CN111471794A - 禾谷镰刀菌的rt-qpcr检测的引物、探针、试剂盒及方法 - Google Patents

禾谷镰刀菌的rt-qpcr检测的引物、探针、试剂盒及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111471794A
CN111471794A CN202010370372.9A CN202010370372A CN111471794A CN 111471794 A CN111471794 A CN 111471794A CN 202010370372 A CN202010370372 A CN 202010370372A CN 111471794 A CN111471794 A CN 111471794A
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
copies
probe
fusarium graminearum
sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010370372.9A
Other languages
English (en)
Inventor
车团结
张镭
沈颂东
朱建宁
孙宗科
石勇
高恺
李潇玲
郑晓玲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lanzhou Baiyuan Gene Technology Co ltd
Original Assignee
Lanzhou Baiyuan Gene Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lanzhou Baiyuan Gene Technology Co ltd filed Critical Lanzhou Baiyuan Gene Technology Co ltd
Priority to CN202010370372.9A priority Critical patent/CN111471794A/zh
Publication of CN111471794A publication Critical patent/CN111471794A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了禾谷镰刀菌的RT‑QPCR检测的引物、探针、试剂盒及方法，属于生物技术领域。上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；试剂盒包括上述引物及探针。荧光定量PCR检测方法包括：提取待测样品总DNA；制备反应体系；将模板梯度稀释制成标准曲线样品及阳性对照样品；将待测样品、标准曲线样品、阳性对照样品、阴性对照样品使用引物和探针进行荧光定量PCR扩增；绘制标准曲线，计算结果。本发明的引物、探针及试剂盒，具有高度特异性和良好的灵敏度，能快速、准确度地禾谷镰刀菌进行检测。

Description

禾谷镰刀菌的RT-QPCR检测的引物、探针、试剂盒及方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及禾谷镰刀菌的实时荧光定量PCR检测的引物、探针、试剂盒及方法。
背景技术
禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)是禾本科作物的重要病原菌之一，可引起小麦、燕麦、大麦、玉米等发生赤霉病，该病菌主要危害粮食作物穗部，使受害穗子粒变色，皱缩，粒重下降，进而引起产量下降。此外，禾谷镰刀菌也是玉米贮存过程中污染程度最严重的真菌菌群之一。由禾谷镰刀菌产生的次级代谢物霉菌毒素-赤霉烯酮能引起人畜中毒并有致癌作用，当前鉴定禾谷镰刀菌主要依靠其菌丝体及再生菌丝的形态结构学特征或对寄主植物接种根据其病害症状特征来进行判定，这些鉴定方法相对简单但需要较长的时间在很大程度上利用检测人员的经验。
现有技术中，采用多重PCR检测禾谷镰刀菌虽然特异性好、准确性高，然而其PCR结果需要通过琼脂糖电泳进行分析，影响因素较多。随着分子生物学技术的不断发展，RT-QPCR (实时荧光定量PCR)目前已广泛应用于菌种的检测。其与常规的分离培养方法相比，具有耗时短、操作简便、特异性好的特点，且结果可直接观察，能有效避免操作过程中引起的污染。但禾谷镰刀菌与其它镰刀属菌种有着较高的同源性，如腐皮镰刀菌、三线镰刀菌、尖孢镰孢。因此提供一种用于禾谷镰刀菌的PCR检测方法，具有高度特异性，准确度高，成为了本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的之一在于，提供一种禾谷镰刀菌的RT-QPCR检测的引物，特异性好，准确度高。
本发明的目的之二在于，提供一种禾谷镰刀菌的RT-QPCR检测的探针。
本发明的目的之三在于，提供一种禾谷镰刀菌的RT-QPCR检测的试剂盒。
本发明的目的之四在于，提供一种禾谷镰刀菌的RT-QPCR检测的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明通过对NCBI数据库中禾谷镰刀菌ITS基因全序列进行生物信息学比对分析，选取适合设计引物和探针的保守片段序列为靶目标，并进一步应用Primer express 3软件、Primer Premier 5软件以及Oligo 7软件，设计了多组实时荧光定量PCR引物与探针，经过试验初步筛选，最终确定了一组用于检测植物禾谷镰刀菌的荧光定量PCR引物和探针。
本发明所述的禾谷镰刀菌的RT-QPCR检测的引物，该引物包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，
上游引物：5'-TCGAGCTTCCATAGCGTAG-3'；
下游引物：5'-GATCCGAGGTCAACATTCAGA-3'。
本发明所述的禾谷镰刀菌的RT-QPCR检测的探针，该探针的核苷酸序列如SEQ IDNO:3 所示：5'-TAATCGTCGCGGCCACTCC-3'；优选地，所述探针5’端标记的荧光报告基团为FAM， 3’端标记的荧光淬灭基团为TAMAR。
ITS基因广泛存在于禾谷镰刀菌中，具有很高的保守性。本发明采用禾谷镰刀菌ITS基因作为靶序列，合成了引物及探针。
本发明所述的禾谷镰刀菌的实时荧光定量PCR检测的引物及探针组合，包括：
上游引物：5'-TCGAGCTTCCATAGCGTAG-3'；
下游引物：5'-GATCCGAGGTCAACATTCAGA-3'；
探针：5'-TAATCGTCGCGGCCACTCC-3'。
本发明所述的一种禾谷镰刀菌的RT-QPCR检测的试剂盒，包括上述的引物、及探针。
本发明的技术方案中，该试剂盒还包括QPCR模板，该QPCR模板如SEQ ID NO:4所示；优选地，所述模板是以质粒的形式存在。
本发明的引物和探针扩增片段对应质粒合成的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，具体为： 5’-TGGGAGCTGCAGTCCTGCTGCACTCCCCAAATACATGGGCGGTCACGTCGAGCTTCC ATAGCGTAGTAATTTACACATCGTTACTGGTAATCGTCGCGGCCACTCCGTTAAACCCCA ACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCAT-3’。
本发明的实施例中，该试剂盒还包括阴性样品；优选地，所述阴性对照样品为ddH2O。
本发明的实施例中，还包括预混液；优选地，所述预混液为2×Probe Mix。
本发明所述的禾谷镰刀菌的RT-QPCR检测的反应体系，其包括：
上游引物：5'-TCGAGCTTCCATAGCGTAG-3'；
下游引物：5'-GATCCGAGGTCAACATTCAGA-3'；
探针：5'-TAATCGTCGCGGCCACTCC-3'；
模板：如SEQ ID NO:4所示；
优选地，还包括阴性对照样品，进一步优选地，所述阴性对照样品为ddH2O。
本发明所述的检测植物禾谷镰刀菌的RT-QPCR检测方法，包括以下步骤：
步骤1.提取待测样品总DNA；
步骤2.制备反应体系，所述反应体系如上所述；
步骤3.将模板梯度稀释制成标准曲线样品及阳性对照样品；
步骤4.将待测样品、标准曲线样品、阳性对照样品、阴性对照样品使用所述引物和探针，进行荧光定量PCR扩增；
步骤5.绘制标准曲线，通过标准曲线和待测样品的Ct值计算结果；
优选地，所述步骤3中，梯度稀释制得的标准曲线样品的浓度分别为3.17×109copies/μL、 3.17×108copies/μL、3.17×107copies/μL、3.17×106copies/μL、3.17×105copies/μL、3.17×104copies/μL、 3.17×103copies/μL、3.17×102copies/μL、3.17×101copies/μL；
优选地，所述阳性对照样品的浓度为3.1×1010copies/μL。
本发明的实施例中，PCR的反应条件为：37℃污染消化2min，95℃预变性10min，1个循环；95℃15s、60℃20s、72℃40s并收集荧光信号，40个循环。
作为本发明的一个实施例，RT-QPCR反应体系为：
2×probe Mix 10μL
Primer F(10μM) 0.4μL
Primer R(10μM) 0.4μL
TaqMan Probe(10μM) 0.2μL
模板 2μL
ddH2O Up to 20μL。
本发明的技术方案中，采用PCR技术扩增禾谷镰刀菌ITS基因，利用基因重组技术将其连接到质粒载体PUC57中，构建出重组质粒PUC57-ITS，并进行相应的PCR鉴定和测序鉴定，最后经定量作为本发明方法的ITS基因标准品。
本发明中ITS基因标准品的制备方法包括：
S1.提取禾谷镰刀菌(标准菌株)基因组DNA，得到DNA样本，用作ITS基因PCR扩增的模板；
S2.ITS基因片段的PCR扩增：选取扩增序列，设计PCR引物和探针，
S3.以S1得到的DNA样本为模板进行PCR扩增；而后对所得PCR扩增产物进行纯化；
S4.将S3得到的纯化后的PCR扩增产物与质粒载体PUC57进行连接；再对连接产物进行转化，得到转化了质粒的菌落；
S5.挑取单克隆菌落接种于培养液中培养；利用质粒制备试剂盒提取阳性重组质粒 PUC57-ITS，用于菌液PCR鉴定和测序分析。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明选择包含高度保守、特异序列的禾谷镰刀菌ITS基因，构建出重组质粒PUC57-ITS，作为标准品；再进一步筛选出用于检测禾谷镰刀菌的荧光定量PCR引物和探针。本发明的禾谷镰刀菌的实时荧光定量PCR检测的引物、探针及试剂盒，具有高度特异性和良好的灵敏度，能快速、准确度地禾谷镰刀菌进行检测。
附图说明
附图1为ITS基因扩增序列NCBI数据库blast比对结果图。
附图2为本发明上下游引物序列经NCBI中Primer-Blast比对结果图。
附图3为标准品的标准曲线图。
附图4为本发明灵敏度实验结果图；其中a、b、c、d、e、f、g、h、i、j分别为不同质粒浓度的相对荧光值曲线。其中，a代表质粒浓度为3.17×109copies/μL、b代表质粒浓度为3.17×108copies/μL、c代表质粒浓度为3.17×107copies/μL、d代表质粒浓度为3.17×106copies/μL、 e代表质粒浓度为3.17×105copies/μL、f代表质粒浓度为3.17×104copies/μL、g代表质粒浓度为3.17×103copies/μL、h代表质粒浓度为3.17×102copies/μL、i代表质粒浓度为 3.17×101copies/μL、j代表质粒浓度为3.17×10-1copies/μL和阴性对照。
附图5为本发明特异性实验结果图。
附图6为本发明特异性实验凝胶成像验证图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步说明。有必要指出，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员根据上述发明内容，对本发明做出一些非本质的改进和调整进行具体实施，仍属于发明保护的范围。
实施例1
本实施例公开了本发明的ITS基因标准品的制备方法。
要建立实时荧光定量PCR方法，首先必须制备方法所需的外部标准品，标准品应包含高度保守、特异的序列，要保证反应的高特异性。ITS基因广泛存在于禾谷镰刀菌中，具有很高的保守性。本发明采用禾谷镰刀菌ITS基因作为靶序列。本实施例主要采用PCR技术扩增禾谷镰刀菌ITS基因，利用基因重组技术将其连接到质粒载体PUC57中，构建出重组质粒PUC57-ITS，并进行相应的PCR鉴定和测序鉴定，最后经定量作为待建立方法的标准品，为下一步的方法及评估奠定基础。
一、模板DNA的制备
提取禾谷镰刀菌(标准菌株)基因组DNA，用作ITS基因PCR扩增的模板。采用北京百泰克公司生产的真菌基因组提取试剂盒来提取，具体提取方法如下：
①取1ml菌悬液，加入1.5ml离心管，8000r/min离心2分钟，弃上清液；
②加入550μL 65℃预热Buffer FP1和4μL RNaseA剧烈涡旋震荡混匀菌液沉淀，混匀后放入65℃水浴1h，期间激烈涡旋震荡5-6次；
③加入130μL Buffer P2，充分混匀，12000rmp离心3min；
④小心吸取上清到一个分离柱A，注意不要吸到界面物质，12000rmp离心1min，收集下液；
⑤加入1.5倍体积的Buffer P3立刻轻柔涡旋，充分混匀；
⑥将上一步所得的混合物加入一个吸附柱AC中，12000rmp离心1min，倒掉收集管中的废液；
⑦加入700μL漂洗液WB，12000rmp离心1min，弃掉废液；
⑧加入500μL漂洗液WB，12000rmp离心1min，弃掉废液；
⑨将吸附柱AC放回空收集管中，12000rmp离心3-5min；
⑩取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加50μL洗脱缓冲液EB(在65-70℃水浴中预热)，室温放置3-5min，12000rmp离心1min收集DNA。
二、ITS基因片段的PCR扩增
1、引物的设计与合成
ITS鉴定是利用真菌ITS序列测序的方法对真菌进行种属鉴定。是一种快速获得真菌种属信息的方法。本发明利用实时荧光定量PCR检测禾谷镰刀菌ITS基因表达水平，明确ITS 在禾谷镰刀菌检测中的意义及特异性。
本发明通过对NCBI数据库中禾谷镰刀菌ITS基因全序列进行生物信息学比对分析，选取适合设计引物和探针的保守片段序列为靶目标，应用Primer express 3软件、Primer Premier 5软件以及Oligo 7软件，设计了一组实时荧光定量PCR引物和探针以及一组相关序列的外围引物。
本发明选取的扩增序列SEQ ID NO:4所示，具体为：
>HG964355.1Fusarium graminearum genomic DNA containing 18S rRNA gene,ITS1,5.8S rRNA gene,ITS2 and 28S rRNA gene
5’-CCATACCTTATGTTGCCTCGGCGGATCAGCCCGCGCCCCGTAAAAAGGGACGGCCC GCCGCAGGAAACCTAAACTCTGTTTTTAGTGGAACTTCTGAGTATAAAAAACAAATAA ATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCAAAA TGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATT GCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGGGTCATTTCAACCCTCAAGCTCAGCTTGGTGTTGGGAGCTGCAGTCCTGCTGCACTCCCCAAATACATGGGCGGTCACGTC GAGCTTCCATAGCGTAGTAATTTACACATCGTTACTGGTAATCGTCGCGGCCACTCCGT TAAACCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAA GCAT-3’。
此序列通过对NCBI数据库blast结果显示见图1。
图1为NCBI数据库blast比对结果。
由图1可知：此序列对禾谷镰刀菌具有特异性。
该外围引物序列SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示，具体为：
上游引物：Fusarium graminearum-52F 5'-GGCCCGCCGCAGGAAACCTAAA-3'
下游引物：Fusarium graminearum-442R 5'-TGATCCGAGGTCAACATTCAG-3'
扩增片段大小为：391bp。
2、PCR反应体系和反应条件
以DNA为模板，以上述外围引物Fusarium graminearum-52F/Fusariumgraminearum-442R 为扩增引物，采用下述体系和反应条件进行PCR扩增。
PCR体系：
Figure RE-GDA0002553999150000061
其中引物采用Fusarium graminearum-52F/Fusarium graminearum-442R，Taq酶采用北京百泰克Power Taq Plus DNA Polymerse，PCR扩增仪为苏州百源基因技术有限公司ASA-4800 PCR仪。
扩增程序/反应条件：
94℃预变性5min；94℃30s、50℃30s、72℃1min，30个循环；72℃10min。取5μL扩增产物进行1％琼脂糖电泳，检测PCR产物大小，然后采用上海生工公司生产的DNA凝胶回收试剂盒纯化回收剩余的PCR扩增产物。
三、重组质粒PUC57-ITS的构建和转化
1、连接反应：将上述纯化得到的PCR扩增产物与PUC57(武汉金开瑞生物工程有限公司)进行连接，采用如下连接体系进行配制：
Figure RE-GDA0002553999150000071
配制完成后置于16℃进行过夜连接反应。
2、PUC57-ITS质粒的转化以及PCR鉴定
①从-70℃的超低温冰箱中取出冻存的DH5α感受态细胞，置于冰盒上使其自然解冻；
②取连接产物10μL加入100μL的DH5α感受态细胞中；
③42℃水浴中热休克90s，热休克后立即置冰上冷却30min；
④向1.5ml EP管中加入预冷的800μL的LB液体培养基(不含氨苄青霉素)混匀后，37℃ 140rpm轻摇培养1h；
⑤将上述培养液8000rpm离心1min，弃上清，将细胞重悬吸收剩余涂布于含0.1ngAmp 的LB平板上，正面向上放置30min，待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿37℃恒温箱培养过夜；
⑥次日观察，从平板上挑取单克隆菌落于100μL LB液体培养基(含氨苄青霉素)的PCR 管中，37℃振荡培养2-3小时。吸取2μL作为模板进行PCR鉴定，剩余的菌液加入到20ml的LB液体培养基中进行扩摇；
⑦用禾谷镰刀菌特异性引物Fusarium graminearum-2F/Fusarium graminearum-2R扩增上述稀释菌液，PCR产物采用1％琼脂糖凝胶电泳，通过检测PCR产物大小鉴定阳性转化子。
引物Fusarium graminearum-2F/Fusarium graminearum-2R序列如下：
上游引物；Fusarium graminearum-2F 5'-TCGAGCTTCCATAGCGTAG-3'
下游引物；Fusarium graminearum-2R 5'-GATCCGAGGTCAACATTCAGA-3'
扩增片段大小为：94bp。
上下游引物序列经NCBI中Primer-Blast比对结果见图2
图2为上下游引物序列经NCBI中Primer-Blast比对结果。
由图2可知：此对引物对禾谷镰刀菌具有特异性。
PCR反应体系如下：
Figure RE-GDA0002553999150000072
Figure RE-GDA0002553999150000081
扩增程序/反应条件：94℃预变性5min；94℃30s、64℃30s、72℃20s，30个循环；72℃ 5min。
采用百泰克公司生产的质粒制备试剂盒提取阳性重组质粒PUC57-ITS，测定浓度和纯度，同时吸取一部分纯化质粒送至上海生物工程有限公司进行测序，确定插入片段的基因序列与目的序列一致。
四、标准品的获取和定量
1、取步骤三得到的含有重组质PUC57-ITS的大肠杆菌DH5α100μL转种于5mL的LB液体培养基，37℃200rpm过夜摇培；
2、取1ml培养过夜的菌液转种于10ml LB液体培养基，200rpm增菌培养2-3小时，然后采用北京百泰克公司生产的质粒制备试剂盒提取质粒；
3、利用北京百泰克生物科技有限公司超微量紫外可见分光光度计(ND5000)对提取的质粒进行测定，测定A260、A280，根据A260/A280判断质粒的纯度；
4、质粒PUC57-ITS浓度(拷贝数)计算
1)质粒的分子量＝2880bp×660(每对碱基的平均分子量)
(2)测得质粒浓度为100ng/μL，质粒纯度A260/A280＝1.84，因在进行实时荧光定量PCR 时，需要以“拷贝数”为单位，因此需要将单位转换成copies/μL。
质粒copies/μL＝阿伏伽德罗常数×质粒摩尔数
其中阿伏伽德罗常数＝6.02×1023copies/mol。
因此提取的质粒浓copies/μL＝100×10-9ng/μL×6.02×1023copies/mol÷(2880bp×660g/bp·mol) ＝3.17×1010Copies/μL
10μL质粒加90μL的无菌水就得到浓度为3.17×109Copies/μL的质粒，再将该质粒进行10 倍比稀释就可得到一系列浓度的质粒，并于-20℃保存备用。
实施例2
本实施例公开了本发明的荧光定量PCR试剂盒包括以下组分：
预混液2×Probe Mix(为南京诺唯赞生物科技有限公司生产，全称为AceQ U+Probe Master Mix)。
终浓度为10μM的上游引物、终浓度为10μM的下游引物；
终浓度为10μM的探针；
实施例1制备的重组质粒PUC57-ITS基因系列浓度标准品(系列浓度标准品的系列浓度为：3.17×109copies/μL、3.17×108copies/μL、3.17×107copies/μL、3.17×106copies/μL、 3.17×105copies/μL、3.17×104copies/μL、3.17×103copies/μL、3.17×102copies/μL、 3.17×101copies/μL)；
阳性对照：浓度为3.17×1010copies/μL的实施例1制备的重组质粒PUC57-ITS；
ddH2O，ddH2O作为试剂和阴性对照使用。
上游引物：Fusarium graminearum-2F 5'-TCGAGCTTCCATAGCGTAG-3'
下游引物：Fusarium graminearum-2R 5'-GATCCGAGGTCAACATTCAGA-3'
探针：Fusarium graminearum-ITS 5'-TAATCGTCGCGGCCACTCC-3'
探针5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMAR。
本发明的引物和探针扩增片段对应质粒合成的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，具体为：
5’-TGGGAGCTGCAGTCCTGCTGCACTCCCCAAATACATGGGCGGTCACGTCGAGCTTCC ATAGCGTAGTAATTTACACATCGTTACTGGTAATCGTCGCGGCCACTCCGTTAAACCCCA ACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCAT-3’。
试剂盒的使用方法如下：
1)提取待测样品总DNA；
2)将待测样品、系列浓度标准品样品、阳性对照样品、阴性对照样品使用所述引物和探针，进行荧光定量PCR扩增；
3)绘制标准曲线，通过标准曲线和待测样品的Ct值计算结果。
实施例3
本实施例公开了采用实施例2的试剂盒绘制标准品的标准曲线。
以ITS基因系列浓度标准品(系列浓度标准品的系列浓度为：3.17×109copies/μL、 3.17×108copies/μL、3.17×107copies/μL、3.17×106copies/μL、3.17×105copies/μL、3.17×104copies/μL、 3.17×103copies/μL、3.17×102copies/μL、3.17×101copies/μL)为模板，使用试剂盒中的引物和探针，进行荧光定量PCR扩增，同时设置阳性对照和阴性对照。
阳性对照：浓度为3.1×1010copies/μL的实施例1制备的重组质粒PUC57-ITS；
阴性对照：ddH2O。
PCR反应体系如下：
Figure RE-GDA0002553999150000091
Figure RE-GDA0002553999150000101
反应条件：37℃污染消化2min，95℃预变性10min，1个循环；95℃15s、60℃20s、 72℃40s并收集荧光信号，40个循环。
标准曲线的获得方法：以标准品的质粒浓度的对数为横坐标，以ct值为纵坐标得到标准曲线。标准曲线原始方程为y＝ax+b，本次标准曲线的方程为Y＝-3.2783x+38.814，标准曲线图如附图3所示。
由图3可知，标准品标准曲线光滑，相关系数高，具体为R2＝0.9856，满足实时荧光定量 PCR检测的要求。
实施例4
本实施例公开了本发明的实时荧光定量PCR试剂盒的性能实验
1、灵敏度实验
将实施例1制备得到的质粒进行10倍比稀释得到一系列浓度的质粒，选取浓度为3.17×109copies/μL、3.17×108copies/μL、3.17×107copies/μL、3.17×106copies/μL、3.17×105copies/μL、 3.17×104copies/μL、3.17×103copies/μL、3.17×102copies/μL、3.17×101copies/μL和阴性对照作为模板。反应体系如下：
Figure RE-GDA0002553999150000102
反应条件：37℃污染消化2min，95℃预变性10min，1个循环；95℃15s、60℃20s、 72℃40s并收集荧光信号，40个循环。
根据仪器所检测到的荧光信号经软件处理获得荧光曲线，观察荧光曲线的信号，结果如附图4所示：数据显示当质粒浓度达到3.17×101copies/μL时依然有荧光信号，当质粒浓度达到3.1×10-1copies/μL时没有荧光信号。因此本发明方法的灵敏度为3.17×101copies/μL。
图4为本发明灵敏度实验结果。其中，a代表质粒浓度分别为3.17×109copies/μL、b代表质粒浓度为3.17×108copies/μL、c代表质粒浓度为3.17×107copies/μL、d代表质粒浓度为 3.17×106copies/μL、e代表质粒浓度为3.17×105copies/μL、f代表质粒浓度为3.17×104copies/μL、g代表质粒浓度为3.17×103copies/μL、h代表质粒浓度为3.17×102copies/μL、i代表质粒浓度为3.17×101copies/μL、j代表质粒浓度为3.17×10- 1copies/μL和阴性对照。
2、特异性实验
为了证实本发明对禾谷镰刀菌检测的特异性，我们选取了其他常见临床感染微生物特异性实验，选取的微生物包括：尖孢镰刀菌、链格孢菌、燕麦镰刀菌、拟枝孢镰刀菌、灰葡萄孢、腐皮镰刀菌。
该特异性试验包括用上述样本的基因组DNA为模板进行的试验。上述微生物的DNA提取均采用北京百泰克生物技术有限公司DNA快速提取试剂盒，采用南京诺唯赞生物科技有限公司生产的AceQ U+Probe Master Mix实时荧光定量PCR试剂盒进行实验，反应体系如下：
Figure RE-GDA0002553999150000111
其中的引物和探针为本发明实施例2中的引物和探针。
反应条件：37℃污染消化2min，95℃预变性10min，1个循环；95℃15s、60℃20s、 72℃40s并收集荧光信号，40个循环。
根据仪器所检测到的荧光信号经软件处理获得荧光曲线，观察荧光曲线的信号，分析特异性。结果参考图5：以基因组DNA为模板仅禾谷镰刀菌检测为阳性，其余微生物均为阴性，表明本发明具有很好的特异性。检测结果如表1和附图5所示。
表1
Figure RE-GDA0002553999150000112
附图5为本发明特异性实验结果图。其中a标准扩增曲线为禾谷镰刀菌基因组，b代表未出现标准扩增曲线，其分别为尖孢镰刀菌、链格孢菌、燕麦镰刀菌、拟枝孢镰刀菌、灰葡萄孢、腐皮镰刀菌阴性对照。
3、特异性实验凝胶成像验证图
为了证实本发明方法对禾谷镰刀菌检测具有特异性，我们选取了其他常见植物感染微生物进行特异性实验。选取的微生物包括：禾谷镰刀菌、链格孢菌、燕麦镰刀菌、拟枝孢镰刀菌、灰葡萄孢、腐皮镰刀菌。
配制1％的琼脂糖胶检测禾谷镰刀菌特异性引物探针荧光定量结果。以特异性实验的扩增产物为模板。
结果如附图6所示：其中泳道1-8依次为1：空白对照(水)、2：阳性对照(禾谷镰刀菌)、阴性对照(3：链格孢菌、4：腐皮镰刀菌、5：尖孢镰孢菌、6：拟枝孢镰刀菌、7、燕麦镰刀菌、8：灰葡萄孢)、DL2000的Marker。
结果表明，采用本发明方法对禾谷镰刀菌检测具有特异性。
实施例5
本实施例公开了本发明植物禾谷镰刀菌实时荧光定量PCR的定量检测方法：
分别以待测样品DNA和实施例1制备的ITS基因系列浓度标准品(系列浓度标准品的系列浓度为：3.17×109copies/μL、3.17×108copies/μL、3.17×107copies/μL、3.17×106copies/μL、 3.17×105copies/μL、3.17×104copies/μL、3.17×103copies/μL、3.17×102copies/μL、3.17×101copies/μL) 为模板，使用试剂盒中的引物和探针，进行荧光定量PCR扩增，同时设置阳性对照和阴性对照。
PCR反应体系如下：
Figure RE-GDA0002553999150000121
反应条件：37℃污染消化2min，95℃预变性10min，1个循环；95℃15s、60℃20s、 72℃40s并收集荧光信号，40个循环。
绘制标准曲线，通过标准曲线和待测样品的Ct值进行快速定量检测。
上述实施例仅为本发明的优选实施方式之一，不应当用于限制本发明的保护范围，但凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 兰州百源基因技术有限公司
<120> 禾谷镰刀菌的RT-QPCR检测的引物、探针、试剂盒及方法
<130> 20200420
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcgagcttcc atagcgtag 19
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gatccgaggt caacattcag a 21
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
taatcgtcgc ggccactcc 19
<210> 4
<211> 470
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ccatacctta tgttgcctcg gcggatcagc ccgcgccccg taaaaaggga cggcccgccg 60
caggaaacct aaactctgtt tttagtggaa cttctgagta taaaaaacaa ataaatcaaa 120
actttcaaca acggatctct tggttctggc atcgatgaag aacgcagcaa aatgcgataa 180
gtaatgtgaa ttgcagaatt ccgtgaatca tcgaatcttt gaacgcacat tgcgcccgcc 240
agtattctgg cgggcatgcc tgttcgaggg tcatttcaac cctcaagctc agcttggtgt 300
tgggagctgc agtcctgctg cactccccaa atacatgggc ggtcacgtcg agcttccata 360
gcgtagtaat ttacacatcg ttactggtaa tcgtcgcggc cactccgtta aaccccaact 420
tctgaatgtt gacctcggat caggtaggaa tacccgctga acttaagcat 470
<210> 5
<211> 170
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tgggagctgc agtcctgctg cactccccaa atacatgggc ggtcacgtcg agcttccata 60
gcgtagtaat ttacacatcg ttactggtaa tcgtcgcggc cactccgtta aaccccaact 120
tctgaatgtt gacctcggat caggtaggaa tacccgctga acttaagcat 170
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ggcccgccgc aggaaaccta aa 22
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tgatccgagg tcaacattca g 21

Claims (10)

1.禾谷镰刀菌的RT-QPCR检测的引物，其特征在于，所述引物包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，
上游引物：5'-TCGAGCTTCCATAGCGTAG-3'；
下游引物：5'-GATCCGAGGTCAACATTCAGA-3'。
2.禾谷镰刀菌的RT-QPCR检测的探针，其特征在于，所述探针的核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示：5'-TAATCGTCGCGGCCACTCC-3'；优选地，所述探针5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为TAMAR。
3.植物植物禾谷镰刀菌的RT-QPCR检测的引物及探针组合，其特征在于，包括：
上游引物：5'-TCGAGCTTCCATAGCGTAG-3'；
下游引物：5'-GATCCGAGGTCAACATTCAGA-3'；
探针：5'-TAATCGTCGCGGCCACTCC-3'。
4.一种禾谷镰刀菌的RT-QPCR检测的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物、及权利要求2所述的探针。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括QPCR模板，所述QPCR模板如SEQID NO:4所示；优选地，所述模板是以质粒的形式存在。
6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，还包括阴性样品；优选地，所述阴性对照样品为ddH2O。
7.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，还包括预混液；优选地，所述预混液为2×Probe Mix。
8.一种禾谷镰刀菌的RT-QPCR检测的反应体系，其特征在于，所述反应体系包括：
上游引物：5'-TCGAGCTTCCATAGCGTAG-3'；
下游引物：5'-GATCCGAGGTCAACATTCAGA-3'；
探针：5'-TAATCGTCGCGGCCACTCC-3'；
模板：如SEQ ID NO:4所示；
优选地，还包括阴性对照样品，进一步优选地，所述阴性对照样品为ddH2O。
9.一种检测植物禾谷镰刀菌的RT-QPCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1.提取待测样品总DNA；
步骤2.制备反应体系，所述反应体系如权利要求8所述；
步骤3.将模板梯度稀释制成标准曲线样品及阳性对照样品；
步骤4.将待测样品、标准曲线样品、阳性对照样品、阴性对照样品使用所述引物和探针，进行荧光定量PCR扩增；
步骤5.绘制标准曲线，通过标准曲线和待测样品的Ct值计算结果；
优选地，所述步骤3中，梯度稀释制得的标准曲线样品的浓度分别为3.17×109copies/μL、3.17×108copies/μL、3.17×107copies/μL、3.17×106copies/μL、3.17×105copies/μL、3.17×104copies/μL、3.17×103copies/μL、3.17×102copies/μL、3.17×101copies/μL；
优选地，所述阳性对照样品的浓度为3.17×1010copies/μL。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，PCR的反应条件为：37℃污染消化2min，95℃预变性10min，1个循环；95℃15s、60℃20s、72℃40s并收集荧光信号，40个循环。
CN202010370372.9A 2020-05-06 2020-05-06 禾谷镰刀菌的rt-qpcr检测的引物、探针、试剂盒及方法 Pending CN111471794A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010370372.9A CN111471794A (zh) 2020-05-06 2020-05-06 禾谷镰刀菌的rt-qpcr检测的引物、探针、试剂盒及方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010370372.9A CN111471794A (zh) 2020-05-06 2020-05-06 禾谷镰刀菌的rt-qpcr检测的引物、探针、试剂盒及方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111471794A true CN111471794A (zh) 2020-07-31

Family

ID=71757229

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010370372.9A Pending CN111471794A (zh) 2020-05-06 2020-05-06 禾谷镰刀菌的rt-qpcr检测的引物、探针、试剂盒及方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111471794A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112280888A (zh) * 2020-11-10 2021-01-29 上海市农业科学院 一种快速鉴定禾谷镰刀菌产毒基因型的试剂盒和方法
CN113930543A (zh) * 2021-11-29 2022-01-14 拱北海关技术中心 检测食品中禾谷镰刀菌类产毒真菌的实时荧光pcr试剂盒
CN116024365A (zh) * 2022-08-25 2023-04-28 上海市农业科学院 基于pcr-rflp快速鉴定nx型禾谷镰刀菌的引物及方法
CN116694804A (zh) * 2023-06-16 2023-09-05 浙江大学 用于检测小麦禾谷镰孢菌的lamp引物探针组、试剂盒及其检测方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101974650A (zh) * 2010-11-30 2011-02-16 中国农业科学院植物保护研究所 一种检测尖孢镰刀菌的pcr方法及试剂盒
CN102517385A (zh) * 2011-12-15 2012-06-27 江苏省农业科学院 通过荧光时实定量pcr建立转基因小麦生长期内根际土壤中镰刀菌拷贝数的方法
CN108277296A (zh) * 2018-04-17 2018-07-13 中国农业科学院植物保护研究所 一种引起大豆根腐病的镰孢菌属菌种的鉴定与区分方法
CN109652586A (zh) * 2019-02-19 2019-04-19 西安博睿康宁生物科技有限公司 一种鉴别四种镰刀菌的方法
CN110616157A (zh) * 2019-11-08 2019-12-27 山东省花生研究所 一株尖孢镰孢菌及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101974650A (zh) * 2010-11-30 2011-02-16 中国农业科学院植物保护研究所 一种检测尖孢镰刀菌的pcr方法及试剂盒
CN102517385A (zh) * 2011-12-15 2012-06-27 江苏省农业科学院 通过荧光时实定量pcr建立转基因小麦生长期内根际土壤中镰刀菌拷贝数的方法
CN108277296A (zh) * 2018-04-17 2018-07-13 中国农业科学院植物保护研究所 一种引起大豆根腐病的镰孢菌属菌种的鉴定与区分方法
CN109652586A (zh) * 2019-02-19 2019-04-19 西安博睿康宁生物科技有限公司 一种鉴别四种镰刀菌的方法
CN110616157A (zh) * 2019-11-08 2019-12-27 山东省花生研究所 一株尖孢镰孢菌及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
葛波;杨洋;张申萍;王晓鸣;陈国康;段灿星;: "禾谷镰孢荧光定量检测体系的建立及其在玉米苗枯病上的应用" *
葛波;王宝宝;郭成;孙素丽;陈国康;王晓鸣;朱振东;段灿星;: "玉米根际土壤中镰孢菌的构成与定量分析" *
魏巍 等: "土壤镰孢菌Real-Time QPCR定量方法的" *
魏巍;许艳丽;刘金波;李春杰;韩晓增;李文滨;李淑娴;: "土壤镰孢菌Real-Time QPCR定量方法的建立及应用" *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112280888A (zh) * 2020-11-10 2021-01-29 上海市农业科学院 一种快速鉴定禾谷镰刀菌产毒基因型的试剂盒和方法
CN113930543A (zh) * 2021-11-29 2022-01-14 拱北海关技术中心 检测食品中禾谷镰刀菌类产毒真菌的实时荧光pcr试剂盒
CN116024365A (zh) * 2022-08-25 2023-04-28 上海市农业科学院 基于pcr-rflp快速鉴定nx型禾谷镰刀菌的引物及方法
CN116694804A (zh) * 2023-06-16 2023-09-05 浙江大学 用于检测小麦禾谷镰孢菌的lamp引物探针组、试剂盒及其检测方法
CN116694804B (zh) * 2023-06-16 2024-02-02 浙江大学 用于检测小麦禾谷镰孢菌的lamp引物探针组、试剂盒及其检测方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111471794A (zh) 禾谷镰刀菌的rt-qpcr检测的引物、探针、试剂盒及方法
CN103642910B (zh) 定量检测肺炎克雷伯氏菌的引物和探针及其应用
CN108841985A (zh) 一种用于检测腐皮镰刀菌的核苷酸序列组、试剂盒及方法
CN108179209A (zh) 用于检测奇异变形杆菌的特异性引物和探针以及实时荧光定量pcr试剂盒
WO2015196778A1 (zh) 对普罗威登斯菌o3，o4，o8，o12，o13和o20特异的核苷酸及其应用
CN113151522A (zh) 基于lfd-rpa技术的水稻细菌性条斑病菌检测试剂盒及其引物探针组合物与应用
CN108841984A (zh) 一种用于检测尖孢镰刀菌的核苷酸序列组、试剂盒及方法
CN111471795A (zh) 燕麦镰刀菌的rt-qpcr检测的引物、探针、试剂盒及方法
CN111549165A (zh) 腐皮镰刀菌的rt-qpcr检测的引物、探针、试剂盒及方法
CN111187756A (zh) 一种槟榔黄化病相关病毒及其检测方法
CN113308561B (zh) 用于检测猪肺炎支原体的引物组及其应用、实时荧光定量pcr检测方法
CN103667271B (zh) 定量检测白假丝酵母菌的引物和探针及其应用
CN109439801A (zh) 一种蜜蜂以色列急性麻痹病毒实时荧光rt-pcr检测试剂盒及其检测方法
WO2015180484A1 (zh) 对普罗威登斯菌031，041，042，043和050特异的核苷酸及其应用
CN111471793A (zh) 拟枝孢镰孢菌的rt-qpcr检测的引物、探针、试剂盒及方法
CN114574628B (zh) 一种检测试剂盒及其应用
CN111607657A (zh) 尖孢镰刀菌的rt-qpcr检测的引物、探针、试剂盒及方法
CN114622041A (zh) 一种用于检测犬细环病毒的引物和TaqMan探针及其应用
CN111996274B (zh) 一种高通量测序用于植物病原真菌的大规模定量检测方法
CN108179210A (zh) 用于检测金黄色葡萄球菌的特异性引物和探针以及实时荧光定量pcr试剂盒
CN111471792A (zh) 灰葡萄孢的rt-qpcr检测的引物、探针、试剂盒及方法
CN112646923A (zh) 快速鉴定及定量酿酒酵母的引物、试剂盒、方法
CN112695120A (zh) 用于酿酒酵母的快速鉴定及定量的引物、试剂盒、方法
CN108660228A (zh) 用于检测福氏志贺氏菌的特异性引物和探针以及实时荧光定量pcr试剂盒
CN112608985A (zh) 快速鉴定及定量粟酒裂殖酵母的引物和方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination