CN114774563A

CN114774563A - 一种犬种布鲁氏菌病的检测试剂及应用

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Publication number: CN114774563A
Application number: CN202210712584.XA
Authority: CN
Inventors: 程汝佳; 沈光年; 朱良全; 王培�; 巩玉洁; 李巧玲; 赵荣茂; 雷琪莉; 李佳; 殷雨晴; 陈敏姮; 乌那尔汗·吉斯汗; 努尔麦麦提·阿穆提; 居马别克·夏拉巴依; 沙娜瓦尔·塔希
Original assignee: Beijing Nabai Bio Tech Co ltd; Center For Animal Disease Control And Prevention Of Beijing
Current assignee: Beijing Nabai Bio Tech Co ltd; Center For Animal Disease Control And Prevention Of Beijing
Priority date: 2022-06-22
Filing date: 2022-06-22
Publication date: 2022-07-22
Anticipated expiration: 2042-06-22
Also published as: CN114774563B

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种犬种布鲁氏菌病的检测试剂及应用。与其他布鲁氏菌核酸检测方法相比，本发明建立的方法是通过荧光信息直接实现对犬种布鲁氏菌病进行快速鉴定，具有便捷、准确、灵敏、特异等优点，大大缩短了检测时间，对于犬种布鲁氏菌病的临床诊断具有重大的应用价值，公共卫生安全意义十分显著。

Description

一种犬种布鲁氏菌病的检测试剂及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种犬种布鲁氏菌病的检测试剂及应用。

背景技术

布鲁氏菌病（简称布病）是由布鲁氏菌（Brucella spp.）引起的一种重要的人畜共患传染病。布病在畜群和人间布病感染率逐年上升，并维持在较高水平，持续对公共卫生安全和畜牧业的发展构成危害。

牛、羊、猪种布鲁氏菌属于光滑型布鲁氏菌，对人和多种动物具有较强的致病性，而犬种布鲁氏菌属于粗糙型菌株，以引发犬的布病较为多见，对人的致病力弱，是一种容易被忽视但对犬养殖业和公共卫生具有重要影响的病原菌。随着养犬业的发展和宠物犬数量的增多，以及与人类的密切接触，由犬种布病带来的潜在公共卫生安全问题日趋严重。

犬种布病可导致妊娠母犬流产以及公犬睾丸炎典型症状，临床上通常以非特异性的临床症状为主，而且存在2周至3月的可变潜伏期。由于犬种布鲁氏菌与光滑型的牛、羊、猪种布鲁氏菌抗原表型不同，其为粗糙型，免疫原性相对较弱，并具有自凝特性，目前常用的布鲁氏菌血清学检测方法对犬种布病诊断的敏感性和特异性均较低，极易导致漏诊、误诊从而延误病情。对于犬种布鲁氏菌病，主要采取“检疫和淘汰”策略。细菌分离鉴定仍是诊断的金标准，但因其操作时间长，分离率低、而且涉及生物安全因素和技术条件所限，故常用PCR方法。截止目前，还没有一种荧光定量PCR方法能够快速鉴定出犬种布鲁氏菌。

荧光定量PCR技术（Quantitative Real-time PCR，qPCR）与普通PCR技术相比，qPCR增加了一个两端带有荧光标记的寡核苷酸探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知的模板进行定量分析。该技术具有灵敏度高、特异性强、重复性好、定量准确的优点，可以利用多种荧光基团实现多种基因的检测，并可利用寡核苷酸探针实现相似性较高基因的检测。鉴于国内外几乎未有成功运用双重实时荧光定量PCR直接实现对犬种布鲁氏菌进行确诊的报道，因此基于犬种布鲁氏菌和其它布鲁氏菌基因组水平的差异，建立一种准确、特异、快速地诊断犬种布鲁氏菌荧光定量PCR方法对于公共卫生安全具有十分重要的意义。

发明内容

本申请的目的之一是鉴定犬种布鲁氏菌。

一方面，本申请提供了一种犬种布鲁式菌病的检测试剂，所述检测试剂含有成套试剂1，或成套试剂2；

所述成套试剂1包括：

如SEQ ID NO：1和2所示的引物对以及如SEQ ID NO：3所示的探针；和

如SEQ ID NO：7和8所示的引物对以及如SEQ ID NO：9所示的探针；

所述成套试剂2包括：

如SEQ ID NO：4和5所示的引物对以及如SEQ ID NO：6所示的探针。

在一些实施方案中，所述成套试剂1的2条探针的5’端分别标记有不同的荧光报告基团；所述成套试剂2的2条探针的5’端分别标记有不同的荧光报告基团。

一方面，本申请提供了一种BCSP31基因和SEQ ID NO:11所示序列的检测试剂，所述检测试剂含有成套试剂1和/或成套试剂2；

所述成套试剂1包括：

如SEQ ID NO：7和8所示的引物对以及如SEQ ID NO：9所示的探针；

所述成套试剂2包括：

如SEQ ID NO：4和5所示的引物对以及如SEQ ID NO：6所示的探针。

一方面，本申请提供了所述的检测试剂在制备检测犬种布鲁式菌病的试剂盒中的应用。

一方面，本申请提供了一种鉴定待测样品是否含有或疑似含犬种布鲁氏菌的方法，包括以下步骤：以待测样品的核酸为模板，以所述的检测试剂进行双重实时荧光定量PCR，然后进行如下评判：如果检出两种荧光信号，则待测样品中含有或疑似含有非犬种布鲁氏菌的布鲁氏菌；如果检出一种荧光信号，则待测样品中含有或疑似含有犬种布鲁氏菌；如果未检出荧光信号，则待测样品中不含有或疑似不含有布鲁氏菌。

一方面，本申请提供了一种鉴定待测样品是否含有或疑似含犬种布鲁氏菌的方法，包括以下步骤：以待测样品的核酸为模板，以所述的检测试剂进行双重实时荧光定量PCR，然后进行如下评判：如果获得2条S形扩增曲线，则待测样品中含有或疑似含有非犬种布鲁氏菌的布鲁氏菌；如果获得1条S形扩增曲线，则待测样品中含有或疑似含有犬种布鲁氏菌；如果不能获得S形扩增曲线，则待测样品中不含有或疑似不含有布鲁氏菌。

一方面，本申请提供了一种犬种布鲁氏菌的检测系统，所述检测系统包括以下构件：

1）BCSP31基因和SEQ ID NO:11所示序列的检测构件；

2）数据处理构件；

3）结果输出构件；

所述BCSP31基因和SEQ ID NO:11所示序列的检测构件含有所述的检测试剂。

在一些实施方案中，所述检测构件包含检测仪器，所述检测仪器选自荧光定量PCR仪、测序仪中的一种或多种。

在一些实施方案中，所述检测构件的检测结果为荧光信号或“S”形扩增曲线。

在一些实施方案中，所述数据处理构件被配置为：

根据检测构件检测的待测样品中BCSP31基因和SEQ ID NO:11所示序列检出与否的检测结果，判断待测样品中是否含有布鲁氏菌和/或布鲁氏菌的类型。

所述数据处理构件的判断标准为：

若待测样品中同时检出BCSP31基因和SEQ ID NO:11所示序列，则待测样品中含有或疑似含有非犬种布鲁氏菌的布鲁氏菌；

若待测样品中检出BCSP31基因且未检出SEQ ID NO:11所示序列，则待测样品中含有或疑似含有犬种布鲁氏菌；

若待测样品中无法检出BCSP31基因和SEQ ID NO:11所示序列，则待测样品中不含有或疑似不含有布鲁氏菌。

一方面，本申请提供了一种引物，所述引物选自：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的序列或其互补序列中的至少任意一条。

在一些实施方式中，所述引物选自SEQ ID NO：1和2、SEQ ID NO：4和5以及SEQ IDNO：7和8所示的至少一对引物对。

在一些实施方式中，所述引物选自SEQ ID NO：4和5与SEQ ID NO：1和2组成的引物对组；或SEQ ID NO：7和8与SEQ ID NO：1和2组成的引物对组。

一方面，本申请提供了一种探针，所述探针选自：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6和SEQID NO：9所示的序列或其互补序列中的至少任意一条。

在一些实施方式中，所述探针选自SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：6组成的探针组；或SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：9组成的探针组。

在一些实施方式中，所述探针组中的2条探针的5’端分别标记有不同的荧光基团；在一些实施方案中，所述荧光基团选自FITC，FAM，TexasRed，Alexa Fluor 488、TAMRA、DEAC、APC、Cy3、Cy3.5、Cy5、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 555、Rhodamine、和Pacific Blue中的至少任意一种；在一些实施方案中，所述探针组中的2条探针的5’端分别标记有FAM和Cy5。

一方面，本申请提供了一种检测试剂，包括检测BCSP31基因和SEQ ID NO:11所示序列的引物和/或探针。

在一些实施方式中，所述检测BCSP31基因的引物如SEQ ID NO：1和2所示。

在一些实施方式中，所述检测SEQ ID NO:11所示序列的引物如SEQ ID NO：4和5组成的引物对或SEQ ID NO：7和8组成的引物对所示。

在一些实施方式中，所述检测BCSP31基因的探针如SEQ ID NO：3所示。

在一些实施方式中，所述检测SEQ ID NO:11所示序列的探针如SEQ ID NO：6或SEQID NO：9所示。

在一些实施方式中，还提供了所述的引物，所述的探针，或所述的检测试剂在制备犬种布鲁氏菌的试剂或试剂盒中应用。

1）BCSP31基因和SEQ ID NO:11所示序列的检测构件；及

2）结果判断构件。

在一些实施方式中，所述BCSP31基因和SEQ ID NO:11所示序列的检测构件含有所述的引物、探针和/或检测试剂。

在一些实施方式中，所述检测构件包含检测仪器，所述检测仪器选自PCR仪、测序仪中的一种或多种；在一些实施方式中，所述PCR仪选自荧光定量PCR仪。

在一些实施方式中，所述结果判断构件用于根据检测构件检测的BCSP31基因和SEQ ID NO:11所示序列结果，输出待测样品中是否含有布鲁氏菌和/或布鲁氏菌的类型；

在一些实施方式中，若检测构件检测到待测样品中有BCSP31基因，则所述结果判断构件输出待测样品中含有布鲁氏菌；在一些实施方式中，若检测构件未检测到含有布鲁氏菌的待测样品中含有SEQ ID NO:11所示序列，则所述结果判断构件输出待测样品中含有犬种布鲁氏菌。

在一些实施方式中，所述检测构件的检测结果为荧光信号或“S”形扩增曲线。

在一些实施方式中，所述检测针对的样品所述样品包括非人体或动物体来源样品。

在一些实施方式中，所述样品选自犬的全血、犬的阴道分泌物、犬的精液、犬的流产物中的至少一种。

在一些实施方式中，所述非人体或动物体来源样品包括含菌液、培养细胞、发酵液、水环境样本、土壤样本或食物样本。

在一些实施方式中，本申请针对布鲁氏菌的BCSP31序列和犬种布鲁氏菌的缺失序列，设计特异性引物和探针，建立了双重实时荧光定量PCR鉴定犬种布鲁氏菌的方法，实现在同一反应管中对布鲁氏菌进行鉴别诊断。与其他现行的动物布鲁氏菌病检测的国家标准和行业标准中推荐的布鲁氏菌核酸检测方法相比，本申请建立的方法是通过荧光信息直接对犬种布鲁氏菌进行定性、定量，且同时进行分析鉴定，具有便捷、准确、灵敏（最低检测限达到10拷贝/μL）、特异等特点，大大缩短了检测时间，该方法在鉴别犬种布鲁氏菌的同时，也能检测到其他布鲁氏菌，不光为犬布鲁氏菌病流行病学调查提供了便捷、特异性好、敏感性高的诊断技术，适于宠物门诊及基层研究单位对犬布鲁氏菌病尽早鉴别诊断，以尽快采取治疗或扑杀措施，同时对于布鲁氏菌病的防控也具有重大的应用价值。

附图说明

图1为犬种布鲁氏菌和其它种布鲁氏菌基因序列的比对结果。

图2为比较三个成套试剂扩增效果。

图3为荧光定量PCR标准曲线。

图4为特异性检测结果。

图5为灵敏度检测结果。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中，实时荧光定量PCR均采用Applied Biosystems ABI 7500型定量PCR仪进行。

Applied Biosystems ABI 7500型定量PCR仪、超微量分光光度计（NANODROP2000）和2×P qPCR Master Mix）均为Promega公司的产品。

牛种布鲁氏菌2308株、牛种布鲁氏菌A19疫苗株、羊种布鲁氏菌16M株、羊种布鲁氏菌M28株、羊种布鲁氏菌M5株、猪种布鲁氏菌S2株、猪种布鲁氏菌1330株、犬种布鲁氏菌RM6/66株、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O:157、耶尔森菌O:9的核酸均由中国兽医药品监察所提供。

实施例1、用于鉴定犬种布鲁氏菌的试剂盒的制备

一、用于鉴定犬种布鲁氏菌的成套试剂的筛选

1、本发明的发明人通过大量序列获取、分析、比对以及预实验，最终以布鲁氏菌基因组中的BCSP31基因为靶基因，筛选并合成用于检测布鲁氏菌的引物探针组合B-F1/B-R1/B-P1；针对犬种布鲁氏菌特有的缺失序列（如图1所示），设计并合成用于鉴定犬种布鲁氏菌的引物探针组合Q-F1/Q-R1/Q-P1、Q-F2/Q-R2/Q-P2和Q-F3/Q-R3/Q-P3。将B-F1/B-R1/B-P1分别与Q-F1/Q-R1/Q-P1、Q-F2/Q-R2/Q-P2和Q-F3/Q-R3/Q-P3进行组合，依次获得成套试剂1、成套试剂2和成套试剂3。每个成套试剂均由4个引物和2个探针组成。各个成套试剂的引物和探针的序列详见表1。

表1

2、提取灭活犬种布鲁氏菌的总核酸，得到犬种布鲁氏菌的总核酸。

3、以犬种布鲁氏菌的总核酸为模板，采用成套试剂1、成套试剂2或成套试剂3进行实时荧光定量PCR扩增。延伸时进行荧光信号采集。

反应体系为20 μL，包括10 μL 2×P qPCR Master Mix、B-F1水溶液、B-R1水溶液、B-P1水溶液、上游引物水溶液、下游引物水溶液、探针水溶液、模板和水。名称中含有“Q-F”的为上游引物，名称中含有“Q-R”的为下游引物，名称中含有“Q-P”的为探针。反应体系中，B-F1、B-R1、B-P1、上游引物、下游引物和探针的浓度均为0.3 μM。

反应程序为：95℃ 2min；95℃ 15s，60℃ 1min，40个循环。

检测结果见图2。

3个成套试剂的实时荧光定量PCR扩增结果表明，针对布鲁氏菌BCSP31序列的扩增曲线没有差异，针对犬种布鲁氏菌缺失序列的扩增曲线却显著不同：成套试剂1和成套试剂2的扩增曲线其扩增效率较高且荧光信号强度较强，而成套试剂3则基本没有得到S型的扩增曲线。因此，成套试剂1和成套试剂2均可以作为用于鉴定犬种布鲁氏菌的最优成套试剂。

二、用于鉴定犬种布鲁氏菌的试剂盒的制备

用于鉴定犬种布鲁氏菌的试剂盒由成套试剂1和/或成套试剂2组成。

实施例2、双重实时荧光定量PCR鉴定犬种布鲁氏菌的方法的建立

一、标准曲线的绘制

1、参照NCBI数据库中犬种布鲁氏菌RM6/66株、牛种布鲁氏菌2308株、羊种布鲁氏菌16M株、羊种布鲁氏菌M28株、猪种布鲁氏菌1330株、猪种布鲁氏菌S2株的全基因组序列，由生工生物工程（上海）股份有限公司人工合成质粒BCSP31和质粒Q。

质粒BCSP31中含有布鲁氏菌BCSP31基因的核苷酸序列。布鲁氏菌BCSP31基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。

质粒Q中含有特异DNA序列。特异DNA序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。

犬种布鲁氏菌不含有该特异DNA序列，其它布鲁氏菌含有该特异DNA序列。

2、用超微量分光光度计（NANO DROP2000）检测质粒BCSP31和质粒Q的浓度，计算其拷贝数；然后将质粒BCSP31和质粒Q进行10倍梯度稀释。

3、分别以不同拷贝数的质粒BCSP31为模板，采用成套试剂1进行实时荧光定量PCR扩增。延伸时进行荧光信号采集。

反应体系为20 μL，包括10 μL 2×P qPCR Master Mix、B-F1水溶液、B-R1水溶液、B-P1水溶液、Q-F1水溶液、Q-R1水溶液、Q-P1水溶液、模板和水。反应体系中，B-F1、B-R1、B-P1、Q-F1、Q-R1和Q-P1的浓度均为0.3 μM。

反应程序为：95℃ 2 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40个循环。

检测结果见图3中A（从左至右质粒BCSP31的浓度依次为1×10⁸拷贝/μL、1×10⁷拷贝/μL、1×10⁶拷贝/μL、1×10⁵拷贝/μL、1×10⁴拷贝/μL、1×10³拷贝/μL、1×10²拷贝/μL、1×10拷贝/μL）。结果表明，各个模板呈等距性和平行性，具有较好的线性关系。

按照上述步骤，将成套试剂1替换为成套试剂2，其它步骤均不变。结果表明，各个模板呈等距性和平行性，具有较好的线性关系。

4、分别以不同拷贝数的质粒Q为模板，采用成套试剂1进行实时荧光定量PCR扩增。延伸时进行荧光信号采集。

反应体系为20μL，包括10μL 2× P qPCR Master Mix、B-F1水溶液、B-R1水溶液、B-P1水溶液、Q-F1水溶液、Q-R1水溶液、Q-P1水溶液、模板和水。反应体系中，B-F1、B-R1、B-P1、Q-F1、Q-R1和Q-P1的浓度均为0.3μM。

反应程序为：95℃2min；95℃15s，60℃1min，40个循环。

检测结果见图3中B（从左至右质粒Q的浓度依次为1×10⁸拷贝/μL、1×10⁷拷贝/μL、1×10⁶拷贝/μL、1×10⁵拷贝/μL、1×10⁴拷贝/μL、1×10³拷贝/μL、1×10²拷贝/μL、1×10拷贝/μL）。结果表明，各个模板呈等距性和平行性，具有较好的线性关系。

二、双重实时荧光定量PCR扩增的条件优化

采用单一变量的优化方法，对退火温度、引物浓度、探针浓度等进行优化。

以浓度为1×10⁶拷贝/μL的质粒BCSP31水溶液和浓度为1×10⁶拷贝/μL的质粒Q水溶液等体积混合并作为模板，采用成套试剂1进行双重实时荧光定量PCR扩增；延伸时进行荧光信号采集，如果可以同时检出FAM荧光信号和CY5荧光信号，则说明可以检测出质粒BCSP31和质粒Q。

反应体系为20μL，包括10μL 2× P qPCR Master Mix、B-F1水溶液、B-R1水溶液、B-P1水溶液、Q-F1水溶液、Q-R1水溶液、Q-P1水溶液、质粒BCSP31、质粒Q和水。反应体系中，B-F1、B-R1、B-P1、Q-F1、Q-R1和Q-P1的浓度为0.2 μM、0.3 μM、0.4 μM、0.5 μM、0.6 μM、0.7μM或0.8 μM。

反应程序为：95℃ 2 min；95℃ 15 s，54-64℃ 1 min，40个循环。

结果表明，退火温度为54-64℃时均能同时检出FAM荧光信号和CY5荧光信号；

退火温度为60℃时，双重实时荧光定量PCR的扩增效率最佳，因此最佳退火温度为60℃；通过比较ΔRn最大值和Ct最小值发现，进行双重实时荧光定量PCR的反应体系中，B-F1、B-R1、B-P1、Q-F1、Q-R1和Q-P1的最佳浓度均为0.3 μM。

按照上述步骤，将成套试剂1替换为成套试剂2，其它步骤均不变。结果表明，成套试剂1和成套试剂2的双重实时荧光定量PCR扩增的最佳退火温度，B-F1、B-R1、B-P1、Q-F2、Q-R2和Q-P2的最佳浓度基本一致。

三、双重实时荧光定量PCR鉴定犬种布鲁氏菌的方法一的建立

1、以待测样品的核酸为模板，采用成套试剂1进行双重实时荧光定量PCR扩增。

反应体系为20 μL，包括10μL 2×P qPCR Master Mix、B-F1水溶液、B-R1水溶液、B-P1水溶液、Q-F1水溶液、Q-R1水溶液、Q-P1水溶液、模板和水。反应体系中，B-F1、B-R1、B-P1、Q-F1、Q-R1和Q-P1的浓度为0.3 μM。

反应程序为：95℃ 2 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40个循环。

按照上述步骤，将无菌水作为模板，其它步骤均不变，作为阴性对照。

2、完成步骤1后，根据采集的荧光信号（延伸时进行荧光信号采集）进行如下判断：如果同时检出FAM荧光信号和CY5荧光信号，则待测样品中含有非犬种布鲁氏菌的布鲁氏菌（可能同时也含有犬种布鲁氏菌）；如果检出FAM荧光信号且未检出CY5荧光信号，则待测样品中含有犬种布鲁氏菌；如果未检出FAM荧光信号，也未检出CY5荧光信号，则待测样品中不含有布鲁氏菌。阴性对照未检出FAM荧光信号，也未检出CY5荧光信号。

3、完成步骤1后，根据扩增曲线进行如下判断：如果获得2条“S”形扩增曲线，则待测样品中含有非犬种布鲁氏菌的布鲁氏菌（可能同时也含有犬种布鲁氏菌）；如果获得1条“S”形扩增曲线，则待测样品中含有犬种布鲁氏菌；如果不能获得“S”形扩增曲线，则待测样品中不含有布鲁氏菌。阴性对照不能获得“S”形扩增曲线。

四、双重实时荧光定量PCR鉴定犬种布鲁氏菌的方法二的建立

按照步骤三，将成套试剂1替换为成套试剂2，其它步骤均不变，建立双重实时荧光定量PCR鉴定犬种布鲁氏菌的方法二；即方法一采用成套试剂1进行双重实时荧光定量PCR扩增，方法二采用成套试剂2进行双重实时荧光定量PCR扩增。

实施例3、特异性检测

1、按照实施例2中步骤三的方法，进行特异性检测。待测样品为羊种布鲁氏菌16M株、羊种布鲁氏菌M28株、羊种布鲁氏菌M5株、牛种布鲁氏菌2308株、牛种布鲁氏菌A19株、猪种布鲁氏菌1330株、猪种布鲁氏菌S2株、犬种布鲁氏菌RM6/66株、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O:157和耶尔森菌O:9。

部分结果见图4（A为羊种布鲁氏菌16M株，B为犬种布鲁氏菌RM6/66株）。结果表明，羊种布鲁氏菌16M株、羊种布鲁氏菌M28株、羊种布鲁氏菌M5株、牛种布鲁氏菌2308株、牛种布鲁氏菌A19株、猪种布鲁氏菌1330株、猪种布鲁氏菌S2株（均为非犬种布鲁氏菌的布鲁氏菌）均有2条“S”形扩增曲线，犬种布鲁氏菌RM6/66株有1条“S”形扩增曲线，金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O:157、耶尔森菌O:9和阴性对照均没有“S”形扩增曲线。与预期结果完全一致。

2、按照实施例2中步骤四的方法，进行特异性检测。待测样品同步骤1。

结果表明，羊种布鲁氏菌16M株、羊种布鲁氏菌M28株、羊种布鲁氏菌M5株、牛种布鲁氏菌2308株、牛种布鲁氏菌A19株、猪种布鲁氏菌1330株、猪种布鲁氏菌S2株（均为非犬种布鲁氏菌的布鲁氏菌）均有2条“S”形扩增曲线，犬种布鲁氏菌RM6/66株有1条“S”形扩增曲线，金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O:157、耶尔森菌O:9和阴性对照均没有“S”形扩增曲线。与步骤1的结果完全一致。

由此可见，采用实施例1制备的试剂盒可以鉴定犬种布鲁氏菌的特异性高。

实施例4、灵敏度检测

1、按照实施例2中步骤三的方法，进行灵敏度检测。模板为浓度为1×10⁸拷贝/μL的质粒BCSP31溶液1、1×10⁷拷贝/μL的质粒BCSP31溶液2、1×10⁶拷贝/μL的质粒BCSP31溶液3、1×10⁵拷贝/μL的质粒BCSP31溶液4、1×10⁴拷贝/μL的质粒BCSP31溶液5、浓度为1×10³拷贝/μL的质粒BCSP31溶液6、浓度为1×10²拷贝/μL的质粒BCSP31溶液7、浓度为1×10拷贝/μL的质粒BCSP31溶液8。

检测结果见图5中A（从左至右依次为质粒BCSP31溶液1-质粒BCSP31溶液8）。结果表明，检测质粒BCSP31的灵敏度达到10拷贝/μL。

2、按照实施例2中步骤三的方法，进行灵敏度检测。模板浓度为1×10⁸拷贝/μL的质粒Q溶液1、1×10⁷拷贝/μL的质粒Q溶液2、1×10⁶拷贝/μL的质粒Q溶液3、1×10⁵拷贝/μL的质粒Q溶液4、1×10⁴拷贝/μL的质粒Q溶液5、浓度为1×10³拷贝/μL的质粒Q溶液6、浓度为1×10²拷贝/μL的质粒Q溶液7、浓度为1×10拷贝/μL的质粒Q溶液8。

检测结果见图5中B（从左至右依次为质粒Q溶液1—质粒Q溶液8）。结果表明，检测质粒Q的灵敏度达到10拷贝/μL。

因此，成套试剂1对质粒BCSP31和质粒Q的最低检测限都达到10拷贝/μL。

3、按照实施例2中步骤四的方法，进行灵敏度检测。模板同步骤1。

结果表明，检测质粒BCSP31的灵敏度达到10拷贝/μL。与步骤1的结果完全一致。

4、按照实施例2中步骤四的方法，进行灵敏度检测。模板同步骤2。

结果表明，检测质粒Q的灵敏度达到10拷贝/μL。

因此，成套试剂2对质粒BCSP31和质粒Q的最低检测限都达到10拷贝/μL，10个拷贝也是荧光定量检测方法的检测极限。

由此可见，采用实施例1制备的试剂盒鉴定犬种布鲁氏菌具有较高的灵敏度。

实施例5、重复性试验

重复性也是判断鉴定方法好坏的重要指标之一，良好的重复性是鉴定结果正确的重要保障。

1、实验重复三次，每次重复的步骤如下：按照实施例2中步骤三的方法进行检测，模板为10²拷贝/μL的质粒BCSP31溶液a、10⁴拷贝/μL的质粒BCSP 31溶液b、10⁶拷贝/μL的质粒BCSP31溶液c、10²拷贝/μL的质粒Q溶液A、10⁴拷贝/μL的质粒Q溶液B或10⁶拷贝/μL的质粒Q溶液C。

2、统计三次重复产生的Ct值并计算变异系数。

检测结果见表2。3次重复的Ct值重复性均良好，其变异系数均小于3％。

表2

按照上述方法，将按照实施例2中步骤三的方法进行检测替换为按照实施例2中步骤四的方法进行检测，其它步骤均不变。结果表明，3次重复的Ct值重复性也均良好，其变异系数也均小于3％。

由此可见，采用实施例1制备的试剂盒及鉴定犬种布鲁氏菌具有较好的重复性。

实施例6、实施例1制备的试剂盒在鉴定犬种布鲁氏菌中的应用

36份血液待测样品由中国兽医药品监察所国家动物布鲁氏菌病参考实验室提供。

1、取待测样品，按照实施例2中步骤三的方法进行双重实时荧光定量PCR检测。

检测结果见表3中第2行。结果表明，36份样品中，非犬种布鲁氏菌的布鲁氏菌6个，检出率为16.7％；犬种布鲁氏菌8个，检出率为22.2％；其余为布鲁氏菌阴性（即样品中不含有布鲁氏菌）；且耗时较短，50min左右即可完成。

2、取待测样品，采用《动物布鲁氏菌病诊断技术》（GB/T 18646-2018）中的多重PCR方法检测。

检测结果见表3中第3行。结果表明，36份样品中，非犬种布鲁氏菌的布鲁氏菌5个，检出率为13.9％；犬种布鲁氏菌6个，检出率为16.7％；且耗时较长。

由此可见，本发明提供的方法不仅检测敏感性高于现行国家标准，还能够对犬种布鲁氏菌和其它种布鲁氏菌进行快速区分，提高了检测效率。

表3

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 北京市动物疫病预防控制中心

北京纳百生物科技有限公司

<120> 一种犬种布鲁氏菌病的检测试剂及应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> B-F1

<400> 1

cgacctcatc tataacatca 20

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> B-R1

<400> 2

ccttgtaaaa gcgttctg 18

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> B-P1

<400> 3

cgaggataca cgcaaggcac 20

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Q-F2

<400> 4

atcctcaagg ctcactcgaa aca 23

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Q-R2

<400> 5

tacgatcctt cgctcgccca g 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Q-P2

<400> 6

tcgcagccgt tgccacactc a 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Q-F1

<400> 7

cacactcatt ctgctgctcg a 21

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Q-R1

<400> 8

ccagcgcacc cgtcatcc 18

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Q-P1

<400> 9

ccgcaaggtg cttttcgagg tca 23

<210> 10

<211> 430

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 布鲁氏菌BCSP31基因的核苷酸序列

<400> 10

aggcgagagg ctgaaagatg gtgcgctgga cgcctatttc tttgtgggcg gctatccgac 60

gggcgcaatc tcggaactgg ccatctcgaa cggtatttcg ctcgttccga tctccgggcc 120

ggaagcggac aagattctgg agaaatattc cttcttctcg aaggatgtgg ttcctgccgg 180

agcctataag gacgtggcgg aaacaccgac ccttgccgtt gccgcacagt gggtgacgag 240

cgccaagcag ccggacgacc tcatctataa catcaccaag gttctctgga acgaggatac 300

acgcaaggca ctcgatgcgg gccatgcgaa gggcaagctc atcaagctcg atagtgcgac 360

gagcagcctc ggtattccgc tgcatcccgg cgcagaacgc ttttacaagg aagcgggcgt 420

gctgaaataa 430

<210> 11

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 特异DNA序列

<400> 11

ccgctcgcac aactgacatt tctgctggtc gcagccgttg ccacactcat tctgctgctc 60

gatttccgcg ggcgcttcag gaagctatga cctcgaaaag caccttgcgg accatttcga 120

tatccttctt ttccatggcg gtccgcagta ccgccaggct ttcctgaata tctaccacgg 180

ccttgctgcc ctggggcgca cgcatgattt tcggatgacg ggtgcgctgg gcgagcgaag 240

gatcgtagaa aagctcttca tacatcttct cgccttcgcg aatacccgtc acctcaatgg 300

cgatatcgcc ctgcgggttt tcctcgttgc gcacggtgag tcccgcgagc a 351

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Q-F3

<400> 12

tggcgctttt aaatacaatc ctga 24

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Q-R3

<400> 13

tgcttttcga ggtcatagc 19

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> Q-P3

<400> 14

ctggtcgcag ccgttgccac a 21

Claims

1.一种犬种布鲁式菌病的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂含有成套试剂1，或

成套试剂2；

所述成套试剂1包括：

如SEQ ID NO：7和8所示的引物对以及如SEQ ID NO：9所示的探针；

所述成套试剂2包括：

如SEQ ID NO：4和5所示的引物对以及如SEQ ID NO：6所示的探针。

2.如权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述成套试剂1的2条探针的5’端分别标记有不同的荧光报告基团；

所述成套试剂2的2条探针的5’端分别标记有不同的荧光报告基团。

3.一种BCSP31基因和SEQ ID NO:11所示序列的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂含有成套试剂1和/或成套试剂2；

所述成套试剂1包括：

如SEQ ID NO：7和8所示的引物对以及如SEQ ID NO：9所示的探针；

所述成套试剂2包括：

如SEQ ID NO：4和5所示的引物对以及如SEQ ID NO：6所示的探针。

4.如权利要求3所述的检测试剂在制备检测犬种布鲁式菌病的试剂盒中的应用。

5.一种鉴定待测样品是否含有或疑似含犬种布鲁氏菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

以待测样品的核酸为模板，以权利要求1至3任一所述的检测试剂进行双重实时荧光定量PCR，然后进行如下评判：如果检出两种荧光信号，则待测样品中含有或疑似含有非犬种布鲁氏菌的布鲁氏菌；如果检出一种荧光信号，则待测样品中含有或疑似含有犬种布鲁氏菌；如果未检出荧光信号，则待测样品中不含有或疑似不含有布鲁氏菌。

6.一种鉴定待测样品是否含有或疑似含犬种布鲁氏菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

以待测样品的核酸为模板，以权利要求1至3任一所述的检测试剂进行双重实时荧光定量PCR，然后进行如下评判：如果获得2条S形扩增曲线，则待测样品中含有或疑似含有非犬种布鲁氏菌的布鲁氏菌；如果获得1条S形扩增曲线，则待测样品中含有或疑似含有犬种布鲁氏菌；如果不能获得S形扩增曲线，则待测样品中不含有或疑似不含有布鲁氏菌。

7.一种犬种布鲁氏菌的检测系统，其特征在于，所述检测系统包括以下构件：

1）BCSP31基因和SEQ ID NO:11所示序列的检测构件；

2）数据处理构件；

3）结果输出构件；

所述BCSP31基因和SEQ ID NO:11所示序列的检测构件含有权利要求1-3任一所述的检测试剂。

8.如权利要求7所述的检测系统，其特征在于，所述检测构件包含检测仪器，所述检测仪器选自荧光定量PCR仪、测序仪中的一种或多种。

9.如权利要求7所述的检测系统，所述检测构件的检测结果为荧光信号或“S”形扩增曲线。

10.如权利要求7所述的检测系统，其特征在于，所述数据处理构件被配置为：

根据检测构件检测的待测样品中BCSP31基因和SEQ ID NO:11所示序列检出与否的结果，判断待测样品中是否含有布鲁氏菌和/或布鲁氏菌的类型；

所述数据处理构件的判断标准为：