＰ、免疫グロブリンＩgＧ、Ｉg
Ａ、ＩgＭ、自己免疫関連としてリウマチ因子、更に血
液学的な検査としてはプラスミノ−ゲンの定量化、アン
チトロンビンIIIの定量化等がある。一方、標識化免疫
測定法として、ＲＩＡ法は内分泌学検査（例えばエリス
ロポエチン、プロスタグランディンなど）からウイルス
学検査（例えばＨＢｓ抗体、ＨＣＶ抗体など）、腫瘍関
連検査（例えばＡＦＰ、ＣＥＡなど）、生化学検査（例
えばトリプシン等）と広い範囲に及び、ＥＩＡ法は血液
学検査（例えばプロテインＳ、ＦＰＡなど）、免疫血清
学検査（例えば免疫複合体、マイクログロブリンなど）
ＦＡＴはウイルス抗体の検査（例えばＥＢＶ、ヘルペス
など）、免疫血清学検査（例えば抗核抗体など）に使用
される。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】上に述べた様に、免疫
検査法は広く臨床検査等に利用されているが、高感度に
目的物質を検出するためにはＲＩＡ法によることが多
い。しかしながら、このＲＩＡ法では、同一被検体中の
複数目的物質を同時に検出する事はできないという問題
点があった。また、他の方法、例えばＥＩＡ法やＦＩＡ
法では、感度の点で使用が制限されるという問題点と複
数目的物質を同時に検出しようとすると酵素反応生成物
の分画装置や蛍光、発光の分光分布の分析装置が必要と
なり装置コストが高くなり、かつ分解能の点で対象種類
がかなり制限されるという問題点があった。
検査法は広く臨床検査等に利用されているが、高感度に
目的物質を検出するためにはＲＩＡ法によることが多
い。しかしながら、このＲＩＡ法では、同一被検体中の
複数目的物質を同時に検出する事はできないという問題
点があった。また、他の方法、例えばＥＩＡ法やＦＩＡ
法では、感度の点で使用が制限されるという問題点と複
数目的物質を同時に検出しようとすると酵素反応生成物
の分画装置や蛍光、発光の分光分布の分析装置が必要と
なり装置コストが高くなり、かつ分解能の点で対象種類
がかなり制限されるという問題点があった。
【０００５】本発明はこのような問題点に鑑み、複数の
目的物質を同時に、簡単に、高感度に検出することを目
的にしている。
目的物質を同時に、簡単に、高感度に検出することを目
的にしている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明において
は、複数の目的物質と各々反応させる抗体または抗原
に、各々異なるＤＮＡ鎖からなる標識を付与して用いる
ことにした。これらを検出試薬として、被検体に加え
る。被検体に目的物質が含まれている場合には、抗原抗
体反応が起こり、これと未反応検出試薬とを分離（Ｂ／
Ｆ分離）して未反応検出試薬を除去する。得られた免疫
反応複合体は各々異なるＤＮＡ鎖を有しており、これら
を増幅して得られたＤＮＡ鎖断片を分析して測定するこ
とにより複数の目的物質を検出する。
は、複数の目的物質と各々反応させる抗体または抗原
に、各々異なるＤＮＡ鎖からなる標識を付与して用いる
ことにした。これらを検出試薬として、被検体に加え
る。被検体に目的物質が含まれている場合には、抗原抗
体反応が起こり、これと未反応検出試薬とを分離（Ｂ／
Ｆ分離）して未反応検出試薬を除去する。得られた免疫
反応複合体は各々異なるＤＮＡ鎖を有しており、これら
を増幅して得られたＤＮＡ鎖断片を分析して測定するこ
とにより複数の目的物質を検出する。
【０００７】本発明によれば、複数の検出試薬の各々異
なるＤＮＡ鎖を同一槽内で同時に増幅することが可能で
あるので、複数の目的物質を同時に、簡単に、高感度に
検出することができる。本発明において、複数の目的物
質を検出するときの標識となる各々異なるＤＮＡ鎖とし
ては、好ましくは増幅されるＤＮＡ鎖断片の長さが各々
異なるようなＤＮＡ鎖を用いる。
なるＤＮＡ鎖を同一槽内で同時に増幅することが可能で
あるので、複数の目的物質を同時に、簡単に、高感度に
検出することができる。本発明において、複数の目的物
質を検出するときの標識となる各々異なるＤＮＡ鎖とし
ては、好ましくは増幅されるＤＮＡ鎖断片の長さが各々
異なるようなＤＮＡ鎖を用いる。
【０００８】また、増幅された各々長さの異なるＤＮＡ
鎖断片を分析する手段として、電気泳動法により同一泳
動路で分画して測定することにより、複数の目的物質を
同時に、簡単に、高感度に検出することが可能となる。
鎖断片を分析する手段として、電気泳動法により同一泳
動路で分画して測定することにより、複数の目的物質を
同時に、簡単に、高感度に検出することが可能となる。
【０００９】
【作用】本発明によれば、検出試薬として各々の抗体又
は抗原に各々異なるＤＮＡ鎖をつけて被検体に同時に加
える。ここで、被検体中に複数の目的物質が存在する場
合、これと検出試薬との間で抗原抗体反応が起こり、抗
原と抗体は非常に高い特異性を持って結合する。
は抗原に各々異なるＤＮＡ鎖をつけて被検体に同時に加
える。ここで、被検体中に複数の目的物質が存在する場
合、これと検出試薬との間で抗原抗体反応が起こり、抗
原と抗体は非常に高い特異性を持って結合する。
【００１０】これをＢ／Ｆ分離して未反応検出試薬を除
去すれば免疫反応複合体が得られる。このときの状態は
ごく少量の各々の免疫反応複合体に各々異なるＤＮＡ鎖
が付いているものである。そこで、この各々のＤＮＡ鎖
を同時に高感度に検出するために、例えば公知技術であ
るＰＣＲ（polymerase chain reaction）法によりＤＮ
Ａ鎖断片を増幅する。
去すれば免疫反応複合体が得られる。このときの状態は
ごく少量の各々の免疫反応複合体に各々異なるＤＮＡ鎖
が付いているものである。そこで、この各々のＤＮＡ鎖
を同時に高感度に検出するために、例えば公知技術であ
るＰＣＲ（polymerase chain reaction）法によりＤＮ
Ａ鎖断片を増幅する。
【００１１】公知のＰＣＲ法とは、ＤＮＡ鎖内の特定の
塩基配列に挟まれた部分を増幅する手段である。本発明
では、抗原抗体反応により形成された複合体のＤＮＡ鎖
をＰＣＲ法を用いて増幅することにより、多量のＤＮＡ
鎖断片を生成させる。ＤＮＡ鎖断片が生成されること
は、すなわち目的物質である抗原（または抗体）の存在
を示しており、このＤＮＡ鎖断片を適当な方法で検出す
ることにより、目的物質の検出が行われる。また、本発
明では複数の目的物質を検出することを目的とするた
め、標識となるＤＮＡ鎖を各々の免疫反応複合体により
異なるものとする。
塩基配列に挟まれた部分を増幅する手段である。本発明
では、抗原抗体反応により形成された複合体のＤＮＡ鎖
をＰＣＲ法を用いて増幅することにより、多量のＤＮＡ
鎖断片を生成させる。ＤＮＡ鎖断片が生成されること
は、すなわち目的物質である抗原（または抗体）の存在
を示しており、このＤＮＡ鎖断片を適当な方法で検出す
ることにより、目的物質の検出が行われる。また、本発
明では複数の目的物質を検出することを目的とするた
め、標識となるＤＮＡ鎖を各々の免疫反応複合体により
異なるものとする。
【００１２】生成された複数のＤＮＡ鎖断片をたとえば
電気泳動法により検出することを考慮した場合、各々の
ＤＮＡ鎖断片の長さをかえることにより同時かつ簡単に
検出できる。ＤＮＡ鎖断片の長さをかえる手段として、
ＰＣＲ法により増幅されるＤＮＡ鎖の被増幅部を、プラ
イマー部となる２つ特定配列の共通オリゴヌクレオチド
部とこれに挟まれた個別ヌクレオチド部とから構成す
る。個別ヌクレオチド部は共通オリゴヌクレオチドと同
じ塩基配列を含まず、各々の標識しようとする抗体又は
抗原によって長さが異なる。このような被増幅部は、一
つのＤＮＡ鎖に１つ設けられていても良いし、２以上あ
っても良い。これにより、抗原抗体（免疫）反応が生じ
た場合には、ＰＣＲ法によりＤＮＡ鎖断片を増幅したと
き反応液中に各ＤＮＡ鎖に応じた長さのＤＮＡ断片が非
常に大量に生じることになる。そこでこれらを分画する
ために例えばゲル電気泳動により各々異なる長さを各々
異なる場所に局在化させ、エチジウムブロマイド等で染
色して蛍光を観察すればゲルのパタ−ンとして同時に簡
単に検出できる。
電気泳動法により検出することを考慮した場合、各々の
ＤＮＡ鎖断片の長さをかえることにより同時かつ簡単に
検出できる。ＤＮＡ鎖断片の長さをかえる手段として、
ＰＣＲ法により増幅されるＤＮＡ鎖の被増幅部を、プラ
イマー部となる２つ特定配列の共通オリゴヌクレオチド
部とこれに挟まれた個別ヌクレオチド部とから構成す
る。個別ヌクレオチド部は共通オリゴヌクレオチドと同
じ塩基配列を含まず、各々の標識しようとする抗体又は
抗原によって長さが異なる。このような被増幅部は、一
つのＤＮＡ鎖に１つ設けられていても良いし、２以上あ
っても良い。これにより、抗原抗体（免疫）反応が生じ
た場合には、ＰＣＲ法によりＤＮＡ鎖断片を増幅したと
き反応液中に各ＤＮＡ鎖に応じた長さのＤＮＡ断片が非
常に大量に生じることになる。そこでこれらを分画する
ために例えばゲル電気泳動により各々異なる長さを各々
異なる場所に局在化させ、エチジウムブロマイド等で染
色して蛍光を観察すればゲルのパタ−ンとして同時に簡
単に検出できる。
【００１３】
【実施例】本発明を利用してHBs抗原及びHBe抗原を高感
度に検出する例を以下に示す。 （1）標識用ビオチン化ＤＮＡ鎖及び増幅用プライマ−
鎖の作成 ここでは増幅用プライマ−鎖として市販されているλgt
10プライマ−を利用した。順方向（forward）λgt10プ
ライマ−の塩基配列は5'(GCTGGGTAGTCCCCACCTTT）3'で
あり、逆方向（reverse）用の塩基配列は5'(CTTATGAGTA
TTTCTTCCAGGGTA）3'である。ここではこれらの配列をλ
gt10F、λgt10Rと各々記す。次に標識用のＤＮＡ鎖とし
ては図１に示すようなＤＮＡ鎖ＡとＤＮＡ鎖ＢをＤＮＡ
合成機により調製した。ＤＮＡ鎖Ａは全長2000bpsの長
さを有し、112は塩基配列としてλgt10Rを有し、111は
これと相補的な配列を有し、115は塩基配列としてλgt1
0Fを有し、116はこれと相補的な配列を有する。113と11
4はλgt10R及びλgt10Fを含まない互いに相補的な任意
の配列であり、117と118も同様である。ＤＮＡ鎖Ｂは全
長2000bpsの長さを有し、122は塩基配列としてλgt10R
を有し、121はこれと相補的な配列を有し、125は塩基配
列としてλgt10Fを有し、126はこれと相補的な配列を有
する。123と124はλgt10F及びλgt10Rを含まない任意の
配列であり、127と128も同様である。ただし、117と118
の末端、127と128の末端は市販のビオチン化オリゴヌク
レオチドとリガ−ゼにより結合が可能になっている。こ
のＤＮＡ鎖ＡとＤＮＡ鎖Ｂをそれぞれビオチン化オリゴ
ヌクレオチド及びリガ−ゼと反応させて標識用ビオチン
化ＤＮＡ鎖Ａと標識用ビオチン化ＤＮＡ鎖Ｂを得た。 （2）検出試薬（ＤＮＡ標識抗体）の作成 アビジンを0.1mol/l リン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）
に溶解し、そこへ500〜1000当量のN-スクシンイミジル-
4-（N-マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボキ
シレートのN,N-ジメチルホルムアミド溶液を加え30℃に
て1時間反応させ、沈殿した未反応のマレイミド化合物
を遠心分離にて除去したのち、上清を0.1mo1/l リン酸
ナトリウム緩衝液（pH6.0）で平衡化したSephadex G-25
カラムにて目的物を精製した。この画分へHBs抗原の抗
体を溶解した5mmol/l EDTA含有リン酸ナトリウム緩衝液
を混ぜ合わせ4℃にて20時間インキュベートしたのち、
0.1mol/l リン酸ナトリウム緩衝液（pH6.5）で平衡化し
たUltrogel AcA 44カラムにて目的画分を精製しアビジ
ンにて標識された抗体を得た。これに（1）のビオチン
化DNA鎖Aの0.1mol/l リン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）
溶液を加えて反応させた。これにより生成した複合体を
0.1mol/l リン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）で平衡化し
たSephadex G-25カラムにて精製し、目的のＤＮＡ標識
化抗体を得て検出試薬とした。また同様の方法にてアビ
ジン-マレイミドのリンカーを介してHBe抗原の抗体とビ
オチン化DNA鎖Bとの複合体も作成して検出試薬とした。 （3）固相化抗体の作成 パイレックスガラスの微小試験管（市販ＰＣＲ増幅装置
のヒータ部に入るサイズ）を500℃で5時間乾燥し、45℃
で24時間、2％の3-アミノプロピルトリエトキシシラン
のアセトン溶液に浸したのち、洗浄し乾燥して1％グル
タルアルデヒド水溶液に1時間浸した。リン酸ナトリウ
ム緩衝液（pH7.2）にHBs抗原の抗体とHBe抗原の抗体と
を溶解したものをこれに加え、4℃にて1晩インキュベー
トしたのち、液を捨てリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.
2）にて洗浄した。これにより試験管に固定された固相
化抗体を得た。 （4）固相化抗体-抗原-標識化抗体複合体（免疫反応複
合体）の作成 （3）で処理した固相化抗体を有する試験管に被検体で
あるHBs抗原標準試料及びHBe抗原の標準試料を加えた系
C、HBs抗原標準試料のみを加えた系D、HBe抗原の標準試
料のみを加えた系Eの３種類を調製し、これらを室温に
て2時間インキュベートした。液を捨てリン酸ナトリウ
ム緩衝液（pH7.2）にて洗浄したのち、先に調製した検
出試薬である２種のＤＮＡ標識化抗体（Ａ鎖による標識
抗体及びＢ鎖による標識抗体）をリン酸ナトリウム緩衝
液で希釈し、各試験管に加え室温にて1時間インキュベ
ートした。 （5）標識の検出 試験管内の液を捨て、緩衝液にて洗浄してＢ／Ｆ分離を
したのち、（1）で準備したプライマー及び公知技術で
あるＰＣＲに必要な試薬（酵素及び各塩基の三リン酸体
等）を加え、パイレックスガラス製試験管のまま、ＰＣ
Ｒ増幅装置にかけたのち、試験内の液をポリアクリルア
ミドゲルにて電気泳動し、エチジウムブロマイドにて染
色して図２に示すようなバンドパターンを得た。図中21
はポリアクリルアミドのゲル板を表し、22は200bpsの塩
基配列長のバンドを示し、23は同じく400bpsのバンドを
示す。また矢印は泳動方向を示している。この各バンド
の蛍光強度を測定し、それを検量線と比較することによ
りバンドに存在するＤＮＡ量を求め、それにより抗原の
量を定量化した。
度に検出する例を以下に示す。 （1）標識用ビオチン化ＤＮＡ鎖及び増幅用プライマ−
鎖の作成 ここでは増幅用プライマ−鎖として市販されているλgt
10プライマ−を利用した。順方向（forward）λgt10プ
ライマ−の塩基配列は5'(GCTGGGTAGTCCCCACCTTT）3'で
あり、逆方向（reverse）用の塩基配列は5'(CTTATGAGTA
TTTCTTCCAGGGTA）3'である。ここではこれらの配列をλ
gt10F、λgt10Rと各々記す。次に標識用のＤＮＡ鎖とし
ては図１に示すようなＤＮＡ鎖ＡとＤＮＡ鎖ＢをＤＮＡ
合成機により調製した。ＤＮＡ鎖Ａは全長2000bpsの長
さを有し、112は塩基配列としてλgt10Rを有し、111は
これと相補的な配列を有し、115は塩基配列としてλgt1
0Fを有し、116はこれと相補的な配列を有する。113と11
4はλgt10R及びλgt10Fを含まない互いに相補的な任意
の配列であり、117と118も同様である。ＤＮＡ鎖Ｂは全
長2000bpsの長さを有し、122は塩基配列としてλgt10R
を有し、121はこれと相補的な配列を有し、125は塩基配
列としてλgt10Fを有し、126はこれと相補的な配列を有
する。123と124はλgt10F及びλgt10Rを含まない任意の
配列であり、127と128も同様である。ただし、117と118
の末端、127と128の末端は市販のビオチン化オリゴヌク
レオチドとリガ−ゼにより結合が可能になっている。こ
のＤＮＡ鎖ＡとＤＮＡ鎖Ｂをそれぞれビオチン化オリゴ
ヌクレオチド及びリガ−ゼと反応させて標識用ビオチン
化ＤＮＡ鎖Ａと標識用ビオチン化ＤＮＡ鎖Ｂを得た。 （2）検出試薬（ＤＮＡ標識抗体）の作成 アビジンを0.1mol/l リン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）
に溶解し、そこへ500〜1000当量のN-スクシンイミジル-
4-（N-マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボキ
シレートのN,N-ジメチルホルムアミド溶液を加え30℃に
て1時間反応させ、沈殿した未反応のマレイミド化合物
を遠心分離にて除去したのち、上清を0.1mo1/l リン酸
ナトリウム緩衝液（pH6.0）で平衡化したSephadex G-25
カラムにて目的物を精製した。この画分へHBs抗原の抗
体を溶解した5mmol/l EDTA含有リン酸ナトリウム緩衝液
を混ぜ合わせ4℃にて20時間インキュベートしたのち、
0.1mol/l リン酸ナトリウム緩衝液（pH6.5）で平衡化し
たUltrogel AcA 44カラムにて目的画分を精製しアビジ
ンにて標識された抗体を得た。これに（1）のビオチン
化DNA鎖Aの0.1mol/l リン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）
溶液を加えて反応させた。これにより生成した複合体を
0.1mol/l リン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）で平衡化し
たSephadex G-25カラムにて精製し、目的のＤＮＡ標識
化抗体を得て検出試薬とした。また同様の方法にてアビ
ジン-マレイミドのリンカーを介してHBe抗原の抗体とビ
オチン化DNA鎖Bとの複合体も作成して検出試薬とした。 （3）固相化抗体の作成 パイレックスガラスの微小試験管（市販ＰＣＲ増幅装置
のヒータ部に入るサイズ）を500℃で5時間乾燥し、45℃
で24時間、2％の3-アミノプロピルトリエトキシシラン
のアセトン溶液に浸したのち、洗浄し乾燥して1％グル
タルアルデヒド水溶液に1時間浸した。リン酸ナトリウ
ム緩衝液（pH7.2）にHBs抗原の抗体とHBe抗原の抗体と
を溶解したものをこれに加え、4℃にて1晩インキュベー
トしたのち、液を捨てリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.
2）にて洗浄した。これにより試験管に固定された固相
化抗体を得た。 （4）固相化抗体-抗原-標識化抗体複合体（免疫反応複
合体）の作成 （3）で処理した固相化抗体を有する試験管に被検体で
あるHBs抗原標準試料及びHBe抗原の標準試料を加えた系
C、HBs抗原標準試料のみを加えた系D、HBe抗原の標準試
料のみを加えた系Eの３種類を調製し、これらを室温に
て2時間インキュベートした。液を捨てリン酸ナトリウ
ム緩衝液（pH7.2）にて洗浄したのち、先に調製した検
出試薬である２種のＤＮＡ標識化抗体（Ａ鎖による標識
抗体及びＢ鎖による標識抗体）をリン酸ナトリウム緩衝
液で希釈し、各試験管に加え室温にて1時間インキュベ
ートした。 （5）標識の検出 試験管内の液を捨て、緩衝液にて洗浄してＢ／Ｆ分離を
したのち、（1）で準備したプライマー及び公知技術で
あるＰＣＲに必要な試薬（酵素及び各塩基の三リン酸体
等）を加え、パイレックスガラス製試験管のまま、ＰＣ
Ｒ増幅装置にかけたのち、試験内の液をポリアクリルア
ミドゲルにて電気泳動し、エチジウムブロマイドにて染
色して図２に示すようなバンドパターンを得た。図中21
はポリアクリルアミドのゲル板を表し、22は200bpsの塩
基配列長のバンドを示し、23は同じく400bpsのバンドを
示す。また矢印は泳動方向を示している。この各バンド
の蛍光強度を測定し、それを検量線と比較することによ
りバンドに存在するＤＮＡ量を求め、それにより抗原の
量を定量化した。
【００１４】以上のようにここでは２つの抗原に対して
実施例を示したがいかなる複数個の抗原に対してもプラ
イマ−間の塩基配列の長さを変えることにより同じ様に
できる。
実施例を示したがいかなる複数個の抗原に対してもプラ
イマ−間の塩基配列の長さを変えることにより同じ様に
できる。
【００１５】
【発明の効果】以上のとおり、本発明によれば、複数の
目的物質と反応する抗体（または抗原）の標識体とし
て、各々異なるＤＮＡ鎖を用いることにより、複数の目
的物質を同時に、簡単に、高感度に検出することが可能
となる。また、各々のＤＮＡ鎖のプライマ−間の塩基配
列の長さを目的物質毎に変えるだけで、複数の目的物質
を同時に高感度に検出できるのみならず、ごく一般的に
利用され取扱いの簡単な電気泳動法を使用しての検出が
可能となり、装置的にも優位である。
目的物質と反応する抗体（または抗原）の標識体とし
て、各々異なるＤＮＡ鎖を用いることにより、複数の目
的物質を同時に、簡単に、高感度に検出することが可能
となる。また、各々のＤＮＡ鎖のプライマ−間の塩基配
列の長さを目的物質毎に変えるだけで、複数の目的物質
を同時に高感度に検出できるのみならず、ごく一般的に
利用され取扱いの簡単な電気泳動法を使用しての検出が
可能となり、装置的にも優位である。
【００１６】更に検出された被検体（目的物質）のデ−
タは後日、いつでも再チェックできるし、検体相互の比
較も容易という利点もある。
タは後日、いつでも再チェックできるし、検体相互の比
較も容易という利点もある。
【図１】 本発明に用いる標識用のＤＮＡ鎖の構成図で
ある。
ある。
【図２】 本発明に用いる電気泳動法による泳動パタ−
ンである。
ンである。
111〜118 ＤＮＡ鎖の塩基配列 121〜128 ＤＮＡ鎖の塩基配列
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/543 ５４５ Ｐ 33/561 // Ｇ０１Ｎ 33/566
Claims (4)
- 【請求項１】 目的物質である抗原または抗体と、標識
を有する抗体または抗原とを反応させ免疫反応複合体を
得た後、該複合体と未反応物とを分離し、前記複合体の
標識を利用して目的物質を検出する免疫検査法におい
て、目的物質が複数あり、これらと反応する各々の抗体
または抗原の標識を各々異なるＤＮＡ鎖とし、前記反応
及び分離の後、免疫反応複合体のＤＮＡ鎖を増幅し、該
増幅されたＤＮＡ鎖断片を分析して測定することにより
複数の目的物質を検出することを特徴とする免疫検査
法。 - 【請求項２】 請求項１に記載の免疫検査法において、
前記各々異なるＤＮＡ鎖として、増幅されるＤＮＡ鎖断
片の長さが各々異なるＤＮＡ鎖を用いることを特徴とす
る免疫検査法。 - 【請求項３】 請求項２に記載の免疫検査法において、
各々のＤＮＡ鎖に、２つの特定配列の共通オリゴヌクレ
オチド部とこれに挟まれ前記特定配列を含まない個別オ
リゴヌクレオチド部とからなる被増幅部を１または２以
上設けることを特徴とする免疫検査法。 - 【請求項４】 請求項１に記載の免疫検査法において、
前記増幅された各々異なるＤＮＡ鎖断片を電気泳動法に
より同一泳動路で分画して測定することにより複数の目
的物質を検出することを特徴とする免疫検査法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6059259A JPH07265076A (ja) | 1994-03-29 | 1994-03-29 | 免疫検査法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6059259A JPH07265076A (ja) | 1994-03-29 | 1994-03-29 | 免疫検査法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07265076A true JPH07265076A (ja) | 1995-10-17 |
Family
ID=13108208
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6059259A Pending JPH07265076A (ja) | 1994-03-29 | 1994-03-29 | 免疫検査法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07265076A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997047968A1 (fr) * | 1996-06-10 | 1997-12-18 | Laboratory Of Molecular Biophotonics | Immunodosage a fluorescence a haute sensibilite |
| JP2005110664A (ja) * | 2003-09-16 | 2005-04-28 | Nissui Pharm Co Ltd | 核酸シグナルの増幅による標的ｄｎａの存在を検出する方法、及び免疫学的配位子の検出又は定量する方法 |
-
1994
- 1994-03-29 JP JP6059259A patent/JPH07265076A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997047968A1 (fr) * | 1996-06-10 | 1997-12-18 | Laboratory Of Molecular Biophotonics | Immunodosage a fluorescence a haute sensibilite |
| US6255048B1 (en) | 1996-06-10 | 2001-07-03 | Laboratory Of Molecular Biophotonics | Highly sensitive fluoroassay |
| JP2005110664A (ja) * | 2003-09-16 | 2005-04-28 | Nissui Pharm Co Ltd | 核酸シグナルの増幅による標的ｄｎａの存在を検出する方法、及び免疫学的配位子の検出又は定量する方法 |
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