ES2850324T3 - Método de detección de hemoplasmas - Google Patents

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ES2850324T3 ES17184008T ES17184008T ES2850324T3 ES 2850324 T3 ES2850324 T3 ES 2850324T3 ES 17184008 T ES17184008 T ES 17184008T ES 17184008 T ES17184008 T ES 17184008T ES 2850324 T3 ES2850324 T3 ES 2850324T3
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Carl-Ulrich Richard Zimmerman
Renate Rosengarten
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Abstract

Un método para detectar al menos una especie de hemoplasma dentro del grupo de hemoplasmas del género Mycoplasma en una muestra biológica, comprendiendo dicho método las etapas de: i) tratar dicha muestra para liberar el ácido nucleico de hemoplasma en la muestra, ii) amplificar un segmento de un gen del ARNr 16S por PCR en tiempo real (qPCR) usando un par de cebadores oligonucleótidos, consistiendo dicho par de cebadores oligonucleótidos en un cebador directo que comprende al menos 10 bases consecutivas de la SEQ ID 1 y un cebador inverso que comprende al menos 10 bases consecutivas de la SEQ ID 2, produciendo así un producto de amplificación, y iii) detectar el producto de amplificación mediante la producción de una señal de detección que se correlaciona con la cantidad del producto de amplificación que es indicativo de una especie de hemoplasma dentro del género Mycoplasma.

Description

DESCRIPCIÓN
Método de detección de hemoplasmas
La invención se refiere a una técnica y ensayo molecular para detectar bacterias del grupo hemoplasma de los micoplasmas con una amplia cobertura.
Antecedentes
Los micoplasmas hemotrópicos, también conocidos como hemoplasmas o bacterias hemoplasmas, son bacterias pequeñas, pleomórficas, sin pared celular que se han detectado en la sangre de diversas especies de mamíferos. Aunque muchos hemoplasmas son de origen animal no humano, existe un alto potencial zoonótico, que posiblemente transmita enfermedades a los seres humanos. Los hemoplasmas se dividen según la filogenia en dos grupos: un grupo haemominutum y un grupo haemofelis.
Productos sanguíneos o componentes sanguíneos que incluyen p. ej. glóbulos rojos, plaquetas, plasma fresco congelado y crioprecipitado, pero también derivados del plasma fabricados a partir de donaciones de plasma combinadas, tales como albúmina, factores de coagulación e inmunoglobulinas, proceden de donantes y potencialmente contienen patógenos. Estos productos deben usarse de forma segura en la práctica clínica.
La sangre para transfusión es una fuente potencial de infección por una variedad de agentes transmisibles conocidos y desconocidos. Si bien el riesgo de infección viral a través de sangre alogénica se ha reducido sustancialmente mediante la detección temprana de contaminación viral transmitida por la sangre en el plasma de origen y los productos finales, la contaminación bacteriana de los productos sanguíneos se ha convertido en una fuente de enfermedades transmitidas por transfusiones.
La contaminación por micoplasmas también es un desafío importante en las técnicas de cultivo celular, utilizadas en la producción de proteínas recombinantes. La contaminación por micoplasmas es invisible sin cambios perceptibles en la turbidez o el pH, y puede ser extremadamente virulenta.
Willi et al. (Journal of Clinical Microbiology 2009, 47: 4049-4054) describen el desarrollo de un ensayo universal de detección por PCR de hemoplasmas como herramienta de diagnóstico para analizar muestras de sangre humana. El ensayo de PCR se basa en la amplificación del gen del ARNr 16S y cubre micoplasmas hemotrópicos de origen felino, bovino, porcino, camélido y murino, pero también tiene reacciones cruzadas con especies de micoplasmas no hemotrópicos, como Mycoplasma penetrans y Mycoplasma pneumoniae.
Tasker et al. (Journal of Medical Microbiology 2010, 59: 1285-1292) describen la determinación de la infección por micoplasmas hemotrópicos humanos utilizando dos ensayos de PCR en tiempo real (qPCR) genéricos de hemoplasmas en muestras de sangre y frotis de sangre. Una de las dos qPCR de hemoplasmas genéricas cubre el grupo de hemofelis y la otra cubre el grupo de haemominutum. No se observó reactividad cruzada con ninguna especie de micoplasma no objetivo.
Sumario de la invención
El objetivo de la presente invención es proporcionar un ensayo de qPCR genérico mejorado que cubra ampliamente micoplasmas hemotrópicos que incluya las especies principales tanto del grupo hemofelis como del grupo haemominutum.
El objetivo se resuelve mediante el objeto de la presente invención como se describe en el presente documento.
Según la invención, se proporciona un método para detectar al menos una especie de hemoplasma dentro del grupo de hemoplasmas del género Micoplasma, en particular cualquier especie de hemoplasma dentro de todo el grupo de hemoplasmas del género Micoplasma, en una muestra biológica, comprendiendo dicho método las etapas de:
i) tratar dicha muestra para liberar el ácido nucleico de hemoplasma en la muestra,
ii) amplificar un segmento de un gen del ARNr 16S por PCR en tiempo real (qPCR) usando un par de cebadores oligonucleótidos, dicho par de cebadores oligonucleótidos consiste en un cebador directo que comprende al menos 10 bases consecutivas de la SEQ ID 1 y un cebador inverso que comprende al menos 10 bases consecutivas de la SEQ ID 2, produciendo así un producto de amplificación, y
iii) detectar el producto de amplificación, también denominado en el presente documento "amplicón", mediante la producción de una señal de detección que se correlaciona con la cantidad del producto de amplificación que es indicativo de al menos una o cualquier especie de hemoplasma dentro del género Mycoplasma (se entiende en el presente documento que dicho género abarca la especie Mycoplasma y especie Candidatus Mycoplasma, en particular las cubiertas por el método descrito en el presente documento).
Específicamente, el cebador directo comprende o consiste en la SEQ ID 1, y el cebador inverso comprende o consiste en la SEQ ID 2.
SEQ ID 1 :AGCAAATGGGATTAGATACCCCA
SEQ ID 2: TTCCTTT GAGTTTCAT ATTTGCAT A
Específicamente, el producto de amplificación es indicativo de un grupo de diferentes especies de hemoplasmas que comprenden al menos hemoplasmas del grupo hemofelis y del grupo haemominutum. En particular, el método descrito
en el presente documento cubre al menos las siguientes especies de hemoplasmas: Mycoplasma haemofelis, Mycoplasma haemocanis, Mycoplasma haemomuris, Candidatus Mycoplasma haemohominis, Candidatus Mycoplasma turicensis, Mycoplasma coccoides, Candidatus Mycoplasma haemomacaque, Candidatus Mycoplasma haemobos, Candidatus Mycoplasma haemovis, Mycoplasma ovis, Mycoplasma parvum, Candidatus Mycoplasma haemominutum, Candidatus Mycoplasma haematoparvum, Candidatus Mycoplasma kahanei, Candidatus Mycoplasma haemozalophi, Candidatus Mycoplasma haemolamae, Mycoplasma suis, Candidatus Mycoplasma haemodidelphis, Mycoplasma wenyonii, Candidatus Mycoplasma erythrocervae y Candidatus Mycoplasma haemocervae.
Específicamente, el método descrito en el presente documento, también denominado "ensayo", no tiene reactividad cruzada con Mycoplasma penetrans o Mycoplasma pneumoniae, o cualquier otra especie de micoplasma no hemotrópico. Más específicamente, el ensayo no presenta reactividad cruzada con ninguna de las siguientes especies de micoplasmas: M. arginini, M. bovigenitalium M. bovirhinis, M. bovoculi, M. californicum, M. canis, M. canadense, M. cynos, M. dispar, M. edwardii, M. fastidiosum, M. felis, M. fermentans, M. gallisepticum, hyopneumoniae, M. hyorhinis, M. maculosum, M. molare, M. mucosicanis, M. mycoides spp. mycoides SC, M. orale,
M. pneumoniae, M. salivarium, M. synoviae, Acholeplasma laylawii, y Spiroplasma citri. Se puede analizar ADN genómico de cepas tipo o de campo de las especies de micoplasmas enumeradas con una concentración de 106 copias con el ensayo genérico de qPCR de hemoplasmas. Se demuestra la no reactividad cruzada si no se determinan amplificaciones (o menos de 1 genoma equivalente [véase la Tabla 3]) a la concentración dada.
Específicamente, el producto de amplificación se detecta por un método de detección cuantitativo.
Específicamente, el límite de detección más bajo está por debajo de 6 copias/PCR. Por ejemplo, un conjunto de diluciones seriadas de 10 veces de ADN plasmídico de control purificado y linealizado (p. ej., Mhmu) (números de copias en el intervalo de 1 a 106 copias por reacción de PCR) se amplificó dando resultados positivos para todas las concentraciones del ADN de control. Para determinar el límite de detección más bajo de la PCR, todos los plásmidos de control se diluyeron en diluciones seriadas de 10 veces y se compararon con una curva de referencia del plásmido
de control (Mhmu). Los números de copias más bajos que se detectaron estaban en el intervalo de 0,18 a 5,83, por lo que el límite de detección más bajo de la PCR era inferior a 1 copia por reacción.
Específicamente, la sensibilidad para el material de muestra de diagnóstico es de al menos 10 copias por 1 ml de sangre completa. Por ejemplo, se enriquecieron tres matrices de productos (sangre completa de conejo, sangre completa humana y sangre completa de beagle) con diferentes concentraciones del plásmido de control (p. ej., Mhmu).
Los niveles de enriquecimiento variaban de 106 a 10 copias por ml de matriz de producto. Se extrajo el ADN de 1 ml de cada muestra enriquecida o no enriquecida y se eluyó con 100 gl de tampón de extracción de ADN. Por reacción
de PCR, se analizaron 10 gl de eluato de ADN. En las tres matrices de productos, se detectó el nivel de enriquecimiento
de 10 copias por ml. Por tanto, la sensibilidad de detección del ensayo era tan baja como 1-10 copias de ADN por reacción de PCR en una matriz de producto enriquecida con 10 copias de ADN por ml de muestra. No se observaron reacciones cruzadas con las muestras de sangre no enriquecidas.
Específicamente, el método de detección cuantitativa emplea
i) un colorante de unión a ADN bicatenario (colorante de ADNbc) como indicador, preferiblemente en donde el colorante de ADNbc es fluorescente y el producto de amplificación se detecta midiendo la fluorescencia; o
ii) al menos una sonda que se hibrida específicamente con el producto de amplificación y que comprende un marcador detectable, preferiblemente en donde dicha al menos una sonda es un oligonucleótido que consiste en la SEQ ID 3.
SEQ ID 3: 5'-CATCGTTTACGGTGTGGACTACTG-3 '
Específicamente, la sonda es una sonda marcada, p. ej. sonda fluorogénica.
Se usa específicamente una sonda oligonucleotídica marcada de manera detectable que es suficientemente complementaria y capaz de hibridar con el ácido nucleico amplificado (es decir, el amplicón), si está presente, como
una indicación de la presencia o ausencia de cualquier hemoplasma en la muestra. Una sonda marcada de forma detectable incluye p. ej. como marcador fluorescente 6-carboxifluoresceína (FAM), tetrametil-rodamina (TAMRA), 2',4',5',T-tetracloro-4-7-diclorofluoresceína (TET), Cy5, 6-carboxi-X-rodamina (ROX), Colorantes CAL Fluor® (colorantes-CPG (vidrio de poro controlado) o colorantes-fosforamiditas) tales como CAL Fluor® GOLD (LGC Biosearch Technologies); balizas moleculares (que son oligonucleótidos marcados con un compuesto fluorescente y un atenuador (Tyagi S, Kramer FR: Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nat Biotechnol 1996,
14: 303-8); moléculas de señalización fluorescente Scorpion (que son moléculas bifuncionales que combinan cebador y sonda en un único oligonucleótido, Carters et al., Methods Mol Biol. 2008; 429: 99-115).
Específicamente, dicho colorante de ADNbc es cualquier colorante SYBR™ Green (N',N'-dimetil-N-[4-[(E)-(3-metil-1,3-benzotiazol-2-iliden)metil]-1-fenilquinolin-1-io-2-il]-N-propilpropano-1,3-diamina) u otros colorantes de cianina asimétricos utilizados como tinción de ácido nucleico en biología molecular, tales como SYBR GOLD™ (ThermoFisher Scientific) y EVAGREEN™ (Biotium).
Específicamente, dicho método de detección cuantitativa utiliza PCR en tiempo real con SYBR™ Green, o un ensayo de nucleasa 5' fluorogénica, tal como la técnica TaqMan™. Específicamente, dicha etapa de detección puede incluir análisis de temperatura de fusión o análisis de curva de fusión, p. ej., donde la temperatura del punto de fusión se determina normalmente de forma experimental sometiendo la muestra a un aumento constitutivo de temperatura y midiendo continuamente la disociación del complejo de hibridación en hebras individuales. La disociación se detecta mediante fluorescencia.
Específicamente, dicha etapa de tratamiento i) en el método descrito en el presente documento, comprende la lisis de células de hemoplasma, extracción y purificación de ácido nucleico, obteniendo así ácido nucleico de hemoplasma purificado en un tampón.
En concreto, se entiende por gen del ARNr 16S el gen que codifica el ARN ribosómico 16S, que es el componente de la subunidad pequeña 30S de un ribosoma procariota que se une a la secuencia de Shine-Dalgarno. Los genes que lo codifican se denominan gen del ARNr 16S, también denominado como ADN 16S, y se utilizan en la reconstrucción de filogenias, debido a las lentas velocidades de evolución de esta región del gen.
Según un aspecto específico, dicho segmento del gen del ARNr 16S forma parte de un ADNc obtenido por transcripción inversa de ARN a ADNc utilizando una transcriptasa inversa.
Específicamente, dicho segmento del gen del ARNr 16S comprende la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID 4. Específicamente, dicho producto de amplificación comprende o consiste en moléculas caracterizadas por la secuencia de consenso identificada por la SEQ ID 4.
(identificación de secuencia, véase la SEQ ID 4):
AKYAAATGGGATTAGATACCCCAGTAGTCCACRCCGTAAACGATGRGNATTAGDY RTBDGRNNTTNNDNYYNRGYGHTGTAGCTWACGYGTTAAATDCYCCGCCTGGGT AGTAYATAT GCAAATAT GAAACT CAAAGRAA,
en donde N es cualquiera de G, C, A o T;
en donde Y es cualquiera de C o T;
en donde R es cualquiera de A o G;
en donde K es cualquiera de G o T;
en donde W es A o T;
en donde B es G, T o C;
en donde D es G, A o T.
En otras palabras, la secuencia de consenso es la siguiente:
SEQ SD 4:
AXXAAATGGGATTAGATACCCCAGTAGTCCACXCCGTAAACGATGXGXATTAGXX XTXXGXXXTTXXXXXXXXGXG H T GTAGCTXACGXGTT AAATXCXCCGCCT G G GTA GT AXAT AT GCAAAT AT GAAACT CAAAGXAA,
en donde X en la posición 2 es cualquiera de G o T;
en donde X en la posición 3 es cualquiera de C o T;
en donde X en la posición 33 es cualquiera de A o G;
en donde X en la posición 46 es cualquiera de A o G;
en donde X en la posición 48 es cualquiera de G, C, A o T;
en donde X en la posición 54 es cualquiera de G, A o T;
en donde X en la posición 55 es cualquiera de C o T;
en donde X en la posición 56 es cualquiera de A o G;
en donde X en la posición 58 es cualquiera de G, T o C;
en donde X en la posición 59 es cualquiera de G, A o T;
en donde X en la posición 61 es cualquiera de A o G;
en donde X en la posición 62 es cualquiera de G, C, A o T;
en donde X en la posición 63 es cualquiera de G, C, A o T;
en donde X en la posición 66 es cualquiera de G, C, A o T;
en donde X en la posición 67 es cualquiera de G, C, A o T;
en donde X en la posición 68 es cualquiera de G, A o T;
en donde X en la posición 69 es cualquiera de G, C, A o T;
en donde X en la posición 70 es cualquiera de C o T;
en donde X en la posición 71 es cualquiera de C o T;
en donde X en la posición 72 es cualquiera de G, C, A o T;
en donde X en la posición 73 es cualquiera de A o G;
en donde X en la posición 75 es cualquiera de C o T;
en donde X en la posición 85 es cualquiera de A o T;
en donde X en la posición 89 es cualquiera de C o T;
en donde X en la posición 97 es cualquiera de G, A o T;
en donde X en la posición 99 es cualquiera de C o T;
en donde X en la posición 114 es cualquiera de C o T;
en donde X en la posición 138 es cualquiera de A o G;
La SEQ ID 4 identifica la secuencia de consenso en un determinado segmento del gen del ARNr 16S que cubre al menos los genes identificados por los respectivos números de acceso de GenBank de las secuencias de ADN diana, como sigue:
Números de acceso de GenBank: AF178677 (SEQ ID 5), AF548631 (SEQ ID 6), AY069948 (SEQ ID 7), AY150972 (SEQ ID 8), AY150976 (SEQ ID 9), AY150977 (SEQ ID 10), AY150984 (SEQ ID 11), AY529632 (SEQ ID 12), DQ157160 (SEQ ID 13), DQ825438 (SEQ ID 14), DQ825441 (SEQ ID 15), DQ825447 (SEQ ID 16), DQ825451 (SEQ ID 17), DQ825453 (SEQ ID 18), DQ825458 (SEQ ID 19), EU888930 (SEQ ID 20), EU442623 (SEQ ID 21), U88563 (SEQ ID 22), EU442616 (SEQ ID 23), EU442617 (SEQ ID 24), EU442618 (SEQ ID 25) EU442619 (SEQ ID 26), EU442620 (SEQ ID 27), EU442621 (SEQ ID 28), EU442622 (SEQ ID 29), EU442624 (SEQ ID 30), EU442625 (SEQ ID 31), EU442626 (SEQ ID 32), EU442627 (SEQ ID 33), EU442628 (SEQ ID 34), EU442630 (SEQ ID 35), EU442631 (SEQ ID 36), EU442632 (SEQ ID 37), EU442633 (SEQ ID 38), EU442634 (SEQ ID 39), EU442635 (SEQ ID 40), EU442636 (SEQ ID 41), EU442637 (SEQ ID 42), EU442638 (SEQ ID 43), EU442639 (SEQ ID 44), EU442640 (SEQ ID 45), U95297 (SEQ ID 46), AF407208 (SEQ ID 47), AY150973 (SEQ ID 48), EF416568 (SEQ ID 49), AF197337 (SEQ ID 50), AY529641 (SEQ ID 51), GQ129115 (SEQ ID 52), GQ129117 (SEQ ID 53), GQ129116 (SEQ ID 54), GQ129118 (SEQ ID 55), GQ129119 (SEQ ID 56), U82963 (SEQ ID 57), GU562823 (SEQ ID 58), AY831867 (SEQ ID 59), EU442629 (SEQ ID 60), DQ157150 (SEQ ID 61), DQ464417 (SEQ ID 62), DQ464421 (SEQ ID 63), DQ464424 (SEQ ID 64), DQ464425 (SEQ ID 65), DQ825448 (SEQ ID 66), DQ825449 (SEQ ID 67), DQ825450 (SEQ ID 68), DQ825454 (SEQ ID 69), EU861063 (SEQ ID 70) , AY171918 (SEQ ID 71), FJ667773 (SEQ ID 72), FJ667774 (SEQ ID 73), KC512401 (SEQ ID 74), EF460765 (SEQ ID 75), EF616468 (SEQ ID 76), AB617734 (SEQ ID 77), AB617735 (SEQ ID 78), AB617736 (SEQ ID 79), AB617737 (SEQ ID 80), AB617738 (SEQ ID 81), EU165512 (SEQ ID 82), EU165513 (SEQ ID 83), EU828579 (SEQ ID 84), EU828580 (SEQ ID 85), EU828581 (SEQ ID 86), JF931131 (SEQ ID 87), JF931132 (SEQ ID 88), JF931133 (SEQ ID 89), JF931136 (SEQ ID 90), JF931137 (SEQ ID 91), AF338268 (SEQ ID 92), CP006935 (SEQ ID 93), CP006935 (SEQ ID 94), KF313922 (SEQ ID 95), EU165511 (SEQ ID 96), EU165509 (SEQ ID 97), EU165510 (SEQ ID 98), EU828582 (SEQ ID 99), JF931134 (SEQ ID 100), JF931135 (SEQ ID 101), JF931138 (SEQ ID 102), FJ440328 (SEQ ID 103), EU916726 (SEQ ID 104), GU230142 (SEQ ID 105), GU230143 (SEQ ID 106), GU230144 (SEQ ID 107), HQ197746 (SEQ ID 108), HQ197745 (SEQ ID 109), HQ197747 (SEQ ID 110), HQ197744 (SEQ ID 111), HQ197742 (SEQ ID 112), HQ197743 (SEQ ID 113), HQ197748 (SEQ ID 114), HQ197749 (SEQ ID 115), AB610845 (SEQ ID 116), AB610846 (SEQ ID 117), AB610850 (SEQ ID 118), CP006771 (SEQ ID 119), AF271154 (SEQ ID 120), AY150974 (SEQ ID 121), AY150978 (SEQ ID 122), AY150979 (SEQ ID 123), AY150980 (SEQ ID 124), AY150981 (SEQ ID 125), AY297712 (SEQ ID 126), AM691834 (SEQ ID 127), DQ157149 (SEQ ID 128), DQ825439 (SEQ ID 129), DQ825440 (SEQ ID 130), DQ825442 (SEQ ID 131), DQ825443 (SEQ ID 132), DQ825444 (SEQ ID 133), DQ825445 (SEQ ID 134), DQ825446 (SEQ ID 135), DQ825452 (SEQ ID 136), DQ825455 (SEQ ID 137) , DQ825456 (SEQ ID 138), DQ825457 (SEQ ID 139), FJ004275 (SEQ ID 140), U88564 (SEQ ID 141), AY532390 (SEQ ID 142), KF366443 (SEQ ID 143), GQ129113 (SEQ ID 144), GQ129114 (SEQ ID 145), GQ129112 (SEQ ID 146), EF416569 (SEQ ID 147), AF338269 (SEQ ID 148), JQ897388 (SEQ ID 149), GU124610 (SEQ ID 150), AF306346 (SEQ ID 151), JN214359 (SEQ ID 152), JN214357 (SEQ ID 153), JN214358 (SEQ ID 154), JN214356 (SEQ ID 155), FN908079 (SEQ ID 156), FN908077 (SEQ ID 157), FN908080 (SEQ ID 158), FN908081 (SEQ ID 159), FN908082 (SEQ ID 160), FN908084 (SEQ ID 161), FN908083 (SEQ ID 162), FN908078 (SEQ ID 163), FN908076 (SEQ ID 164), JF495171 (SEQ ID 165), FJ527244 (SEQ ID 166), GU047355 (SEQ ID 167), AF029394 (SEQ ID 168), AY492086 (SEQ ID 169), AB610847 (SEQ ID 170), NC_015153 (SEQ ID 171), NC_015155 (SEQ ID 172), HQ259257 (SEQ ID 173), U88565 (SEQ ID 174), AF016546 (SEQ ID 175), AY946266 (SEQ ID 176), EU367964 (SEQ ID 177), CP003703 (SEQ ID 178), DQ641256 (SEQ ID 179), AB558897 (SEQ ID 180), AB558899 (SEQ ID 181).
Específicamente, el método descrito en el presente documento cubre todas y cada una de las especies de hemoplasmas caracterizadas por las secuencias identificadas como SEQ ID 5 - SEQ ID 180.
Era sorprendente que tal cobertura pudiera obtenerse mediante el ensayo descrito en el presente documento a pesar de la variabilidad de las secuencias del gen del ARNr 16S dentro de los grupos hemofelis y haemominutum, y entre ambos grupos. Al mismo tiempo, la alta especificidad del ensayo asegura la ausencia de falsos positivos que pudieran ocurrir debido a cualquier contaminación por micoplasmas no hemotrópicos.
Específicamente, el método descrito en el presente documento comprende además detectar al menos un control negativo y/o al menos un control positivo.
Específicamente, dicha detección de al menos un control negativo comprende amplificar y detectar una secuencia de ácido nucleico de un plásmido que no contiene la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID 4.
Específicamente, dicha detección de al menos un control positivo comprende amplificar y detectar una secuencia de ácido nucleico de un plásmido que contiene la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID 4, y las porciones flanqueantes del polinucleótido ("flanqueante" significa: las secuencias de nucleótidos adyacentes al extremo 5' y al extremo 3' de la SEQ ID 4, respectivamente) que son complementarias de los cebadores directo e inverso, y capaces de hibridar con los cebadores respectivos en condiciones estándar.
Preferiblemente, el control negativo se usa en combinación con un control positivo, en donde el control negativo es el mismo plásmido que se usa de otra manera para incorporar el gen del ARNr 16S de hemoplasma de control positivo o el segmento de gen que abarca la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID 4 y la porciones flanqueantes capaces de hibridar con los cebadores directo e inverso. Un ejemplo de plásmido de control es pBSK (Stratagene), que, cuando se usa como control positivo, comprende el gen del ARNr 16S del hemoplasma o el segmento del gen, o, cuando se usa como control negativo, es el mismo plásmido, pero sin dicho gen del ARNr 16S del hemoplasma o el segmento del gen.
Los controles positivos pueden ser cualquier secuencia de ADNr 16S o ADN genómico de cualquiera de las especies de hemoplasma cubiertas por el ensayo descrito en el presente documento. Un control positivo específico es cualquiera de los siguientes genes de ARNr 16S de hemoplasma clonado en un vector de clonación estándar, p. ej., pBSK(+)Simple-Amp (Biomatik): Mycoplasma haemofelis (Mhf), Mycoplasma haemomuris (Mhmu), Candidatus Mycoplasma haemohominis (CMhh), Candidatus Mycoplasma turicensis (CMt), Mycoplasma coccoides (Mcc), Mycoplasma ovis (Movi), Candidatus Mycoplasma haemominutum (CMhm), Candidatus Mycoplasma haemolamae (CMhla), Mycoplasma suis (Msui), o Mycoplasma wenyonii (Mwyi).
Específicamente, dicha muestra es una muestra de mamífero, células de mamífero o cultivo de células in vitro, en particular humanas y de otros primates, incluidos primates no humanos tales como chimpancés y otras especies de simios y monos; animales de granja tales como ganado vacuno, ovejas, cerdos, cabras y caballos; mamíferos domésticos tales como perros y gatos; animales de laboratorio, incluidos roedores tales como ratones, ratas y cobayas; y similares. En concreto, dicha muestra se proporciona para llevar a cabo el ensayo descrito en el presente documento ex vivo.
Específicamente, dicha muestra es un fluido corporal de mamífero seleccionado del grupo que consiste en sangre, fracciones de sangre, plasma, médula ósea, orina, heces, saliva, linfa, exudados, trasudados, secreciones, líquido cefalorraquídeo, líquido seminal, tejido disperso y/o fluidos de cavidades corporales naturales o no naturales o frotis, en particular frotis de sangre.
Específicamente, dicha muestra es una muestra de un cultivo celular in vitro, incluyendo p. ej. material celular, medio de cultivo celular o productos de cultivo celular.
Específicamente, dicha muestra se obtiene a partir del material original y/o de material de control en proceso y/o material de control final, en un método de producción de productos farmacéuticos, p. ej., productos de cultivo celular tales como proteínas recombinantes, productos sanguíneos o derivados del plasma.
Específicamente, dicha muestra se obtiene de un animal, incluidos seres humanos, para diagnosticar la infección por hemoplasmas y la respectiva enfermedad.
La invención proporciona además una composición que comprende un par de cebadores oligonucleótidos que consiste en un cebador directo que comprende al menos 10 bases consecutivas de la SEQ ID 1 y un cebador inverso que comprende al menos 10 bases consecutivas de la SEQ ID 2.
Específicamente, el cebador directo comprende o consiste en al menos cualquiera de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 bases de la SEQ ID 1.
Específicamente, el cebador inverso comprende o consiste en al menos cualquiera de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 bases de la SEQ ID 2.
Específicamente, el cebador directo comprende o consiste en la SEQ ID 1, y el cebador inverso comprende o consiste en la SEQ ID 2.
Específicamente, la composición comprende los cebadores en forma aislada.
Específicamente, la composición se proporciona en un kit de partes o reactivo compuesto listo para usar en un ensayo de qPCR, preferiblemente en donde el par de cebadores se proporciona en una mezcla, o en contenedores separados, preferiblemente en una combinación envasada.
Una formulación de ejemplo de la mezcla de cebadores comprende: cebador directo 3-8 pM, cebador inverso 5-8 pM pM, sonda con marcado doble 2-3 pM, tampón 1xTris/EDTA (Tris 10 mM, EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) 1 mM, pH 8,0). Esta formulación de ejemplo es equivalente a una mezcla de cebadores concentrada 10 x que se puede diluir a una mezcla de cebadores concentrada 1 x (cebador directo 300-800 nM, cebador inverso 500-800 nM, sonda con marcado doble 200-300 nM) en la mezcla de reacción final de la qPCR.
Específicamente, dicha composición de cebadores o mezcla de cebadores se proporciona en una forma estable al almacenamiento, preferiblemente en tampón 1xTris/EDTA o liofilizada. La invención además proporciona un conjunto o kit de partes en una combinación envasada, que comprende la composición del cebador directo e inverso como se describe en el presente documento, los controles positivos y/o negativos (p. ej., controles de plásmidos descritos en el presente documento), p. ej., los componentes en dos o más recipientes.
Específicamente, como control positivo, se proporciona un plásmido de clonación estándar lineal (p. ej., un vector pBSK lineal) que contiene un gen del ARNr 16S completo o casi completo de cualquiera de las especies de hemoplasma cubiertas por el ensayo descrito en el presente documento. Los plásmidos se pueden proporcionar en diversas concentraciones en tampón, p. ej. tampón 1xTris/EDTA. Específicamente, como control negativo en combinación con el control positivo mencionado anteriormente, se usa el mismo plásmido de clonación estándar lineal, pero sin el gen del ARNr 16S que por otro lado se usa en el control positivo.
Específicamente, el conjunto o kit de partes comprende al menos un colorante de ADNbc, tal como el colorante SYBR® Green, un colorante de referencia, una enzima que extiende el ácido nucleico dependiente del molde tal como una polimerasa Hot Start Taq que se ha inhibido químicamente o inactivado por anticuerpo para evitar la amplificación inespecífica de la polimerasa a temperaturas más bajas.
Específicamente, el conjunto o kit de partes comprende además una solución para el funcionamiento óptimo de la enzima de extensión de ácido nucleico.
Específicamente, el conjunto o kit de partes comprende además desoxirribonucleótidos trifosfatos.
Figuras
Figura 1: Sensibilidad del ensayo genérico de qPCR de hemoplasma.
Gráfico de dispersión con curva de referencia para la amplificación por qPCR del gen del ARNr 16S de la secuencia diana de M. hemomuris (Mhmu) y amplificación de secuencias diana de 9 plásmidos de control adicionales: Mcc (Mycoplasma coccoides), Mhf (Mycoplasma haemofelis), Movi (Mycoplasma ovis), Msui (M. suis), Mwyi (Mycoplasma wenyonii), CMhh (Candidatus Mycoplasma haemohominis), CMhla (Candidatus Mycoplasma haemolamae), CMhm (Candidatus Mycoplasma haemominutum), CMt (Candidatus Mycoplasma turicensis).
Figura 2: Amplificación de la secuencia diana a partir del ADN genómico de M. suis. Curvas de amplificación de la secuencia diana del gen de ARNr 16S. Análisis de diferentes diluciones del control positivo Mhmu y ADN genómico de M. suis aislado de sangre porcina.
Figura 3: Sensibilidad de la qPCR de hemoplasmas genérica en muestras de sangre enriquecidas con el plásmido de control Mhmu. Amplificación de la secuencia diana de tres muestras de sangre entera enriquecidas experimentalmente con el plásmido de control Mhmu en concentraciones que varían de 10 a 106 copias por ml de sangre.
Descripción detallada
Los términos específicos que se utilizan a lo largo de la memoria descriptiva tienen el siguiente significado. La expresión "PCR en tiempo real" o "qPCR" como se usa en el presente documento se entiende como sigue:
"Reacción en cadena de la polimerasa" o "PCR" se refiere a un ensayo basado en ácidos nucleicos (NAT) o un ensayo de amplificación de ácidos nucleicos (NAAT), que implica amplificar un polinucleótido diana específico a través de ciclos repetidos de desnaturalización de ADN bicatenario, hibridación de cebadores oligonucleótidos y polimerización de ADN usando una ADN polimerasa termoestable en presencia de nucleótidos trifosfatos. Como se usa en el presente documento, "qPCR" se refiere a una reacción de PCR realizada de tal manera y en tales condiciones controladas que los resultados del ensayo son cuantitativos; es decir, el ensayo es capaz de cuantificar la cantidad de polinucleótido diana presente en la muestra.
Cuando el molde o el ácido nucleico diana es ARN, se puede realizar una reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa o "RT-PCR". Dicho método se refiere a una variante del método básico de PCR en donde el material de partida es un ARN, que se transcribe de forma inversa en un ADNc antes de la PCR. "RT-qPCR" se refiere a la RT-PCR realizada en condiciones que permiten la cuantificación del ARN presente en la muestra.
Como se describe en el presente documento, los cebadores y, opcionalmente, las sondas se pueden usar en técnicas basadas en PCR, para detectar la presencia de hemoplasmas en muestras biológicas. Tales técnicas proporcionan la amplificación de una secuencia de ácido nucleico diana deseada contenida en una molécula de ácido nucleico o mezcla de moléculas. Se emplea un par de cebadores en exceso para hibridar con las cadenas complementarias del ácido nucleico diana. Cada uno de los cebadores se extiende mediante una polimerasa utilizando el ácido nucleico diana como molde. Los productos de extensión se convierten ellos mismos en secuencias diana después de la disociación de la hebra diana original. Luego, se hibridan nuevos cebadores y se extienden mediante una polimerasa, y el ciclo se repite para aumentar geométricamente el número de moléculas de la secuencia diana. Los métodos de PCR para amplificar secuencias de ácido nucleico diana en una muestra son bien conocidos en la técnica y se han descrito, p. ej., en Innis et al. (eds.) PCR Protocols (Academic Press, NY 1990); Taylor (1991) "Polymerase chain reaction: basic principles and automation, in PCR: A Practical Approach", McPherson et al. (eds.) IRL Press, Oxford.
El método de la qPCR descrito en el presente documento se basa en la amplia cobertura y alta especificidad del método de detección. El ensayo se realiza específicamente de manera para detectar niveles bajos de un polinucleótido de hemoplasma diana específico presente en una muestra.
Cualquier muestra de la que se sospeche que contiene alguna bacteria hemoplasma puede analizarse en el método. El experto en la técnica apreciará que ciertas muestras pueden requerir pretratamientos, tales como dilución, tamponamiento, extracción, filtración y similares, antes de llevar a cabo el método descrito en el presente documento. Para la detección de hemoplasmas, se prefieren las muestras derivadas de materiales biológicos que incluyen materiales derivados de animales tales como sangre y productos sanguíneos, sueros, tejidos, extractos de tejido, células y extractos celulares, y materiales desprendidos o excretados de otra forma o eliminados por un animal o una célula en un cultivo celular. Estos materiales pueden incluir muestras clínicas, así como materias primas y suministros utilizados en procedimientos industriales o de otro tipo que requieren la exclusión de la contaminación por hemoplasmas. Las muestras específicas son aquellas que comprenden preparaciones de materiales biológicos en varios estados de pureza que pueden derivarse del muestreo en proceso durante la preparación y purificación.
La cuantificación del polinucleótido diana específico se logra realizando la PCR en condiciones apropiadas y midiendo, directa o indirectamente, la producción de copias amplificadas del polinucleótido diana. Un método especialmente útil para cuantificar el polinucleótido diana es mediante el uso de la técnica TaqMan® (PE Biosystems, Foster City, EE.UU.). Cualquier método que permita la detección y cuantificación de productos amplificados que se producen como resultado de llevar a cabo la PCR en un polinucleótido diana específico es adecuado para su uso en el ensayo descrito en el presente documento. Ejemplos de tales métodos incluyen la PCR competitiva cuantitativa o PCR seguida de electroforesis en gel con cuantificación directa de la banda de amplicón en el gel por densitometría.
El término "cebador" o "cebador oligonucleótido" como se usa en el presente documento, se refiere a un oligonucleótido que se hibrida con la hebra molde de un ácido nucleico y sirve como punto de inicio para la síntesis de una hebra de ácido nucleico complementaria de la hebra molde cuando se pone en condiciones en las que se induce la síntesis de un producto de extensión del cebador, es decir, en presencia de nucleótidos y un agente inductor de la polimerización tal como una ADN o ARN polimerasa y a una temperatura, pH, concentración de metal y concentración de sal adecuados. El cebador es monocatenario para una máxima eficacia en la amplificación, pero alternativamente puede ser bicatenario. Si es bicatenario, el cebador se puede tratar primero para separar sus cadenas antes de usarse para preparar productos de extensión. Esta etapa de desnaturalización se efectúa típicamente mediante calor, pero alternativamente se puede llevar a cabo usando álcali, seguido de neutralización. Por lo tanto, un "cebador" es complementario de un molde y se forma complejo mediante enlaces de hidrógeno o hibridación con el molde para dar un complejo cebador/molde para el inicio de la síntesis por una polimerasa, que se extiende mediante la adición de bases unidas covalentemente enlazadas en su extremo 3' complementario del molde en el proceso de síntesis de ADN o ARN.
Como se describe en el presente documento, los ácidos nucleicos de hemoplasma se amplifican usando un conjunto de cebadores oligonucleótidos que comprenden el cebador "directo" y el cebador "inverso" capaces de hibridar con regiones del gen del ARNr 16S o su ADNc que flanquean la porción del polinucleótido que se va a amplificar. Un cebador directo está en la orientación 5' a 3' complementaria a la hebra codificante del ADN genómico del hemoplasma. Un cebador inverso está en la orientación inversa del complemento y es complementario al molde de hemoplasma antigenómico producido durante la replicación o amplificación de los ácidos nucleicos del hemoplasma.
El término "amplicón" se refiere al producto de ácido nucleico amplificado de una reacción de PCR. Los amplicones como se describen en el presente documento comprenden ADN generado por PCR o RT-PCR.
Como se usa en el presente documento, el término "sonda" o "sonda oligonucleotídica" se refiere a un polinucleótido, que contiene una secuencia de ácido nucleico complementaria de una secuencia de ácido nucleico presente en el analito de ácido nucleico diana o el amplicón producido por amplificación de la diana, capaz de hibridar con dicho analito y amplicón, respectivamente, en condiciones de ensayo estándar.
Las regiones polinucleótidas de las sondas utilizadas en el presente documento pueden estar compuestas de ADN y/o análogos nucleotídicos sintéticos. Las sondas pueden marcarse con el fin de detectar la secuencia diana. Dicho marcador puede estar presente en el extremo 5', en el extremo 3', tanto en el extremo 5' como 3' y/o internamente. Por ejemplo, cuando se va a utilizar una sonda en un ensayo de nucleasa 5' fluorogénico, tal como el utilizado en la técnica T aqMan™, la sonda normalmente contendrá al menos un fluorescente y al menos un atenuador que se elimina mediante la actividad de endonucleasa o exonucleasa de una polimerasa usada en la reacción con el fin de detectar cualquier secuencia de oligonucleótidos diana amplificada. En este contexto, la sonda oligonucleotídica tendrá un número suficiente de enlaces fosfodiéster adyacentes a su extremo 5' para que la actividad de nucleasa 5' a 3' empleada pueda degradar eficazmente la sonda unida para separar los fluorescentes y atenuadores. Además, la sonda oligonucleotídica se obtendrá típicamente de una secuencia que se encuentra entre las regiones de la diana que se hibridan con los cebadores directo e inverso cuando se usa en un ensayo de nucleasa 5'.
Se apreciará que las secuencias de hibridación no necesitan tener 100% de complementariedad para proporcionar híbridos estables. En algunas situaciones, se formarán híbridos estables donde menos de aproximadamente 10% de las bases sean apareamientos erróneos, ignorando los bucles de cuatro o más nucleótidos. En consecuencia, como se usa en el presente documento, la hibridación de cebadores o una sonda con la secuencia de nucleótidos diana respectiva requiere "complementariedad", término que se refiere a un oligonucleótido que forma un dúplex estable con su "complemento" en condiciones de ensayo, generalmente donde hay aproximadamente homología de 90% o mayor.
Realizaciones específicas se refieren a secuencias de nucleótidos de origen natural, pero en un entorno y sistema de ensayo artificiales. Por tanto, los oligonucleótidos o secuencias de genes se proporcionan en forma aislada o como productos artificiales, y los amplicones son productos sintéticos que resultan de la amplificación por PCR. Normalmente, los oligonucleótidos se proporcionan como productos o composiciones sintéticas, por lo que se aíslan, es decir, se separan suficientemente de otros ácidos nucleicos con los que estarían asociados en su estado natural, o se separan de otros componentes presentes durante su síntesis.
La secuencia de consenso (SEQ ID 4) descrita en el presente documento es una secuencia artificial. Por lo tanto, la determinación de dicha secuencia de consenso empleando el par de cebadores (oligonucleótidos) y el método descrito en el presente documento implica materiales artificiales, y las reivindicaciones se refieren significativamente a más que a describir una relación natural.
La descripción anterior se entenderá más completamente con referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, dichos ejemplos son meramente representativos de métodos para poner en práctica una o más realizaciones de la presente invención y no deben interpretarse como limitantes del alcance de la invención.
Ejemplos
Métodos:
Aislamiento de ADN genómico de muestras
La purificación del ADN de las muestras se puede realizar de forma manual o automática y puede contener cualquiera de las siguientes etapas de tratamiento: lisis celular, digestión de proteínas, precipitación de proteínas y membranas, unión de ADN a resina de sílice o perlas de unión a ADN, precipitación de ADN, lavado de ADN y elución o resuspensión de ADN. El ADN se aísla preferiblemente con un kit de extracción de ADN disponible comercialmente.
La extracción manual de ADN utilizando columnas de centrifugación con resina de sílice incluye las siguientes etapas: lisis celular, digestión con proteinasa K, digestión con ARNasa A, unión de ADN a resina de sílice, lavado y elución.
Kits de ejemplo:
QlAamp® DNA Blood Mini Kit (QIAGEN): el kit "proporciona purificación de ADN basada en membranas de sílice. Los mini kits están diseñados para procesar hasta 200 pl de sangre humana completa, y el ADN se eluye en un volumen final de 50-200 pl".
GenElute™ Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit (Sigma-Aldrich): El kit "proporciona una forma sencilla y conveniente de aislar el ADN genómico puro de una variedad de células cultivadas, tejidos (incluyendo colas de roedores) y sangre entera fresca o glóbulos blancos. El kit combina las ventajas de la unión a sílice con un formato de microcentrifugación y elimina la necesidad de resinas costosas, precipitación con alcohol y compuestos orgánicos peligrosos tales como fenol y cloroformo. Los materiales de partida se lisan en una solución que contiene sal caotrópica para asegurar la desnaturalización completa de macromoléculas. La adición de etanol hace que el ADN se una cuando el lisado se centrifuga a través de una membrana de sílice en un tubo de microcentrífuga. Después de lavar para eliminar los contaminantes, el ADN se eluye en 200 pl de una solución de Tris-EDTA ".
La extracción de ADN manual o automatizada utilizando perlas de unión a ADN incluye las siguientes etapas: lisis celular, digestión con proteinasa K, digestión con RNasa A, unión de ADN a perlas, lavado y elución.
Kits de ejemplo:
Maxwell® HT 96 gDNA Blood Isolation System (Promega)
MagNA Pure 96 DNA y Viral NA Small Volume Kit e instrumento MagNA Pure 96 (Roche)
PCR
La reacción en cadena de la polimerasa implica el uso del par de cebadores oligonucleótidos específicos (SEQ ID 1 y SEQ ID 2) para iniciar la síntesis de ADN en una molde de ADN diana. Se utilizan dos cebadores oligonucleótidos para cada secuencia bicatenaria a amplificar. La secuencia diana se desnaturaliza por calor en sus hebras complementarias. Cada cebador, que es suficientemente complementario de una región de cada hebra de la secuencia diana para hibridar con ella, se hibrida con una de las hebras disminuyendo la temperatura de reacción. Los cebadores se extienden utilizando nucleósidos en la muestra y un agente de polimerización termoestable de la ADN desoxinucleotidiltransferasa EC 2.7.7.7. Ejemplos de tales polimerasas termoestables son la ADN polimerasa Taq derivada de Thermus aquaticus, ADN polimerasa Tgo de Thermococcus gorgonarius,ADN polimerasa Pfu de Pyrococcus furiosus, Pfx y sus enzimas de procesividad mejorada). La extensión del cebador ocurre aumentando la temperatura en la mezcla de reacción a una temperatura de extensión óptima para la ADN polimerasa. Los productos de extensión del cebador se hibridan con la hebra complementaria de la secuencia diana. A continuación, los productos de amplificación se separan de las hebras molde y el proceso se repite hasta que se obtiene el nivel deseado de amplificación. En los ciclos posteriores, los productos de extensión del cebador sirven como nuevos moldes para sintetizar la secuencia de ácido nucleico diana.
Seguimiento de la secuencia de ácido nucleico objetivo
El ADN amplificado se detecta mediante técnicas convencionales tales como electroforesis en gel o hibridación con una sonda específica de la diana o por análisis de qPCR en tiempo real utilizando colorantes intercalantes de ADN o una sonda fluorogénica marcada doble.
Al incorporar una entidad detectable en los cebadores de SEQ ID 1 o SEQ ID 2, el ADN amplificado se puede seguir por electroforesis en gel. Una entidad detectable puede ser una molécula o compuesto detectable, tal como un fluoróforo o un isotipo radiactivo. El producto de PCR amplificado también se puede visualizar en un gel utilizando una molécula intercalante de ADN tal como el bromuro de etidio.
Cuando se usa una sonda, el ADN amplificado se desnaturaliza en sus cadenas simples complementarias. La sonda se pone en contacto con una mezcla que contiene la secuencia de ácido nucleico diana amplificada desnaturalizada. Se determina si se ha producido o no hibridación. Preferiblemente, la sonda es un oligonucleótido tal como la SEQ ID 3 que se ha marcado con una entidad detectable tal como moléculas marcadas con fluorescencia o radiactivas.
Un método para el seguimiento de la acumulación en tiempo real o en el punto final del amplicón es con el uso de un colorante fluorescente intercalante de ADNbc (agentes de ejemplo incluyen SYBR Gr Ee N™, SYBR GOLD™ y EVAGREEN™) en la mezcla de reacción de PCR. La señal del colorante intercalante aumenta con el aumento de ácidos nucleicos bicatenarios.
Otro método para la detección de productos de amplificación es el ensayo de PCR de "hidrólisis" por exonucleasa 5'-3' (también denominado ensayo TaqMan™, p. ej. Holland et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1991,88 (16): 7276-7280).
La técnica TaqMan y el principio de la sonda se basan en la actividad de exonucleasa 5'-3' de una polimerasa Taq para escindir una sonda marcada doble durante la hibridación con la secuencia diana complementaria y la detección basada en fluoróforos. Como en otros métodos de PCR cuantitativa, la señal de fluorescencia resultante permite mediciones cuantitativas de la acumulación del producto durante las etapas exponenciales de la PCR. En principio, el ensayo TaqMan™ detecta la acumulación de un producto de PCR específico por hibridación y escisión de una sonda fluorogénica marcada doble durante la reacción de amplificación. La sonda fluorogénica puede consistir en un oligonucleótido (p. ej., SEQ ID 3) marcado con un colorante indicador fluorescente y un colorante atenuador. Durante la PCR, esta sonda se escinde por la actividad de 5'-exonucleasa de la ADN polimerasa si, y solo si, se hibrida con el segmento que se amplifica. La escisión de la sonda genera un aumento en la intensidad de fluorescencia del colorante indicador.
Plásmidos de control positivo y negativo
Los controles positivos son pBSK linealizados que contienen el gen del ARNr 16S casi completo de cualquiera de las especies cubiertas por el ensayo descrito en el presente documento, ya sea liofilizado o en tampón 1x TE. El control negativo es un pBSK linealizado liofilizado o en tampón TE 1x.
Escherichia co lise transformó con un vector plasmídico que contenía un gen del ARNr 16S de hemoplasma casi completo o con el plásmido desprovisto de la secuencia de ADNr 16S. Los plásmidos se volvieron a aislar de E. coli y se linealizaron por digestión con endonucleasas. Después de una etapa de purificación adicional, se cuantificó el ADN plasmídico por fotometría. Las diluciones del plásmido linealizado sirven como controles de referencia en el análisis de qPCR para la cuantificación del número de copias.
Ejemplo 1: Amplificación de ADN del molde (plásmidos de control) utilizando el protocolo de PCR con SYBR Green
Para evaluar la sensibilidad del ensayo de qPCR y determinar si 1 copia de ADN todavía puede ser detectada por el la qPCR de hemoplasmas genérico, un plásmido que contenía el gen del ARNr 16S de M. hemomuris (Mhmu) se diluyó y se aplicó en varias concentraciones para generar una curva de referencia (Fig. 1). La mezcla de reacción estaba compuesta de 12,5 gl de 2x Mezcla maestra PowerUp™ SYBR® Green (ThermoFisher Scientific), cebador directo 300 nM, cebador inverso 800 nM y 10 gl de muestra de ADN. Los ensayos se realizaron en un sistema de PCR en tiempo real rápido 7500 (ThermoFisher Scientific). El protocolo de PCR era el siguiente: 50°C durante 2 min y 95°C durante 2 min, seguido de 40 ciclos de 95°C durante 5 s y 60°C durante 30 s. Después de llevar a cabo la PCR, se realizó la disociación con los siguientes ajustes térmicos: 95°C durante 15 s, 60°C durante 60 s y finalmente 95°C durante 15 s. El Ct umbral se fijó en 0,2. En seis repeticiones, la 1 copia por reacción de PCR era detectable (Fig. 1, tabla 1).
Para evaluar si todos los controles positivos pueden detectarse con el ensayo de qPCR de hemoplasmas genérico y para determinar la sensibilidad del ensayo, se analizaron las diluciones de todos los controles positivos. Todos los plásmidos de control positivo se detectaron en concentraciones en el intervalo de 0,2 a 6 copias por reacción de PCR (Fig. 1, tabla 1), por lo que la sensibilidad del ensayo es <1 copia de ADNr 16S por reacción de PCR.
Ejemplo 2: Amplificación de ADN del molde (plásmido de control y ADN genómico) por PCR con SYBR Green
Para evaluar si el ADN genómico de hemoplasma se puede detectar con el ensayo de qPCR de hemoplasmas genérico, el ADN genómico de M. suis KI3806 (Oehlerking et al. 2011, J Bacteriol. 193: 2369-2370) se analizó en varias concentraciones (Fig. 2). Se aisló ADN de una sangre infectada por M. suis. Para reducir el ADN de fondo de los eritrocitos, la sangre completa se diluyó primero 1:80 en suero porcino. El ADN se aisló de 1 ml de muestra diluida con el kit GenElute™ Mammalian Genomic DNA Miniprep (Sigma-Aldrich) y se eluyó con 200 gl de tampón de elución. El ADN eluido se cuantificó con el fluoroespectrómetro NanoDrop 3300 (ThermoFisher Scientific). Se cuantificaron diluciones del ADN de M. suis usando el ensayo de qPCR de hemoplasmas genérico y el plásmido de control positivo Mhmu como referencia (Fig. 2). Las mezclas de reacción de PCR y los ajustes eran los mismos que en el Ejemplo 1. Las amplificaciones para copias del genoma diluidas tenían valores de Ct similares al plásmido de control diluido.
Ejemplo 3: Amplificación de ADN del molde (plásmidos de control) a partir de muestras de sangre enriquecidas experimentalmente utilizando el protocolo de PCR con SYBR Green
Para evaluar si el ensayo de PCR es lo suficientemente sensible como para detectar 10 copias por ml de sangre, tres matrices de productos (sangre completa de conejo, sangre completa humana y sangre completa de beagle) se enriquecieron experimentalmente con diferentes concentraciones del plásmido de control Mhmu. Los niveles de enriquecimiento variaron de 10 a 106 copias por ml de matriz de producto. El ADN se extrajo con el instrumento MagNA Pure 96 (Roche) a partir de 1 ml de cada muestra enriquecida o no enriquecida y se eluyó con 100 gl de tampón de extracción de ADN. Las mezclas de reacción de PCR y los ajustes eran los mismos que en el Ejemplo 1, excepto que se realizaron 48 ciclos. En las tres matrices de producto, se podía detectar el nivel de enriquecimiento de 10 copias por ml (Fig. 3, Tabla 2), lo que significa que la PCR tiene una sensibilidad de detección entre 1 y 10 copias por reacción de PCR o 10 copias por ml de muestra de sangre completa. No se detectó ninguna reacción cruzada con el ADN de las matrices de producto no enriquecidas.
Ejemplo 4: Especificidad y selectividad de la detección de hemoplasmas por el ensayo de qPCR genérico
Para evaluar si el ensayo de PCR de hemoplasmas genérico tiene reacción cruzada con el ADN de especies de micoplasmas relacionadas, se analizó el ADN genómico de diferentes especies de micoplasmas en una concentración de 106 copias del genoma por reacción. El ADN se aisló de cultivos líquidos con el kit GenElute™ Mammalian Genomic DNA Miniprep (Sigma-Aldrich). El ADN eluido se cuantificó con el fluoroespectrómetro NanoDrop 3300 (ThermoFisher Scientific). Las concentraciones de ADN generalmente estaban en el intervalo 106-107 copias del genoma por gl de eluato. El ADN se diluyó en 1 x TE a 105 copias de genoma por pl y por reacción de PCR, se aplicaron 10 pl. Las mezclas de reacción de PCR y los ajustes eran los mismos que en el Ejemplo 1, excepto que se realizaron 48 ciclos. Los resultados de la amplificación se determinaron por comparación con una curva de referencia del plásmido de control Mhmu (Tabla 3).
Tablas
Tabla 1. Sensibilidad del ensayo genérico de qPCR de hemoplasmas basado en el número de copias detectadas de plásmidos de control
Figure imgf000012_0001
*: promedio de 6 repeticiones
Tabla 2. Sensibilidad del ensayo de qPCR de hemoplasmas genérico basado en valores Ct de muestras de ensayo enriquecidas y no enriquecidas
Figure imgf000012_0002
-: negativo
Tabla 3. Especificidad del ensayo de qPCR de hemoplasmas genérico basado en la falta de detección de especies de micoplasmas relacionadas
Figure imgf000012_0003

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un método para detectar al menos una especie de hemoplasma dentro del grupo de hemoplasmas del género Mycoplasma en una muestra biológica, comprendiendo dicho método las etapas de:
i) tratar dicha muestra para liberar el ácido nucleico de hemoplasma en la muestra,
ii) amplificar un segmento de un gen del ARNr 16S por PCR en tiempo real (qPCR) usando un par de cebadores oligonucleótidos, consistiendo dicho par de cebadores oligonucleótidos en un cebador directo que comprende al menos 10 bases consecutivas de la SEQ ID 1 y un cebador inverso que comprende al menos 10 bases consecutivas de la SEQ ID 2, produciendo así un producto de amplificación, y
iii) detectar el producto de amplificación mediante la producción de una señal de detección que se correlaciona con la cantidad del producto de amplificación que es indicativo de una especie de hemoplasma dentro del género Mycoplasma.
2. El método de la reivindicación 1, en donde el cebador directo comprende o consiste en la SEQ ID 1, y el cebador inverso comprende o consiste en la SEQ ID 2.
3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde el producto de amplificación es indicativo de un grupo de diferentes especies de hemoplasma que comprenden al menos Mycoplasma haemofelis, Mycoplasma haemocanis, Mycoplasma haemomuris, Candidatus Mycoplasma haemohominis, Candidatus Mycoplasma turicensis, Mycoplasma coccoides, Candidatus Mycoplasma haemomacaque, Candidatus Mycoplasma haemobos, Candidatus Mycoplasma haemovis, Mycoplasma ovis, Mycoplasma parvum, Candidatus Mycoplasma haemominutum, Candidatus Mycoplasma haematoparvum, Candidatus Mycoplasma kahanei, Candidatus Mycoplasma haemozalophi, Candidatus Mycoplasma haemolamae, Mycoplasma suis, Candidatus Mycoplasma haemodidelphis, Mycoplasma wenyonii, Candidatus Mycoplasma erythrocervae y Candidatus Mycoplasma haemocervae.
4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el producto de amplificación se detecta por un método de detección cuantitativo.
5. El método de la reivindicación 4, en donde el método de detección cuantitativo emplea
i) un colorante de unión a ADN bicatenario (colorante de ADNbc) como indicador, preferiblemente en donde el colorante de ADNbc es fluorescente y el producto de amplificación se detecta midiendo la fluorescencia; o
ii) al menos una sonda que se hibrida específicamente con el producto de amplificación y que comprende un marcador detectable, preferiblemente en donde dicha al menos una sonda es un oligonucleótido que consiste en la SEQ ID 3.
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicha etapa de tratamiento i) comprende lisis de las células bacterianas, extracción del ácido nucleico y purificación, obteniendo así ácido nucleico bacteriano purificado en un tampón.
7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicho segmento del gen del ARNr 16S es parte de un ADNc obtenido por transcripción inversa de ARN en ADNc usando una transcriptasa inversa.
8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicho segmento del gen del ARNr 16S comprende la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID 4.
9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende además detectar al menos un control negativo y/o al menos un control positivo.
10. El método de la reivindicación 9, en donde dicha detección de al menos un control negativo comprende amplificar y detectar una secuencia de ácido nucleico de un plásmido que no contiene la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID 4.
11. El método de la reivindicación 9 o 10, en donde dicha detección de al menos un control positivo comprende amplificar y detectar una secuencia de ácido nucleico de un plásmido que contiene la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ ID 4.
12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde dicha muestra es un fluido corporal de mamífero seleccionado del grupo que consiste en sangre, fracciones de sangre, plasma, médula ósea, orina, heces, saliva, linfa, exudados, trasudados, secreciones, líquido cefalorraquídeo, líquido seminal, tejido disperso y/o fluidos de cavidades corporales naturales o no naturales o frotis, o una muestra de un cultivo celular.
13. Una composición que comprende un par de cebadores oligonucleótidos que consiste en un cebador directo que comprende al menos 10 bases consecutivas de la SEQ ID 1 y un cebador inverso que comprende al menos 10 bases consecutivas de la SEQ ID 2.
14. La composición de la reivindicación 13, en donde el cebador directo consiste en la SEQ ID 1 y el cebador inverso consiste en la SEQ ID 2.
15. La composición de la reivindicación 13 o 14, que se proporciona en un kit de partes o reactivo compuesto listo para usar en un ensayo de qPCR, preferiblemente en donde el par de cebadores se proporciona en una mezcla.
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