CN104178575B - 一种快速鉴别胎儿弯曲菌和性病亚种的方法和试剂盒 - Google Patents

一种快速鉴别胎儿弯曲菌和性病亚种的方法和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种快速鉴别胎儿弯曲菌和性病亚种的方法和试剂盒。该方法通过以待检样品的基因组DNA为模板,在qPCR反应体系中还加入如SEQ?ID?NO.1、2、4和5所示的引物和如SEQ?ID?NO.3和6所示的探针进行双重实时荧光定量PCR,Ct值<35为阳性;35~40为可疑,需要重复试验一次;>40为阴性。实现该方法的试剂盒主要包括上述引物和探针。本发明具有如下优点:能极大地缩短检测时间,只需要1天时间即可完成整个检测;操作更加简单,只需要提取核酸和荧光PCR,无需额外操作;一次性能对待检样品进行胎儿弯曲菌和性病亚种的定性和定量检测;灵敏度高,结果准确可靠。

Description

一种快速鉴别胎儿弯曲菌和性病亚种的方法和试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域,特别涉及一种快速鉴别胎儿弯曲菌和性病亚种的方法和试剂盒。
背景技术
胎儿弯曲菌是一类革兰染色阴性、氧化酶阳性、触媒阳性、呈逗点或S形弯曲、动力活泼、嗜微需氧菌的人兽共患传染病病原体。胎儿弯曲菌常定居在野生动物、家禽、家畜及宠物的肠道或泌尿生殖道内,通过“粪-口”途径的方式感染人类,常导致人类肠外感染,如菌血症、脑膜炎、关节炎、蜂窝组织炎、动脉瘤感染等疾病。胎儿弯曲菌可分为胎儿亚种和性病亚种,性病亚种常存在于动物生殖道中,通过交配和人工授精等传播,常导致牛羊不育、流产和生殖道炎症。目前,胎儿弯曲菌国内有《GB/T18653-2002》对绵羊、牛的冷冻精液中胎儿弯曲菌的标准检验方法,这种方法仅适用于液体样品,对固体样品具有一定局限性;同时,弯曲菌培养条件苛刻、生长缓慢,从培养到生化鉴定需要7~9天,会延误相应的诊断和治疗;再者,弯曲菌培养操作繁琐,需要微需氧环境,培养到生化鉴定需要8种培养基,进行10次试验。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足,提供一种快速鉴别胎儿弯曲菌和性病亚种的方法。
本发明的另一目的在于提供实现上述方法的试剂盒。
本发明的目的通过下述技术方案实现:一种快速鉴别胎儿弯曲菌和性病亚种的方法,包括如下步骤:
(1)设计双重实时荧光定量PCR的引物和探针:
①胎儿弯曲菌的检测引物和探针:
Sap-F:5’-GGTGGAGAATTTACTGATAG-3’;
Sap-R:5’-GCCTTAGCCTCAAATATAG-3’;
Sap-P:5’-FAM-TTAGACTCAGCACTACCGCCATT-BHQ1-3’;
②胎儿弯曲菌性病亚种检测引物:
Par-F:5’-GTGGATCGGCATCTACTA-3’;
Par-R:5’-ATCGCAATCTGCAATGAA-3’;
Par-P:5’-HEX-TATCATCGCCGACGAGTGCC-BHQ1-3’;
(2)提取待检样品中的基因组DNA;
(3)以步骤(2)得到的基因组DNA为模板,加入步骤(1)的引物和探针,进行双重实时荧光定量PCR;
(4)结果判断:Ct值<35为阳性;35~40为可疑,需要重复试验一次;>40为阴性;
步骤(2)中所述的待检样品包括粪便、生殖道涂抹物和血液;
步骤(2)中所述的待检样品可通过常规方法得到基因组DNA,如通过相应的基因组试剂盒提取基因组DNA;
步骤(2)中所述的待检样品优选经过增菌,再进行基因组DNA的提取;
步骤(3)中所述的双重实时荧光定量PCR的体系优化为:qPCRMIX(2.5×)10μL、引物Sap-F(10nM)1.25μL、引物Sap-R(10nM)1.25μL、引物Par-F(10nM)1.25μL、引物Par-R(10nM)1.25μL、探针Sap-P(10nM)0.5μL、探针Par-P(10nM)0.5μL、EnchancerSolution(增强剂,20×)1.25μL、模板DNA5μL,无菌水补足至25μL;
步骤(3)中所述的双重实时荧光定量PCR的条件优选为:95℃2min;95℃10s、56℃30s,40个循环;在退火阶段接受荧光信号;
步骤(4)中所述的阳性的解读如下:只出现sap扩增产物,表示待检样品含有胎儿弯曲菌胎儿亚种;若同时出现sap扩增产物和par扩增产物,比较FAM曲线和HEX曲线的ct值,若两者ct值相同时,待检样品只含胎儿弯曲菌性病亚种,若两者ct值不同时,待检样品含有胎儿弯曲菌胎儿亚种和性病亚种;
实现上述快速鉴别胎儿弯曲菌和性病亚种的方法的试剂盒,包括如下引物和探针:
Sap-F:5’-GGTGGAGAATTTACTGATAG-3’;
Sap-R:5’-GCCTTAGCCTCAAATATAG-3’;
Sap-P:5’-FAM-TTAGACTCAGCACTACCGCCATT-BHQ1-3’;
Par-F:5’-GTGGATCGGCATCTACTA-3’;
Par-R:5’-ATCGCAATCTGCAATGAA-3’;
Par-P:5’-HEX-TATCATCGCCGACGAGTGCC-BHQ1-3’;
所述的试剂盒还包括阳性对照;
所述的阳性对照为胎儿弯曲菌的Sap基因或含有胎儿弯曲菌Sap基因的核酸序列;以及胎儿弯曲菌性病亚种的Par基因或含有胎儿弯曲菌性病亚种Par基因的核酸序列;
所述含有胎儿弯曲菌Sap基因的核酸序列优选为将胎儿弯曲菌Sap基因和克隆载体重组得到的质粒;
所述含有胎儿弯曲菌性病亚种Par基因的核酸序列优选为将胎儿弯曲菌性病亚种Par基因和克隆载体重组得到的质粒;
所述的试剂盒还含有qPCR所用的酶、缓冲液和增强剂等。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
(1)本发明提供的方法和试剂盒,能极大地缩短检测时间,只需要1天时间即可完成整个检测。
(2)操作更加简单,只需要提取核酸和荧光PCR,无需额外操作。
(3)一次性能对待检样品进行胎儿弯曲菌和性病亚种的定性和定量检测。
(4)灵敏度高,结果准确可靠。
附图说明
图1是Sap-阳性克隆标准曲线图。
图2是Par-阳性克隆标准曲线图。
图3是Sap-阳性克隆的灵敏度检测结果图。
图4是Par-阳性克隆的灵敏度检测结果图。
图5是特异性实验扩增曲线图;其中,曲线1是胎儿弯曲菌胎儿亚种ATCC27374,曲线2是胎儿弯曲菌性病亚种ATCC19438,曲线3是胎儿弯曲菌性病亚种ATCC19438。
图6是对比例1的扩增曲线图。
图7是对比例2的扩增曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
实施例1:
(1)设计双重实时荧光定量PCR的引物和探针:
①胎儿弯曲菌的检测引物和探针:
Sap-F:5’-GGTGGAGAATTTACTGATAG-3’;
Sap-R:5’-GCCTTAGCCTCAAATATAG-3’;
Sap-P:5’-FAM-TTAGACTCAGCACTACCGCCATT-BHQ1-3’;
以胎儿弯曲菌为模板,通过引物Sap-F和Sap-R扩增得到的产物的长度为137bp;Sap-P为Taqman探针。
②胎儿弯曲菌性病亚种检测引物:
Par-F:5’-GTGGATCGGCATCTACTA-3’;
Par-R:5’-ATCGCAATCTGCAATGAA-3’;
Par-P:5’-HEX-TATCATCGCCGACGAGTGCC-BHQ1-3’;
以胎儿弯曲菌性病亚种为模板,通过引物Par-F和Par-R扩增得到的产物的长度为112bp;Par-P为Taqman探针。
(2)阳性质粒的制备
1)通过细菌基因组提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司),按说明书的操作,分别抽提胎儿弯曲菌(ATCC27374)和胎儿弯曲菌性病亚种(ATCC19438)的基因组DNA。
2)以Sap-F和Sap-R为引物对,以胎儿弯曲菌(ATCC27374)的基因组DNA为模板进行PCR;以Par-F和Par-R为引物对,以胎儿弯曲菌性病亚种(ATCC19438)的基因组DNA为模板进行PCR。PCR扩增条件为:预变性95℃5min;变性95℃20sec、退火55℃30sec、延伸72℃1min,30个循环;终延伸72℃5min。PCR扩增体系为:基因组DNA2μL、引物对(浓度分别为10μmol/L)各1μL、PCRMIX(天根生化科技公司)25μL,双蒸水补足至50μL。将得到的PCR产物通过2%的琼脂糖凝胶电泳(100V,70min)分离,通过DNA凝胶回收试剂盒(InvitrogenPurelinkQuickGelExtractionKit)回收,分别得到Sap片段(137bp)和Par片段(112bp)。
3)将步骤2)得到的Sap片段(137bp)和Par片段(112bp)分别末端平端化,再与平末端载体连接,具体如下:目的片段(Sap片段或Par片段)3μL,2×ReactionBuffer5μL,DNA平端化酶0.5μL,加水补足8.5μL;70℃反应5min,放在冰上冷却,再加入pZeroBack/blunt载体(2974bp,天根生化科技公司)1μL和T4连接酶(天根生化科技公司)0.5μL,于22℃反应5min。反应结束后,置于冰上。
4)将步骤3)得到的连接产物分别转化大肠杆菌TOP10感受态细胞(天根生化科技公司)中,将转化液涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上,得到初步筛选得到的克隆;接着通过菌落PCR对初步筛选得到的克隆进行复筛,反应条件同步骤2);将复筛阳性的克隆扩大培养并提取质粒,经上海美吉生物(广州)公司测序确定,分别得到Sap-阳性克隆和Par-阳性克隆。
Sap-阳性克隆含如下序列(划横线部分为目的序列):
GCGAACTCGATGGCTCGAGTTTTAGCAGATGGTGGAGAATTTACTGATAGTAAGGGTAATGTTATTAATGTTGCTAG TTTAAGCAAGGGTGATTTAATAGGTGCTATGATTGACTCTATGGTTAATGGTGGTAGTGCTGAGTCTAAGGCTATAT TTGAGGCTAAGGCATCTTTCTAGAAGATCTCCTACAATATTCTCAGCTGCCATGGAAAATCGATGTTCTTAAAAT;
Par-阳性克隆含如下序列(划横线部分为目的序列):
CGTATTGTAGAGACTTCTAGATGATGTGGATCGGCATCTACTAAAAGCGTATCATCGCCGACGAGTGCCAGCTTTAT GGCTAAATTTATGGCGATATTTGTTTTGCCGCTACCGCCTTTTTCATTGCAGATTGCGATATCTTGCTGAAAAACTCGAGCCATCCGGAAGATCTGGCGGCCGCTCTCCCTATAGTGAGTCGA。
经Blast证实:重组的碱基没有变异和缺失。
(3)标准曲线的绘制
1)使用质粒抽提试剂盒抽提得到Sap-阳性克隆质粒(3111bp)和Par-阳性克隆质粒(3086bp)。经Eppendorf核酸蛋白分析仪检测,Sap-阳性克隆质粒和Par-阳性克隆质粒溶液在260nm的吸光度值分别为0.0228ng/L、0.0317ng/L;经如下公式计算其相应的质粒拷贝浓度为3.3×1010拷贝/μL,4.7×1010拷贝/μL。
阿伏伽德罗常数=6.02×1023,重组质粒碱基数=质粒大小+重组片段大小
2)质粒稀释
将两种质粒用EasyDilution稀释液分别十倍稀释,使其终浓度从109~100级共十个稀释梯度,如表1所示:
表1.质粒稀释浓度表
*:Sap-阳性克隆质粒为3.3;Par-阳性克隆质粒为4.7。
3)取各浓度梯度质粒溶液2μL,进行荧光PCR扩增,扩增后根据Ct值和样品浓度自动生成标线,并得出相关系数R2。根据公式E=10-1/SLOPE-1,带入扩增sap和par的标准曲线斜率,分别计算其各自标准曲线的扩增效率。
经优化后的反应体系为:取模板(质粒)5μL、qPCRMIX(Tiangen公司)10μL、enhancerSolution1.25μL、引物Sap-F(10nM)1.25μL、引物Sap-R(10nM)1.25μL、引物Par-F(10nM)1.25μL、引物Par-R(10nM)1.25μL、探针Sap-P(10nM)0.5μL、探针Par-P(10nM)0.5μL、加水补至体系25μL。
经优化后的反应条件为:预变性95℃2分钟;变性95℃10秒、退火温度56℃30秒,40个循环,在退火阶段采集荧光信号。
仪器设置为:在appliedsystem7500fast上Sap探针的报告基团选择FAM、淬灭基团选择BHQ;Par基因的报告基团选择HEX,淬灭基团选择BHQ;参比荧光(passivereference)选择ROX。
A、Sap-阳性克隆质粒的标准曲线
曲线结果如图1所示,X轴为质粒拷贝浓度的对数值,Y轴为对应的Ct值,线性方程为Y=-3.3382X+40.0153,相关系数为99.91%,扩增效率为99.33%。
B、Par-阳性克隆质粒的标准曲线
曲线结果如图2所示,X轴为质粒拷贝浓度的对数值,Y轴为对应的Ct值,线性方程为Y=-3.3694X+41.3279,相关系数为99.91%,扩增效率为98.06%。
(4)荧光PCR检测其灵敏度
分别取10个梯度(109~100copies/μL)的质粒标准品2μL,分别用同步骤(3)3)进行荧光PCR扩增,观察扩增曲线及Ct值。
A.双重荧光PCR的Sap-阳性克隆质粒标准品灵敏度检测结果
如图3所示,其对应的Ct值分别为10.01,12.93,16.94,20.04,23.53,26.58,29.87,34.77和und。因此该方法对Sap-阳性克隆质粒的灵敏度为Ct值为34.77,对应模板浓度3.3×102copies/μL。
B.双重荧光PCR的Par-阳性克隆质粒标准品灵敏度检测结果
如图4所示,其对应的Ct值为11.01,14.04,18.00,21.08,24.63,27.90,31.50,34.22和und。因此该方法对Par-阳性克隆质粒的灵敏度为Ct值为34.22,对应的模板浓度4.7×102copies/μL。
(5)特异性检验
.菌株:标准菌株(如表2所示):胎儿弯曲菌胎儿亚种1株,胎儿弯曲菌性病亚种1株,弯曲菌属其他菌种2株,其他肠道致病菌和微需氧菌标准株21株。
表2标准菌株
将上述菌株用细菌基因组提取试剂盒提取其基因组DNA,分别用步骤(3)3)的反应体系和反应条件,用Taqman双探针荧光PCR方法进行检测,结果如图5所示,以胎儿弯曲菌胎儿亚种的基因组DNA为模板,出现一条曲线,以胎儿弯曲菌性病亚种的基因组DNA为模板,出现两条曲线。从图5中可见,sap基因能特异扩增胎儿弯曲菌胎儿亚种和性病亚种,par基因能特异扩增性病亚种;其他对照菌株和NTC均无扩增信号。
(6)实际应用
I、提取样品的基因组DNA
①25份粪便和13份生殖道拭子样本使用Tiangen粪便基因组DNA提取试剂盒,按说明书步骤进行提取。
②107份血液样本使用Tiangen细菌基因组提取试剂盒,按说明书步骤进行提取。
II、双重荧光定量PCR
反应体系为:取模板(基因组DNA)5μL、qPCRMIX(Tiangen公司)10μL、enhancerSolution1.25μL、引物Sap-F(10nM)1.25μL、引物Sap-R(10nM)1.25μL、引物Par-F(10nM)1.25μL、引物Par-R(10nM)1.25μL、探针Sap-P(10nM)0.5μL、探针Par-P(10nM)0.5μL、加水补至体系25μL。
反应条件为:预变性95℃2分钟;变性95℃10秒、退火温度56℃30秒,40个循环,在退火阶段采集荧光信号。
仪器设置为:在appliedsystem7500fast上Sap探针的报告基团选择FAM、淬灭基团选择BHQ;Par基因的报告基团选择HEX,淬灭基团选择BHQ;参比荧光(passivereference)选择ROX。
III、结果判断,如表3所示:
表3Ct值<35为阳性,35~40为可疑,需要重复试验一次,>40为阴性。
注:荧光PCR结果中9个样品均只有一条FAM扩增曲线,为胎儿弯曲菌胎儿亚种
该方法与生化培养方法完全一致,从而证明本发明提供的双重荧光PCR准确性高,而且所用的时间较生化培养方法所需时间大大缩短,只需要一天时间。
IV、生化培养方法如下:
①将步骤I中的样品进行增菌培养
粪便:取1g粪便到10mL的bolton肉汤;
生殖道涂抹物:将棉拭子放入10mLbolton肉汤,置于微需氧(5%O2、10%CO2、85%NO2)环境,37℃培养2天,取一环增菌液划线接种于skirrow平板,微需氧条件下培养2天,调取灰白、圆形凸起、湿润有光泽的小菌落经血平板纯培养后用APICampy鉴定;
血液:用注射器吸取0.5ml血液到血平板上,置于微需氧(5%O2、10%CO2、85%NO2)环境,37℃培养2天,调取灰白、中等大小、圆形凸起、边缘整齐的菌落,经血平板纯培养后用APICampy鉴定。
②革兰染色,按常规方法进行革兰氏染色。
③氧化酶和触媒试验
④APICampy鉴定,按API试纸条的操作说明进行实验。
生化培养的结果和双重荧光PCR的结果是一致的。生化培养的结果需7~10天才能确定。
对比例1
(1)依据文献“EvaluationofmolecularassaysforidentificationCampylobacterfetusspeciesandsubspeciesanddevelopmentofaC.fetusspecificreal-timePCRassay,JournalofMicrobiologyMethods,2013”的报道,通过引物合成,得到如下引物和探针,重复前述文献的实验过程:
nahE-f:5’-TGTTATGGTGATCAAAATAGCTGTTG-3’;
nahE-r:5’-GAGCTGTTTTTATG-3’;
nahE-p:5’-FAM-TGTATATGCACTTTTAGCAACTT-BHQ1-3’。
(2)反应体系和条件
反应体系为:qPCRMIX(2.5×)10μL、Enhancersolution(20×)1.25μL、引物nahE-f(10nM)1.25μL、引物nahE-r(10nM)1.25μL、探针nahE-p(10nM)0.5μL、DNA模板2μL、无菌超纯水补足25μL。
反应条件:扩增参数:95℃1min;95℃10s、56℃30s,40循环。
(3)DNA模板
1)胎儿弯曲菌胎儿亚种ATCC27374;2)胎儿弯曲菌性病亚种ATCC19438;3)大肠弯曲菌ATCC33559;4)空肠弯曲菌ATCC29428;5)阴性对照。
4.实验结果:
无法重复上述文献的实验结果,即不能够检测胎儿弯曲菌。如图6所示,使用上述的引物和探针,只有胎儿弯曲菌性病亚种ATCC19438有荧光信号,而胎儿弯曲菌胎儿亚种ATCC27374无荧光信号。
对比例2
(1)根据2009年11月《中国预防兽医学报》杂志中的关于胎儿弯曲菌检测的《胎儿弯杆菌病Taqman实时荧光定量PCR检测方法的建立》中提供的可用以检测胎儿弯曲菌的一对引物和探针:
CF-sapAF:5’-CCTTAGCTCTTCTGCGTTTA-3’;
CF-sapAR:5’-AGCGCTGTTACATCATTTAGTT-3’;
CF-sapP:5’-FAM-CTAAAGAGGCTGCCGATACGACT-TAMRA-3’。
(2)反应体系和条件
反应体系为:qPCRMIX(2.5×)10μL、Enhancersolution(20×)1.25μL、引物CF-sapAF(10nM)0.5μL、引物CF-sapAR(10nM)0.5μL、探针CF-sapP(10nM)0.5μL、DNA模板1μL、无菌超纯水补足25μL。
反应条件:扩增参数:95℃1min;95℃10s,60℃45s,40循环。
(3)DNA模板
1)胎儿弯曲菌胎儿亚种ATCC27374;2)胎儿弯曲菌性病亚种ATCC19438;3)大肠弯曲菌ATCC33559;4)空肠弯曲菌ATCC29428;5)阴性对照。
(4)实验结果
重复了3次,均无法重复该文的实验结果,即未能够检测胎儿弯曲菌。胎儿弯曲菌胎儿亚种ATCC27374和性病亚种ATCC19438均无荧光信号(见图7)。
对比例3
(1)dam基因作为胎儿弯曲菌扩增的目的基因,parC作为性病亚种扩增的目的基因,设计的引物和探针为:
damF:5’-GCATGAAAATCTAGCCAAA-3’;
damR:5’-GCTCTTTGAATTTGAAATCC-3’;
damp:5’-FAM-ACTTCTAACCATCTCACAGTCGTTG-BHQ1-3’;
parcF:5’-GGTTGAAAACTAAAATCATCTTA-3’;
parcR:5’-CGTGATAGCCAAGAAATG-3’;
parcP:5’-HEX-TTAATACCGCAATATCAAGATCGCTT-BHQ1-3’;
以胎儿弯曲菌胎儿亚种ATCC27374和性病亚种ATCC19438的基因组DNA分别为模板,使用本对比例中的引物和探针,参照同实施例1的扩增体系和条件进行荧光定量PCR。经扩增后,胎儿弯曲菌胎儿亚种ATCC27374和性病亚种ATCC19438均无荧光增长信号;
(2)sapA12基因作为胎儿弯曲菌扩增的目的基因,parA作为性病亚种扩增的目的基因,设计的引物和探针为:
sapF:5’-GGCCTTTGAAGTTATTCTTC-3’;
sapR:5’-CTGAGGGTGGAGATCTTA-3’;
sapP:5’-FAM-AAGCACATCATTACCAGCACCAC-BHQ1-3’;
paraF:5’-TGGCAATATCGCAAACTG-3’;
paraR:5’-CTGCTATTTAATAGTGTCTCAAAG-3’;
paraP:5’-HEX-TTCTTGGCTATCACGTCCGC-BHQ1-3’;
以胎儿弯曲菌胎儿亚种ATCC27374和性病亚种ATCC19438的基因组DNA分别为模板,使用本对比例中的引物和探针,参照同实施例1的扩增体系和条件进行荧光定量PCR。经扩增后,胎儿弯曲菌胎儿亚种ATCC2737无荧光增长信号,性病亚种ATCC19438有荧光增长信号。
可见,多重荧光PCR检测胎儿弯曲菌并不是一件容易的事。多重荧光PCR的难点在于:A、扩增靶基因的选择,因为靶基因需要满足保守和特异,因此需要对靶基因进行反复选择和试验;B、由于存在两对引物和两条探针,首先两两引物之间、探针之间不能相互配对,否则易形成二聚体;C、PCR扩增产物的长度在100-150bp之间;D、对引物和探针的浓度组合优化,选取某一浓度组合时,CT值最小扩增信号最强;E、对退火温度优化,某一退火温度时,扩增曲线较好、产物量较高且无非特异性产物;F、探针设计有一系列要求:tm值比引物tm值高5-10℃,5’端不能为G,位置尽可能靠近上游引物,长度在20-30bp,碱基C含量要高于G含量。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种快速鉴别胎儿弯曲菌和性病亚种的试剂盒,其特征在于包括如下引物和探针:
Sap-F:5’-GGTGGAGAATTTACTGATAG-3’;
Sap-R:5’-GCCTTAGCCTCAAATATAG-3’;
Sap-P:5’-FAM-TTAGACTCAGCACTACCGCCATT-BHQ1-3’;
Par-F:5’-GTGGATCGGCATCTACTA-3’;
Par-R:5’-ATCGCAATCTGCAATGAA-3’;
Par-P:5’-HEX-TATCATCGCCGACGAGTGCC-BHQ1-3’。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于:包括阳性对照;
所述的阳性对照为胎儿弯曲菌的Sap基因或含有胎儿弯曲菌Sap基因的核酸序列;以及胎儿弯曲菌性病亚种的Par基因或含有胎儿弯曲菌性病亚种Par基因的核酸序列。
3.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于:所述含有胎儿弯曲菌Sap基因的核酸序列为将胎儿弯曲菌Sap基因和克隆载体重组得到的质粒;
所述含有胎儿弯曲菌性病亚种Par基因的核酸序列为将胎儿弯曲菌性病亚种Par基因和克隆载体重组得到的质粒。
4.根据权利要求1~3任一项所述的试剂盒,其特征在于:还含有qPCR所用的酶、缓冲液和增强剂。
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