CN116694804A - 用于检测小麦禾谷镰孢菌的lamp引物探针组、试剂盒及其检测方法 - Google Patents
用于检测小麦禾谷镰孢菌的lamp引物探针组、试剂盒及其检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于检测小麦禾谷镰孢菌的LAMP引物探针组、试剂盒及其检测方法。该LAMP引物探针组包括核苷酸序列为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6的引物和探针组合。本发明提供的方法可以快速提取禾谷镰孢菌的DNA，同时将LAMP和分子信标技术应用于禾谷镰孢菌的分子检测，检测方法简便易行、实用性好、灵敏度高、特异性强、准确性高，为小麦赤霉病的早期诊断、病害防治提供新方法。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，涉及一种禾谷镰孢菌核酸快速提取方法，特别涉及一种用于检测小麦禾谷镰孢菌的LAMP引物探针组、试剂盒及其检测方法。
背景技术
小麦赤霉病(Fusariumheadblight,FHB)是由禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)等多种镰孢菌引起的一种真菌病害，俗称小麦“癌症”，在流行年份造成小麦大面积减产并严重降低小麦籽粒质量。赤霉病主要侵染开花期的小麦穗部，在灌浆期迅速扩展繁殖，并在籽粒中产生多种毒素，包括脱氧雪腐镰孢菌烯醇、雪腐镰孢菌烯醇和玉米赤霉烯酮等，严重威胁人畜健康。禾谷镰孢菌种属于真菌，细胞壁坚韧，裂解困难，若菌株分散不充分，进一步减弱了菌壁裂解，从而影响基因组核酸的释放。目前多数检测试剂配套的DNA提取方法，存在提取效率低、提取时间长、操作繁琐等问题。全自动核酸提取仪的应用虽然能够简化操作的步骤，但是依然存在提取效率不高、耗材昂贵等缺陷。面对禾谷镰孢菌种核酸提取的难点，急需开发一种能快速进行核酸提取的方法，具备成本低廉、操作简便和快速的特点，在科学研究和产业应用上都具有重大的意义。
传统的植物病原检测技术，包括形态观察、生化鉴定、基于酶联免疫吸附的免疫检测法，以及聚合酶链式反应法等不仅耗时、费力，且对检测人员的专业性要求较高，同时在检测方法的准确性、灵敏度及便携性上难以满足现代农业对病原检测的“快”、“准”及“多目标”的基本要求。并且，目前的DNA扩增技术多依赖精密温度循环仪器，对实验条件与操作技能的要求比较高，在基层单位或现场快速检测难以发挥作用。随着分子生物学的不断发展，不依赖温度循环系统的等温扩增技术应运而生。等温扩增技术在单一温度条件下进行，对仪器依赖性低，反应快速，非常适合快速检测。
环介导等温扩增技术(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是由Notomi等2000年发明的一种新的恒温核酸扩增方法，相较于传统的核酸扩增方法，其具有灵敏度高、操作简单和快速高效及成本低等优点。LAMP检测方式有SYBR荧光染料、焦磷酸镁沉淀、pH变化显色以及分子信标探针等。SYBR荧光染料的缺点在于污染、序列相似性和引物二聚体引起的扩增假阳性，因为SYBR染料可与任何的双链DNA发生结合，因此也会与非特异性的双链DNA序列发生结合，导致特异性不高。焦磷酸镁沉淀和pH变化显色，可肉眼观察结果，容易发生误读，依赖于浊度仪或者分光光度计等的检测，存在灵敏度不高的缺点。分子信标(Molecularbeacon)属于探针的一种，是具有荧光标记的寡核苷酸链。一般有三部分组成：①环状区：由15～30个可以与靶分子特异结合的核苷酸组成；②茎干区：一般由5～8个可发生可逆性解离的碱基对组成；③荧光基团和淬灭基团：分子信标的两个末端分别标记荧光基团和淬灭基团。在没有靶分子的时候，分子信标为发夹状，荧光基团和淬灭基团靠得很近，荧光被淬灭。在与靶分子配对后，分子信标将成链状，使得荧光基团与淬灭基团分开，当荧光基团被激发时，因淬灭作用被解除，发出激发光子。因此分子信标探针具有极高的特异性和灵敏度，已广泛应用于病毒、细菌、支原体等的分子检测中。LAMP与分子信标技术相结合应用于小麦赤霉病病原禾谷镰孢菌的检测方面，目前未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测小麦禾谷镰孢菌的LAMP引物探针组，该LAMP引物探针组可以实现禾谷镰孢菌核酸的快速检测。
本发明的另一目的在于提供一种小麦禾谷镰孢菌的快速检测方法，该方法是一种基于LAMP与分子信标相结合的恒温核酸扩增方法，相较于传统的核酸扩增方法，其具有灵敏度高、特异性强、操作简单和快速高效及成本低等优点。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种用于检测小麦禾谷镰孢菌的LAMP引物探针组，该LAMP引物探针组包括：
正向外引物F3：5’-GGATTACGGTTTTGGGGTGA-3’，SEQ ID NO.1，反向外引物B3：5’-TAATCTGGTGCCGGAAGAGG-3’，SEQ ID NO.2，正向内引物FIP：
5’-CGCCAACACATCGATGTCGTCC-GAGCAAATCCGTCAGCAGT-3’，SEQ ID NO.3，
反向内引物BIP：
5’-TTACGCTTATGCACAGCTGGGA-TTCGGGTCAGGCTGTTCA-3’，SEQ ID NO.4，
环引物LF：5’-CAGCTCCAAAGGGCAAATAAG-3’，SEQ ID NO.5，
分子信标探针LR-probe：
5’-FAM-cggagcTGTTGCCACGTTTATCAGATTGGTTCAgctccg-BHQ-1-3’，SEQ ID NO.6。所述分子信标探针LR-probe的5’端标记有FAM，3’端标记有BHQ-1。
一种本发明所述的LAMP引物探针组在检测小麦禾谷镰孢菌中的应用。
一种本发明所述的LAMP引物探针组在制备小麦禾谷镰孢菌的LAMP检测试剂中的应用。
一种检测小麦禾谷镰孢菌的LAMP试剂盒，含有本发明所述的LAMP引物探针组。
作为优选，该LAMP试剂盒还包括缓冲液、链置换DNA聚合酶、镁离子、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)。反应体系的体积为40μL。
进一步的，所述链置换DNA聚合酶为Bst聚合酶，所述缓冲液为Bst聚合酶缓冲液。进一步的，所述Bst聚合酶缓冲液含有：300mMTris-HCl，100mM(NH4)2SO4，150mMKCl，20mMMgSO4，质量百分比1％TritonX-100；在25℃环境下，Bst聚合酶缓冲液的pH值为8.5。
一种小麦禾谷镰孢菌的快速检测方法，该方法包括以下步骤：
S1、样品DNA的快速提取；
S2、以S1提取的DNA作为待检测DNA模板，采用权利要求1所述的LAMP引物探针组，进行LAMP恒温扩增反应；
S3、根据扩增结果判断：通过实时荧光定量法分析LAMP扩增产物，检测出荧光表示检测为阳性，存在小麦禾谷镰孢菌，未有荧光表示检测为阴性，不存在小麦禾谷镰孢菌。
作为优选，所述扩增反应体系中，外引物F3、B3的浓度分别在0.01～1μΜ的范围，优选为0.2μΜ；内引物FIP、BIP的浓度分别在0.1～2μΜ的范围，优选为1.6μΜ；环引物LF浓度在0.01～2μΜ的范围，优选为1.0μΜ；分子信标探针LR-probe浓度在0.01～1μΜ的范围，优选为0.2μΜ。
作为优选，S2中所述LAMP扩增反应采用的LAMP反应体系(40μL)中包含：10×Bst聚合酶缓冲液，4μL
Bst聚合酶，1μL
25mMMgSO4，12μL
10mMdNTP，3μL；
100μM正向外引物F3，0.08μL
100μM反向外引物B3，0.08μL
100μM正向内引物FIP，0.64μL
100μM反向内引物BIP，0.64μL
100μM环引物LF，0.4μL
100μM分子信标探针LR-probe，0.08μL
4M甜菜碱，2μL
DNA模板，5μLddH2O，补齐至40μL。
作为优选，S2中所述LAMP扩增反应在实时荧光定量PCR仪上进行，扩增反应温度为60～65℃，扩增反应时间为20～60分钟；优选地，扩增反应温度为63℃，反应时间为30分钟。
作为优选，S1、样品DNA的快速提取的具体步骤是：
(1)取禾谷镰孢菌菌株置于2mL离心管中，
(2)向离心管中加入1mL裂解液，然后混匀，
(3)将离心管放入95℃水浴锅中水浴10分钟，取出在旋涡混合器上振荡10秒，(4)向离心管中加入30μL的磁珠，上下颠倒混匀2分钟，
(5)将离心管放入磁力架上，待磁珠吸附在底部后，弃去全部液体，
(6)在离心管中加入清洗液，震荡混匀30秒，然后弃去全部液体，
(7)重复步骤(6)一次，
(8)在离心管中加入50μL洗脱液，震荡混匀30秒，然后用移液器将液体转移至新的1.5mL离心管中，即为提取的核酸。
本发明所述的样品DNA的快速提取方法的优点在于：时间短(仅需15分钟左右)；无需液氮冷冻或者玻璃珠研磨，以及其他有毒有害物质(巯基乙醇，苯酚、氯仿、异戊醇等，危害操作人员健康)；提取得率高(优于大部分方法)。
作为优选，S1中采用的快速提取试剂包括裂解液、清洗液、洗脱液和磁珠，其中：
裂解液含有：三羟甲基氨基甲烷(Tris)30mM，乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)15mM，异硫氰酸胍4.0～5.0M(最优值4.2M)，TritonX-1001％，用盐酸将pH调至7.2；
清洗液含有：2MNaCl，15mMTris-HCl，pH在7.2～8.5之间，优选为pH＝7.5的溶液；
洗脱液是TE缓冲液或超纯水，TE缓冲液含有：10mMTris-HCl，1mMEDTA，pH＝8.0，优选为TE缓冲液；
磁珠为羟基磁珠，磁珠表层材料为超顺磁二氧化硅，粒径范围100～500nm，优选为300nm。
相比于现有禾谷镰孢菌的分子检测技术，本发明的有益效果为：
1、本发明首次将LAMP与分子信标技术结合应用到禾谷镰孢菌的分子检测，特异性强、灵敏度高、实用性好、对仪器设备要求较低，为小麦赤霉病的诊断、病害防治和农药减量使用提供新方法；
2、LAMP引物探针基于禾谷镰孢菌保守序列设计，结合分子信标的荧光检测技术，具有特异性高、检测准确率高的特点，并具有较高的检测灵敏度；
3、基于本发明所述用于检测小麦禾谷镰孢菌的LAMP引物探针组的检测方法，可实现在30分钟内完成对禾谷镰孢菌的恒温扩增，无需循环变温等操作，解决了现有常规技术存在检测方法所需时间较长、对仪器设备依懒性高、检测结果假阳性高的现象。
附图说明
图1是不同方法提取的核酸进行PCR结果；
图2是禾谷镰孢菌LAMP引物探针扩增结果；
图3是禾谷镰孢菌LAMP引物探针扩增特异性检测结果；
图4是禾谷镰孢菌LAMP引物探针扩增灵敏度检测结果。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实施例仅是为了解释本发明，但不构成对本发明的限制。在以下实施例中所用到的试验样本及试验过程包括以下内容(如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到)。
实施例中使用的生物材料及试剂说明：
禾谷镰孢菌菌株(编号BNCC189973)，购自北纳生物。
凯杰DNA提取试剂盒(货号：28304)。
实施例1：不同方法对于禾谷镰孢菌DNA的提取效果
一种禾谷镰孢菌样品DNA快速提取方法(本发明方法)具体步骤如下：
(1)取禾谷镰孢菌菌株置于2mL离心管中，
(2)向离心管中加入1mL裂解液，然后混匀，
(3)将离心管放入95℃水浴锅中水浴10分钟，取出在旋涡混合器上振荡10秒，(4)向离心管中加入30μL的磁珠，上下颠倒混匀2分钟，
(5)将离心管放入磁力架上，待磁珠吸附在底部后，弃去全部液体，
(6)在离心管中加入清洗液，震荡混匀30秒，然后弃去全部液体，
(7)重复步骤(6)一次，
(8)在离心管中加入50μL洗脱液，震荡混匀30秒，然后用移液器将液体转移至新的1.5mL离心管中，即为提取的核酸。
上述方法中采用的快速提取试剂裂解液、清洗液、洗脱液和磁珠，具体是：
裂解液含有：三羟甲基氨基甲烷(Tris)30mM，乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)15mM，异硫氰酸胍4.2M，TritonX-1001％，用盐酸将pH调至7.2；
清洗液是含有：2MNaCl，15mMTris-HCl，pH＝7.5的溶液；
洗脱液是TE缓冲液，含有：10mMTris-HCl，1mMEDTA，pH＝8.0；
磁珠为羟基磁珠，磁珠表层材料为超顺磁二氧化硅，粒径为300nm。
选取等量的禾谷镰孢菌菌株，按照表1中所示不同的方法提取核酸以比较各方法之间的区别，具体提取方法参考文献以及产品说明书进行。不同方法提取核酸后，测定核酸浓度，结果见表1。
表1不同核酸提取方法的比较
上述不同方法提取禾谷镰孢菌的核酸后，使用禾谷镰孢菌PCR引物和探针进行实时荧光定量PCR扩增。
引物序列：
正向F:5’-GCCGAAGATGGTCAAACAGT-3’，SEQ ID NO.7，
反向R:5’-AGCGTAATTCTCGCCAACAC-3’，SEQ ID NO.8，
探针P:5’-FAM-ATTACGGTTTTGGGGTGATGAGCAA-BHQ-1-3’，SEQ ID NO.9。
PCR扩增体系为：
扩增条件：
95℃，30秒；
PCR检测结果见图1。
如表1所示，在不同方法提取的核酸浓度测定结果中，本发明方法的核酸浓度和质量优于其他方法。如图1所示，在不同方法提取的核酸进行PCR检测结果中，本发明方法的荧光曲线Ct值小于其他方法，扩增较快，效果更好，无模板对照(NTC)未见扩增。
综上所述，本发明的样品DNA快速提取方法操作时间短，提取的核酸浓度高，优于其他方法。
实施例2：禾谷镰孢菌LAMP引物探针的筛选
以禾谷镰孢菌的CYP51c基因为靶标，根据LAMP引物设计原则，设计LAMP引物和分子信标探针并进行筛选，得到扩增效率高、灵敏度和特异性高的引物对。筛选得到的一组引物探针，序列如下：
正向外引物F3：5’-GGATTACGGTTTTGGGGTGA-3’，SEQ ID NO.1，
反向外引物B3：5’-TAATCTGGTGCCGGAAGAGG-3’，SEQ ID NO.2，
正向内引物FIP：
5’-CGCCAACACATCGATGTCGTCC-GAGCAAATCCGTCAGCAGT-3’，SEQ ID NO.3，
反向内引物BIP：
5’-TTACGCTTATGCACAGCTGGGA-TTCGGGTCAGGCTGTTCA-3’，SEQ ID NO.4，
环引物LF：5’-CAGCTCCAAAGGGCAAATAAG-3’，SEQ ID NO.5，
分子信标探针LR-probe：
5’-FAM-cggagcTGTTGCCACGTTTATCAGATTGGTTCAgctccg-BHQ-1-3’，SEQ ID NO.6。所述分子信标探针LR-probe的5’端标记有FAM，3’端标记有BHQ-1。
一种基于上述LAMP引物探针组的小麦禾谷镰孢菌的快速检测方法，具体步骤如下：
(1)快速提取样品中的DNA：采用实施例1的方法提取样品中的DNA；
(2)以步骤(1)提取的DNA作为待检测DNA模板，采用上述LAMP引物探针组进行LAMP扩增反应。
40μL的LAMP反应体系中加入：
10×Bst聚合酶缓冲液，4μL
Bst聚合酶，1μL
25mMMgSO4，12μL
10mMdNTP，3μL；
100μM正向外引物F3，0.08μL100μM反向外引物B3，0.08μL100μM正向内引物FIP，0.64μL100μM反向内引物BIP，0.64μL100μM环引物LF，0.4μL100μM分子信标探针LR-probe，0.08μL
4M甜菜碱，2μL
DNA模板，5μL。
ddH2O，补齐至40μL。
扩增反应在实时荧光定量PCR仪上进行，扩增反应温度为63℃，反应时间为30分钟。LAMP扩增结果见图2。
如图2所示，红色荧光曲线为本发明方法的LAMP引物探针组扩增结果，在不到10分钟左右即可检测出禾谷镰孢菌的核酸，黑色荧光曲线为无模板对照(NTC)，结果正常。
实施例3：禾谷镰孢菌LAMP引物探针组的特异性检测
参考实施例2中用于检测小麦赤霉病病原禾谷镰孢菌的LAMP引物探针组和检测方法，其中样品分别为禾谷镰孢菌、假禾谷镰孢菌、尖孢镰孢菌、茄腐镰孢菌、串珠镰孢菌、藤仓赤霉菌、雪腐镰刀菌、燕麦镰孢菌。
LAMP扩增结果如图3所示，1至9号荧光曲线分别为禾谷镰孢菌、假禾谷镰孢菌、尖孢镰孢菌、茄腐镰孢菌、串珠镰孢菌、藤仓赤霉菌、雪腐镰刀菌、燕麦镰孢菌和NTC，仅禾谷镰孢菌作为核酸模板才能检测出荧光曲线，而其他样品虽然属于禾谷镰孢菌亲缘性较近的菌，但未有荧光曲线；这表明本发明方法提供的LAMP引物探针组的特异性高。
实施例4：禾谷镰孢菌LAMP引物探针组的灵敏度检测
参考实施例2中用于检测小麦赤霉病病原禾谷镰孢菌的LAMP引物探针组和检测方法，其中禾谷镰孢菌的核酸样本，根据核酸浓度和分子量计算拷贝数，然后按浓度梯度依次稀释为10000拷贝/mL、5000拷贝/mL、1000拷贝/mL、500拷贝/mL、100拷贝/mL、50拷贝/mL、10拷贝/mL。
如图4所示，1至8号荧光曲线分别为禾谷镰孢菌的核酸浓度10000拷贝/mL、5000拷贝/mL、1000拷贝/mL、500拷贝/mL、100拷贝/mL、50拷贝/mL、10拷贝/mL和NTC的LAMP检测结果。
上述检测结果图表明，小麦赤霉病病原禾谷镰孢菌DNA的检出下限为100拷贝/mL。这表明本发明申请的LAMP引物探针组具有较高的检测灵敏度。
综上所述，由实施例1-4可见，本发明提供的小麦赤霉病病原禾谷镰孢菌核酸快速提取方法，具有操作时间短，检测效率高的特点，并首次将LAMP和分子信标技术结合应用到禾谷镰孢菌的分子检测，可在63℃下和30分钟内完成对禾谷镰孢菌的恒温扩增，具备特异性强、灵敏度高、实用性好、对仪器设备要求较低的特点，为小麦赤霉病的快速诊断、病害防治等提供新方法和技术支持。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其它实施例的不同之处，各个实施例之间相同或相似部分互相参见即可。
以上对本发明所提供的用于检测小麦禾谷镰孢菌的LAMP引物探针组、试剂盒及其检测方法进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.一种用于检测小麦禾谷镰孢菌的LAMP引物探针组，其特征在于该LAMP引物探针组包括：
正向外引物F3：5’-GGATTACGGTTTTGGGGTGA-3’，SEQ ID NO.1，
反向外引物B3：5’-TAATCTGGTGCCGGAAGAGG-3’，SEQ ID NO.2，
正向内引物FIP：
5’-CGCCAACACATCGATGTCGTCC-GAGCAAATCCGTCAGCAGT-3’，SEQ ID NO.3，
反向内引物BIP：
5’-TTACGCTTATGCACAGCTGGGA-TTCGGGTCAGGCTGTTCA-3’，SEQ ID NO.4，
环引物LF：5’-CAGCTCCAAAGGGCAAATAAG-3’，SEQ ID NO.5，
分子信标探针LR-probe：
5’-FAM-cggagcTGTTGCCACGTTTATCAGATTGGTTCAgctccg-BHQ-1-3’，SEQ ID NO.6。
2.一种权利要求1所述的LAMP引物探针组在检测小麦禾谷镰孢菌中的应用。
3.一种权利要求1所述的LAMP引物探针组在制备小麦禾谷镰孢菌的LAMP检测试剂中的应用。
4.一种检测小麦禾谷镰孢菌的LAMP试剂盒，其特征在于含有权利要求1所述的LAMP引物探针组。
5.根据权利要求4所述的LAMP试剂盒，其特征在于：该LAMP试剂盒还包括缓冲液、链置换DNA聚合酶、镁离子和脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)。
6.一种小麦禾谷镰孢菌的快速检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
S1、样品DNA的快速提取；
S2、以S1提取的DNA作为待检测DNA模板，采用权利要求1所述的LAMP引物探针组，进行LAMP恒温扩增反应；
S3、根据扩增结果判断：通过实时荧光定量法分析LAMP扩增产物，检测出荧光表示检测为阳性，存在小麦禾谷镰孢菌，未有荧光表示检测为阴性，不存在小麦禾谷镰孢菌。
7.根据权利要求6所述的快速检测方法，其特征在于：
所述扩增反应体系中，外引物F3、B3的浓度分别在0.01～1μΜ的范围，内引物FIP、BIP的浓度分别在0.1～2μΜ的范围，环引物LF浓度在0.01～2μΜ的范围，分子信标探针LR-probe浓度在0.01～1μΜ的范围。
8.根据权利要求6所述的快速检测方法，其特征在于：S2中所述LAMP扩增反应在实时荧光定量PCR仪上进行，扩增反应温度为60～65℃，扩增反应时间为20～60分钟。
9.根据权利要求6所述的快速检测方法，其特征在于S1、样品DNA的快速提取的具体步骤是：
(1)取禾谷镰孢菌菌株置于2mL离心管中，
(2)向离心管中加入1mL裂解液，然后混匀，
(3)将离心管放入95℃水浴锅中水浴10分钟，取出在旋涡混合器上振荡10秒，(4)向离心管中加入30μL的磁珠，上下颠倒混匀2分钟，
(5)将离心管放入磁力架上，待磁珠吸附在底部后，弃去全部液体，
(6)在离心管中加入清洗液，震荡混匀30秒，然后弃去全部液体，
(7)重复步骤(6)一次，
(8)在离心管中加入50μL洗脱液，震荡混匀30秒，然后用移液器将液体转移至新的1.5mL离心管中，即为提取的核酸。
10.根据权利要求6或9所述的快速检测方法，其特征在于S1中采用的快速提取试剂包括裂解液、清洗液、洗脱液和磁珠，其中：
裂解液含有：三羟甲基氨基甲烷(Tris)30mM，乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)15mM，异硫氰酸胍4.0～5.0M，Triton X-1001％，用盐酸将pH调至7.2；
清洗液含有：2M NaCl，15mM Tris-HCl，pH在7.2～8.5之间；
洗脱液是TE缓冲液或超纯水，TE缓冲液含有：10mMTris-HCl，1mM EDTA，pH＝8.0；
磁珠为羟基磁珠，磁珠表层材料为超顺磁二氧化硅，粒径范围100～500nm。
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