CN108220461A

CN108220461A - 一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测布鲁氏菌的引物、探针和试剂盒

Info

Publication number: CN108220461A
Application number: CN201810085551.0A
Authority: CN
Inventors: 付宝权; 穆赛福·穆罕默德; 周继章; 李兆才; 娄忠子
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2018-01-29
Filing date: 2018-01-29
Publication date: 2018-06-29

Abstract

本发明提供了一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测布鲁氏菌的引物、探针和试剂盒，属于微生物诊断技术领域。本发明提供的基于重组酶聚合酶扩增方法检测布鲁氏菌的引物对和探针是以羊布鲁氏菌pb26基因序列的特异性保守区域为模板设计得到。将本发明提供的试剂盒利用重组酶聚合酶扩增方法检测布鲁氏菌的pb26基因时，检测灵敏度达到6CFU。同时本发明提供的引物对检测布鲁氏菌具有较强的特异性。

Description

一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测布鲁氏菌的引物、探针和试剂盒

技术领域

本发明属于微生物诊断技术领域，具体涉及一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测布鲁氏菌的引物、探针和试剂盒。

背景技术

布鲁氏菌(Brucella)是一种革兰氏阴性兼性细胞内寄生菌，广泛感染家畜、野生动物和人，家畜动物布鲁氏菌主要感染羊、牛和猪，其中对人致病的主要有马耳他布鲁氏菌和流产布鲁氏菌；布鲁氏菌病感染家畜引起公畜的附睾炎和怀孕家畜的流产、胎盘炎症和不育；对于人类，布鲁氏菌病可引起急性炎症和许多类似流感感染的症状，包括波浪热、多汗、背疼和体质虚弱。在一些病人身上，急性临床症状可持续一年以上，最终导致慢性的持续性感染。慢性临床症状包括不规则的发热、关节疼、乏力，并发引起关节炎、局部末梢神经炎症、脊柱炎、骨髓炎和粘液囊炎。布鲁氏菌病的流行不仅危害畜牧业的发展，造成巨大的经济损失，而且严重威胁着人类的健康和公共卫生安全。

当前，对于动物布鲁氏菌病原学的诊断技术有涂片染色、镜检，随着分子生物学技术的发展，PCR技术逐步成为布鲁氏菌检测的重要手段。PCR研究方法很多，可以归纳为单对引物PCR、多重PCR、实时PCR等。单对引物PCR较早用于布鲁氏菌属的检测，检测所使用的扩增模板和手段很多，常选用的有16SrRNA、IS711、VirB8、bcsp31、外膜蛋白omp2b、omp2a、omp31和omp25等。Imaoka等以bcsp31基因和三种外膜蛋白基因(omp2b，omp2a，omp31)为靶基因，设计4对引物进行PCR反应，对羊种布鲁氏菌、牛种布鲁氏菌、猪种布鲁氏菌及犬种布鲁氏菌进行了检测。Ouahrani-Bettache等人根据IS6501在不同种及生物型布鲁氏菌基因中的位置及数目不同，设计了IS6501锚定PCR，该方法不仅可以区分不同的布鲁氏菌种，而且可以区分野毒株和A19疫苗株，对于流行病学调查有着非常重要的意义。Bricker等建立了AMOS(abortus melitensis ovis suis)PCR，是最早建立的多重PCR方法。该试验可以鉴别牛种1、2和4型，羊种1、2、3型，绵羊副睾种和猪种1型布鲁氏菌。后来Ewalt等两次改进了AMOS PCR，使该法可以鉴别的菌种类型进一步完善。国内钟旗等应用AMOS PCR开展了布鲁氏菌种型鉴定研究，结果表明该方法的特异性、敏感性均高于细菌分离和血清学诊断方法，且能区分各种和部分生物型。实时(Real-time)PCR是新近发展的分子生物学技术，其最突出特点是快速、无需电泳并能避免污染。Redkar等于2000年应用Real-time PCR鉴别了牛种、羊种、猪种布鲁氏菌3个种。刘志国等建立的基于TaqMan探针的多重实时荧光PCR方法能快速检测布鲁氏菌的同时并可以确定是否为牛种或羊种布鲁氏菌。PCR技术除了可以应用于布鲁氏菌种属的区分鉴别以外，还可以根据某些特定的序列描述新种和菌株特征。除了PCR技术之外，还有核酸探针技术、环介导等温扩增技术(LAMP)被应用于动物布鲁氏菌的诊断。然而，上述技术的应用都只能在实验室内进行，无法做到临床快速诊断。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测布鲁氏菌的引物、探针和检测试剂盒，使所述引物、探针和检测试剂盒实现临床上达到快速诊断的目的。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测布鲁氏菌的引物对，包括正向引物和反向引物，所述正向引物具有如序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述反向引物具有如序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

本发明提供了一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测布鲁氏菌的探针，具有如序列表中SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。

本发明提供了一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测布鲁氏菌的检测试剂盒，包括以下组分：所述的引物对和所述的探针。

优选的，所述的引物对中正向引物和反向引物的浓度独立为10～1000μmol/L。

优选的，所述探针的浓度为10～1000μmol/L。

优选的，还包括以下组分：反应缓冲液，280mmol/LMgAc溶液，118ng/μL重组酶、850ng/μL单链结合蛋白和28ng/μL链置换DNA聚合酶。

本发明一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测布鲁氏菌的引物对和探针是以羊布鲁氏菌pb26基因序列的特异性保守区域为模板设计得到。本发明提供的引物对检测布鲁氏菌具有较强的特异性。

本发明提供的基于重组酶聚合酶扩增方法检测布鲁氏菌的检测试剂盒，具有操作简便快速等优点，实现临床诊断。同时本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的优点，实现定量分析。实验表明，本发明提供的引物对和探针利用重组酶聚合酶扩增方法检测布鲁氏菌的pb26基因时，检测灵敏度达到6CFU。

附图说明

图1为采用本发明提供的引物和探针组合得到的起飞时间柱状图；

图2为采用本发明提供的引物和探针组合得到的荧光强度柱状图；

图3为用本发明提供的试剂盒扩增不同浓度的重组质粒的扩增曲线。

具体实施方式

本发明提供的引物对是以羊布鲁氏菌pb26基因序列为模板设计得到。所述羊布鲁氏菌pb26基因具有如序列表中SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。所述引物对的来源没有特殊限制，委托生物公司合成即可。在本发明实施例中，所述引物对委托上海生工生物工程有限公司合成。

本发明提供了一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测布鲁氏菌的探针，具有如序列表中SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。在本发明中，所述的探针的浓度优选为10～1000μmol/L，更优选为100～500μmol/L。所述探针为Taqmen探针。所述Taqmen探针的修饰基团包括荧光基团和淬灭基团，具体荧光基团和淬灭基团的修饰位置为：5'-GGCGGTGATTTGAACCTGGTCAATGATAA(FAM-dt)C(THF)C(BHQ)CCGCCGTGATCAAC-P-3'。所述探针的来源没有特殊限制，委托生物公司合成即可。在本发明实施例中，所述探针委托上海生工生物工程有限公司合成。

本发明提供了一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测布鲁氏菌的检测试剂盒，包括以下组成：所述的引物对和所述的探针。

在本发明中，所述的引物对中正向引物和反向引物的浓度独立优选为10～1000μmol/L，更优选为100～500μmol/L。所述正向引物和反向引物独立分开包装。本发明对所述正向引物、反向引物和探针的每个包装的盛装体积没有特殊限制，盛装10次、50次或100次检测用体积即可。

在本发明中，所述试剂盒还包括以下组分：反应缓冲液，280mmol/LMgAc溶液，118ng/μL重组酶、850ng/μL单链结合蛋白和28ng/μL链置换DNA聚合酶。

在本发明中，所述反应缓冲液的来源为TwistAmp Basic试剂盒中Rehydration缓冲液。

在本发明中，所述118ng/μL重组酶、850ng/μL单链结合蛋白和28ng/μL链置换DNA聚合酶的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的来源即可。

在本发明中，所述基于重组酶聚合酶扩增方法检测布鲁氏菌的试剂盒，优选使用TwistAmp Basic试剂盒作为体系组分，使用方法包括以下步骤：

1)配制反应体系，将10μmol/L正向引物和反向引物各2.4μL，Rehydration(再水化缓冲液)缓冲液29.5μL，ddH₂O 12.2μL混合，得到预混液；

2)将所述预混液与TwistAmp Basic试剂盒中的冻干酶制剂混合，得到混合液；

3)将所述混合液与1μL样品中提取的DNA模板和280mmol/L MgAc2.5μL混合，得到反应体系；

4)将所述反应体系进行等温荧光PCR扩增；根据扩增曲线判断待测样品是否为布鲁氏菌；

所述判断的方法为如果产生扩增曲线，且空白对照没有产生扩增曲线，则判断待测样本为布鲁氏菌；如果扩增没有产生扩增曲线，布鲁氏菌阳性对照产生了扩增曲线，则判断待检测样本为布鲁氏菌bp26基因缺失疫苗。

本发明中，所述样本包括含羊布鲁氏菌M5-90△26疫苗菌株和/或羊布鲁氏菌M5野毒株的待测样本即可。

所述等温荧光PCR扩增的条件为37℃持续20min。

下面结合实施例对本发明提供的一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测布鲁氏菌的引物、探针和试剂盒进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

依据羊布鲁氏菌pb26基因序列选择特异性保守区域，设计pb26基因普通PCR引物及RPA引物与探针，目的片段大小为340bp，所有的引物由上海生工生物工程有限公司合成。其中探针序列中具有荧光基团FAM和猝灭基团BHQ1，两个基团之间由THF隔开，3'端由磷酸化修饰。设计得到的引物为SEQ IDNo.1、SEQ ID No.2。

SEQ ID No.1：5'-CAATGTTGGAAAAATTTTGGATGAATCCGT-3'；

SEQ ID No.2：5'-TTACTTGATTTCAAAAACGACATTGACCGATA-3'’；

SEQ ID No.3：5'-GGCGGTGATTTGAACCTGGTCAATGATAA(FAM-dt)C(THF)C(BHQ)CCGCCGTGATCAAC-P-3'。

SEQ ID No.4：5'-TGTAGGAGATTTTATGAACACTCGTGCTAGCAATTTTCTCGCAGCCTCATTTTCCACAATCATGCTCGTCGGCGCTTTCAGCCTGCCCGCTTTCGCACAGGAGAATCAGATGACGACGCAGCCCGCGCGCATCGCCGTCACCGGGGAAGGCATGATGACGGCCTCGCCCGATATGGCCATTCTCAATCTCTCGGTGCTACGCCAGGCAAAGACCGCGCGCGAAGCCATGACCGCGAATAATGAAGCCATGACAAAAGTGCTCGATGCCATGAAGAAGGCCGGCATCGAAGATCGCGATCTCCAGACAGGCGGCATCAATATCCAGCCGATTTATGTCTATCCTGACGACAAGAACAACCTGAAAGAGCCTACCATCACCGGCTATTCTGTATCCACCAGTCTCACGGTTCGCGTGCGCGAACTGGCCAATGTTGGAAAAATTTTGGATGAATCCGTCACGCTCGGTGTTAATCAGGGCGGTGATTTGAACCTGGTCAATGATAATCCCTCCGCCGTGATCAACGAGGCGCGCAAGCGCGCAGTGGCCAATGCCATTGCCAAGGCGAAGACGCTTGCCGACGCTGCAGGCGTGGGGCTTGGCCGTGTGGTGGAAATCAGTGAACTGAGCCGCCCGCCCATGCCGATGCCAATTGCGCGCGGACAGTTCAGAACCATGCTAGCAGCCGCACCGGACAATTCCGTGCCGATTGCCGCAGGCGAAAACAGCTATAACGTATCGGTCAATGTCGTTTTTGAAATCAAGTAAATAGCCGGGGTATGACGCCCTTTGCCACCTGATACAAAACGCCGGCCTGGTTTCACAGGCCGGTTTTTTTGATTAGAGCGCGTTTCGATCTGATTGAATCCGATCGGCGCTCTAATCCTTTGTTTGACGCGCAT-3'。

2.RPA引物与探针验证

以实验室保存的布鲁氏菌M5野毒株基因组为模板，针对设计合成的引物与探针组合，采用RPA试剂盒Basic kit进行扩增验证。

详细操作步骤如下所示：使用TwistAmp Basic kit配制50μL RPA反应体系，其中RPA-F和RPA-R(均10μM)各2.4μL，Rehydration缓冲液29.5μL，ddH₂O 12.2μL，模板1μL，280mM MgAc 2.5μL。将模板和MgAc之外的所有试剂预混后转入含有冻干酶制剂的0.2mL反应管中，并充分混匀。将1μL模板加入反应管中，并将2.5μLMgAc加在反应管盖中，盖紧后瞬时离心并涡旋后，将反应管置于荧光定量PCR仪中，37℃，20min，1min收集一次荧光信号，采集扩增曲线。

3.RPA引物与探针验证结果

对经设计合成的RPA引物与探针组合，采用RPA试剂盒Exo kit进行扩增验证，结果如图1和图2所示，其中F1R1代表采用SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2的引物配合SEQ ID No.3的探针组合，图1中纵轴表示起飞时间(Ct)，图2的纵轴表示荧光强度。采用荧光定量PCR仪进行信号检测，引物与探针组合的扩增曲线和荧光强度较明显，可作为RPA扩增的引物与探针组合进行下一步研究试验。

实施例2

采用Exo kit对衣原体特异性荧光RPA检测

4.1特异性荧光RPA检测

以SEQ ID No.3为探针，SEQ ID No.1和SEQ ID No.2为引物，以羊布鲁氏菌M5-90△26疫苗菌株(中国农业科学院兰州兽医研究所和中国农业科学院哈尔滨兽医研究所共同构建的疫苗)、羊布鲁氏菌M5野毒株、羊流产衣原体、弓形虫、胎儿弯杆菌基因组DNA为检测目标，以布鲁氏菌的DNA为阳性对照，利用本发明提供的试剂盒中所配备的引物探针组合，按照TwistAmpBasic kit试剂盒说明书进行扩增，并采用荧光定量PCR仪进行信号检测。

详细操作步骤如下所示：使用TwistAmp Basic kit配制50μL RPA反应体系，其中RPA-F和RPA-R(均10μM)各2.4μL，Rehydration Buffer 29.5μL，ddH2O 12.2μL，模板1μL，280mM MgAc 2.5μL。将模板和MgAc之外的所有试剂预混后转入含有冻干酶制剂的0.2mL反应管中，并充分混匀。将1μL模板加入反应管中，并将2.5μLMgAc加在反应管盖中，盖紧后瞬时离心并涡旋后，将反应管置于荧光定量PCR仪中，37℃，20min，1min收集一次荧光信号，采集扩增曲线。

特异性荧光RPA检测结果

以SEQ IDNo.3为探针，SEQ ID No.1和SEQ ID No.2为引物，对实验室保存的众多菌株进行检测，结果如表1所示，布鲁氏菌野毒株(Brucella spp.)基因组DNA以及阳性对照为阳性结果，其余均为阴性，说明该方法对检测布鲁氏菌有较强的特异性。

表1特异性荧光RPA检测结果

实施例3

荧光RPA检测灵敏度分析

1、质粒标准品的构建

(1)bp26基因的获取

普通PCR扩增引物的上下游引物分别命名为SEQ ID No.5和SEQ IDNo.6，其中SEQID No.4和SEQ ID No.5如下所示，RPA引物有待进一步筛选。FP：5’-ATCCACCAGTCTCACGGTTC-3’，即SEQ ID No.5

RP：5’-GGCGTCATACCCCAGCTAT-3’，即SEQ ID No.6

采用基因bp26的PCR扩增引物SEQ ID No.5和SEQ ID No.6，对布鲁氏菌M5野毒株基因组进行PCR扩增，50μL PCR反应体系如下所示：上游引物，1μL；下游引物，1μL；ExTaq预混酶，25μL；模板(基因组)，2μL；去离子水，21μL。PCR扩增程序：首先95℃充分变性5min；然后35个循环，分别为：94℃变性30s；56℃退火30s；72℃延伸1min，最后72℃延伸10min。

(2)PCR产物纯化回收并构建重组质粒标准品

PCR产物按照TaKaRaBiotech公司PCR产物纯化试剂盒说明进行，获得的PCR产物通过T-A克隆，克隆在pMD18-T simple载体上，得到重组质粒pMD18-T-bp26，即为质粒标准品。

(3)质粒标准品浓度测定

用蛋白核酸测定仪对pMD18-T-bp26的浓度进行测定，经测定浓度为40.3ng/μL。

(4)质粒标准品拷贝数计算

pMD18-T simple载体空载体大小为2692bp，bp26基因为395bp，因此，PMD18-T-envB重组质粒大小为3087bp。接下来通过基因拷贝数计算公式对质粒标准品拷贝数计算，如下所示，经计算，本研究构建的质粒标准品拷贝数约为0.6×10¹⁰copies/μL(0.6×10¹⁰CFU)。

(5)重组质粒的倍比稀释

将重组质粒pMD18-T-bp26进行倍比稀释，使其浓度为0.6×10⁹CFU、0.6×10⁸CFU、0.6×10⁷CFU、0.6×10⁶CFU、0.6×10⁵CFU、0.6×10⁴CFU、600CFU、60CFU、6CFU、3CFU，并将其作为RPA反应的模板。

2灵敏度分析

(1)基于灵敏度分析的RPA扩增

以浓度为0.6×10⁹CFU、0.6×10⁸CFU、0.6×10⁷CFU、0.6×10⁶CFU、0.6×10⁵CFU、0.6×10⁴CFU、600CFU、60CFU、6CFU、3CFU重组质粒pMD18-T-bp26作为荧光RPA反应的模板，以SEQ ID No.3为探针，SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2为引物，详细的操作步骤同4.1，按照试剂盒说明书进行扩增，并采用荧光定量PCR仪进行信号检测。

(2)扩增结果

以SEQ IDNo.3为探针，SEQ ID No.1和SEQ ID No.2为引物，倍比稀释后的重组质粒pMD18-T-bp26作为荧光RPA反应的模板，对本研究建立的特异性荧光RPA检测进行灵敏度分析，结果如图3所示，其中纵坐标为相对荧光单位(RFU)，横坐标为反应进行的循环数，NTC为没有起飞即没有明显的扩增曲线。随着模板拷贝数的降低，曲线起飞时间(CT值)逐渐增加而荧光信号值逐渐的下降，在拷贝数为6CFU时仍有扩增曲线，当拷贝数为3CFU时判定为没有起飞，即没有明显的扩增曲线。以上结果证明，当把表模板为6CFU及以上拷贝时有明显的扩增曲线，起飞时间随着模板拷贝数的增加而缩短，荧光强度随着模板拷贝数的增加而增强，满足现场检测的要求。

实施例4

临床样品检验

用建立的RPA方法对59份临床样品进行检测，同时用RealtimePCR和普通PCR做为对照，结果如下表2。

表2 59份临床样品检验结果

从表2中可以看出，建立的RPA诊断方法能有效扩增临床样品，并且敏感性优于同等条件的下的Real time PCR和普通PCR。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测布鲁氏菌的引物、探针和试剂盒

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caatgttgga aaaattttgg atgaatccgt 30

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttacttgatt tcaaaaacga cattgaccga ta 32

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(47)

<223> n(32)=THF;

<400> 3

ggcggtgatt tgaacctggt caatgataat cncccgccgt gatcaac 47

<210> 4

<211> 900

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tgtaggagat tttatgaaca ctcgtgctag caattttctc gcagcctcat tttccacaat 60

catgctcgtc ggcgctttca gcctgcccgc tttcgcacag gagaatcaga tgacgacgca 120

gcccgcgcgc atcgccgtca ccggggaagg catgatgacg gcctcgcccg atatggccat 180

tctcaatctc tcggtgctac gccaggcaaa gaccgcgcgc gaagccatga ccgcgaataa 240

tgaagccatg acaaaagtgc tcgatgccat gaagaaggcc ggcatcgaag atcgcgatct 300

ccagacaggc ggcatcaata tccagccgat ttatgtctat cctgacgaca agaacaacct 360

gaaagagcct accatcaccg gctattctgt atccaccagt ctcacggttc gcgtgcgcga 420

actggccaat gttggaaaaa ttttggatga atccgtcacg ctcggtgtta atcagggcgg 480

tgatttgaac ctggtcaatg ataatccctc cgccgtgatc aacgaggcgc gcaagcgcgc 540

agtggccaat gccattgcca aggcgaagac gcttgccgac gctgcaggcg tggggcttgg 600

ccgtgtggtg gaaatcagtg aactgagccg cccgcccatg ccgatgccaa ttgcgcgcgg 660

acagttcaga accatgctag cagccgcacc ggacaattcc gtgccgattg ccgcaggcga 720

aaacagctat aacgtatcgg tcaatgtcgt ttttgaaatc aagtaaatag ccggggtatg 780

acgccctttg ccacctgata caaaacgccg gcctggtttc acaggccggt ttttttgatt 840

agagcgcgtt tcgatctgat tgaatccgat cggcgctcta atcctttgtt tgacgcgcat 900

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atccaccagt ctcacggttc 20

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggcgtcatac cccagctat 19

Claims

1.一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测布鲁氏菌的引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，其特征在于，所述正向引物具有如序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述反向引物具有如序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

2.一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测布鲁氏菌的探针，具有如序列表中SEQ IDNo.3所示的核苷酸序列。

3.一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测布鲁氏菌的试剂盒，包括以下组分：权利要求1所述的引物对和权利要求2所述的探针。

4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述引物对中正向引物和反向引物的浓度独立为10～1000μmol/L。

5.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述探针的浓度为10～1000μmol/L。

6.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括以下组成：反应缓冲液，280mmol/LMgAc溶液，118ng/μL重组酶、850ng/μL单链结合蛋白和28ng/μL链置换DNA聚合酶。