CN111206109B - 用于牛种、羊种和猪种布鲁氏菌多重rpa检测引物组和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于牛种、羊种和猪种布鲁氏菌多重RPA检测引物组、试剂盒，属于布鲁氏菌检测技术领域；所述引物组包括包括B₁₀₇F、B₁₀₇R、B₁₉₂F、B₁₉₂R、B₂₈₅F和B₂₈₅R；所述B₁₀₇F、B₁₀₇R、B₁₉₂F、B₁₉₂R、B₂₈₅F和B₂₈₅R的核苷酸序列依次如SEQ ID No.1～SEQ ID No.6所示。本发明通过特定的引物组对样品进行多重RPA检测，对牛种布鲁氏菌检测灵敏度为10pg/μL、对羊种布鲁氏菌和猪种布鲁氏菌检测灵敏度均为1pg/μL；本发明提供的引物组和试剂盒分别对人工设置血清、牛肉、牛奶三种加标样品进行检测，并与国标《GB/T 18646‑2018动物布鲁氏菌病诊断技术》布鲁氏菌Bruce‑Ladder检测方法作对照，结果相符。

Description

用于牛种、羊种和猪种布鲁氏菌多重RPA检测引物组和试剂盒

技术领域

本发明属于布鲁氏菌检测技术领域，尤其涉及用于牛种、羊种和猪种布鲁氏菌多重RPA检测引物组和试剂盒。

背景技术

布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌(Brucella spp.)引起的一种人兽共患传染病，布鲁氏菌宿主广泛，不仅可感染牛、羊、猪等多种家畜，也可通过直接或间接接触感染人类，严重危害我国畜牧业发展和人类健康(任洪林,卢士英,周玉,李兆辉,柳增善.布鲁氏菌病的研究与防控进展[J].中国畜牧兽医.2009,36(9):139-43.)。该病流行广泛，已超过150个国家爆发过布鲁氏菌病疫情，被世界动物卫生组织列为B类传染病，同时我国动物防疫法也将其列为乙类动物传染病(盛宗华.浅析布鲁氏菌病疫情上升的原因与防控建议[J].青海畜牧兽医杂志.2014,44(5):49-50.)。主要侵害患病动物的生殖系统，导致怀孕母畜流产、公畜睾丸炎、关节炎、不孕不育、生产力下降等症状。布鲁氏菌种类多，早期报道的有六个种，包括羊种布鲁氏菌(B.melitensis)、牛种布鲁氏菌(B.abortus)、猪种布鲁氏菌(B.suis)、沙林鼠种布鲁氏菌(B.neotomae)、绵羊附睾种布鲁氏菌(B.ovis)和犬种布鲁氏菌(B.canis)(高明华,张志琰,李跃,邓庆华,诺敏.布鲁氏菌病实验室诊断研究进展[J].中国人兽共患病学报.2010,26(1):81-3.；VERGER J-M,GRIMONT F,GRIMONT PAD,GRAYONM.Brucella,a Monospecific Genus as Shown by Deoxyribonucleic AcidHybridization[J].Int J Syst Evol Microbiol.1985,35(3):292-5.)；随着研究的深入，Foster等研究者从水生哺乳动物体中陆续分离到鲸型布鲁氏菌(B.ceti)和鳍型布鲁氏菌(B.pinnipedialis)(Geoffrey F,Osterman BS,Jacques G,Isabelle J,Axel C.Brucellaceti sp.nov.andBrucella pinnipedialis sp.nov.for Brucella strains withcetaceans and seals as their preferred hosts[J].Int J Syst EvolMicrobiol.2007,57(11):2688-93.)；Scholz和Whatmore等相继又分离到田鼠布鲁氏菌(B.microti)、意外种布鲁氏菌(B.inopinata)、赤狐种布鲁氏菌(B.vulpis)、以及狒狒种布鲁氏菌(B.papionis)(Scholz HC,Revillafernández S,Dahouk SA,Hammerl JA,ZygmuntMS,Cloeckaert A,et al.Brucella vulpis sp.nov.,isolated from mandibular lymphnodes of red foxes(Vulpes vulpes)[J].Int J Syst Evol Microbiol.2016,66(5):2090-8.；Scholz HC,

K,

C,Bahn P,Vergnaud G,Tomaso H,etal.Brucella inopinata sp.nov.,isolated from a breast implantinfection[J].International Journal of Systematic&Evolutionary Microbiology.2010,60(Pt 4):801.；Scholz HC,Hubalek Z,Sedlácek I,Vergnaud G,Tomaso H,Al DS,et al.Brucellamicroti sp.nov.,isolated from the common vole Microtus arvalis[J].International Journal of Systematic&Evolutionary Microbiology.2008,58(2):375-82.；WhatmoreAM,DavisonN,CloeckaertA,Al Dahouk S,Zygmunt MS,Brew SD,etal.Brucella papionis sp.nov.,isolated from baboons(Papio spp.)[J].Int J SystEvol Microbiol.2014,64(Pt12):4120-8.)，共计12个种。流行病学调查结果显示，我国布病流行的菌株种，以牛种、羊种、猪种布鲁氏菌引起的布病疫情高达93.21％。由此可见，建立牛种、羊种、猪种布鲁氏菌快速简便的检测鉴定方法，对布病防控及净化具有重要意义。

目前常规的布病检测技术以细菌学、血清学方法和分子生物学方法。细菌学方法得对病原进行分离鉴定，费时费力，对人员操作要求高且存在生物安全风险，需要在生物安全3级实验室进行。布鲁氏菌种类多，通过肉眼难以对种型进行区分，往往容易因为操作人员个人主观原因造成错误判断。而血清学方法，只针对布病抗体进行检测，容易出现假阳性的结果，也不能胜任布鲁氏菌的种属鉴定。分子生物学方法中，多是根据IS711基因在不同种布鲁氏菌全基因组中拷贝数不同，常常利用多重PCR技术进行布鲁氏菌的种型鉴定。例如，1994年，Bricker等通过AMOS-PCR技术将牛种1型、2型、4型、羊种、猪种、绵羊附睾种布鲁氏菌进行区分(BrickerBJ,Halling SM.Differentiation ofBrucella abortus bv.1,2,and 4,Brucella melitensis,Brucella ovis,andBrucella suis bv.1byPCR[J].JClinMicrobiol.1994,32(11):2660-6.)；李建云建立多重PCR将牛种、羊种、猪种布鲁氏菌进行区分(李建云.动物布鲁氏菌快速检测方法的研究:内蒙古农业大学；2012.)。为了对更多种型进行区分，Lopez-Goni等发明Bruce-ladder方法，可对牛种、羊种、绵羊附睾种、猪种、沙林鼠种、牛种疫苗株S19、牛种疫苗株RB51、羊种疫苗株Rev1、犬种、海洋种、田鼠种、意外种布鲁氏菌进行区分；国内许邹亮建立的循环探针荧光定量PCR方法，可将牛种、羊种、猪种、犬种、沙林鼠种、海洋种布鲁氏菌进行区分(许邹亮.循环探针荧光定量PCR方法用于布鲁氏菌分种的研究以及布鲁氏菌LAMP可视化检测方法的建立:扬州大学；2011.)。但由于PCR仪及荧光定量PCR仪相对价值较高，目的片段扩增需要经过变性、退火、延伸，扩增时间较长，因此该方法在实际的应用中受到一定的限制。

自2006年，Piepenburg等开发重组酶聚合酶扩增(RecombinasePolymeraseAmplification，RPA)技术以来，该技术已广泛应用于病原的检测(PiepenburgO,Williams CH,Stemple DL,Armes NA.DNADetectionUsing RecombinationProteins[J].PLoS Biol.2006,4(7):1115-21.)。该技术弥补了上述方法的不足，在恒温条件下即可对目的片段进行扩增，操作简单、扩增反应时间短，对仪器设备要求很低，而且该技术在一个反应体系内可对多个目标进行扩增，可实现多重化扩增检测。例如Crannell等建立的多重RPA技术可对贾第虫、隐孢子虫、阿米巴虫进行同时检测(Crannell ZA,Castellanos-Gonzales A,Nair G,Mejia R,Richards-Kortum R.Multiplexed RecombinasePolymerase Amplification Assay To Detect Intestinal Protozoa[J].AnalChem.2015,88(3):1610-6.)；李晓军等利用多重RT-RPA扩增甲型流感病毒Matrix基因、H1亚型HA基因和H3亚型HA基因(李晓军,孙宁,王卫萍,姚新月,陈芳芳,杨阳,王洁.一种用于甲型流感病毒检测及H1和H3分型的多重RT-RPA引物组合及其应用[P].中国专利:CN108192996 A,2018-06-22)；赵军等利用多重RPA可对新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和H9N2亚型禽流感病毒进行同步检测(赵军,王川庆,杨霞,李永涛,常洪涛,陈陆,王新卫,刘红英,姚慧霞,高冬生.一种用于同时检测NDV、IBV和H9N2亚型AIV的多重RPA引物和探针及其检测方法[P].中国专利:CN107287349B,2018-10-23)。但是目前利用该技术对布鲁氏菌进行种间鉴定的相关报道较少。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供用于牛种、羊种和猪种布鲁氏菌多重RPA检测引物组和试剂盒。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了用于牛种、羊种和猪种布鲁氏菌多重RPA检测的引物组，包括B₁₀₇F、B₁₀₇R、B₁₉₂F、B₁₉₂R、B₂₈₅F和B₂₈₅R；所述B₁₀₇F、B₁₀₇R、B₁₉₂F、B₁₉₂R、B₂₈₅F和B₂₈₅R的核苷酸序列依次如SEQ ID No.1～SEQ ID No.6所示。

优选的，所述B₁₀₇F、B₁₀₇R、B₁₉₂F、B₁₉₂R、B₂₈₅F和B₂₈₅R的使用浓度独立为8～12μmol/L。

优选的，所述B₁₀₇F、B₁₀₇R、B₁₉₂F、B₁₉₂R、B₂₈₅F和B₂₈₅R使用的体积比为(1.15～1.25):(1.15～1.25):(1.08～1.12):(1.08～1.12):(1.08～1.12):(1.08～1.12)。

优选的，所述B₁₀₇F、B₁₀₇R、B₁₉₂F、B₁₉₂R、B₂₈₅F和B₂₈₅R使用的体积比为1.2:1.2:1.1:1.1:1.1:1.1。

本发明提供了用于牛种、羊种和猪种布鲁氏菌多重RPA检测的试剂盒，包括所述的引物组。

优选的，还包括RPABasic冻干粉、RPA缓冲液、MgOAc和ddH₂O。

优选的，所述引物组、RPA缓冲液、MgOAc和ddH₂O的使用体积比为(6.5～7)：(29.2～29.8)：(2.2～2.8)：(9.5～10)。

优选的，所述引物组、RPA缓冲液、MgOAc和ddH₂O的使用体积比为6.8：29.5：2.5：9.9。

优选的，所述试剂盒进行RPA检测时的体系，以50μL计，包括以下组分：10μmol/L的B₁₀₇F 1.2μL；10μmol/L的B₁₀₇R 1.2μL，10μmol/L的B₁₉₂F1.1μL，10μmol/L的B₁₉₂R 1.1μL，10μmol/L的B₂₈₅F 1.1μL，10μmol/L的B₂₈₅R1.1μL，待检测样品1.3μL，RPA缓冲液29.5μL，ddH₂O9.9μL和MgOAc 2.5μL。

以50μL所述RPA检测体系计，所述RPA Basic冻干粉的质量为4.0～4.5mg。

本发明的有益效果：本发明提供的用于牛种、羊种和猪种布鲁氏菌多重RPA检测引物组、试剂盒；通过特定的引物组对样品进行多重RPA检测，灵敏度高、特异性和重复性好；对牛种布鲁氏菌检测灵敏度为10pg/μL、对羊种布鲁氏菌和猪种布鲁氏菌检测灵敏度均为1pg/μL；利用本发明提供的引物组和试剂盒分别对人工设置血清、牛肉、牛奶三种加标样品进行检测，并与国标《GB/T 18646-2018动物布鲁氏菌病诊断技术》布鲁氏菌Bruce-Ladder检测方法作对照，结果相符。本发明提供的引物组和试剂盒，利用多重RPA检测方法能够实现对牛种、羊种和猪种布鲁氏菌同步检测鉴定。

附图说明

图1为牛种布鲁氏菌2308、羊种布鲁氏菌16M、猪种S2弱毒株单重RPA扩增电泳图，其中M.DL 2000DNAMarker；A.1为牛种布鲁氏菌2308；B.2为羊种布鲁氏菌16M；C.3为猪种布鲁氏菌S2；

图2为牛种引物特异性检测电泳图，其中M.DL 2000DNAMarker；1.牛种布鲁氏菌2308；2.羊种布鲁氏菌16M；3.猪种布鲁氏菌S2；4.大肠杆菌；5.沙门氏菌；6.小肠结肠炎耶氏菌；7.副溶血弧菌；8.福氏志贺氏菌；9.ddH₂O；

图3为羊种引物特异性检测电泳图，其中M.DL 2000DNAMarker；1.羊种布鲁氏菌16M；2.牛种布鲁氏菌2308；3.猪种布鲁氏菌S2；4.大肠杆菌；5.沙门氏菌；6.小肠结肠炎耶氏菌；7.副溶血弧菌；8.福氏志贺氏菌；9.ddH₂O；

图4为猪种引物特异性检测电泳图，其中M.DL 2000DNAMarker；1.猪种布鲁氏菌S2；2.羊种布鲁氏菌16M；3.牛种布鲁氏菌2308；4.大肠杆菌；5.沙门氏菌；6.小肠结肠炎耶氏菌；7.副溶血弧菌；8.福氏志贺氏菌；9.ddH₂O；

图5为布鲁氏菌多重RPA检测结果电泳图，其中M.DL 2000DNA Marker；1.牛种布鲁氏菌2308；2.羊种布鲁氏菌16M；3.猪种布鲁氏菌S2；4.ddH₂O；

图6为反应温度的优化电泳图，其中M.DL 2000DNAMarker；1.37℃；2.38℃；3.39℃；4.40℃；5.41℃；6.42℃；

图7为反应时间的优化电泳图，其中M.DL 2000DNAMarker；1.10min；2.15min；3.20min；4.25min；5.30min；

图8为多重RPA的灵敏度检测结果电泳图，其中A为多重RPA检测牛种布鲁氏菌2308灵敏度图；B为多重RPA检测羊种布鲁氏菌16M灵敏度图；C为多重RPA检测猪种布鲁氏菌S2灵敏度图；M.DL 2000DNA Marker；1-9.1.0×10²ng/μL～10×10^-6ng/μL；

图9为多重RPA方法特异性检测电泳图，其中M.DL 2000DNAMarker；1.牛种布鲁氏菌2308；2.羊种布鲁氏菌16M；3.猪种布鲁氏菌S2；4.大肠杆菌；5.沙门氏菌；6.小肠结肠炎耶氏菌；7.副溶血弧菌；8.福氏志贺氏菌；9.ddH₂O；

图10为多重RPA检测方法的重复性检测电泳图，其中M.DL 2000DNA Marker；1-3.牛种布鲁氏菌2308；4-6.羊种布鲁氏菌16M；7-9.猪种布鲁氏菌S2；10.ddH₂O；

图11为牛种布鲁氏菌、羊种布鲁氏菌、猪种布鲁氏菌的三种菌混合多重RPA检测电泳图，其中M.DL 2000DNAMarker；1-3.牛种布鲁氏菌2308、羊种布鲁氏菌16M、猪种布鲁氏菌S2的三种布鲁氏菌基因组的混合物；

图12为多重RPA检测加标血清样品中猪种布鲁氏菌的灵敏度电泳图，其中M.DL2000DNAMarker；；1-9.2.14×10⁹CFU/mL-2.14×10¹CFU/mL；

图13为多重RPA检测加标牛肉样品中猪种布鲁氏菌的灵敏度电泳图，其中M.DL2000DNAMarker；1-9.2.14×10⁹CFU/g-2.14×10¹CFU/g；

图14为多重RPA检测加标牛奶样品中猪种布鲁氏菌的灵敏度电泳图，其中M.DL2000DNAMarker；1-9.2.14×10⁹CFU/mL-2.14×10¹CFU/mL；

图15为多重RPA检测加标血清样品中猪种布鲁氏菌的重复性电泳图，其中M.DL2000DNAMarker；A.1-10:10个加标样；B.1:阴性对照；

图16为多重RPA检测加标牛肉样品中猪种布鲁氏菌的重复性电泳图，其中M.DL2000DNAMarker；A.1-10:10个加标样；B.1:阴性对照；

图17为多重RPA检测加标牛奶样品中猪种布鲁氏菌的重复性电泳图，其中M.DL2000DNAMarker；A.1-10:10个加标样；B.1:阴性对照；

图18为国家标准Bruce-Ladder方法检测加标血清样品中猪种布鲁氏菌电泳图，其中M.DL 2000DNAMarker；A.1-10:10个加标样；B.1:阴性对照；

图19为国家标准Bruce-Ladder方法检测加标牛肉样品中猪种布鲁氏菌电泳图，其中M.DL 2000DNAMarker；A.1-10:10个加标样；B.1:阴性对照；

图20为国家标准Bruce-Ladder方法检测加标牛奶样品中猪种布鲁氏菌电泳图，其中M.DL 2000DNAMarker；A.1-10:10个加标样；B.1:阴性对照。

具体实施方式

本发明提供了用于牛种、羊种和猪种布鲁氏菌多重RPA检测的引物组，包括B₁₀₇F、B₁₀₇R、B₁₉₂F、B₁₉₂R、B₂₈₅F和B₂₈₅R；所述B₁₀₇F、B₁₀₇R、B₁₉₂F、B₁₉₂R、B₂₈₅F和B₂₈₅R的核苷酸序列依次如SEQ ID No.1～SEQ ID No.6所示。

在本发明中，所述引物组的具体序列、扩增长度和靶标具体如表1所示。在本发明中，所述引物组的具体序列根据NCBI登载的牛种布鲁氏菌(GenBank:AM040265.1)、羊种布鲁氏菌(GenBank:AE008917.1)、猪种布鲁氏菌(GenBank:CP006961.1)基因组序列，利用MUMmer比较分析三种布鲁氏菌基因组序列之间的差异部分，同时参考文献中猪种布鲁氏菌特异性靶基因片段，该片段长度为285bp；参考文献：李争,李诗语,卢晓冉,沙洲,程慧敏,卜昭阳,等.布鲁氏菌新型多重PCR方法的建立与初步应用[J].黑龙江畜牧兽医.2016(4):176-80.，应用Premier Primer 5设计引物。在本发明中，所述引物序列的合成由长春库美生物科技有限公司完成。在本发明中，所述引物设计的原则优选的如下：1)引物长度在30～35bp，以增加重组酶活性；2)引物5’端3～5个核苷酸避免多个G，5’端优选为C或G有助于聚合酶的稳定性并促进重组率；3)避免出现连续嘌呤和嘧啶；4)避免形成引物二聚体、发卡等结构，G+C％含量在30～70％；5)靶序列避免重复元件；6)为保证扩增效率，尽量使扩增片段小于500bp。所述引物获取的具体过程如下：序列差异部分使用数据库进行比对，针对比对出的差异序列分别设计多对引物，并进行引物Blast，选取理论上较好的引物通过实际实验进行筛选，筛选出能扩增出明显且特异条带的引物。本发明在设计种间鉴定的引物时，优先进行理论上的引物Blast，能够节省原料且增加成功率。

在本发明中，所述引物组中(B₁₀₇F和B₁₀₇R)、(B₁₉₂F和B₁₉₂R)以及(B₂₈₅F和B₂₈₅R)分别扩增牛种布鲁氏菌、羊种布鲁氏菌和猪种布鲁氏菌，所述引物组中各个引物对单独扩增特异性良好，利用所述引物组进行多重RPA，特异性好、灵敏度高。在本发明中，所述B₁₀₇F、B₁₀₇R、B₁₉₂F、B₁₉₂R、B₂₈₅F和B₂₈₅R的使用浓度独立优选为8～12μmol/L，更优选为10μmol/L。在本发明中，所述B₁₀₇F、B₁₀₇R、B₁₉₂F、B₁₉₂R、B₂₈₅F和B₂₈₅R使用的体积比优选为(1.15～1.25):(1.15～1.25):(1.08～1.12):(1.08～1.12):(1.08～1.12):(1.08～1.12)，更优选为1.2:1.2:1.1:1.1:1.1:1.1。

表1引物信息

本发明还提供了用于牛种、羊种和猪种布鲁氏菌多重RPA检测的试剂盒，包括所述的引物组。

在本发明中，所述试剂盒优选的还包括RPABasic冻干粉、RPA缓冲液、MgOAc和ddH₂O。在本发明中，所述RPA Baic冻干粉的使用质量优选为4.0～4.5mg，更优选为4.3mg，所述引物组、RPA缓冲液、MgOAc和ddH₂O的使用体积比优选为(6.5～7):(29.2～29.8):(2.2～2.8):(9.5～10)，更优选为6.8:29.5:2.5:9.9。本发明对所述RPA Basic冻干粉、RPA缓冲液以及MgOAc包含于Twist

Basic Kit购自英国TwistDx Inc公司。

在本发明中，采用所述试剂盒进行牛种、羊种和猪种布鲁氏菌多重RPA检测。在本发明中，所述试剂盒的使用方法优选的如下：将待检测样品、引物组、RPA缓冲液、MgOAc和ddH₂O混合后充分溶解RPABasic冻干粉进行RPA扩增。在本发明中，所述待检测样品优选为液体样品或固体样品；在本发明中，所述样品包括但不限于血清样品、牛肉样品和牛奶样品。在本发明中，所述RPA检测体系，以50μL计，优选的包括以下组分：B₁₀₇F和B₁₀₇R(浓度均为10μmol/L)各1.2μL，B₁₉₂F和B₁₉₂R(浓度均为10μmol/L)各1.1μL，B₂₈₅F和B₂₈₅R(浓度均为10μmol/L)各1.1μL，待检测样品1.3μL，RPABasic冻干粉4.3mg，RPA缓冲液29.5μL，ddH₂O 9.9μL，MgOAc 2.5μL；在本发明中，所述扩增程序如下：39℃扩增20min。在本发明中，所述扩增优选的在金属浴中进行。在本发明中，当扩增结束后，优选的通过普通DNA产物纯化试剂盒将扩增产物进行纯化，取纯化后的产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，所述纯化产物电泳检测的上样体积优选为8～12μL，更优选为10μL。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

实验菌株及细胞牛种布鲁氏菌2308、羊种布鲁氏菌16M由长春军事兽医研究所保存；猪种布鲁氏菌弱毒株S2、大肠杆菌模式株、沙门氏菌、小肠结肠炎耶氏菌、副溶血弧菌、福氏志贺氏菌由吉林大学人兽共患病研究所细菌病研究室保存。

主要仪器及试剂凝胶成像仪购自UVP公司；程控金属浴购自中国卡尤迪生物科技有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、普通DNA产物纯化试剂盒购自天根生化科技有限公司；Twist

Basic Kit购自英国TwistDx Inc公司；布氏肉汤培养基购自青岛日水生物技术有限公司。

引物设计与合成根据NCBI登载的牛种布鲁氏菌(GenBank:AM040265.1)、羊种布鲁氏菌(GenBank:AE008917.1)、猪种布鲁氏菌(GenBank:CP006961.1)基因组系列，利用MUMmer比较分析各种序列之间的差异，同时参考文献：李争,李诗语,卢晓冉,沙洲,程慧敏,卜昭阳,等.布鲁氏菌新型多重PCR方法的建立与初步应用[J].黑龙江畜牧兽医.2016(4):176-80.，应用PremierPrimer 5设计引物，由长春库美生物科技有限公司合成，通过RPA实验对引物进行筛选，筛选出各个种的引物信息见表1。

布鲁氏菌基因组的提取首先对牛种布鲁氏菌2308、羊种布鲁氏菌16M、猪种布鲁氏菌S2进行巴氏灭菌法灭活处理。利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取牛种布鲁氏菌2308、羊种布鲁氏菌16M、猪种布鲁氏菌S2的基因组，应用核酸定量仪检测，并用离心浓缩仪浓缩或用ddH₂O调整，使基因组DNA浓度大于1pg/μL，-20℃保存备用。

牛种、羊种、猪种布鲁氏菌单重RPA检测方法以提取的牛种布鲁氏菌2308、羊种布鲁氏菌16M、猪种布鲁氏菌S2的基因组分别为模板，以各自引物进行RPA扩增，参考Twist

Basic Kit说明书加入的反应体系为：上下游引物(10μmol/L)各2.4μL，模板2μL，RPA缓冲液29.5μL，ddH₂O 11.2μL，MgOAc 2.5μL，各组分混合均匀后充分溶解4.3mg的RPABasic冻干粉，放置金属浴中39℃扩增20min。扩增结束后，通过普通DNA产物纯化试剂盒将扩增产物进行纯化，取10μL纯化产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图1所示，成功扩增出牛种布鲁氏菌107bp的条带(图1中A的第1泳道)，羊种布鲁氏菌192bp(图1中B的第2泳)，猪种布鲁氏菌285bp(图1中C的第3泳道)。

牛种、羊种、猪种布鲁氏菌不同引物的特异性检测分别检测牛种、羊种及猪种布鲁氏菌引物的特异性，以提取的牛种布鲁氏菌2308、羊种布鲁氏菌16M、猪种布鲁氏菌S2基因组分别为模板，以大肠杆菌、沙门氏菌、小肠结肠炎耶氏菌、副溶血弧菌、福氏志贺氏菌等不同种细菌的基因组以及ddH₂O作为对照，进行RPA扩增反应，扩增体系为:上下游引物(10μmol/L)各2.4μL，模板2μL，RPA缓冲液29.5μL，ddH₂O 11.2μL，MgOAc 2.5μL，各组分混合均匀后充分溶解4.3mg的RPABasic冻干粉，反应条件为39℃扩增20min，分别检测各对引物的特异性。结果如图2～4所示，发现牛种布鲁氏菌(图2)、羊种布鲁氏菌(图3)、猪种布鲁氏菌(图4)引物特异性良好，可用于构建多重RPA体系。

布鲁氏菌多重RPA反应体系的建立分别以牛种布鲁氏菌2308、羊种布鲁氏菌16M、猪种布鲁氏菌S2的基因组为模板进行多重RPA扩增实验，多重RPA扩增体系见参见表2，39℃条件下扩增20min。扩增结束后，通过普通DNA产物纯化试剂盒将扩增产物进行纯化，取10μL纯化产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图5，多重RPA体系成功扩增牛种布鲁氏菌大小为107bp条带，羊种布鲁氏菌大小为192bp条带，猪种布鲁氏菌大小为285bp条带。

表2多重RPA反应体系

不同反应温度的扩增效果检测根据重组酶活性温度范围在37～42℃活性最高，将能同时扩增出牛种、羊种、猪种布鲁氏菌目的条带且效果最佳的温度作为反应温度，RPA扩增体系见表3，设置温度分别为37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃，进行RPA扩增20min检测不同反应温度的扩增效果，扩增结束后，将纯化后的扩增产物通过1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。结果如图6所示，确定最佳反应温度为39℃。

表3多重RPA反应体系

不同反应时间的扩增效果检测设置不同扩增时间实验，使用多重RPA体系见表3，设置扩增时间分别为10min、15min、20min、25min、30min，在测定的最佳反应温度39℃下扩增，扩增结束后通过1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。结果如图7所示，根据扩增结果将能同时扩增出牛、羊、猪种布鲁氏菌目的条带且效果最佳的时间作为反应时间，将最佳反应时间确定为20min。

多重RPA检测方法的灵敏性分析将提取的牛种布鲁氏菌2308、羊种布鲁氏菌16M、猪种布鲁氏菌S2的基因组浓度分别调整为100ng/μL，并进行10倍倍比稀释，应用本发明进行多重RPA扩增，体系同表2，39℃条件下扩增20min，分析该方法的灵敏性，扩增结束后，将纯化后的扩增产物通过1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。结果如图8所示，可见多重RPA检测牛种布鲁氏菌2308的灵敏度为10pg/μL(图8中的A)、检测羊种布鲁氏菌16M的灵敏度为1pg/μL(图8中的B)、检测猪种布鲁氏菌S2的灵敏度为1pg/μL(图8中的C)。

多重RPA检测方法的特异性分析以提取的牛种布鲁氏菌2308基因组、羊种布鲁氏菌16M基因组、猪种布鲁氏菌S2基因组、大肠杆菌模式株基因组、沙门氏菌基因组、小肠结肠炎耶氏菌基因组、副溶血弧菌基因组、福氏志贺氏菌基因组、ddH₂O分别为模板，应用本发明进行多重RPA扩增，反应体系同表2，反应条件同上，检测本发明方法引物的特异性。结果如图9所示：以提取100pg/μL的牛种布鲁氏菌2308基因组、羊种布鲁氏菌16M基因组、猪种布鲁氏菌S2基因组、大肠杆菌模式株基因组、沙门氏菌基因组、小肠结肠炎耶氏菌基因组、副溶血弧菌基因组、福氏志贺氏菌基因组、ddH₂O分别为模板进行多重RPA扩增，非布鲁氏菌均呈现阴性结果，且牛种、羊种、猪种布鲁氏菌分别扩增出相应的目的条带，表明引物具有良好的特异性。

多重RPA检测方法的重复性分析分别提取牛种布鲁氏菌2308、羊种布鲁氏菌16M以及猪种布鲁氏菌S2的基因组DNA，分别以各自基因组为模板，应用本发明进行多重RPA扩增，反应体系同表2，39℃扩增20min，分别进行三次多重RPA重复实验，分析该方法的稳定性，结果如图10所示，可见本发明重复性良好。

混合病原菌的检测提取牛种布鲁氏菌2308、羊种布鲁氏菌16M以及猪种布鲁氏菌S2的基因组DNA，分别将DNA浓度调整至100ng/μL后进行等体积混合均匀，利用本发明同时对牛种布鲁氏菌、羊种布鲁氏菌和猪种布鲁氏菌检测，以混合基因组为模板，应用本发明进行多重RPA扩增，反应体系同表2，反应条件同上，结果如图11所示，同时能扩增出牛种布鲁氏菌大小为107bp条带，羊种布鲁氏菌大小为192bp条带，猪种布鲁氏菌大小为285bp条带，可见本研究建立的多重PCR方法可同时检测牛、羊、猪种布鲁氏菌。

实施例2

多重RPA检测方法对加标样品进行检测为评价本发明方法的可行性，将培养的猪种布鲁氏菌S2进行计数，算出菌液浓度，人工对血清样品、牛肉样品、牛奶样品添加菌液，使用煮沸法进行粗提基因组，进行加标检测。

人工加标血清样品的制备：对布鲁氏菌S2菌液通过平板计数，得出菌液浓度，将菌液与血清混合，使血清中布鲁氏菌终浓度为2.14×10⁹CFU/mL，12000转/分钟离心1min收集菌体，无菌生理盐水洗涤两遍，最后加入100μL生理盐水重悬菌体，沸水煮30min，离心取上清基因组溶液，然后将其进行10倍倍比稀释作模板，用于分析血清样品中布鲁氏菌检测灵敏度。另外将200μL浓度为2.14×10⁹CFU/mL布鲁氏菌S2菌液与800μL血清混合，制备10个人工加标血清样品，同样按上述方法经离心、煮沸提取基因组作模板，用于分析血清样品中布鲁氏菌检测重复性，同时设置ddH₂O阴性对照。

人工加标牛肉样品的制备：对布鲁氏菌S2菌液通过平板计数，得出菌液浓度，将牛肉尽可能粉碎制成牛肉渣，将菌体与肉渣充分混合，使肉渣中布鲁氏菌终浓度为2.14×10⁹CFU/g，用无菌生理盐水重悬肉渣，过滤肉渣，滤液通过12000转/分钟离心1min收集菌体，无菌生理盐水洗涤两遍，最后加入100μL生理盐水重悬菌体，沸水煮30min，离心取上清基因组溶液，然后将其进行10倍倍比稀释作模板，用于分析牛肉样品中布鲁氏菌检测灵敏度。另外离心收集200μL浓度为2.14×10⁹CFU/mL布鲁氏菌S2菌体与1g肉渣混合，制备10个人工加标牛肉样品，同样按上述方法经离心、煮沸提取基因组作模板，用于分析牛肉样品中布鲁氏菌检测重复性，同时设置ddH₂O阴性对照。

人工加标牛奶样品的制备：对布鲁氏菌S2菌液通过平板计数，得出菌液浓度，将菌液与牛奶混合，使牛奶中布鲁氏菌终浓度为2.14×10⁹CFU/mL，12000转/分钟离心1min收集菌体，无菌生理盐水洗涤两遍，最后加入100μL生理盐水重悬菌体，沸水煮30min，离心取上清基因组溶液，然后将其进行10倍倍比稀释作模板，用于分析牛奶样品中布鲁氏菌检测灵敏度。另外将200μL浓度为2.14×10⁹CFU/mL布鲁氏菌S2菌液与800μL牛奶混合，制备10个人工加标血清样品，同样按上述方法，经离心、煮沸提取基因组作模板，用于分析牛奶样品中布鲁氏菌检测重复性，同时设置ddH₂O阴性对照。

应用本发明方法对所制备的人工加标模拟样品进行扩增检测，反应体系同表2，39℃条件下扩增20min，同时利用《GB/T 18646-2018动物布鲁氏菌病诊断技术》中布鲁氏菌Bruce-Ladder检测方法进行检测，分析本发明方法检测样品中牛种、羊种、猪种布鲁氏菌的可行性。

结果发现本发明方法检测血清样品中猪种布鲁氏菌S2的灵敏度为2.14×10⁴CFU/mL(图12)，牛肉样品中猪种布鲁氏菌S2的灵敏度为2.14×10⁵CFU/g(图13)，牛奶样品中猪种布鲁氏菌S2的灵敏度为2.14×10⁵CFU/mL(图14)。人工加标的血清样品(图15)、牛肉样品(图16)、牛奶样品(图17)检测重复性好，每种样品10份重复样的检测结果均为阳性，结果同国家标准《GB/T 18646-2018动物布鲁氏菌病诊断技术》中布鲁氏菌Bruce-Ladder检测方法结果一致，加标血清样品国家标准方法检测结果见图18，加标牛肉样品国家标准方法检测结果见图19，加标牛奶样品国家标准方法检测结果见图20，证明本发明方法可应用于临床样品的检测。

由上述实施例可知，本发明提供的引物组和试剂盒，利用多重RPA检测方法可同时检测牛种、羊种、猪种布鲁氏菌，检测灵敏度高、重复性好、特异性好。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 吉林大学

<120> 用于牛种、羊种和猪种布鲁氏菌多重RPA检测引物组和试剂盒

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tggcacctgg acagcggcta cgggcaactt 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcccaccgcc aaagaccgca aacgcaccat 30

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttcacgcaag aaataccgtt caagcaagag 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gattgcggag ataatgaagc gaccccagtg 30

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgccgatcac ttaagggcct tcattgccag cg 32

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcgcggtttt ctgaaggttc aggggtttta 30

Claims (10)

1.用于牛种、羊种和猪种布鲁氏菌多重RPA检测的引物组，其特征在于，包括B₁₀₇F、B₁₀₇R、B₁₉₂F、B₁₉₂R、B₂₈₅F和B₂₈₅R；所述B₁₀₇F、B₁₀₇R、B₁₉₂F、B₁₉₂R、B₂₈₅F和B₂₈₅R的核苷酸序列依次如SEQ ID No.1～SEQ ID No.6所示。

2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述B₁₀₇F、B₁₀₇R、B₁₉₂F、B₁₉₂R、B₂₈₅F和B₂₈₅R的使用浓度独立为8～12μmol/L。

3.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于，所述B₁₀₇F、B₁₀₇R、B₁₉₂F、B₁₉₂R、B₂₈₅F和B₂₈₅R使用的体积比为(1.15～1.25):(1.15～1.25):(1.08～1.12):(1.08～1.12):(1.08～1.12):(1.08～1.12)。

4.根据权利要求3所述的引物组，其特征在于，所述B₁₀₇F、B₁₀₇R、B₁₉₂F、B₁₉₂R、B₂₈₅F和B₂₈₅R使用的体积比为1.2:1.2:1.1:1.1:1.1:1.1。

5.用于牛种、羊种和猪种布鲁氏菌多重RPA检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～4任意一项所述的引物组。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括RPABasic冻干粉、RPA缓冲液、MgOAc和ddH₂O。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述引物组、RPA缓冲液、MgOAc和ddH₂O的使用体积比为(6.5～7):(29.2～29.8):(2.2～2.8):(9.5～10)。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述引物组、RPA缓冲液、MgOAc和ddH₂O的使用体积比为6.8:29.5:2.5:9.9。

9.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进行RPA检测时的体系，以50μL计，包括以下组分：10μmol/L的B₁₀₇F 1.2μL；10μmol/L的B₁₀₇R 1.2μL，10μmol/L的B₁₉₂F 1.1μL，10μmol/L的B₁₉₂R 1.1μL，10μmol/L的B₂₈₅F 1.1μL，10μmol/L的B₂₈₅R1.1μL，待检测样品1.3μL，RPA缓冲液29.5μL，ddH₂O 9.9μL和MgOAc 2.5μL。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，以50μL所述RPA检测体系计，所述RPABasic冻干粉的质量为4.0～4.5mg。

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