CN116004870A - 一种用于检测和鉴别布鲁氏杆菌的试剂盒与检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于检测和鉴别布鲁氏杆菌的试剂盒与检测方法。所述试剂盒包括用于检测和鉴别布鲁氏杆菌的crRNA，序列如SEQ ID NO.1～3所示；或者用于检测和鉴别布鲁氏杆菌的crDNA，序列如SEQ ID NO.4～6所示。本发明提供的用于检测和鉴别布鲁氏杆菌的试剂盒可以同时区分待测样品是牛种布鲁氏杆菌菌株、羊种布鲁氏杆菌菌株和猪种布鲁氏杆菌菌株，有效解决了现有技术中布鲁氏杆菌菌株生物种分别鉴定区分的问题，为后续布鲁氏菌病的治疗提供了明确的指导。且操作步骤简单，通过荧光颜色即可肉眼分辨出布鲁氏杆菌菌株生物种，判断布鲁氏菌病的感染来源，为布鲁氏菌病的净化提供全新的思路和方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于检测和鉴别布鲁氏杆菌的试剂盒与检测方法，属于生物检测技术领域。
背景技术
布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏杆菌(Brucella)感染引起的疾病，是一种人畜共患性全身传染病，简称"布病"，又有地中海弛张热、马耳他热、波浪热等称谓。布鲁氏杆菌可通过皮肤黏膜、呼吸道、消化道等途径侵入机体，引起发热、流产、不育、虚弱、关节痛等临床症状。布鲁氏杆菌宿主广泛、传染性强，不同种布鲁氏杆菌具有宿主间交叉感染的能力，对畜牧业和人类健康均构成严重威胁。因此，在当前严峻的防控形势下研发简便、快速、精确的布鲁氏杆菌检测技术就显得非常迫切。
布鲁氏杆菌(Brucella)是一种革兰氏阴性的不运动细菌，无荚膜(光滑型有微荚膜)，触酶、氧化酶阳性，绝对嗜氧菌，可还原硝酸盐，细胞内寄生，可以在很多种家畜体内存活。目前，布鲁氏杆菌属主要有7个种，分别为羊种布鲁氏杆菌(B.melitensis)、牛种布鲁氏杆菌(B.abortus)、猪种布鲁氏杆菌(B.suis)、犬种布鲁氏杆菌(B.canis)、绵羊附睾种布鲁氏杆菌、沙林鼠种布鲁氏杆菌和海洋哺乳动物种布鲁氏杆菌，一共21个生物型。人布鲁氏菌病亦呈上升趋势，人布鲁氏菌病疫情表现出明显的职业性、地区性、季节性，人布鲁氏菌病可能与接触感染动物有关。因此，必须从根本上预防和控制动物布鲁氏菌病。
一方面，传统的病原分离培养、血清学检测技术和分子生物学检测方法存在诸多局限性，如常规生化识别过程繁琐、周期长、效率低；免疫检测特异性不强，容易造成漏检；RT-PCR需要耗时、繁琐、仪器昂贵不便携带和需要专业人员操作等。另一方面，现有的布鲁氏杆菌的试剂盒虽然能够实现布鲁氏杆菌的检测，但是无法对布鲁氏杆菌的种类进行区分和鉴别。因此，亟需研发一种同时具备检测和鉴别布鲁氏杆菌的试剂盒。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种用于检测和鉴别布鲁氏杆菌的试剂盒与检测方法。
本发明技术方案如下：
一种用于检测和鉴别布鲁氏杆菌的crRNA，所述crRNA为crRNA-Me、crRNA-Ab和crRNA-Su的组合；
所述crRNA-Me的序列如SEQ ID NO.1所示；所述crRNA-Ab的序列如SEQ ID NO.2所示；所述crRNA-Su的序列如SEQ ID NO.3所示。
一种用于检测和鉴别布鲁氏杆菌的crDNA，所述crDNA为crDNA-Me、crDNA-Ab和crDNA-Su的组合；
所述crDNA-Me的序列如SEQ ID NO.4所示；所述crDNA-Ab的序列如SEQ ID NO.5所示；所述crDNA-Su的序列如SEQ ID NO.6所示。
一种用于检测和鉴别布鲁氏杆菌的DNA，所述DNA为DNA-Me、DNA-Ab和DNA-Su的组合；
所述DNA-Me的序列如SEQ ID NO.7所示；所述DNA-Ab的序列如SEQ ID NO.8所示；所述DNA-Su的序列如SEQ ID NO.9所示。
所述crDNA-Me、crDNA-Ab和crDNA-Su可以经人工合成得到。所述crRNA-Me、crRNA-Ab和crRNA-Su可以经人工合成得到，或以crDNA-Me、crDNA-Ab和crDNA-Su为模板转录得到。所述DNA-Me是crRNA-Me的靶向序列，用于检测和鉴别羊种布鲁氏杆菌；所述DNA-Ab是crRNA-Ab的靶向序列，用于检测和鉴别牛种布鲁氏杆菌；所述DNA-Su是crRNA-Su的靶向序列，用于检测和鉴别猪种布鲁氏杆菌。
一种用于检测和鉴别布鲁氏杆菌的试剂盒，包含上述crRNA或crDNA。
根据本发明优选的，所述试剂盒还包括Cas蛋白和荧光探针；
进一步优选的，所述Cas蛋白为CRISPR-Cas13蛋白；
根据本发明优选的，所述荧光探针序列的5端标记有荧光基团，3端标记有淬灭基团。
进一步优选的，所述荧光基团为FAM；淬灭基团为BHQ1。
进一步优选的，所述荧光探针为ssRNA荧光探针，序列为5’-FAM-UUUUU-3’BHQ1。
一种利用上述试剂盒以非诊断目的检测和鉴别布鲁氏杆菌的方法，包括步骤如下：
(1)提取待测样本的基因组；
(2)以提取的待测样本基因组为模板，加入至含有反应液和聚合酶的反应体系中，进行RPA扩增；
(3)取RPA扩增产物分别建立Me检测体系、Ab检测体系和Su检测体系，在37℃下，孵育5～30min；
(4)将Me检测体系、Ab检测体系和Su检测体系分别放入LED照射灯下，当Me检测体系荧光显色时，表明待测样本是羊种布鲁氏杆菌菌株；当Ab检测体系荧光显色时，表明待测样本是牛种布鲁氏杆菌菌株；当Su检测体系荧光显色时，表明待测样本是猪种布鲁氏杆菌菌株；当三个反应体系同时不形成荧光显示时，表明待测样本不存在牛、羊和猪种布鲁氏杆菌感染。
根据本发明优选的，步骤(1)中，所述待测样本为经过65～80℃、10分钟预灭活处理的羊、牛和猪的全血、尿液或唾液。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述RPA扩增的引物序列为：
正向引物：
5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGCCGTATGGTTCAGCCGCACAATTTCGGAA T-3'；
反向引物：5'-AACCGGTCATCTGGCAGGGGCAGGCCTTGG-3'。
根据本发明优选的，步骤(2)中，所述RPA扩增体系为：RPA基础反应球一管，再水合缓冲液29.5μL，醋酸镁缓冲液2.5μL，正向引物2.5μL，反向引物2.5μL，其余用无酶水8μL补足，然后进行5等份分配，每9μL一份，每份加待测样本1μL，总体积10μL。
扩增条件为：反应温度39～42℃，孵育时间5～20min。
其中，RPA基础反应球、再水合缓冲液和醋酸镁缓冲液均来自于TwistAmpRBasic试剂盒，RPA基础反应球为球状固体，内含重组酶、聚合酶等成分。
根据本发明优选的，步骤(3)中，所述Me检测体系、Ab检测体系和Su检测体系相同，具体为：Tris-HCl(400mM)、MgCl2(120mM)、ssRNA荧光探针(2μM)、crRNA 0.5μL、RNaseInhibitor 0.5μL、Cas13a蛋白2μL、T7 Polymerase 0.25μL、rNTP 0.4μL，RPA扩增产物1μL，总体积10μL。
根据本发明优选的，步骤(4)中，所述LED照射灯为便携式LED照射灯，激发波长为360～450纳米。
本发明未详细说明的均为现有技术。
本发明的技术特点：
在本发明的Me检测体系、Ab检测体系和Su检测体系中，Cas13a蛋白与crRNA-Me、crRNA-Ab和crRNA-Su分别结合成Cas13a-crRNA(Me)、Cas13a-crRNA(Ab)和Cas13a-crRNA(Su)复合物。然后Cas13a-crRNA(Me)、Cas13a-crRNA(Ab)和Cas13a-crRNA(Su)复合物能够特异性地识别RPA扩增产物中DNA(Me)、DNA(Ab)和DNA(Su)的转录产物。以DNA(Ab)片段为例，若RPA扩增产物中有DNA(Ab)片段，Cas13a蛋白被激活，并对ssRNA荧光报告基团进行切割。被切割的ssRNA荧光报告基团通过LED设备激发后将会发出荧光，表明样品为阳性，存在牛种布鲁氏杆菌感染。若RPA扩增产物中无DNA(Ab)片段，Cas13a则不会被激活，ssRNA荧光报告基团不会被切割，不形成荧光显示，表明样品为阴性，样本不存在牛种布鲁氏杆菌感染。同理，本发明提供的试剂盒也可以检测和鉴别羊种布鲁氏杆菌感染和猪种布鲁氏杆菌感染。
有益效果：
1、本发明提供的用于检测和鉴别布鲁氏杆菌的试剂盒可以同时区分待测样品是牛种布鲁氏杆菌菌株、羊种布鲁氏杆菌菌株和猪种布鲁氏杆菌菌株，有效解决了现有技术中布鲁氏杆菌菌株生物种分别鉴定区分的问题，为后续布鲁氏菌病的治疗提供了明确的指导。并且本发明提供的检测方法与传统的检测方法相对比特异性强、检测限低、灵敏度高，还具有价格便宜，操作简单、快速，且设备仪器方便携带的优点。
2、本发明提供的检测方法将RPA扩增技术、CRISPR系统和快速荧光检测技术联用，通过合理配比降低相互之间的干扰，使反应试剂之间依然能够准确地、特异地实现各自的功能，通过扩增和检测结合进行，用便携式的LED照射灯观测即可得到结果，使得整个检测过程耗时极短，进行定性检测时在5～30min内即可完成，且操作步骤简单，通过荧光颜色即可肉眼分辨出布鲁氏杆菌菌株生物种，判断布鲁氏菌病的感染来源，为布鲁氏菌病的净化提供全新的思路和方法。
附图说明
图1为羊种、牛种及猪种布鲁氏杆菌的MAS位点的差异基因分析图。
图2为羊种、牛种及猪种布鲁氏杆菌的检测和鉴别结果照片。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
以下实施例中CRISPR-Cas13蛋白，北京科昕生物公司有售。
TwistAmpRBasic试剂盒，TwistDX公司有售。
实施例1用于检测布鲁氏杆菌的crRNA和DNA的设计及获得
登录NCBI，从GenBank中下载基因序列包括：羊种(M28、ATCC23457、NI、BmWS93、CIT31、B9、QH61、BY38、20236、RM57、Rev.1、M5-90)、牛种(A19、A13334、2308、9-941、104M、BD、BAB8416、clpP、MC、BJ1)、猪种(S2、1330、QH05、CVI-71)菌株进行基因组生物信息学分析和差异性分析比对，分析结果如图1所示。
由图1可知，羊种布鲁氏杆菌、牛种布鲁氏杆菌和猪种布鲁氏杆菌的基因序列之间存在明显差异，本申请发明人进一步发现检测和鉴别这三种来源布鲁氏杆菌的基因位点为MAS基因，所述羊种布鲁氏杆菌MAS基因(DNA-Me)如SEQ ID NO.7所示，所述牛种布鲁氏杆菌MAS基因(DNA-Ab)如SEQ ID NO.8所示，所述猪种布鲁氏杆菌MAS基因(DNA-Su)如SEQ IDNO.9所示。
在所述MAS基因第66bp～98bp区域，羊种布鲁氏杆菌与牛种布鲁氏杆菌相比，其差异部分是1个碱基突变和10个碱基缺失(图1)；羊种布鲁氏杆菌与猪种布鲁氏杆菌相比，其差异部分是1个碱基突变和2个碱基缺失(图1)；牛种布鲁氏杆菌与猪种布鲁氏杆菌相比，其差异部分是两处共12个碱基缺失(图1)，具体序列区别如下：
羊种布鲁氏杆菌该处序列为TCCGCTTCCC--GCGCTTTCACCGACAAGCCGC；
牛种布鲁氏杆菌该处序列为TCCGCCTCCC--GCGCTTTCACC----------；
猪种布鲁氏杆菌该处序列为TCCGCCTCCCGCGCGCTTTCACCGACAAGCCGC。
然后根据羊种布鲁氏杆菌、牛种布鲁氏杆菌和猪种布鲁氏杆菌在MAS基因区域的区别，设计得到crRNA-Me、crRNA-Ab和crRNA-Su，所述crRNA-Me、crRNA-Ab和crRNA-Su的序列分别如SEQ ID NO.1～3所示。本发明设计的crRNA-Me、crRNA-Ab和crRNA-Su能够特异性的匹配到羊种布鲁氏杆菌、牛种布鲁氏杆菌和猪种布鲁氏杆菌在MAS基因区域的差异片段，从而激活对应的Cas蛋白核酸酶活性，对体系中的报告基团进行切割。
获得crRNA的具体操作方法如下：以crDNA为模板，分别进行退火反应形成双链DNA，然后进行琼脂糖凝胶电泳，胶回收纯化DNA片段，在T7 RNA聚合酶作用下转录生成RNA，回收纯化得到成熟的crRNA，将纯化得到的crRNA分装冻存至-80℃；或者根据序列直接人工合成。
其中，crDNA-Me的序列如SEQ ID NO.4所示；crDNA-Ab的如SEQ ID NO.5所示；crDNA-Su的序列如SEQ ID NO.6所示；所述crDNA可以根据序列直接人工合成。
退火体系：把待退火的DNA oligo(合成的引物)用经灭菌的无酶水或重蒸水配制成50μM。
溶解Annealing Buffer for DNA Oligos(5×)，混匀备用。
按照上述顺序依次加入各种试剂，混匀。
T7 primer的序列为：5’-GAAATTAATACGACTCACTATAGGG-3’。
如下设置PCR仪进行退火反应：
| 步骤 | 温度 | 时间 | 说明 |
| 1 | 95℃ | 2分钟 | 充分变性 |
| 2 | 每8秒下降0.1℃，降至25℃ | 约90分钟 | 退火 |
| 3 | 4℃ | 长时间保持 | 暂时存放 |
转录体系为：模板DNA 1μg，T7 RNA聚合酶混合物2μL，NTP Buffer Mix 10μL，无酶水补足，总体积30μL。
转录条件为：37℃，16h。
实施例2用于检测布鲁氏杆菌的试剂盒
本实施例试剂盒包括TwistAmpRBasic试剂盒、用于检测和鉴定布鲁氏杆菌的crRNA-Me、crRNA-Ab和crRNA-Su(SEQ ID NO.1～3)、CRISPR-Cas13蛋白、RPA扩增引物、Tris-HCl(400mM)、MgCl2(120mM)、ssRNA荧光探针(2μM)、RNase Inhibitor 0.5μL、T7Polymerase0.25μL、rNTP 0.4μL。
其中，所述ssRNA荧光探针序列为5’-FAM-UUUUU-3’BHQ1。
实施例3采用实施例2所述试剂盒进行布鲁氏杆菌荧光检测的方法
分别取有牛种布鲁氏杆菌、羊种布鲁氏杆菌和猪种布鲁氏杆菌的牛血样本20μL，然后以20μL无酶水作为对照组，进行布鲁氏杆菌荧光检测。
具体方法，包括步骤如下：
(1)将待检测样本分别经80℃、10分钟预灭活处理，然后加入20μL的NP-40裂解液，震荡15s至混匀，置于95～99℃的恒温仪加热10min，得到三个待测样本的基因组；
(2)以提取的待测样本基因组为模板，加入至含有反应液和RPA的反应体系中，进行目的基因的核酸扩增；
RPA扩增反应体系：RPA基础反应球一管，再水合缓冲液29.5μL，醋酸镁缓冲液2.5μL，正向引物2.5μL，反向引物2.5μL，其余用无酶水8μL补足，总体积45μL，然后进行5等份分配，每9μL一份，每份加待测样本1μL，可同时扩增五个样本的RPA反应，每个反应体积10μL。
扩增条件为：反应温度40℃，孵育时间15min。
其中，所述RPA基础反应球、再水合缓冲液和醋酸镁缓冲液均来自于TwistAmpRBasic试剂盒。
所述RPA扩增引物选自如下引物对：
正向引物：
5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGCCGTATGGTTCAGCCGCACAATTTCGGAA T-3'；
反向引物：
5'-AACCGGTCATCTGGCAGGGGCAGGCCTTGG-3'；
RPA扩增条件：反应温度40℃，孵育时间10min；
其中，RPA基础反应球、PBS缓冲液和醋酸镁缓冲液均来自于TwistAmpRBasic试剂盒；RPA扩增为现有技术。
(3)取RPA扩增产物分别建立Me检测体系(牛种布鲁氏杆菌)、Ab检测体系(羊种布鲁氏杆菌)和Su检测体系(猪种布鲁氏杆菌)，在37℃下，孵育20min；
所述Me检测体系(牛种布鲁氏杆菌)、Ab检测体系(羊种布鲁氏杆菌)和Su检测体系(猪种布鲁氏杆菌)相同，具体为：Tris-HCl(400mM)、MgCl2(120mM)、ssRNA荧光探针(2μM)、crRNA(与具体的检测体系相对应)0.5μL、RNase Inhibitor 0.5μL、Cas13a蛋白1μL、T7Polymerase 0.25μL、rNTP 0.4μL，RPA扩增产物0.5μL，总体积10μL。
(4)将10μL的Me检测体系(牛种布鲁氏杆菌)、Ab检测体系(羊种布鲁氏杆菌)和Su检测体系(猪种布鲁氏杆菌)分别放入360～450纳米激发波长下的便携LED照射灯下，根据荧光显色得到检测结果，按照此方法共做两组实验。
本实施例的检测结果如图2所示。由图2可知，无酶水的检测结果为不形成荧光显示，为对照组(NC)。在牛种布鲁氏杆菌检测体系(Melitensis)中，含有牛种布鲁氏杆菌的样本检测液荧光显色，而含有羊种布鲁氏杆菌和猪种布鲁氏杆菌的样本检测液荧光未显色。在羊种布鲁氏杆菌检测体系(Abortus)中，含有羊种布鲁氏杆菌的样本检测液荧光显色，而含有牛种布鲁氏杆菌和猪种布鲁氏杆菌的样本检测液荧光未显色。在猪种布鲁氏杆菌检测体系(Suis)中，含有猪种布鲁氏杆菌的样本检测液荧光显色，而含有羊种布鲁氏杆菌和牛种布鲁氏杆菌的样本检测液荧光未显色。
Claims (10)
1.一种用于检测和鉴别布鲁氏杆菌的crRNA，其特征在于，所述crRNA为crRNA-Me、crRNA-Ab和crRNA-Su的组合；
所述crRNA-Me的序列如SEQ ID NO.1所示；所述crRNA-Ab的序列如SEQ ID NO.2所示；所述crRNA-Su的序列如SEQ ID NO.3所示。
2.一种用于检测和鉴别布鲁氏杆菌的crDNA，其特征在于，所述crDNA为crDNA-Me、crDNA-Ab和crDNA-Su的组合；
所述crDNA-Me的序列如SEQ ID NO.4所示；所述crDNA-Ab的序列如SEQ ID NO.5所示；所述crDNA-Su的序列如SEQ ID NO.6所示。
3.一种用于检测和鉴别布鲁氏杆菌的DNA，其特征在于，所述DNA为DNA-Me、DNA-Ab和DNA-Su的组合；
所述DNA-Me的序列如SEQ ID NO.7所示；所述DNA-Ab的序列如SEQ ID NO.8所示；所述DNA-Su的序列如SEQ ID NO.9所示。
4.一种用于检测和鉴别布鲁氏杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的crRNA或权利要求2所述的crDNA。
5.如权利要求4所述的用于检测布鲁氏杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括Cas蛋白和荧光探针；所述Cas蛋白为CRISPR-Cas13蛋白。
6.如权利要求5所述的用于检测布鲁氏杆菌的试剂盒，其特征在于，所述荧光探针序列的5端标记有荧光基团，3端标记有淬灭基团；所述荧光基团为FAM；淬灭基团为BHQ1；
进一步优选的，所述荧光探针为ssRNA荧光探针，序列为5’-FAM-UUUUU-3’BHQ1。
7.一种利用权利要求4所述试剂盒以非诊断目的检测和鉴别布鲁氏杆菌的方法，其特征在于，包括步骤如下：
(1)提取待测样本的基因组；
(2)以提取的待测样本基因组为模板，加入至含有反应液和聚合酶的反应体系中，进行RPA扩增；
(3)取RPA扩增产物分别建立Me检测体系、Ab检测体系和Su检测体系，在37℃下，孵育5～30min；
(4)将Me检测体系、Ab检测体系和Su检测体系分别放入LED照射灯下，当Me检测体系荧光显色时，表明待测样本是羊种布鲁氏杆菌菌株；当Ab检测体系荧光显色时，表明待测样本是牛种布鲁氏杆菌菌株；当Su检测体系荧光显色时，表明待测样本是猪种布鲁氏杆菌菌株；当三个反应体系同时不形成荧光显示时，表明待测样本不存在牛、羊和猪种布鲁氏杆菌感染。
8.如权利要求7所述的检测和鉴别布鲁氏杆菌的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述待测样本为经过65～80℃、10分钟预灭活处理的羊、牛和猪的全血、尿液或唾液。
9.如权利要求7所述的检测和鉴别布鲁氏杆菌的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述RPA扩增的引物序列为：
正向引物：
5'-GAAATTAATACGACTCACTATAGGGCCGTATGGTTCAGCCGCACAATTTCGGAA T-3'；
反向引物：5'-AACCGGTCATCTGGCAGGGGCAGGCCTTGG-3'；
所述RPA扩增体系为：RPA基础反应球一管，再水合缓冲液29.5μL，醋酸镁缓冲液2.5μL，正向引物2.5μL，反向引物2.5μL，其余用无酶水8μL补足，然后进行5等份分配，每9μL一份，每份加待测样本1μL，总体积10μL；
扩增条件为：反应温度39～42℃，孵育时间5～20min。
10.如权利要求7所述的检测和鉴别布鲁氏杆菌的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述Me检测体系、Ab检测体系和Su检测体系相同，具体为：Tris-HCl 400mM、MgCl2 120mM、ssRNA荧光探针2μM、crRNA 0.5μL、RNase Inhibitor 0.5μL、Cas13a蛋白2μL、T7 Polymerase0.25μL、rNTP 0.4μL，RPA扩增产物1μL，总体积10μL。
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Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016193896A1 (en) * | 2015-05-30 | 2016-12-08 | The Director General, Defence Research And Development Organisation (DRDO) | Nucleotide sequences for simultaneous and differential identification of brucella spp |
| KR101955117B1 (ko) * | 2017-09-29 | 2019-03-06 | 한국수자원공사 | 브루셀라균 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 브루셀라균 검출방법 |
| CN111206109A (zh) * | 2020-03-02 | 2020-05-29 | 吉林大学 | 用于牛种、羊种和猪种布鲁氏菌多重rpa检测引物组和试剂盒 |
| CN112322764A (zh) * | 2020-12-11 | 2021-02-05 | 武汉博杰生物医学科技有限公司 | 布鲁氏杆菌的检测试剂盒与检测方法 |
| CN113637778A (zh) * | 2021-07-15 | 2021-11-12 | 内蒙古大学 | 一种用于检测布鲁氏杆菌的试剂盒与检测方法 |
| CN114015792A (zh) * | 2021-11-10 | 2022-02-08 | 内蒙古大学 | 一种用于检测布鲁氏杆菌的荧光试剂盒与检测方法 |
| CN114058719A (zh) * | 2021-07-28 | 2022-02-18 | 内蒙古农业大学 | 一种用于鉴定布鲁氏菌的引物对、试剂盒及其应用 |
-
2023
- 2023-01-30 CN CN202310045345.8A patent/CN116004870A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016193896A1 (en) * | 2015-05-30 | 2016-12-08 | The Director General, Defence Research And Development Organisation (DRDO) | Nucleotide sequences for simultaneous and differential identification of brucella spp |
| KR101955117B1 (ko) * | 2017-09-29 | 2019-03-06 | 한국수자원공사 | 브루셀라균 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 브루셀라균 검출방법 |
| CN111206109A (zh) * | 2020-03-02 | 2020-05-29 | 吉林大学 | 用于牛种、羊种和猪种布鲁氏菌多重rpa检测引物组和试剂盒 |
| CN112322764A (zh) * | 2020-12-11 | 2021-02-05 | 武汉博杰生物医学科技有限公司 | 布鲁氏杆菌的检测试剂盒与检测方法 |
| CN113637778A (zh) * | 2021-07-15 | 2021-11-12 | 内蒙古大学 | 一种用于检测布鲁氏杆菌的试剂盒与检测方法 |
| CN114058719A (zh) * | 2021-07-28 | 2022-02-18 | 内蒙古农业大学 | 一种用于鉴定布鲁氏菌的引物对、试剂盒及其应用 |
| CN114015792A (zh) * | 2021-11-10 | 2022-02-08 | 内蒙古大学 | 一种用于检测布鲁氏杆菌的荧光试剂盒与检测方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| DARLA R. EWALT ET AL.: "Validation of the Abbreviated Brucella AMOS PCR as a Rapid Screening Method for Differentiation of Brucella abortus Field Strain Isolates and the Vaccine Strains, 19 and RB51", 《JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY》, vol. 38, no. 8, 31 August 2000 (2000-08-31), pages 3085 - 3086 * |
| 李争 等: "布鲁氏菌新型多重 PCR 方法的建立 与初步应用", 《黑龙江畜牧兽医》, vol. 288, 15 April 2016 (2016-04-15), pages 176 - 180 * |
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