CN111961705A

CN111961705A - 一种沙门氏菌的检测方法

Info

Publication number: CN111961705A
Application number: CN202010803778.1A
Authority: CN
Inventors: 曾令文; 易志健; 梁琼心; 吴靖华; 甄俊杰
Original assignee: Foshan University
Current assignee: Foshan University
Priority date: 2020-08-11
Filing date: 2020-08-11
Publication date: 2020-11-20

Abstract

本发明提供了一种沙门氏菌的检测方法，包括以下步骤：(1)以待测样品的核酸为模板，利用沙门氏菌特异性引物使用环介导等温扩增技术进行扩增，得到扩增产物；(2)在特异crRNA的介导下，利用CRISPR系统对步骤(1)所得到的扩增产物进行裂解反应，得到裂解产物；(3)将步骤(2)得到的裂解产物使用胶体金试纸条进行显色检测。所述检测方法具有很好的灵敏度和准确性。

Description

一种沙门氏菌的检测方法

技术领域

本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一种沙门氏菌的检测方法。

背景技术

沙门氏菌(salmonella)是一种人畜共患致病菌，严重威胁着食品安全和畜牧生产安全。在世界范围内，沙门氏菌是细菌性食物中毒的罪魁祸首，在自然界拥有众多宿主的沙门氏菌不仅危害人类健康，对各种畜禽也能致病，感染对象不分年龄段，且最易感的是幼龄动物，特别是仔猪、犊牛、乳羊、幼驹等。易感畜禽以猪、鸡为例，猪的沙门氏菌病即仔猪副伤寒，发病快慢的不同导致病变症状不同，发病快的症状表现为败血症，发病慢的症状表现为大肠坏死性肠炎。鸡的沙门氏菌病种类繁多，常见有鸡白痢、鸡伤寒、鸡副伤寒、禽亚利桑那菌病。上述病种以鸡白痢和与鸡伤寒对鸡群的危害最大，前者可造成雏鸡大批死亡，后者主要针对青年鸡与成年鸡，是一种以肝脏和脾脏实质病变以及腹泻为病变特征的败血传染，沙门氏菌威胁着食品安全同时危害着畜牧业生产，为保障食品安全和畜禽健康。

目前检测沙门氏菌的方法主要有传统培养法、免疫学方法和分子生物学方法，其中环介导等温扩增技术(LAMP)是一种恒温核酸扩增技术在检测时可以很快完成检测，但准确性低，经常会出现假阳性；免疫学方法中侧流层析试纸条作为试纸条生物传感器的一种，是一种结合色谱法和免疫反应原理的固相免疫测定法，根据其待检物质的分子大小不同可以分为两种方法即双抗体夹心法和竞争法。目前用于试纸条生物传感器的失踪器有胶体金、胶体银、胶体硒、胶体碳、磁性纳米颗粒、乳胶、脂质体或量子点等，以上所用的示踪物所检测的结果均肉眼可见，其中胶体金(gold-nanoparticles，AuNPs)的应用最早也最为广泛，操作简单，结果肉眼可见。但是现有的胶体金试纸条在检测沙门氏菌时容易出现假阳性，假阴性，灵敏度较低等问题，因此亟需建立一种能快速准确地对沙门氏菌进行检测的方法，以解决上述问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种沙门氏菌的检测方法，以解决现有技术中存在的一个或多个技术问题，至少提供一种有益的选择或创造条件。

为实现上述目的，技术方案如下：

一种沙门氏菌的检测方法，包括以下步骤：

(1)以待测样品的核酸为模板，利用沙门氏菌特异性引物使用环介导等温扩增技术(LAMP)进行扩增，得到扩增产物；

(2)在特异crRNA的介导下，利用CRISPR系统对步骤(1)所得到的扩增产物进行裂解反应，得到裂解产物；

(3)将步骤(2)得到的裂解产物使用胶体金试纸条进行显色检测；

所述胶体金试纸条包括：支撑板、样品垫、胶金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述样品垫、胶金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫在所述支撑板上按照顺序依次固定，所述胶金垫内含有胶体金标记沙门氏菌抗体，所述硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，所述胶体金试纸条进行显色检测的结果判断为：

阴性(-)：在检测线和质控线上均为红色条带，证明待测样品中没有沙门氏菌污染；

阳性(+)：在检测线不出现红色条带，在质检线上出现红色条带，证明待测样品中存在沙门氏菌。

所述沙门氏菌特异性引物包括：外引物、内引物和加速引物。

所述外引物包括：F3和B3，所述F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述内引物包括：FIP和BIP，所述FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

所述加速引物包括：LoopF和LoopB，所述LoopF的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示，所述LoopB的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

所述特异性crRNA的核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示。

所述利用CRISPR系统对步骤(1)所得到的扩增产物进行裂解反应的酶为Cas12a酶。

所述裂解反应的步骤包括：将12μL的裂解缓冲液、3μL特异性crRNA、1μLCas12a酶和5μL的激活子(activator)进行混匀，在37℃下孵育15min；然后再加入2μL的生物素化reporter和2μL的所述扩增产物，混匀，37℃下孵育45min。

所述胶体金试纸条的构建步骤包括：

(a)样品垫的预处理：将玻璃纤维膜在样品垫缓冲液中浸泡25-35min，干燥；

(b)胶体金标记沙门氏菌抗体的制备：采用柠檬三钠还原法制备胶体金，在无菌的环境下，然后将沙门氏菌抗体加入到胶体金中，制得胶体金标记沙门氏菌抗体；

(c)胶金垫的制备：将步骤(b)制备得到的胶体金标记沙门氏菌抗体喷涂在玻璃纤维膜上，室温干燥后得到胶金垫；

(d)硝酸纤维素膜的处理：以生物素化的兔多克隆抗体为质控线，以捕获探针为检测线，用划膜喷金仪在的硝酸纤维素膜上进行划线，在外下照射15分钟，然后烘干，得到硝酸纤维素膜；

(e)在支撑板上按照顺序粘贴样品垫、胶金垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，即得胶体金试纸条。

本发明的有益效果是：提供了一种沙门氏菌的检测方法，所述方法中利用LAMP对样品中的核酸进行扩增，LAMP反应灵敏度高，能够扩增到样品中极少量的沙门氏菌，反应灵敏，虽然准确性低，但是在特异crRNA的介导下，CRISPR系统能够作用于扩增产物中沙门氏菌特定的基因序列，且基因编辑效率高，准确性好、灵敏度好，因此在使用胶体金试纸条进行显色检测时结果准确性好，所以本发明所述的检测方法具有更高的准确性和灵敏性。

本发明在CRISPR系统进行裂解时使用的是Cas12a酶，所述Cas12a酶可以在crRNA的介导下靶向结合dsDNA，进而激活了特异性dsDNA切害活性以及非特异性ssDNA反式裂解活性，因此利用Cas12a酶进行裂解反应可以提高沙门氏菌的检测的灵敏性。

具体实施方式

以下各步骤仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各步骤对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各步骤所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各步骤技术方案的范围。

实施例1

1、胶体金试纸条的制备

所述胶体金试纸条包括：支撑板、样品垫、胶金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述样品垫、胶金垫、硝酸纤维素膜和吸水垫在所述支撑板上按照顺序依次固定，所述胶金垫内含有胶体金标记沙门氏菌抗体，所述述硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线。

所述胶体金试纸条的构建步骤包括：

(a)样品垫的预处理：将玻璃纤维膜在样品垫缓冲液((1％Triton，1％BSA，2％葡萄糖，50mM硼酸，pH 8.0)中浸泡30min，然后在塑料架上过夜干燥，干燥后将样品垫切成大小约为17mm×30cm，干燥保存；

(b)胶体金标记沙门氏菌抗体的制备：采用柠檬三钠还原法制备胶体金，在100℃下，通过改变柠檬酸钠和氯金酸的比例控制胶体金颗粒的大小，由此可得到50nm胶体金，在无菌的环境下，然后将沙门氏菌抗体加入到胶体金中，制得胶体金标记沙门氏菌抗体，其中所述柠檬酸钠和氯金酸的比例为1：2；

(c)胶金垫的制备：将步骤(b)制备得到的胶体金标记沙门氏菌抗体用划膜喷金仪喷涂在玻璃纤维膜上，然后把胶金垫切割成大小为8mm×30cm，室温干燥后4℃保存；

(d)硝酸纤维素膜的处理：以生物素化的兔多克隆抗体为质控线，以捕获探针(5’-AATAAAAAAAAAAAAAAAAAATAAAAAAAAAAAAAAAA-3’，SEQ ID NO.10)为检测线，用划膜喷金仪在的硝酸纤维素膜上进行划线，在紫外下照射15分钟，然后37℃烘箱中烘干，室温下干燥保存；

(e)在支撑板上按照顺序粘贴样品垫、胶金垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，重叠2mm，然后切成0.4cm宽的条，即得胶体金试纸条。

2、检测

一种沙门氏菌的检测方法，所述方法的具体步骤包括：

(2)在特异crRNA的介导下，利用Cas12a酶对步骤(1)所得到的扩增产物进行裂解反应，得到裂解产物；

(3)将步骤(2)得到的裂解产物使用上述胶体金试纸条进行显色检测；

其中环介导等温扩增技术(LAMP)扩增的反应体系为：Isothermal buffer 2.5μL、MgSO₄ 1.5μL、dNTPs 3.5μL、FIP/BIP(内引物)各0.4μL、F3/B3(外引物)各0.05μL、LoopF/LoopB(加速引物)各0.1μL、Bst聚合酶0.67μL、加待测样品的核酸1μL，然后加水至25μL；反应条件为：温度63℃反应1h；

其中所述裂解反应的步骤包括：将12μL的裂解缓冲液、3μL特异性crRNA、1μLCas12a酶和5μL的activator进行混匀，在37℃下孵育15min；然后再加入2μL的生物素化reporter和2μL的所述扩增产物，混匀，37℃下孵育45min；

其中F3、B3、FIP、BIP、LoopF、LoopB、特异crRNA、生物素化reporter、和activator的核苷酸序列如表1所示：

表1

所述胶体金试纸条的检测结果判断：

1)阴性(-)：在检测线和质控线上均为红色条带，证明所检测的样本没有沙门氏菌污染；

2)阳性(+)：在检测线不出现红色条带，在质检线上出现红色条带，证明所检测的样本中存在沙门氏菌。

对比例1

一种沙门氏菌的检测方法，所述方法的具体步骤包括：

(2)将步骤(1)得到的扩增产物使用胶体金试纸条进行显色检测；

其中环介导等温扩增技术(LAMP)扩增的反应体系为：Isothermal buffer 2.5μL、MgSO₄ 1.5μL、dNTPs 3.5μL、FIP/BIP各0.4μL、F3/B3各0.05μL、LoopF/LoopB各0.1μL、Bst聚合酶0.67μL、加待测样品的核酸1μL，然后加水至25μL；反应条件为：温度63℃反应1h；

其中F3、B3、FIP、BIP、LoopF、LoopB的核苷酸序列上述如表1所示；

所述胶体金试纸条的检测结果判断：

对以上实施例和对比例进行效果检测。

按照上述实施例1和对比例1中所述的方法分别对含有不同浓度沙门氏菌的样品进行检测，所述不同浓度沙门氏菌的样品分别为2.8×10^-15M(mol/l)、2.8×10^-12M(mol/l)、2.8×10^-9M(mol/l)、2.8×10^-6M(mol/l)、2.8×10^-3M(mol/l)、0，分别命名为样品1、样品2、样品3、样品4、样品5、样品6，结果如表2可以看出本发明所述方法灵敏度好、准确性好，在特异crRNA的介导下，CRISPR系统能够作用于扩增产物中沙门氏菌特定的基因序列，且基因编辑效率高，准确度高、灵敏度好，因此在使用胶体金试纸条进行显色检测时结果准确性好，Cas12a酶可以在crRNA的介导下靶向结合dsDNA，进而激活了特异性dsDNA切害活性以及非特异性ssDNA反式裂解活性，因此利用Cas12a酶进行裂解反应可以提高沙门氏菌的检测的灵敏性，因此本发明所述检测方法具有很好的灵敏性、准确性，在检测时不会出现假阳性和假阴性等问题。

表2检测结果

SEQUENCE LISTING

<110> 佛山科学技术学院

<120> 一种沙门氏菌的检测方法

<130> 2020.08.04

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

ctgcggtact gttaattacc a 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ggtcagcatg gtataagtag ac 22

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

cacggtgaca atagagaaga caatcagtac cagccgtctt 40

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

gtattattga tgcggatgct gcgcggcaat agcgtcacc 39

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

atcgccaata acgaattgcc 20

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

ggcgaagcgt actggaa 17

<210> 7

<211> 45

<212> RNA

<213> 人工合成

<400> 7

uaauuucuac uaaguguaga ucgaauugcc cgaacguggc gauaa 45

<210> 8

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

ttttttttat t 11

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

tttggttcat tttaatgcgc atttt 25

<210> 10

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

aataaaaaaa aaaaaaaaaa ataaaaaaaa aaaaaaaa 38

Claims

1.一种沙门氏菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以待测样品的核酸为模板，利用沙门氏菌特异性引物使用环介导等温扩增技术进行扩增，得到扩增产物；

2.根据权利要求1中所述的沙门氏菌的检测方法，其特征在于，所述沙门氏菌特异性引物包括：外引物、内引物和加速引物。

3.根据权利要求2中所述的沙门氏菌的检测方法，其特征在于，所述外引物包括：F3和B3，所述F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求2中所述的沙门氏菌的检测方法，其特征在于，所述内引物包括：FIP和BIP，所述FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

5.根据权利要求2中所述的沙门氏菌的检测方法，其特征在于，所述加速引物包括：LoopF和LoopB，所述LoopF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述LoopB的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

6.根据权利要求1中所述的沙门氏菌的检测方法，其特征在于，所述特异性crRNA的核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示。

7.根据权利要求1中所述的沙门氏菌的检测方法，其特征在于，所述利用CRISPR系统对步骤(1)所得到的扩增产物进行裂解反应的酶为Cas12a酶。

8.根据权利要求7中所述的沙门氏菌的检测方法，其特征在于，所述裂解反应的步骤包括：将12μL的裂解缓冲液、3μL特异性crRNA、1μLCas12a酶和5μL的activator进行混匀，在37℃下孵育15min；然后再加入2μL生物素化reporter和2μL的所述扩增产物，混匀，37℃下孵育45min。

9.根据权利要求1中所述的沙门氏菌的检测方法，其特征在于，所述胶体金试纸条的构建步骤包括：