CN103562411B - 细环病毒诊断学 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及检测样品中猪细环病毒（Torque？Teno？virus）存在的方法、检测样品中猪细环病毒复制的方法、细环病毒(RT)-PCR引物和探针、以及用于检测样品中猪细环病毒的存在和复制的诊断测试试剂盒。

Description

细环病毒诊断学
本发明涉及用于检测样品中猪细环病毒（TorqueTenovirus）的存在的方法、检测样品中猪细环病毒复制的方法、细环病毒(RT)-PCR引物和探针、以及用于检测样品中猪细环病毒的存在和复制的诊断测试试剂盒。
细环病毒(TTV’s)是具有环状负义单链DNA(ssDNA)基因组的小的、无被膜病毒。它们属于环病毒科（Anelloviridae）。
第一例TTV由NishizawaT等在1997年表征。该病毒在遭受输血后肝炎并表现出异常的肝酶类水平但无典型的肝炎病毒的患者的血液中鉴定到。后来在许多非人物种诸如非人灵长类、猫、犬、树鼩和猪中检测到TTV(Leary等,1999,Martinez等,2006)。
猪细环病毒1（Torquetenosusvirus1(TTSuV1)）和猪细环病毒2（Torquetenosusvirus2(TTSuV2)）均感染家猪和野猪（并且因此也称为猪TTV's或简称为sTTV’s），被分类于壬型细环病毒属（Iotatorquevirusgenus）。认为TTV’s通过存在于血液或组织中可以影响某些疾病的发生或甚至调节疾病的结果(Okamoto,2009)。
目前已经显示了TTV’s明确的致病作用，并且它在与其他病原体尤其是关于猪圆环病毒病(PCVDs)共感染过程中的作用仍在争论(Kekarainen等,2006,Ellis等,2008,Taira等,2009)。
TTV’s与经济上重要的猪和家禽的环状ssDNA病毒即猪圆环病毒-2(PCV2)和鸡贫血病毒(CAV)（均为环状病毒科的成员）共有保守的基因组区和保守的功能。sTTV’s具有与感染人的TTV’s相似的基因组组成，但它们具有低于45％的核苷酸序列同一性(Niel等,2005;Okamoto等,2002)。近期研究还表明多种sTTV’s诸如sTTV1和sTTV2之间高度的遗传变异性(Huang等,2010,Cortey等,2010)。sTTV的基因组长度大约为2.8kbp，并且从核苷酸序列中可以推断出两个主要的潜在蛋白编码基因，可读框(ORF)1和ORF2。通过与相关的ssDNA病毒类比，认为ORF1编码病毒壳体蛋白。ORF2编码非结构蛋白，认为其参与病毒复制(Hijikata等,1999;Huang等,2010)。TTVORF2还已经与NF78KB途径抑制相关(Zheng等,2007)。sTTV核苷酸序列分析揭示存在额外的ORF（ORF3），其通过RNA剪切产生并且它的5‘端与ORF2共用。认为ORF3编码具有未知功能的非结构蛋白(Okamoto等,2000;Biagini等,2001)。
对环病毒的研究已经几乎仅仅依赖于PCR技术。近期，已经报道了据说支持人TTV复制（虽然增殖效率低）的组织培养体系(Kakkola等,2007;Leppik等,2007)。然而，对于sTTV，还不知道支持sTTV生长和复制的组织培养体系。
体外无法生长sTTV已经严重地阻碍了sTTV研究。为此原因，目前，研究主要集中于不同的人TTV基因型的分子病毒学、转录和表达策略。在COS-1细胞中用含有由推定的启动子驱动的TTV基因型1基因组的质粒转染后，产生了三种mRNA(Kamahora等,2000)。然而，已经描述了可变剪切和可变翻译过程后来自基因型6的六种不同蛋白和来自分离株P/1C1（基因型1）的七种不同蛋白(Qiu等,2005;Mueller等,2008)。在淋巴瘤来源的和T细胞白血病细胞系中鉴定到了TTV's额外的剪切事件和基因组内重排(Leppik等,2007)。
仅存在少数关于人TTV蛋白定位的研究并且结果相当矛盾。TTV基因型6ORF1和ORF2蛋白定位于转染细胞的细胞质中(Qiu等,2005)。相反，在更近期的研究中，ORF1蛋白定位于细胞核中（具体而言，在核仁内），而观察到ORF3在细胞核中但不在核仁中。在同一研究中，如之前描述，发现ORF2在细胞质中(Mueller等,2008)。研究之间观察到的差异暗示TTV分离株中发现的基因组多样性可能与病毒蛋白的表达和定位的不同策略相关(Mueller等,2008)。
已经暗示sTTV的转录谱与在人TTV's中发现的转录谱类似(Okamoto等,2002)，但仍缺乏实验证据。
由于无法在细胞培养中增殖sTTV，所以sTTV检测和诊断目前仍基于常规聚合酶链反应(PCR)方法。尤其对于检测ssDNA病毒如TTV’s，其甚至在感染相同的特异宿主或宿主群的亚群中都具有高度可变的基因组，因此选择合适的PCR引物结合位点以及如需要时的探针结合位点是至关重要的。
用于sTTV检测的PCR引物的常见问题是尽管它们可以对相同地理来源和相同基因型的sTTV毒株具有高度特异性，但它们可能不会与不同地理来源或另一种基因型的sTTV毒株反应。结果是，在猪群以及在生物材料中存在某些sTTV毒株可能仍未被注意。
如果仅检测动物中sTTV存在与否，很明显可靠且通用的用于检测猪群中sTTV的诊断工具是必要的。
此类工具还将对于监测sTTV的地理分布是必要的。尤其这能够揭示来自不同地理位置的猪中的某一地理来源或某一基因型的sTTV菌株的存在与否。
在疫苗生产领域还存在对可靠诊断工具的需求。许多猪病毒疫苗（并且不仅仅是猪疫苗）在细胞培养物中产生。某些细胞培养基组分和细胞系是猪来源的。因此重要的是检查在这些细胞培养物以及使用这些细胞培养物产生的疫苗中不存在sTTV。
存在能够在多种类型的样品材料中不仅给出存在的指示，而且还能给出sTTV的量的指示的定量方法和检测工具的更大需求。尤其是这将大大促进sTTV病理学的研究。
并且最重要的是，sTTV能够存在于组织中并且在那复制或不复制。已知TTV实际上发现于所有组织和器官中，但不知道发现它在那里是否仅是由于通过血液将它运输到那一组织，或者是否它在那里活跃地复制。
因此，能够区分sTTV在例如组织中仅仅存在而已与所述病毒在该组织中活跃复制的测试是高度需要的。这样的测试将使其可能检测细胞培养物中痕量的sTTV是否是或不是非复制形式。这将使在细胞培养物中的sTTV疫苗生产更为安全。
因此，存在对能够检测sTTV毒株而不考虑那些sTTV毒株的地理来源和基因型的可靠的方法和诊断工具的明确需求。并且此外，存在对能够检测此类sTTV毒株的病毒复制活性的可靠的方法和诊断工具的需求。
本发明的目标是提供这样的方法和诊断工具。
令人惊奇的是，目前已经发现特异性引物组（如需要的话，组合有特异性探针）能够检测sTTV毒株存在与否，而不考虑那些TTV毒株的地理来源和基因型。
在根据本发明的方法中，样品中TTV的检测现在可以通过进行以下方法步骤来完成：
a）使用引物组进行所述样品的聚合酶链反应（PCR），所述引物组包含结合具有如SEQIDNO.:1中所示序列的寡核苷酸FDNA-TTV的至少14个连续核苷酸的一段的正向引物和结合具有如SEQIDNO.:2中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-r1的至少14个连续核苷酸的一段的反向引物或结合具有如SEQIDNO.:3中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-r2的至少14个连续核苷酸的一段的反向引物，以及
b）检测步骤（a）的PCR扩增结果
使用术语“引物”来描述能够识别并且结合互补多核苷酸并且作为沿互补链进行核酸合成或复制的起始点的寡核苷酸。
术语“能够结合互补多核苷酸”表示能够在杂交条件下与该多核苷酸形成双链体结构。
术语“探针”指与目标多核苷酸互补并且能够在杂交条件下与该多核苷酸形成双链体结构的寡核苷酸。
词语“探针”基本上具有额外携带特异性标记物的引物多核苷酸的特征。这样的标记物尤其可以是荧光团，诸如用于例如TaqMan探针中的荧光团（见下文）。
本文使用术语“寡核苷酸”来描述核酸的短聚合物。这样的短聚合物通常会具有10-100个核酸的长度。
术语“杂交条件”涉及允许引物或探针与目标多核苷酸退火的条件。这些条件依赖于进行杂交的温度和溶液中的离子强度。杂交反应和条件是本领域众所周知的，并且尤其描述于由Maniatis/Sambrook的标准实验室手册中(34)。
对于确定杂交条件，基本使用以下公式：
对于长于13个核苷酸的序列的基础解链温度(Tm)计算，使用以下方程：
Tm=64.9+41*(yG+zC-16.4)/(wA+xT+yG+zC)
其中w、x、y和z分别是序列中碱基A、T、G和C的数目（来自Marmur,J.,和Doty,P.(1962)JMolBiol5:109-118）
额外信息提供于：Wallace,R.B.,Shaffer,J.,Murphy,R.F.,Bonner,J.,Hirose,T.,和Itakura,K.(1979)NucleicAcidsRes6:3543-3557和Sambrook,J.和Russell,D.W.(2001)MolecularCloning:ALaboratoryManual.ColdSpringHarborLaboratoryPress;ColdSpringHarbor,NY。
方程假定退火发生在50nMprimer、50mMNa+和pH7.0的标准条件下
对于基础盐调整的解链温度(Tm)计算，可以使用以下方程：
Tm=100.5+(41*(yG+zC)/(wA+xT+yG+zC))-(820/(wA+xT+yG+zC))+16.6*log10([Na+])
其中w、x、y和z分别是序列中碱基A、T、G和C的数目。
术语16.6*log10([Na+])调整Tm对盐浓度中的变化。（额外信息提供于：Howley,P.M;Israel,M.F.;Law,M-F.;和M.A.Martin"ArapidmethodfordetectingandmappinghomologybetweenheterologousDNAs.Evaluationofpolyomavirusgenomes."J.Biol.Chem.254,4876-4883,1979)。
PCR技术同样是本领域众所周知的，并且它们还广泛描述于标准实验室手册中，诸如“Real-TimePCR:CurrentTechnologyandApplications”、在“PCRprimers,alaboratorymanual”中和在Maniatis/Sambrook中(见下文的文献列表)。
技术人员的确认识到引物或探针不需要与目标多核苷酸完全互补，只要杂交条件使得退火能够发生而不管不完整的互补性。
原则上，可以通过降低Tm或通过改变盐浓度例如使用上文给出的方程或上文引用的文献中的大量信息来补偿一个或多个核苷酸的错配。
应该认识到使用具有错配的引物通常需要使用更低严格杂交条件。并且这有时依次可以导致更低的特异性。由于TTV基因组大小较小，所以这不会必然成为问题。具有错配的引物结合到非特异性TTV序列上的机率是非常小的。
然而，明确的是包含与具有如SEQIDNO.:1、2或3中所示序列的寡核苷酸的至少14个连续的核苷酸的一段100％互补匹配的引物是优选的。
根据本发明的引物和探针尤其可以用于在动物或该动物的样品中检测sTTV。
本文使用术语“样品”来指怀疑包含sTTV的任何生物材料。生物材料尤其可以是组织诸如猪肝组织、脾组织、骨组织或肌肉组织，但它还可以是体液诸如例如血液、尿、排泄物、羊水。材料还可以是泄殖腔、口腔或鼻腔拭子或例如破裂的细胞。
不言而喻待测试材料还可以是非猪来源的。非常可能的是怀疑非猪物种携带sTTV，或者对其测试以排除它们携带sTTV。
还称为PCR的聚合酶链反应包括以下步骤：在引物组存在的情况下加热DNA分子至高于解链温度的温度，随后冷却以允许引物组的引物结合各个互补DNA链。DNA-引物复合体形成了互补DNA链的合成的起始点，所述互补DNA链的合成在以三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs)的形式的四种DNA结构单元A、T、G和C存在的情况下使用酶DNA聚合酶。用这些结构单元，DNA聚合酶合成新的DNA链。
根据样品中sTTV-DNA的量（假设它存在），在存在可被检测的足够材料之前，将需要进行几个PCR循环。平均30-45循环将是正常的。技术人员将能够基于引物和探针的序列使用例如上文给出的或标准实验室手册中的公式来确定PCR循环的多个步骤的最佳温度条件。（见上文）。
术语“结合具有SEQIDNO.:中所示序列的寡核苷酸的至少14个连续核苷酸的一段的引物”意指引物应该至少具有结合该SEQIDNO中所示的寡核苷酸的至少14个连续核苷酸的一段的长度。仅仅作为实例：FDNA-TTV可以具有如SEQIDNO.:1中所示的序列cgaatggctgagtttatgccgc。因此，术语“结合具有如SEQIDNO.:1中所示序列的寡核苷酸的至少14个连续核苷酸的一段的引物”应该至少由来自核苷酸cgaatggctgagtttatgccgc以该顺序的至少14个连续核苷酸的一段组成。然而，它可以是更长的引物，其例如包含核苷酸cgaatggctgagtttatgccgc，并且在5’端和/或3’端具有一个或多个额外的核苷酸。
对于探针也是同样（尽管明确的是探针不应该具有猝灭分子不再猝灭荧光团的长度；见下文）。如SEQIDNO.:2中所示的寡核苷酸具有17个核酸的长度，但再一次地，根据本发明的引物或探针的寡核苷酸应该具有结合具有如SEQIDNO.:2中所示序列的寡核苷酸的至少14个连续核苷酸的最小长度。
如果选择的引物（或探针）在5’端和/或3’端具有额外的核苷酸，这样的核苷酸可能与或可能不与引物结合的互补链的3’-和/或5’-侧翼区互补。在某些情况下，多种RT-PCR循环的温度应该能够适应引物增加的长度并且适应额外的核苷酸的一个或多个是互补的这一事实。并且再一次地；技术人员将能够基于引物和探针的序列使用例如上文给出的或本文提及的PCR教科书中的公式来确定PCR循环的多个步骤的最佳温度条件（见上文）。
结合具有如SEQIDNO.:1-8中所示的序列的寡核苷酸的一段15、16、17、18、19或甚至20或更多个连续核苷酸（对于SEQIDNO:2最多为17）的引物优选以该优先顺序，这是由于它们对sTTV序列更加选择性地退火。
结合具有如SEQIDNO.:2和5中所示的序列的寡核苷酸的一段15、16、17、18、19、20或更多个连续核苷酸（对于SEQIDNO:2最多为17）的探针优选以该优先顺序，这是由于它们也对sTTV序列更加选择性地退火。
原则上，在本发明的方法的步骤a）之后，存在不同的方式进行步骤b）。PCR步骤产生其长度和量可以例如通过常规琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳检查的PCR产物。在sTTVDNA存在于样品中的情况下，引物对会退火并因此在步骤a）后，将在凝胶上检测到预期长度的PCR产物。如果样品中不存在sTTVDNA，引物对或引物的至少一条将无法退火，并且因此将不会检测到预期长度的PCR产物。
正如将注意到的，SEQIDNO:1、2、3、4和5中存在的寡核苷酸反映了各个病毒的序列在这些区域中的（少数）差异。开发引物的可能后果在下文中讨论（见下文）。
表1提供了69种已知的sTTV序列的序列比对，并且在该表中编号1-5的箭表示SEQIDNO:1、2、3、4和5大致所处的位置。
表1
如从表1中可见，包含结合FDNA-TTV的根据本发明的正向引物和结合RDNA-TTV-r1的根据本发明的反向引物的引物组或包含结合结合FDNA-TTV的本发明的正向引物和结合RDNA-TTV-r2的本发明的反向引物的引物组在所有情况下即与所有测试的野外分离株均能产生PCR产物，而无论它们的地理来源或它们的基因型。
如表1所示，由结合FDNA-TTV和RDNA-TTV-r2的引物组产生的PCR产物会具有大概83-88个核苷酸的长度。当然这依赖于两条引物之间区域的准确长度。并且由于引物之间区域的变异性高，甚至在sTTV组内，也不可能预测准确长度。然而，PCR产物的准确长度并不重要：只有PCR产物是否存在是相关的，而非它的准确大小。
潜在PCR产物通过常规琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳的耗时分析的替代方法是使用SYBRGreen体系（见上文和下文）。SYBRGreen是嵌入双链（ds）DNA的染料。这种嵌入导致SYBRGreen发出荧光。因此，如果在存在SYBRGreen的情况下完成PCR反应，每一新的dsDNA拷贝将获得一定量的SYBRGreen并导致其发出荧光。实时PCR仪器能够检测这种荧光并且专用软件能够从荧光的强度计算Ct值。这允许产生的cDNA的量的直接定量。（然而SYBRGreen的使用不允许指示反应步骤是否如预期进行的内部对照的存在）。基于SYBRGreen的RT-PCR方法已经由Mackay,I.M.等描述。
因此，上述方法提供了选择性地检测样品中sTTV存在与否的方法，而不管所述TTV毒株的地理来源或基因型。
因此，本发明的第一个实施方案涉及检测样品中存在猪细环病毒（sTTV）的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤
a）使用引物组进行所述样品的聚合酶链反应（PCR），所述引物组包含结合具有如SEQIDNO.:1中所示序列的寡核苷酸FDNA-TTV的至少14个连续核苷酸的一段的正向引物和结合具有如SEQIDNO.:2中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-r1的至少14个连续核苷酸的一段的反向引物或结合具有如SEQIDNO.:3中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-r2的至少14个连续核苷酸的一段的反向引物，以及
b）检测步骤（a）的PCR扩增结果
在该实施方案的优选方式中，引物组的一条引物结合具有如SEQIDNO.:1中所示序列的寡核苷酸FDNA-TTV的全长，并且引物组的另一条引物结合具有如SEQIDNO.:2中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-r1的全长或具有如SEQIDNO.:3中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-r2的全长。
仅仅作为实例：结合具有如SEQIDNO.:1中所示序列的寡核苷酸FDNA-TTV的全长的引物组的一条引物例如是22个核苷酸长度的引物或具有序列cgaatggctgagtttatgccgc。
将注意的是例如在SEQIDNO:1中，位置2处的核苷酸为S（即可以是G或C）。当涉及开发合适的引物时，位置2处的S没有太大影响。它位于相对远离引物延伸发生的点。引物将与在该位置上具有G的DNA和具有C的DNA退火。因此，具有序列cgaatggctgagtttatgccgc的引物和具有序列ccaatggctgagtttatgccgc的引物都是合适的。技术人员会知晓如何校正PCR步骤的温度以补偿可能的错配。
或者，可以使用简并引物，其包含具有序列cgaatggctgagtttatgccgc的引物和具有序列ccaatggctgagtttatgccgc的引物。
仅仅作为另一个实例：在位置18处的核苷酸R是更相关的，这是由于它位于靠近引物延伸发生的点。因此，将建议使用更短的引物诸如cgaatggctgagtttat，或者使用包含在位置18处具有A的引物和具有G的引物的简并引物。
对于SEQIDNO:1、2、3、4和5中给出的每一序列，存在明显的共有序列。这从表1中直接可见。
SEQIDNO:1的共有序列为cgaatggctgagtttatgccgc
SEQIDNO:2的共有序列为ctgggcgggtgccggag
SEQIDNO:3的共有序列为cggagtcaaggggcctatcgggcagg
SEQIDNO:4的共有序列为tgtctagccgcctgggcgggtgccggag
SEQIDNO:5的共有序列为cggagtcaaggggcctatcgggcagg
当设计结合这些序列的引物时，共有序列是优选的序列。
应注意以下内容：在表1中分析和呈现的sTTV序列的38中，SEQIDNO:4的序列为ygtctarcmgmctgggcgggtgccgvag。然而，在表1中分析和呈现的sTTV序列的31中，由于一个核苷酸的缺口，SEQIDNO:4的序列为ygtctarcgmctgggcgggtgccgvag。所述缺口位于相对远离引物延伸发生的点，所以当设计合适引物时，应该不必将它考虑在内。
检测PCR产物存在的更有效且选择性的方法是基于探针的实时PCR。
该方法基本上依赖于上述的PCR方法，但它具有超出上述PCR反应的选择性的选择性水平。根据本发明，它依赖于使用引物组，所述引物组包含结合具有如SEQIDNO.:1中所示序列的寡核苷酸FDNA-TTV的至少14个连续核苷酸的一段的正向引物和结合具有如SEQIDNO.:3中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-r2的至少14个连续核苷酸的一段的反向引物和结合具有如SEQIDNO.:2中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-r1的至少14个连续核苷酸的一段的探针。
结合寡核苷酸RDNA-TTV-r1的至少14个连续核苷酸的一段的探针与结合寡核苷酸RDNA-TTV-r1的至少14个连续核苷酸的一段的引物的区别在于此探针是具有附于其上的荧光团及猝灭剂分子的寡核苷酸。当涉及所用的荧光团或猝灭剂或者探针/猝灭剂组合背后的工作机制时，存在几个版本的此类探针。仅仅作为实例，此类探针作为TaqMan探针、Scorpions探针和MolecularBeacons探针是商品化的（见下文）。
在使用探针的该方法中，例如可以通过使用本发明的探针来完成检测。如上所述，该探针以选择性的方式结合例如使用根据本发明的FDNA-TTV/RDNA-TTV-r2结合引物组在PCR反应中生成的cDNA的内部序列。例如在毒株TTV2_(HM633239.1)/1-2797中（见表1），探针例如将在步骤b）中与来自对比的位置380-396的cDNARDNA-TTV-r2区退火。然而，这仅在扩增的DNA的确是sTTV来源的情况下发生。在不太可能的情况下，两种选择性引物将扩增非TTVDNA，由于探针将不会与它退火，因此这将在步骤b中被发现。因此，根据本发明的探针使得sTTV的检测比仅PCR反应特异的多。而且，探针的使用避免了使用凝胶检测PCR产物。并且最终，在实时PCR热循环仪中检测到的荧光水平与释放的荧光团并因此在PCR中存在的DNA模板的量直接成比例（见下文）。因此该方法非常适合于实时PCR反应。
基于TaqMan的实时RT-PCR方法是由AppliedBiosystems,850LincolnCentreDrive,FosterCity,CA94404,USA发展来。
基于TaqMan的实时RT-PCR方法尤其描述在文献参考8、10和33中。
基于Scorpions和Molecularbeacons的实时RT-PCR方法经PREMIERBiosoftInternational,3786CorinaWay,PaloAltoCA94303-4504,USA是商品化的。
基于MolecularBeacons的实时PCR的使用尤其详细描述于：由Manganelli,R.,Tyagi,S.和Smith,I.的MolecularBeacons;ANewTooltoIdentifyPointMutationsandtoAnalyzeGeneExpressioninMycobacteriumtuberculosis,在:MethodsinMolecularMedicine,第54卷:page295-310中,MycobacteriumTuberculosisProtocols,由:T.Parish和N.G.Stoker编辑?HumanaPressInc.,Totowa,NJ。
TaqMan探针由与寡核苷酸探针的5'端共价结合的荧光团和3'端的猝灭剂组成。几种不同的荧光团（例如6-羧基荧光素，缩写词：FAM、或四氯二氢荧光素，缩写词：TET）和猝灭剂（例如四甲基罗丹明，缩写词：TAMRA、或二氢环吡咯并吲哚三肽小沟结合物，缩写词：MGB）是可用的。猝灭剂分子猝灭当由循环仪的经FRET（荧光共振能量转移）的光源激发时荧光团发出的荧光。只要荧光团和猝灭剂接近，猝灭就能抑制任何荧光信号。
设计TaqMan探针从而使它们在由特异引物的组扩增的DNA区域内退火。由于Taq聚合酶延伸引物并且合成新生链，所以聚合酶的5'至3'的外切核酸酶活性降解已经与模板退火的探针。探针的降解将荧光团从其上释放出并且破坏了与猝灭剂的紧密靠近，因此解除了猝灭效应并允许荧光团发荧光。因此，在实时PCR热循环仪中检测到的荧光与释放的荧光团以及在PCR中存在的DNA模板的量直接成比例。
Taqman探针是用于根据本发明的方法和诊断工具中的优选探针。
实际上，本文描述的Taqman探针ProbeTTV-r1是结合如SEQIDNO.:2中所示的DNA序列的寡核苷酸，但是具有附于其上的荧光团和猝灭剂。但如同解释的（见上文），探针还可以是结合具有如SEQIDNO.:2中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-r1的至少14个连续核苷酸的一段的更短或更长的寡核苷酸。
由于在该方法中引物和探针的退火均在同一过程中发生，所以显色反应的发生实际上在DNA扩增的同一时刻发生。因此，此类反应也称为实时PCR反应。
因此，该实施方案的另一个优选形式涉及检测样品中存在猪细环病毒（sTTV）的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤
a）使用引物组进行所述样品的聚合酶链反应（PCR），所述引物组包含结合具有如SEQIDNO.:1中所示序列的寡核苷酸FDNA-TTV的至少14个连续核苷酸的一段的正向引物和结合具有如SEQIDNO.:3中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-r2的至少14个连续核苷酸的一段的反向引物，以及b）使用结合具有如SEQIDNO.:2中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-r1的至少14个连续核苷酸的一段的探针检查步骤（a）的PCR扩增结果。
在该实施方案的更优选方式中，引物组的一条引物结合具有如SEQIDNO.:1中所示序列的寡核苷酸FDNA-TTV的全长，并且引物组的另一条引物结合具有如SEQIDNO.:3中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-r2的全长。
在该实施方案的另一个更优选方式中，探针结合具有如SEQIDNO.:2中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-r1的全长。
如上所述，sTTV能够存在于组织中并且在那里复制或不复制。已知TTV实际上发现于所有组织和器官中，但不知道发现它在组织中是否仅是由于通过血液将它运输到该组织，或者是否它在那里活跃地复制。
因此，能够区分sTTV在例如组织中仅仅存在与所述病毒在该组织中活跃复制的测试是高度需要的。
这样的检测将还使得检测细胞培养物中痕量的sTTV是否处于灭活的形式成为可能：确证不存在sTTV病毒复制将使在细胞培养物中的病毒疫苗生产更安全。
TTV的基因组复制经滚环模型进行：复制过程中，使用负链基因组病毒DNA链作为模板产生正链的ssDNA，并且该正链DNA依次作为模板来产生新的负链DNA。原则上，正链DNA能够用于检测复制；使用特异性结合正DNA链的引物的链特异性PCR测试（ssPCR）能够随后用于显示DNA复制。然而，当TTV进入非允许细胞（即不支持包括形成新病毒颗粒在内的病毒的完整的、生产性的、复制周期的细胞）时，会产生问题。在此类非允许细胞中，细胞机制将仍然开始复制病毒ssDNA，并且随后会形成正链DNA，错误地暗示生产性的病毒复制。因此，ssPCR不是确定生产性的病毒复制的可靠测试。
对病毒复制的更可靠的指标是存在sTTVmRNA，这是由于活跃的病毒复制经mRNA’s的出现揭示了其自身。可以随后通过逆转录酶聚合酶链反应（还称为RT-PCR）检测这样的mRNA’s。
然而，多种sTTV’s基因组序列中的高度变异性使得其难于鉴定用于逆转录酶聚合酶链反应（RT-PCR）的通用引物。
由于除了在多种sTTV’s之间似乎存在剪切模式的显著不同这一事实之外，关于sTTV’s中RNA剪切模式所知不多的事实，所以产生了第二个问题。由于sTTV病毒复制的剪切特征，很可能的是某些引物可能根本无法使用，这是由于它们与RNA剪切后丢失的区域退火。mRNA剪切后，此类区域将丢失，并因此将不会发现RT-PCR产物。并且这随后会导致没有发生病毒sTTV复制的错误指示。
令人惊奇的是，目前发现PCR引物结合的区域RDNA-TTV-r1和RDNA-TTV-r2也存在于sTTV’s的mRNA中。更为令人惊奇的是，发现这些区域位于在mRNA剪切过程中剪切掉的区域之外。因此，这些区域始终存在于sTTV’s的mRNA中，无论伴随任何sTTV的mRNA剪切模式。
这表示区域RDNA-TTV-r1和RDNA-TTV-r2还能在用于在sTTV’s（不管它们的地理来源或它们的基因型）的病毒复制过程中检测mRNA的RT-PCR反应中用于开发正向引物。
因此该测试首次允许区分sTTVssDNA在组织中仅仅存在与病毒在该组织中的活跃复制。
逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)包括两个反应步骤。在第一步中，允许引物组的引物之一结合TTV-RNA，并且该复合体形成了在四种DNA结构单元A、T、G和C存在的情况下经酶逆转录酶（RNA依赖的DNA聚合酶）RNA链的cDNA链的合成的起始点。
在第二步中，将由此形成的RNA-DNA杂交物加热以将杂交物变性，随后冷却以允许引物组的另一条引物结合cDNA链。该另一条引物随后作为再次在DNA结构单元存在的情况下经DNA聚合酶的第二DNA链的合成的起始点。
根据样品中sTTV-RNA的量（假设它存在），在存在可被检测的足够材料之前，将需要进行几个PCR循环。平均30-45循环将是正常的。技术人员将能够根据引物和探针的序列使用例如上文给出的和上述教科书中的公式来确定PCR循环的多个步骤的最佳温度条件。（见上文）。
如上所述，合适的正向引物是与RDNA-TTV-r1和RDNA-TTV-r2互补的引物。
根据本发明的此类正向引物结合具有如SEQIDNO.:4中所示序列的寡核苷酸FRNA-a的至少14个连续核苷酸的一段或具有如SEQIDNO.:5中所示序列的寡核苷酸FRNA-b的至少14个连续核苷酸的一段。
作为反向引物，使用结合mRNAs的聚腺苷酸尾的引物。此类引物因此将包含聚T段。优选此类引物由至少14个连续的T组成。
为了避免此类引物与聚腺苷酸尾的任何部分随机结合，反向引物优选在聚T段的3'端携带有核苷酸G、核苷酸C或核苷酸A。这会允许引物与聚腺苷酸尾的5'端的特异结合。如果从病毒序列中已知聚腺苷酸尾之前的最后一个核苷酸的特征，则可以使聚T段的3'端的核苷酸与该最后一个核苷酸互补。如果该特征是未知的，则可以成功使用三种聚T引物的混合物，每一种在聚T段的3'端具有G、C或A。
因此，本发明的反向引物包含结合具有如SEQIDNO.:6中所示序列的寡核苷酸RRNA-1的最5'末端核苷酸、具有如SEQIDNO.:7中所示序列的寡核苷酸RRNA-2或具有如SEQIDNO.:8中所示序列的寡核苷酸RRNA-3的至少14个连续核苷酸的一段。
仅仅作为实例；根据本发明的并结合具有如SEQIDNO.:6中所示序列的寡核苷酸RRNA-1的至少14个连续的5'末端核苷酸的一段的反向引物例如可以具有核苷酸序列TTTTTTTTTTTTTTTA、TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTA或TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTA。
T/A双链体的解链温度相对低。因此，如需要的话，结合聚腺苷酸尾的引物可以在5'端与例如15个核苷酸的已知但随机序列延伸。如果使用这样的5'延伸引物，引物的聚T部分与mRNA的聚腺苷酸尾之间的成功退火需要在仅一个PCR循环中成功。在随后的循环中，由于可以使用与聚T引物的5'延伸互补的第二引物，因此退火反应将更为有效。
因此，本发明的另一个实施方案涉及检测样品中存在复制性sTTV的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤
a）使用引物组进行所述样品的逆转录酶聚合酶链反应（RT-PCR），所述引物组包含结合具有如SEQIDNO.:4中所示序列的寡核苷酸FRNA-a的至少14个连续核苷酸的一段的正向引物、或结合具有如SEQIDNO.:5中所示序列的寡核苷酸FRNA-b的至少14个连续核苷酸的一段的反向引物、和至少一条结合具有如SEQIDNO.:6中所示序列的寡核苷酸RRNA-1、具有如SEQIDNO.:7中所示序列的寡核苷酸RRNA-2或具有如SEQIDNO.:8中所示序列的寡核苷酸RRNA-3的至少14个连续的5'末端核苷酸的一段的反向引物，以及
b）检测步骤（a）的RT-PCR扩增结果
作为正向引物，优选使用结合寡核苷酸FRNA-a的至少14个连续核苷酸的一段的引物：这将允许使用结合寡核苷酸FRNA-b的至少14个连续核苷酸的一段的探针用于检测实时RT-PCR反应中的RT-PCR产物。
因此，本实施方案的优选形式涉及根据本发明的用于检测复制性sTTV存在的方法，其特征在于所述正向引物结合如SEQIDNO.:4中所示序列的寡核苷酸FRNA-a的至少14个连续核苷酸的一段。
基本上结合如SEQIDNO.:5中所示序列的寡核苷酸FRNA-b的至少14个连续核苷酸的一段的探针包含猝灭剂分子和荧光团。
因此，本实施方案的更优选形式涉及根据本发明的检测复制性sTTV存在的方法，其特征在于所述方法还包括使用结合如SEQIDNO.:5中所示序列的寡核苷酸FRNA-b的至少14个连续核苷酸的一段的探针检测步骤（a）的PCR扩增结果的步骤。
理想状态下，上述用于检测sTTVDNA的方法和上述用于检测sTTV病毒复制的方法将同时在一个小瓶中应用。这将允许sTTVDNA的存在和sTTV病毒复制的同时检测。
然而，应该注意的是要正确选择用于检测DNA和RNA的引物。如果使用结合FDNA-TTV和RDNA-TTV-r2的引物检测DNA，应该避免使用结合FRNA-b的引物检测mRNA，这是由于在这种情况下，结合FRNA-b的引物会与结合RDNA-TTV-r2的引物退火。由于同样原因，如果使用结合FDNA-TTV和RDNA-TTV-r1的引物检测DNA，应该避免使用结合FRNA-a的引物检测mRNA，这是由于在这种情况下，结合FRNA-a的引物会与结合RDNA-TTV-r1的引物退火。
由于同样原因，如果使用结合RDNA-TTV-r2的引物检测DNA，并且使用结合FRNA-a的引物检测RNA，则随后不能使用与RDNA-TTV-r1和FRNA-b互补的探针检测DNA和RNA。因此，不能使用根据本发明的探针完成各个PCR产物和RT-PCR产物的同时检测。因此，应该通过其他方法诸如凝胶电泳分析这些产物。
因此，本发明的另一个实施方案涉及用于检测样品中复制性sTTV存在的方法，其特征在于所述方法包括以下同时的步骤
a）使用引物组进行所述样品的聚合酶链反应（PCR），所述引物组包含结合具有如SEQIDNO.:1中所示序列的寡核苷酸FDNA-TTV的至少14个连续核苷酸的一段的正向引物和结合具有如SEQIDNO.:3中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-r2的至少14个连续核苷酸的一段的反向引物，以及
b）使用引物组进行所述样品的逆转录酶聚合酶链反应（RT-PCR），所述引物组包含结合具有如SEQIDNO.:4中所示序列的寡核苷酸FRNA-a的至少14个连续核苷酸的一段的正向引物和至少一条结合具有如SEQIDNO.:6中、SEQIDNO.:7中或SEQIDNO.:8中所示序列的寡核苷酸RRNA-1、2或3的至少14个连续核苷酸的一段的反向引物，以及
c）检测步骤a）和b）中的PCR扩增结果
并且本发明的又另一个实施方案涉及检测样品中复制性sTTV存在的方法，其特征在于所述方法包括以下同时的步骤a）使用引物组进行所述样品的聚合酶链反应（PCR），所述引物组包含结合具有如SEQIDNO.:1中所示序列的寡核苷酸FDNA-TTV的至少14个连续核苷酸的一段的正向引物和结合具有如SEQIDNO.:2中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-r1的至少14个连续核苷酸的一段的反向引物，以及
b）使用引物组进行所述样品的逆转录酶聚合酶链反应（RT-PCR），所述引物组包含结合具有如SEQIDNO.:5中所示序列的寡核苷酸FRNA-b的至少14个连续核苷酸的一段的正向引物和至少一条结合具有如SEQIDNO.:6中、SEQIDNO.:7中或SEQIDNO.:8中所示序列的寡核苷酸RRNA的至少14个连续核苷酸的一段的反向引物，以及c）检测步骤a）和b）中的(RT)-PCR扩增结果
如同对由上述分别结合FDNA-TTV和RDNA-TTV-r2的引物组产生的DNAPCR产物的讨论，当使用例如包含结合FRNA-a的正向引物和结合RRNA-1的反向引物的引物组时，无法给出RT-PCR产物的准确长度。首先；由于引物之间区域的变异性高，甚至在sTTV组内，也不可能预测这些产物的准确长度。并且此外，对于RT-PCR产物，由于对TTV’s已知如此之多的剪切变体，因此这也是更为不可预知的。然而，同样地，RT-PCR产物的准确长度并不重要：只有RT-PCR产物是否存在是相关的，而非它的准确大小。
可以通过加入所谓的内部对照RNA(ICRNA)来进一步改善本发明依赖于RT-PCR的方法。实际上，内部对照是平行实验，其中向测试样品中加入一定量的对照RNA以及对对照RNA(IC-RNA)特异的引物和探针。（或者，尽管不那么优选，但可以分别在平行的RT-PCR试验中检测对照RNA和引物及探针）。此类引物和探针应该是非TTV相关的；如果它们是TTV相关的，则它们可能会干扰方法的TTV特异性部分。
明确的是TTV探针的荧光团和非TTV探针的荧光团的颜色必须不同，以区别TTV特异性荧光和IC-RNA特异性荧光。
由于显示IC-RNA存在的成功反应的所有组分均存在，因此将存在特异性荧光，指示多个方法步骤是成功的。优选地，在与sTTV检测测试相同的试管中进行IC-RNA试验。因此，如果检测到IC-RNA特异性荧光团的荧光，则这样的试验是可靠的，并且如果检测到TTV特异性荧光团的额外荧光，其证明存在TTV材料。
如果检测到IC-RNA特异性荧光团的荧光，但没有检测到TTV特异性荧光团的荧光，其证明不存在TTV材料。
如果没有检测到IC-RNA特异性荧光团的荧光，则试验是不可靠的并应该不予考虑。
因此，使用内部对照对于排除由于例如无效的RNA分离、无效的逆转录酶反应或PCR的抑制的假阴性结果是重要的。
原则上，可以使用合成RNA作为内部对照的起始材料。作为RNA合成片段的替代物，可以使用宿主的或来自不同病原体的持家基因或不同基因作为内部对照。然而，它们未知且变化的浓度、不稳定性和生物安全性考虑使得它们比体外转录的RNA更难于操作并整合到PCR测定中。
为此原因，优选的内部对照体系是由Hoffmann等设计的通用异源内部对照体系。它基于RNA并且能容易地适应并整合到测定中以检测成功的RNA提取和RT-PCR。
因此，该实施方案的还更优选的形式涉及本发明的方法，其特征在于进行所述方法的实时RT-PCR反应的步骤还使用至少一个额外的非TTV相关的引物组和至少一种额外的非TTV相关的RNA模板。
如果需要PCR反应的定量，可以进行单独的平行测试，其中存在已知量的TTV-DNA或TTV-mRNA和根据本发明的引物和探针。这将允许绘制标准曲线，其提供了平行测试中DNA或RNA的量与达到荧光检测阈值所需的循环数之间的关系。随后这些标准曲线可以用于确定样品中TTV-DNA或TTV-mRNA未知的量。
因此，将进行单独的平行测试以生成随后用于定量样品中TTV-DNA或TTV-mRNA的量的标准曲线的根据本发明的方法称为定量方法。
明确的是生物材料优选进行进一步的纯化步骤。
由于检测sTTV的方法基于病毒ssDNA和/或mRNA，因此优选从样品中纯化该ssDNA和RNA至某一范围。该方面中的纯化表示在将样品进行本发明的方法之前，将样品中除TTV-DNA或mRNA之外的材料从样品中去除至某一范围。此类纯化例如可以包括去蛋白化作用、去除细胞碎片、DNA提取、RNA提取等。
因此，本发明的还更优选的形式涉及本发明的方法，其特征在于所述方法在步骤a）之前包括RNA和/或DNA纯化步骤。
本发明的另一个实施方案涉及引物组，所述引物组包含结合具有如SEQIDNO.:1中所示序列的寡核苷酸FDNA-TTV的至少14个连续核苷酸的一段的正向引物和结合具有如SEQIDNO.:2中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-r1的至少14个连续核苷酸的一段的反向引物或结合具有如SEQIDNO.:3中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-r2的至少14个连续核苷酸的一段的反向引物。
本发明的进一步的实施方案涉及引物组，所述引物组包含结合具有如SEQIDNO.:4中所示序列的寡核苷酸FRNA-a的至少14个连续核苷酸的一段的正向引物、或结合具有如SEQIDNO.:5中所示序列的寡核苷酸FRNA-b的至少14个连续核苷酸的一段的正向引物、和至少一条结合具有如SEQIDNO.:6中所示序列的寡核苷酸RRNA-1、具有如SEQIDNO.:7中所示序列的寡核苷酸RRNA-2或具有如SEQIDNO.:8中所示序列的寡核苷酸RRNA-3的至少14个连续的5'末端核苷酸的一段的反向引物。
本发明还另一个实施方案涉及探针，所述探针结合具有如SEQIDNO.:2中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-r1的至少14个连续核苷酸的一段或具有如SEQIDNO.:5中所示序列的寡核苷酸FRNA-b的至少14个连续核苷酸的一段。
本发明的又另一个实施方案涉及用于检测样品中猪细环病毒(sTTV)存在的诊断测试试剂盒。此类试剂盒允许实施本发明的方法。
因此，本实施方案的第一种形式涉及用于检测样品中猪细环病毒(sTTV)存在的诊断测试试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含至少一个引物组，所述引物组包含结合具有如SEQIDNO.:1中所示序列的寡核苷酸FDNA-TTV的至少14个连续核苷酸的一段的正向引物和结合具有如SEQIDNO.:2中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-r1的至少14个连续核苷酸的一段的反向引物或结合具有如SEQIDNO.:3中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-r2的至少14个连续核苷酸的一段的反向引物。
在本实施方案的优选形式中，所述用于检测存在sTTV的诊断测试试剂盒还包含结合具有如SEQIDNO.:2中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-r1的至少14个连续核苷酸的一段的探针。
又另一个实施方案涉及用于检测样品中存在复制性sTTV的诊断测试试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含引物组，所述引物组包含结合具有如SEQIDNO.:4中所示序列的寡核苷酸FRNA-a的至少14个连续核苷酸的一段的正向引物、或结合具有如SEQIDNO.:5中所示序列的寡核苷酸FRNA-b的至少14个连续核苷酸的一段的正向引物、和至少一条结合具有如SEQIDNO.:6中所示序列的寡核苷酸RRNA-1、具有如SEQIDNO.:7中所示序列的寡核苷酸RRNA-2或具有如SEQIDNO.:8中所示序列的寡核苷酸RRNA-3的至少14个连续的5'末端核苷酸的一段的反向引物。
在本实施方案的优选形式中，所述用于检测存在复制性sTTV的诊断测试试剂盒还包含结合具有如SEQIDNO.:5中所示序列的寡核苷酸FRNA-b的至少14个连续核苷酸的一段的探针。
这些不同的引物和探针可以存在于试剂盒中不同的小瓶内。它们还可以存在于一个相同的小瓶内。为了便于操作并避免污染的不必要风险，它们甚至可以存在于加入样品的测试小瓶中。
它们将优选以干燥形式存在，以便在室温储藏条件下使它们保持稳定。
还另一个实施方案涉及用于同时检测样品中sTTVssDNA存在和sTTV病毒复制的诊断测试试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含含有结合具有如SEQIDNO.:1中所示序列的寡核苷酸FDNA-TTV的至少14个连续核苷酸的一段的正向引物和结合具有如SEQIDNO.:3中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-r2的至少14个连续核苷酸的一段的反向引物的引物组、以及含有结合具有如SEQIDNO.:4中所示序列的寡核苷酸FRNA-a的至少14个连续核苷酸的一段的正向引物和至少一条结合具有如SEQIDNO.:6中、SEQIDNO.:7中或SEQIDNO.:8中所示序列的寡核苷酸RRNA的至少14个连续核苷酸的一段的反向引物的引物组。
还另一个实施方案涉及用于同时检测样品中sTTVssDNA存在和sTTV病毒复制的诊断测试试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括含有结合具有如SEQIDNO.:1中所示序列的寡核苷酸FDNA-TTV的至少14个连续核苷酸的一段的正向引物和结合具有如SEQIDNO.:2中所示序列的寡核苷酸RDNA-TTV-r1的至少14个连续核苷酸的一段的反向引物的引物组、以及含有结合具有如SEQIDNO.:5中所示序列的寡核苷酸FRNA-b的至少14个连续核苷酸的一段的正向引物和至少一条结合具有如SEQIDNO.:6中、SEQIDNO.:7中或SEQIDNO.:8中所示序列的寡核苷酸RRNA的至少14个连续核苷酸的一段的反向引物的引物组。
根据本发明的诊断测试试剂盒可以还包含逆转录酶和/或热稳定DNA聚合酶。这些酶对于进行实时RT-PCR是必需的，并且为了便于使用，因此它们可以已被整合入诊断测试试剂盒中。
如果需要实时RT-PCR的内部对照，第二组引物和探针（在这种情况下为如上讨论的非TTV引物和非TTVRNA模板和非TTV探针）以及IC-RNA可以包括在诊断测试试剂盒中。不言而喻四种DNA结构单元和必要的缓冲液还可以包括在诊断测试试剂盒中。
如果需要(RT)-PCR反应的定量，可以进行平行测试，其中存在已知量的TTV-RNA和/或TTV-DNA和根据本发明的引物和探针。这将允许绘制标准曲线，其提供了平行测试中RNA和/或DNA的量与达到荧光阈值所需的循环数之间的关系。然后这些标准曲线可以用于确定样品中TTV-RNA和/或TTV-DNA的量。因此，优选诊断测试试剂盒还包含允许进行定量的已知量的TTV-RNA和/或TTV-DNA。
在下文中，给出如何进行根据本发明的方法的实施例。不言而喻实施例不应理解为以任何方式限制本发明的范围。
附图说明。
图1：用于猪TTV的广谱qPCR的扩增曲线（图1a）和标准曲线（图1b）图。在扩增图中，灰色曲线代表标准稀释度系列并且黑色曲线代表样品。在标准曲线图中，点代表标准稀释度系列并且交叉代表样品。
图2：扩增子的解链峰。灰色曲线代表标准稀释度系列并且黑色曲线代表样品。所有样品均显示具有85.0℃-86.5℃的解链温度的一个峰，说明测定到的荧光仅来源于PCR产物。
图3：包含sTTV基因型2(sTTV2)病毒的323个碱基对的质粒TTV008的示意图。
实施例
实施例1
用于检测sTTV病毒DNA的定量实时PCR
所用设备
0.2ml热条(thermo-strip):ThermoScientific(Westburg)
硬壳96孔PCR板:Biorad(目录号HSP-9635)
微密封‘B’膜:Biorad(目录号MSB1001)
IsoFreezeTMPCR冷却架:IsoFreeze
加热块:Thermomixercomfort(Eppendorf)
微量离心机:Eppendorf5418
用于微量滴定板的离心机:Eppendorf5804R
PCR工作站:HerolabCleneCab
CFX96实时系统:Biorad。
DNA的分离
使用QIAamp?MinElute?VirusSpinKit(Qiagen目录号57704)从来源于5只不同的猪的200μl血清中分离DNA。使用如生产商在随试剂盒提供的手册中描述的方法。
使用缓冲液AVE作为蛋白酶重悬缓冲液并且用缓冲液AW1进行推荐的洗涤步骤。不进行推荐的在56℃下的膜干燥。
为了从柱上洗脱DNA，使用50μl的缓冲液AVE。
PCR反应
15个反应的预混液：
187.5μliQ?-SYBR?GreenSupermix(BioRad,catno.170-8882)
82.5μl注射用水
15.0μl10μM正向引物:TTVall-F1:
15.0μl10μM反向引物:TTVall-R4:
300.0μl
向96孔板的13个孔中加入20μl的预混液和5μl分离的DNA、标准稀释度系列的质粒DNA或水。
标准稀释度系列：
标准稀释度系列包含具有5x105拷贝/μl降至5x100拷贝/μl的浓度的质粒TTV008(包含TTSuV-型2的5’UTR的320bp片段，见附录1)的6个样品。由于向每一PCR反应中加入5μl标准品，因此PCR中的标准稀释度曲线范围从2.5x106拷贝-2.5x101拷贝的DNA。
PCR仪编程
如下编程CFX96Real-TimeSystem(BioRad)：
结果
图1显示了用于猪TTV的广谱qPCR的扩增曲线（图1a）和标准曲线（图1b）图。在扩增图中，灰色曲线代表标准稀释度系列并且黑色曲线代表样品并且无模板对照。在标准曲线图中，点代表标准稀释度系列并且交叉代表样品。
表A.属于扩增和标准曲线图的数据。起始量为5μlDNA分离物中TTSuV颗粒的量，其被加入PCR中。
图2显示了扩增子的解链峰。灰色曲线代表标准稀释度系列并且黑色曲线代表样品。所有样品均显示具有85.0℃-86.5℃的解链温度的一个峰，说明测定的荧光仅来源于PCR产物。
表B.属于解链峰图的数据。
结论
所有5个样品均显示为TTV阳性。浓度范围为1.34x104-2.34x101拷贝/反应，其等同于6.71x105-1.17x103拷贝的TTVDNA/ml血清。
实施例2.
用于检测sTTV病毒mRNA的RT-PCR
将从2.5x105个猪肾（PK）细胞中提取总RNA。将使用600μlTRIZOL?试剂(Invitrogen)和120μl1-溴-3-氯丙烷(BCP,Sigma)破裂细胞，随后将悬浮液在4oC下以12,000xg离心15分钟。将获得水相，用300μl100%异丙醇沉淀并随后在4oC下以12,000xg离心10分钟。用1ml75%乙醇洗涤所获的RNA沉淀并在空气中干燥。随后将RNA溶解于无RNase的水中。使用TURBODNA-freeTM试剂盒(Ambion,AppliedBiosystems)从RNA制品中去除污染的DNA。简述之，每10μg的RNA加入2单位的DNase，在37oC下孵育30分钟。将DNase失活并通过以10.000xg离心1,5分钟从RNA样品中去除，并将RNA转移至新管中。随后使用NanoDrop(ThermoFisherScientific)分光光度计将RNA定量并且检测纯度。
按照生产商的方案使用多dT引物(5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTV-3’(V=A/C/G))和SuperScriptmII逆转录酶(RT)系统(InvitrogenCorporation)将500ng如此获得的RNA转变为互补DNA(cDNA)。使用无菌水代替SuperscripttmIIRT进行负RT对照。为了确定存在TTSuVsmRNA，使用多dT引物和FW1(5’-CTGGGCGGGTGCCG-3’)或FW2(5’-AGTCAAGGGGCCTATCGRGC-3’)进行PCR。随后将扩增产物在1,8%的琼脂糖凝胶上电泳，并从凝胶中提取PCR产物，并测序以确定正确的扩增。
序列表
<110>IntervetInt.B.V.
<120>细环病毒诊断学
<130>2011.019
<160>9
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>猪细环病毒
<400>1
csaatggcwgartytatrccgc22
<210>2
<211>17
<212>DNA
<213>猪细环病毒
<400>2
ctgggcgggtgccgvag17
<210>3
<211>26
<212>DNA
<213>猪细环病毒
<400>3
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<210>4
<211>28
<212>DNA
<213>猪细环病毒
<400>4
ygtctarcmgmctgggcgggtgccgvag28
<210>5
<211>26
<212>DNA
<213>猪细环病毒
<400>5
cgragycaagggrcywaycgrgcdgg26
<210>6
<211>25
<212>DNA
<213>猪细环病毒
<400>6
taaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa25
<210>7
<211>25
<212>DNA
<213>猪细环病毒
<400>7
gaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa25
<210>8
<211>25
<212>DNA
<213>猪细环病毒
<400>8
caaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa25
<210>9
<211>323
<212>DNA
<213>猪细环病毒
<400>9
agttacacataaccaccaaaccacaggtaaactctgcaaaaaagaggaaataaatctcat60
tggttgggccagaagtcctcattagaatactaaaaggaccaatcagaaacacttcctctt120
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cgaacagagctgagtgtctaaccgcctgggcgggtgccggagctcctgagagcggagtca240
aggggcctatcgggcaggcggtaatccagcggaaccgggcccccccctcaatggaagaaa300
gatggctgacggtagcgtactgc323

Claims (12)

1.引物组在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于通过包括以下步骤的方法检测样品中复制性sTTV的存在
a）使用引物组进行所述样品的逆转录酶聚合酶链反应（RT-PCR），所述引物组包含结合由如SEQIDNO.:4中所示序列组成的寡核苷酸FRNA-a的至少14个连续核苷酸的一段的正向引物，或结合由如SEQIDNO.:5中所示序列组成的寡核苷酸FRNA-b的至少14个连续核苷酸的一段的正向引物，和至少一条结合由如SEQIDNO.:6中所示序列组成的寡核苷酸RRNA-1、由如SEQIDNO.:7中所示序列组成的寡核苷酸RRNA-2或由如SEQIDNO.:8中所示序列组成的寡核苷酸RRNA-3的至少14个连续的5'末端核苷酸的一段的反向引物，以及
b）检查步骤（a）的RT-PCR扩增结果。
2.根据权利要求1的用途，其特征在于所述正向引物结合具有如SEQIDNO.:4中所示序列的寡核苷酸FRNA-a的至少14个连续核苷酸的一段。
3.权利要求2的用途，其特征在于所述方法还包括使用结合具有如SEQIDNO.:5中所示序列的寡核苷酸的至少14个连续核苷酸的一段的探针检查步骤（a）的PCR扩增结果的步骤。
4.引物组在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于通过包括以下同时的步骤的方法检测样品中复制性sTTV的存在
a）使用引物组进行所述样品的聚合酶链反应（PCR），所述引物组包含结合由如SEQIDNO.:1中所示序列组成的寡核苷酸FDNA-TTV的至少14个连续核苷酸的一段的正向引物和结合由如SEQIDNO.:3中所示序列组成的寡核苷酸RDNA-TTV-r2的至少14个连续核苷酸的一段的反向引物，以及
b）使用引物组进行所述样品的逆转录酶聚合酶链反应（RT-PCR），所述引物组包含结合由如SEQIDNO.:4中所示序列组成的寡核苷酸FRNA-a的至少14个连续核苷酸的一段的正向引物和至少一条结合由如SEQIDNO.:6中所示序列组成的寡核苷酸RRNA-1、由如SEQIDNO.:7中所示序列组成的寡核苷酸RRNA-2或由如SEQIDNO.:8中所示序列组成的寡核苷酸RRNA-3的至少14个连续核苷酸的一段的反向引物，以及
c）检查步骤a）和b）的(RT)-PCR扩增结果。
5.引物组在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于通过包括以下同时的步骤的方法检测样品中复制性sTTV的存在
a）使用引物组进行所述样品的聚合酶链反应（PCR），所述引物组包含结合由如SEQIDNO.:1中所示序列组成的寡核苷酸FDNA-TTV的至少14个连续核苷酸的一段的正向引物和结合由如SEQIDNO.:2中所示序列组成的寡核苷酸RDNA-TTV-r1的至少14个连续核苷酸的一段的反向引物，以及
b）使用引物组进行所述样品的逆转录酶聚合酶链反应（RT-PCR），所述引物组包含结合由如SEQIDNO.:5中所示序列组成的寡核苷酸FRNA-b的至少14个连续核苷酸的一段的正向引物和至少一条结合由如SEQIDNO.:6中所示序列组成的寡核苷酸RRNA-1、由如SEQIDNO.:7中所示序列组成的寡核苷酸RRNA-2或由如SEQIDNO.:8中所示序列组成的寡核苷酸RRNA-3的至少14个连续核苷酸的一段的反向引物，以及
c）检查步骤a）和b）的(RT)-PCR扩增结果。
6.权利要求1-5任一项的用途，其特征在于所述方法的进行PCR和/或RT-PCR反应的步骤还包括至少一个额外的非TTV相关的引物组和至少一种额外的非TTV相关的模板。
7.权利要求1-6任一项的用途，其特征在于所述方法在步骤a）之前包括RNA和/或DNA纯化步骤。
8.一种引物组，其包含结合由如SEQIDNO.:4中所示序列组成的寡核苷酸FRNA-a的至少14个连续核苷酸的一段的正向引物，或结合由如SEQIDNO.:5中所示序列组成的寡核苷酸FRNA-b的至少14个连续核苷酸的一段的正向引物，和至少一条结合由如SEQIDNO.:6中所示序列组成的寡核苷酸RRNA-1、由如SEQIDNO.:7中所示序列组成的寡核苷酸RRNA-2或由如SEQIDNO.:8中所示序列组成的寡核苷酸RRNA-3的至少14个连续的5'末端核苷酸的一段的反向引物。
9.一种诊断测试试剂盒，其用于检测存在复制性sTTV，其特征在于所述试剂盒至少包含根据权利要求8的引物组。
10.一种诊断测试试剂盒，其用于同时检测样品中sTTVssDNA存在和sTTV病毒复制，其特征在于所述试剂盒包括含有结合由如SEQIDNO.:1中所示序列组成的寡核苷酸FDNA-TTV的至少14个连续核苷酸的一段的正向引物和结合由如SEQIDNO.:3中所示序列组成的寡核苷酸RDNA-TTV-r2的至少14个连续核苷酸的一段的反向引物的引物组、以及含有结合由如SEQIDNO.:4中所示序列组成的寡核苷酸FRNA-a的至少14个连续核苷酸的一段的正向引物和至少一条结合由如SEQIDNO.:6中、SEQIDNO.:7中或SEQIDNO.:8中所示序列组成的寡核苷酸RRNA的至少14个连续核苷酸的一段的反向引物的引物组。
11.一种诊断测试试剂盒，其用于同时检测样品中sTTVssDNA存在和sTTV病毒复制，其特征在于所述试剂盒包括含有结合由如SEQIDNO.:1中所示序列组成的寡核苷酸FDNA-TTV的至少14个连续核苷酸的一段的正向引物和结合由如SEQIDNO.:2中所示序列组成的寡核苷酸RDNA-TTV-r1的至少14个连续核苷酸的一段的反向引物的引物组、以及含有结合由如SEQIDNO.:5中所示序列组成的寡核苷酸FRNA-b的至少14个连续核苷酸的一段的正向引物和至少一条结合由如SEQIDNO.:6中、SEQIDNO.:7中或SEQIDNO.:8中所示序列组成的寡核苷酸RRNA的至少14个连续核苷酸的一段的反向引物的引物组。
12.根据权利要求9-11任一项的诊断测试试剂盒，其特征在于所述检测试剂盒包含至少一个额外的非TTV相关的引物组和至少一种额外的非TTV相关的模板。
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