CN113564158A - 一种DNA引物、包括该引物的CRISPR/Cas12a系统及试剂盒 - Google Patents
一种DNA引物、包括该引物的CRISPR/Cas12a系统及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本申请公开了一种DNA引物、包括该引物的CRISPR/Cas12a系统及试剂盒。该DNA引物具有高度CRISPR/Cas12a激活效率，能够用于CRISPR/Cas12a系统的构建以及不同目标物的试剂盒的构建。在多种新型生物传感器方面的应用提供了新的范例。能够应用到不同的诊断领域，包括临床终端用户诊断和环境检测、生物安全监控和食品安全控制等。
Description
技术领域
本申请涉及生物传感、体外诊断及分子诊断领域，更具体地，涉及一种DNA引物、包括该引物的CRISPR/Cas12a系统以及包括该引物的试剂盒。
背景技术
生物传感技术是一种广泛应用的传感技术，其通常采用例如DNA、RNA或者蛋白质(如，抗体)在内的生物分子来对目标物进行检测。通过生物分子对目标物进行识别，并将目标物的含量信息转化为电学或者光学信号，从而实现目标物检测。其中，生物传感器表面修饰、生物传感信号放大技术是生物传感技术中提高目标物检测灵敏度的重要手段。
CRISPR(即Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，规律间隔成簇短回文重复序列)/Cas12a系统是一种新建立的生物传感系统。其中的Cas12a蛋白在被引物(例如，特定序列的单链或者双链DNA)激活的状态下能够识别特定的核酸序列并对该核酸序列进行高效切割。基于此过程，可以设计出对特定目标物进行识别以及灵敏检测的策略。特定目标物超灵敏检测是生物传感的重要目标，然而现有CRISPR/Cas12a系统的切割效率不够高，进而导致了信号放大效率难以达到超灵敏检测需求。
发明内容
发明人发现，CRISPR/Cas12a系统对于核酸序列的切割能力，与对该系统进行激活的引物序列有关，不同的引物序列对于上述系统的激活效率具有很大差别。发明人意外发现了能够对CRISPR/Cas12a系统进行高效激活的DNA引物。
该DNA引物用于激活CRISPR/Cas12a系统，其包括序列表中SEQ ID No.1的序列，也即，包括5’-ACA CAA CAACCA AAC ACA ACC AAC CCC-3’的序列。可以理解，上述核苷酸序列允许被稍微调整，例如，DNA引物还可以是序列表中SEQ ID No.2的序列，也即，包括5’-ACACAA CCACCC AAC ACA ACC AAC CCC-3’的序列。
此外，本申请还公开了一种CRISPER/Cas12a系统，其包括：
Cas12a蛋白，gRNA，以及如上所述的DNA引物；其中，所述gRNA包括所述DNA引物的至少部分序列的互补序列。
可选地，所述gRNA包括序列表中SEQ ID No.3的序列，即，可以包括5’-UAA UUUCUA CUA AGU GUA GAU GGG GUU GGU UGU GUU UGG UUG-3’的序列，该序列可以被选择用于适配于SEQ ID No.1的序列的DNA引物。或者，gRNA可以包括序列表中SEQ ID No.4的序列，即5’-UAA UUU CUA CUA AGU GUAGAU GGG GUU GGU UGU GUU GGG UGG-3’的序列，以适配SEQ ID No.2的序列的DNA引物。
此外，本申请还公开了基于CRISPER/Cas12a系统的荧光信号放大平台，包括：如上所述的CRISPER/Cas12a系统，以及一荧光探针；其中，所述荧光探针具有能够被所述CRISPER/Cas12a系统识别的切割位点以及分别设置于所述切割位点两侧的荧光团和猝灭团。
可选地，所述荧光探针包括序列表中SEQ ID No.5的序列，也即，可以包括5’-TTATT-3’的序列。
可选地，荧光团可以包括量子点，FAM、VIC、HEX、TRT、Cy3、Cy5、ROX、JOE和TexasRed中的至少一种；猝灭团包括TAMRA、DABCYL、MGB、BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3中的至少一种。
此外，本申请还公开了一种用于目标物检测的ELISA试剂盒，包括：固相载体，目标物第一亲和物，目标物第二亲和物，以及如权利要求1上所述的DNA引物；其中，所述目标物第一亲和物包被于所述固相载体，所述DNA引物与所述目标物第二亲和物连接形成复合物。
可选地，上述试剂盒还可以包括：Cas12a蛋白，gRNA，以及荧光探针；其中，所述gRNA包括所述DNA引物的互补序列，所述荧光探针具有能够被所述Cas12a识别的切割位点以及分别设置于所述切割位点两侧的荧光团和猝灭团。
此外，本申请还公开了一种用于目标物检测的侧流层析试剂盒，包括：侧流层析试纸，所述侧流层析试纸包括：样品垫，检测线，质控线，背板，吸收垫；试剂组，所述试剂组包括固定于所述检测线的目标物第三亲和物，固定于所述质控线的生物分子，目标物第四亲和物-DNA引物复合物以及生物分子亲和物-胶体金复合物；其中，所述DNA引物包括如上所述的DNA引物。
可选地，上述侧流层析试剂盒的试剂组还包括：Cas12a蛋白，gRNA，以及荧光探针；其中，所述gRNA包括所述DNA引物的互补序列，所述荧光探针具有能够被所述Cas12a识别的切割位点以及分别设置于所述切割位点两侧的荧光团和猝灭团。
本申请发现了对CRISPR/Cas12a具有高度激活效率的DNA引物。基于此，成功开发了通用且超灵敏的ELISA试剂盒平台，该试剂盒将CRISPR/Cas12a系统与用于信号放大的免疫测定相集成，在灵敏度和线性范围方面有显著的改进。通过成功地将CRISPR/Cas12a与免疫分析技术结合，本申请在多种新型生物传感器方面的应用提供了新的范例。
附图说明
图1是根据本申请一些实施例的DNA引物激活效率示意图；
图2是根据本申请一些实施例的用于目标物检测的ELISA试剂盒的检测原理图；
图3是根据本申请一些实施例的抗体-DNA引物复合物电泳迁移变动分析结果；
图4是根据本申请一些实施例的ELISA试剂盒对目标物的检测的标定曲线；
图5是根据本申请一些实施例的ELISA试剂盒的抗干扰结果图；
图6是根据本申请一些实施例的ELISA试剂盒对不同目标物的检测效果图；
图7是根据本申请一些实施例的用于目标物检测的侧流层析试剂盒原理图；
图8是根据本申请一些实施例的侧流层析试剂盒检测胰岛素的结果图。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本申请进一步详细说明。
本申请的DNA引物包括具有5’-ACACAACAA CCA AAC ACA ACC AAC CCC-3’的序列，也即，如序列表中SEQ ID No.1的序列。由标准核苷酸BLAST27进行的序列相似性测试表明，该序列与NCBI数据库中任何已报道的基因组信息产量没有完全相似性。发明人意外地发现，该序列能够以极高的效率激活CRISPR/Cas12a系统，进而使Cas12a对特定的核苷酸序列进行切割。
在其他一些实施例中，本申请对上述DNA序列的激活效率进行验证。为了进行此验证，本申请首先设计了一条gRNA(也即，导向RNA)序列。该gRNA序列中，至少包括与上述DNA引物的至少部分序列的互补序列。
在一些实施例中，gRNA的序列可以如序列表中SEQ ID No.3所示出的那样，包括：5’-UAA UUU CUA CUA AGU GUA GAU GGG GUU GGU UGU GUU UGG UUG-3’的序列。可以看出，上述序列中，GGG GUU GGU UGU GUU UGG UUG的区段即为该实施例中与上述DNA引物至少部分序列的互补序列。该互补序列包括了21个核苷酸，用于提供与上述DNA引物稳定的结合力，并且能够不影响上述DNA引物对于CRISPR/Cas12a系统的激活效率。gRNA其余部分序列的设计规则可以是现有技术任意的。不再赘述。
应当注意，上述gRNA的序列并非是唯一的，在本申请的上述DNA引物被确定的基础上，gRNA序列可以根据该DNA引物进行自主调节，参照本申请上述公开的gRNA序列设计方法进行设计。例如，选择DNA引物和gRNA分别为SEQ ID No.2和SEQ ID No.4的序列。在此不再赘述。除此之外，Cas12a可以由现有任意的试剂公司直接购得，其氨基酸序列、结构特性等在此不再赘述。
可以理解，对于上述DNA引物的激活效率的验证方式可以是多样的。例如，比色法、电化学方法、荧光法等。
在本申请一些实施例中，选择荧光法对上述系统以及上述DNA序列激活效率进行验证。可以设置包括能够被上述系统所识别的切割位点的荧光探针。例如，选择如序列表中SEQ ID No.5的荧光探针进行验证。该荧光探针包括5’-TTATT-3’的5个核苷酸序列。并且，在该探针的两端，分别标记有荧光团和猝灭团。上述荧光团和猝灭团可以是本领域任意的。例如，荧光团可以包括量子点，FAM、VIC、HEX、TRT、Cy3、Cy5、ROX、JOE和Texas Red中的至少一种；猝灭团可以包括氧化石墨烯、纳米金颗粒、TAMRA、DABCYL、MGB、BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3中的至少一种。可以理解，荧光团和猝灭团还可以是其他类型的，本申请在此不再进行穷举。
此外，应当注意，荧光团和猝灭团的修饰位置可以是多样的，例如，荧光团设置于5’端、猝灭团设置于3’端。或者，荧光团设置于3’端、猝灭团设置于5’端。再或者，二者之一或者全部，连接于非末端核苷酸。仅需保证二者分别设置于上述切割位点两侧即可，从而能够保证在上述荧光探针被切割后荧光团以及猝灭团的分离，进而保证荧光信号的产生。
上述荧光探针的核苷酸序列可以被CRISPR/Cas12a系统识别，例如，可以通过碱基互补配对，与上述系统中的部分核苷酸进行不完全互补配对，进而被Cas12a蛋白识别。进一步地，该荧光探针将被上述CRISPR/Cas12a系统所切割。在一些实施例中，例如，溶液体系中，切割后的荧光探针将脱离CRISPR/Cas12a系统，游离于溶液中。并且，切割导致了上述荧光团与猝灭团的分离，荧光团在发射光源照射后将发出荧光，且不再被猝灭团所猝灭，因此能够被仪器所检出。这样的方式，即可构建基于上述CRISPER/Cas12a系统的荧光信号放大平台。
在一些非限定性的实施例中，本申请对上述DNA引物的激活效率进行了测试。具体地，本申请对比了在DNA引物存在和不存在的情况下，上述CRISPR/Cas12a系统以及荧光探针的荧光信号强度(如无特殊说明，下文中进行验证的DNA引物序列为SEQ ID No.1的序列)。如图1所示，示出了本申请一些实施例的DNA引物激活效率示意图。如图所示，当在足量的gRNA、Cas12a蛋白以及荧光探针的PBS溶液中，加入上述DNA引物(右侧，阳性)以及不加入DNA引物(左侧，阴性)条件下，孵育一定时间后进行荧光强度测试。测试结果显示，本申请的DNA引物在均相溶液中能够达到十倍以上的信号放大效果。该结果证明了，本申请所发现的该DNA引物，能够对CRISPR/Cas12a系统进行高效激活。
至此，本申请公开了上述DNA引物，其能够用于以极高的效率激活CRISPR/Cas12a系统。除此以外，还公开了包括Cas12a蛋白，上述DNA引物以及与之匹配的gRNA在内的CRISPR/Cas12a系统。并且，该系统结合适当序列的荧光探针，可以用于构建荧光信号放大平台。
现有CRISPR/Cas12a系统不能实现真正意义上的体外诊断。发明人意识到，本申请上述DNA引物的高激活效率，能够实现CRISPR/Cas12a系统对任意目标物的生物传感信号放大检测。例如，可以将上述DNA引物连接于能够特异性识别目标物的亲和分子，可以将目标物的浓度与DNA引物的浓度建立等价或者等比例的关系，进而利用上述的CRISPR/Cas12a系统进行信号输出，即可实现上述目标物的信号放大检测。应当知道，上述目标物亲和分子可以是多样的，包括但不限于抗体、抗原、适配体等本领域的特异性目标物亲和物。可以理解，上述检测过程中可以在均相溶液中进行，也可以在异相中进行。
可选地，在异相环境下，本申请创造性地将该DNA引物应用于ELISA(酶联免疫吸附)试剂盒平台以及侧流层析试剂盒平台进行了验证，并成功实现了对目标物的超灵敏检测。下文将对这两种平台分别进行示例性阐述。
如图2所示，示出了本发明一些实施例用于目标物201的检测的ELISA试剂盒的检测原理图。该ELISA试剂盒可以包括固相载体202，目标物第一亲和物203，目标物第二亲和物204，以及DNA引物205。
固相载体202可以是任意的，例如图2所示的96孔板。本领域其他任意的固相载体也是被允许的，包括但不限于聚四氟乙烯ELISA板、玻璃光纤、不锈钢丝，磁珠等，不再一一列举。
图2示出了目标物第一亲和物203可以为目标物201的第一抗体，目标物第二亲和物204为目标物的第二抗体。可以知晓，在本公开教导下，第一、二亲和物还可以是其他对目标物具有特异性识别功能的物质，例如，适配体(aptamer)。在此不再赘述。
目标物第一亲和物203可以包被于所述固相载体202的表面。包被的技术可以是本领域中任意的。例如，可以在固定载体202表面事先修饰生物素或者链霉亲和素；相应地，在目标物第一亲和物203上修饰链霉亲和素或生物素。利用生物素-链霉亲和素的作用力，即可实现目标物第一亲和物203与固定载体203之间的牢固结合。此外，其他结合方式也是被允许的，例如，共价结合，Au与巯基的结合等。不再赘述。
通过抗体-目标物-抗体的夹心结构，能够实现目标物在固相载体202表面的固定。
进一步地，DNA引物205与目标物第二亲和物204连接形成复合物。DNA引物205的具体序列，可以如本申请上述任意实施例所公开，在此不再赘述。此外，如上文所述，该连接可以是通过末端修饰的生物素-链霉亲和素的作用力的连接，也可以是其他任意形式的连接。可以理解，当目标物第二亲和物204为适配体，则DNA引物205可以和该目标物第二亲和物204为一条完整的单链DNA结构。
至此，形成了固相载体202-目标物第一亲和物3-目标物201-目标物第二亲和物204-DNA引物205的连接结构。该结构中，目标物201的浓度可以和DNA引物205建立对应关系，通过对DNA引物205的浓度进行检测，即可对目标物201的浓度进行检测。
检测的手段可以是多样的，例如，类似于本申请上文所述的基于CRISPR/Cas12a系统的荧光信号放大策略。继续参考图2，对该策略进行示例性描述。
该ELISA试剂盒测试系统包括Cas12a 206，gRNA 207，以及荧光探针208。其中，所述gRNA 207包括上述DNA引物205的互补序列，所述荧光探针208具有能够被所述Cas12a206识别的切割位点以及分别设置于所述切割位点两侧的荧光团和猝灭团。
上述Cas12a 206，gRNA 207，荧光探针208，荧光团和猝灭团的结构或类型，上文已详细阐明，在此不再赘述。在加入上述物质以后，DNA引物205可以对CRISPR/Cas12a体系进行激活，从而促使Cas12a对荧光探针208切割。如图所示，被切割后，荧光团远离猝灭团而产生能够被仪器所检测的荧光信号。
可以理解，上述目标物第一亲和物203、目标物第二亲和物204可以根据待检测物的需要进行自由选择，从而构建通用的目标物荧光信号放大检测的超灵敏ELISA试剂盒。目标物可以是：激素、药物、霉菌毒素、过敏原残留、转基因产品；病毒、细菌、真菌等微生物；白介素、选择素、集落刺激因子，肿瘤坏死因子，干扰素等细胞因子；组织多肽抗原，肿瘤相关因子，胰腺癌，直肠癌等肿瘤标志物；乙脑，乙肝，丙肝，丁肝，戊肝，庚肝，衣原体等传染病抗体。上述公开仅是示例性阐述，并不做具体限定。
为进一步阐明本公开的ELISA试剂盒的高灵敏度以及便捷性，本申请选择了干扰素IFN-γ作为待测物，利用上述ELISA平台，进行荧光信号放大检测。下文对该IFN-γ检测进行示例性的描述。可以理解，各实验条件并不做唯一限定，例如，反应时间，浓度选择，缓冲体系等，可以在本公开教导之下进行调整。此外，下述方案的步骤，可以根据需要进行调整，本公开不做限定。
在一些实施例中，上文所述的目标物第二亲和物可以是IFN-γ的抗体；相应地，该抗体可以与上述DNA引物连接形成复合物。二者具体连接方式可以如下：
使用链霉亲和素与IFN-γ的抗体直接连接，并制备生物素化的DNA引物，由于链霉亲和素和生物素的相互作用，该抗体可以与上述DNA引物连接形成复合物。
由于DNA引物寡核苷酸的分子量比抗体低得多，多余未结合的DNA引物寡核苷酸通过基于离心的过滤被去除。
具体地，可以向10μL(1mg mL-1)抗体(66.7pmol)溶液中加入10μL(1mg mL-1)链霉亲和素(189.4pmol)，并在室温下轻轻混合3h。然后，将10μL 10μM(100pmol)生物素化的触发单链DNA与1μg制备的链霉亲和素偶联抗体(6.7pmol)在室温下混合3h，形成抗体-DNA引物复合物，然后使用具有10k分子分离孔的低结合力PES过滤器离心过滤溶液，以除去未连接的适配体。转速设置为12,000rpm，持续5min。用PBS缓冲液洗涤3次，将收集到的抗体-DNA引物复合物保存在4℃下备用。可以理解，上述任意条件包括孵育时间、目标物浓度、转速、时间、温度等，可以在合理范围内进行适当调节。
为了验证上述抗体-DNA引物复合物合成效果，本公开进行了电泳迁移率变动分析。例如，本公开将琼脂糖粉末完全溶解在1×TAE(Tris/乙酸/EDTA)缓冲液中，制成2％琼脂糖凝胶。在添加0.01％(v/v)的10,000×SYBG金染料之前，将凝胶溶液冷却至60℃。然后将12μl上述复合物和20bp DNA阶梯上样到凝胶孔中。电泳在70V下运行1h。用于图像采集的Gel Doc+XR图像系统将凝胶可视化。并将单纯的DNA引物作为对照组进行了验证。结果如图3所示，示出了抗体-DNA引物复合物电泳迁移变动分析结果。电泳迁移率变动分析结果证实了抗体-DNA引物复合物的成功合成，因为与游离DNA引物相比，抗体-DNA引物复合物在琼脂糖凝胶上引起了明显的延迟运动。
进一步地，该ELISA试剂盒中，目标物第一亲和物可以是IFN-γ的另一抗体，该另一抗体(也即，目标物第一亲和物)可以包被于96孔板(也即，固相载体)。具体地，可以用10μg mL-1的上述另一抗体固定在平底96孔板，在4℃下过夜，然后用0.5mg mL-1BSA溶液封闭链霉亲和素修饰板1h。然后，将该准备好的分析物捕获界面存储在4℃以便进一步进行检测。
至此，本申请公开了以IFN-γ作为目标物的前提下，ELISA试剂盒的构建示例。本示例中，可以建立起96孔板-另一抗体-IFN-γ-抗体-DNA引物的平台，进而建立起IFN-γ与DNA引物的对应关系。这样，利用DNA引物的检测手段即可对IFN-γ的含量进行定量以及定性分析。
进一步地，可以利用上述DNA引物对上文任意实施例公开的CRISPR/Cas12a系统进行激活以及信号放大检测。仍然以荧光信号放大检测为例进行验证。可以将10μL 10μM的Cas12a蛋白与5μL 20μM的gRNA在5mL缓冲液(例如，NEB缓冲液或其他)中混合待用。
可以在室温下加入100μL样品溶液(样品可以改变，例如1X PBS，血清和血浆)，持续1h，用PBS洗涤3次后，在室温下加入100μL 4μgmL-1原始IFN-γ检测抗体，放置1h后，再用PBS洗涤3次。然后，加入100μL 10μg mL-1上述抗体-DNA引物复合物，在室温下再放置1h，再洗涤3次。然后，加入100μL预制CRISPR/Cas12a反应混合物(包括足量的上文所述荧光探针)，在室温下放置30min以产生信号。然后使用ID5酶标仪在Ex＝570nm和Em＝615nm处检测荧光信号。应当注意，上述荧光激发、发射波长可基于荧光团、猝灭团的不同而调节。
在一些实施例中，还可以对参数进行优化。优化可以遵循单变量原则或者其他原则。具体而言，可以将不同浓度的生物素化捕获抗体(0、0.5、1、2、4、6和8μg mL-1)固定在板上，形成基本的检测界面。然后在室温下将100μL 1ng mL-1IFN-γ的PBS溶液加入板上的孔中，放置2h。之后，在室温下加入100μL 4μg mL-1原始IFN-γ检测抗体，放置1h后，再用PBS洗涤3次。在室温下加入100μL 4μg mL-1IFN-γ抗体-DNA引物反应2h，形成夹心结构，再用1XPBS缓冲液洗涤3次。最后，在室温下将100μL预制的CRISPR/Cas12a反应混合物添加到每个孔中，放置1h。使用ID5板读数器以Ex＝570nm和Em＝615nm检测荧光信号。
在优化了与抗体-分析物夹心结构形成有关的关键因素后，对CRISPR/Cas12a扩增系统进行了研究。在测试过程中，固定荧光报告分子的浓度为166nM，然后在缓冲液中制备不同浓度的Cas12a蛋白，包括0、3.13、6.25、12.5、25和50μg mL-1。gRNA与Cas12a蛋白混合，摩尔比为Cas12a∶gRNA＝1∶1。其余过程与CANi系统的标准程序相同。
为了检测单一分析物IFN-γ，本申请采用上述系统标准方案，用制备的96孔板对IFN-γ和IFN-γ抗体-DNA引物复合物进行检测。将人IFN-γ分析物掺入1X PBS或用10X系列稀释液稀释的不同浓度的血清(包括1ng mL-1至1fg mL-1)中，来制备测试样品。然后，100μL每份制备好的样品遵循标准方案进行检测。
结果如图4所述，示出了本申请一些实施例中ELISA试剂盒对目标物的检测的标定曲线。该试剂盒可以成功用于IFN-γ超灵敏检测。具体而言，该试剂盒具有六个数量级线性范围从1fg mL-1到1ng mL-1相关系数为0.96，明显广于典型的商用ELISA试剂盒(宽3至4个数量级)。此外，本申请的最低可检测浓度为1fg mL-1，比市售ELISA试剂盒(最低检测浓度为10pg mL-1)高4个数量级。根据0和1fg mL-1之间观察到的统计学显著(P<0.05)荧光差异，此处报道的检测极限(LOD)为1fg mL-1。
为了研究上述试剂盒的特异性，采用了几种物理相关的干扰方法，结果如图5所示，示出了本申请一些实施例中ELISA试剂盒的抗干扰结果。在同样的试剂盒条件下，目标物IFN-γ的荧光信号显着高于干扰蛋白(包括IL-1β，IL-2，IL-6，IL-10，TNF-α，BSA和HSA)，且各干扰蛋白的荧光信号差异有统计学意义(p<0.005)。该结果证实了本申请所公开的ELISA试剂盒的强特异性。
为了进一步研究本申请的ELISA试剂盒的普适性，发明人还将上述试剂盒用于检测五种不同的分析物(IL-1β，IL-6，TNF-α,IFN-γ和insulin)。可以理解，不同的分析物将选择不同的第一目标物亲和物以及第二目标物亲和物(例如，第一抗体、第二抗体)。结果如图6所示，示出了本申请一些实施例中ELISA试剂盒的对不同目标物的检测效果。结果表明，在37℃下反应1h后，CRISPR/Cas12a反应混合物均被激活，表现出和检测IFN-γ时相同的激活效率。因此，该CRISPR/Cas12a反应体系的普适性很强，可以用于不同待测物的检测，并表现出类似的灵敏度。
可见，本申请的ELISA试剂盒检测平台基于本申请发现的DNA引物的高度激活效率，能够实现通用、灵敏、特异的目标物检测。
应当注意，如上文所述，本申请所发现的DNA引物以及基于该DNA引物的CRISPR/Cas12a系统不仅能够用于ELISA试剂盒检测平台，还可以在本公开教导下用于市场上任意其他平台。例如，侧流层析试剂盒。
本申请一些实施例中，公开了一种用于目标物检测的侧流层析试剂盒。
如图7所示，示出了本申请一些实施例的用于目标物检测的侧流层析试剂盒原理图。该试剂盒可以包括侧流层析试纸，上述侧流层析试纸可以包括样品垫701，检测线702，质控线703，背板704，以及吸收垫705。
此外，该试剂盒还可以进一步包括试剂组。试剂组可以包括目标物第三亲和物706，上述目标物第三亲和固定于上述检测线702；试剂组还可以包括一生物分子707，上述生物分子固定于上述质控线703上。此外，试剂组还包括目标物第四亲和物-DNA引物复合物708以及生物分子亲和物-胶体金复合物709。上文已经揭示，亲和物和DNA引物的结合方式可以是任意的，再次不再赘述。可以理解，生物分子亲和物和胶体金的连接方式也可以本领域任意的。
至此，本申请公开了上述侧流层析试剂盒的试纸以及试剂组的主要组成。进一步地，该试剂盒还可以包括Cas12a蛋白，gRNA，以及荧光探针(与上文类似，未在图8标识出)；其中，所述gRNA包括所述DNA引物的互补序列，所述荧光探针具有能够被所述Cas12a识别的切割位点以及分别设置于所述切割位点两侧的荧光团和猝灭团。该部分与上述ELISA试剂盒类似，不再赘述。
本申请还选择了一种目标物对上述侧流层析试剂盒进行验证。具体而言，选择胰岛素作为目标物进行验证。
在非限定性实施例中，取1mL胶态金溶液(60纳米大小)，并通过7000rpm离心10分钟，用硼酸钠缓冲液(2mM，pH＝8.5)代替其介质(即柠檬酸盐缓冲液)。然后，将5μL人胰岛素单克隆抗体(4mg/ml)添加到胶态金溶液中，并在室温轻轻搅拌下孵育1小时。之后，将1％w/v BSA作为封闭剂添加到缀合物溶液中，并在室温下再孵育30分钟。最后，将溶液离心(7000rpm，10分钟)，弃去上清液，将获得的沉淀重新分散在存储缓冲液(Tris-HCL 10mM，pH＝8.2，含BSA1％w/v，Tween-20 1)中。％v/v，蔗糖5％w/v和叠氮化钠0.01％w/v。
在一些实施例中，DNA引物被连接在抗胰岛素的检测抗体，形成胰岛素复合探针。将硝化纤维素膜(300×25mm)粘贴到塑料背衬上，并将相应的试剂分配到检测线和质控线区域。检测线试剂溶液由生物素化的多克隆人胰岛素抗体(4μg/mL)和链霉亲和素(1mg/ml)以1：1的混合比组成，将其在室温下初步孵育1h。将山羊抗小鼠IgG抗体(0.5mg/ml)直接分配在质控线区域。使用定义的设置参数(0.3μL/cm的滑膜体积和100mm/s的滑膜速度)执行滑膜操作。滑膜后，将NC膜在37℃的真空烘箱中干燥2小时。同时，将样品垫(300×25mm)用处理缓冲液(PBS pH＝7.4，含有BSA 1％w/v，Tween-20 0.25％v/v，蔗糖2％)处理，并在37℃下干燥10分钟。37℃的真空烘箱中干燥2小时，将处理后的样品垫和吸收垫(300×25mm)粘贴到背衬，与NC膜重叠2mm的边距。然后将完整的侧流层析胶条切成单独的侧流层析胶条。
在样品垫加入70uL待测样品(唾液，尿液，血液等体液)完成标准的LFA过程。10分钟之后，载入上述复合探针(4μg/mL)，将65μL的CRISPR/Cas12a反应混合物引入试纸的样品垫中，然后将试纸立即转移到黑暗处，在15分钟后使用荧光读取器测量信号。建立荧光信号和待测物胰岛素浓度的线性关系。
图8示出了本申请一些实施例中侧流层析试剂盒检测胰岛素的结果。图8A表示不同胰岛素浓度的试纸条，不同浓度的胰岛素下，试纸均有荧光产生。从图8B看出荧光信号随着胰岛素浓度增加而增加。从图8C检测到的胰岛素的标定曲线看出侧流层析试剂盒的检测灵敏度为10fg/mL，线性范围为10fg/mL到1ng/mL。实验结果显示出了高度的灵敏度以及高度的线性范围。
可以理解，在本申请上述教导下，能够采用类似技术对不同的目标物进行侧流层析试剂盒检测。
本申请中，发现了具有高度CRISPR/Cas12a激活效率的DNA引物。基于此，成功开发了通用且超灵敏的ELISA试剂盒平台，该试剂盒将CRISPR/Cas12a系统与用于信号放大的免疫测定相集成，在灵敏度和线性范围方面有显著的改进。通过成功地将CRISPR/Cas12a与免疫分析技术结合，本申请在多种新型生物传感器方面的应用提供了新的范例。在本公开教导下，该方法能够应用到不同的诊断领域，包括临床终端用户诊断和环境检测、生物安全监控和食品安全控制等。尤其是作为基于抗体的系统，该发明出色的生物传感性能使其为快速响应当前全球COVID-19等突发公共卫生事件提供宝贵的解决方案，以便更好，更快地了解感染阶段，免疫保护水平，疫苗接种效率等，为政府或组织制定临床和经济决策提供关键信息。
SEQUENCE LISTING
<110> 卢青松
<120> 一种DNA引物、包括该引物的CRISPR/Cas12a系统及试剂盒
<130> 5
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acacaacaac caaacacaac caacccc 27
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
acacaaccac ccaacacaac caacccc 27
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<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 3
uaauuucuac uaaguguaga ugggguuggu uguguuuggu ug 42
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<212> RNA
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<400> 4
uaauuucuac uaaguguaga ugggguuggu uguguugggu gg 42
<210> 5
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ttatt 5
Claims (10)
1.一种DNA引物，用于激活CRISPR/Cas12a系统，其特征在于：
所述DNA引物包括序列表中SEQ ID No.1或SEQ ID No.2的序列。
2.一种CRISPER/Cas12a系统，其特征在于，包括：
Cas12a蛋白，gRNA，以及如权利要求1所述的DNA引物；其中，所述gRNA包括所述DNA引物的至少部分序列的互补序列。
3.根据权利要求2所述的CRISPER/Cas12a系统，其特征在于：
所述gRNA包括序列表中SEQ ID No.3或SEQ ID No.4的序列。
4.一种基于CRISPER/Cas12a系统的荧光信号放大平台，其特征在于，包括：
如权利要求2或3所述的CRISPER/Cas12a系统，以及一荧光探针；其中，所述荧光探针具有能够被所述CRISPER/Cas12a系统识别的切割位点以及分别设置于所述切割位点两侧的荧光团和猝灭团。
5.根据权利要求4所述的荧光信号放大平台，其特征在于：
所述荧光探针包括序列表中SEQ ID No.5的序列。
6.根据权利要求4或5所述的荧光信号放大平台，其特征在于：
所述荧光团包括量子点，FAM、VIC、HEX、TRT、Cy3、Cy5、ROX、JOE和Texas Red中的至少一种；所述猝灭团包括氧化石墨烯、金纳米颗粒、TAMRA、DABCYL、MGB、BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3中的至少一种。
7.一种用于目标物检测的ELISA试剂盒，其特征在于，包括：
固相载体，目标物第一亲和物，目标物第二亲和物，以及如权利要求1所述的DNA引物；其中，所述目标物第一亲和物包被于所述固相载体，所述DNA引物与所述目标物第二亲和物连接形成复合物。
8.根据权利要求7所述的ELISA试剂盒，其特征在于，还包括：
Cas12a蛋白，gRNA，以及荧光探针；其中，所述gRNA包括所述DNA引物的互补序列，所述荧光探针具有能够被所述Cas12a识别的切割位点以及分别设置于所述切割位点两侧的荧光团和猝灭团；
所述固相载体包括聚四氟乙烯ELISA板、玻璃光纤、不锈钢丝、磁珠中的至少一种。
9.一种用于目标物检测的侧流层析试剂盒，其特征在于，包括：
侧流层析试纸，所述侧流层析试纸包括：样品垫，检测线，质控线，背板，以及吸收垫；试剂组，所述试剂组包括固定于所述检测线的目标物第三亲和物，固定于所述质控线的生物分子，目标物第四亲和物-DNA引物复合物，以及生物分子亲和物-胶体金复合物；其中，所述DNA引物包括如权利要求1所述的DNA引物。
10.根据权利要求9所述的侧流层析试剂盒，其特征在于，所述试剂组还包括：
Cas12a蛋白，gRNA，以及荧光探针；其中，所述gRNA包括所述DNA引物的互补序列，所述荧光探针具有能够被所述Cas12a识别的切割位点以及分别设置于所述切割位点两侧的荧光团和猝灭团。
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|---|
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