ES2616836T3

ES2616836T3 - Diagnósticos del virus Torque teno

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Publication number: ES2616836T3
Application number: ES12732552.0T
Authority: ES
Inventors: Erwin VAN DEN BORN; Vivian CORNELISSEN-KEIJSERS; Tuija KEKARAINEN; Joaquim SEGALÉS; Laura MARTINEZ-GUINÓ; Maria BALLESTER
Original assignee: Intervet International BV
Current assignee: Intervet International BV
Priority date: 2011-05-31
Filing date: 2012-05-30
Publication date: 2017-06-14
Anticipated expiration: 2032-05-30
Also published as: EP2530170A1; CN103562411A; WO2012163949A1; EP2714940B1; RU2013158142A; US20140248602A1; JP2014516545A; EP2714940A1; US9212400B2; BR112013030393A2; HUE032313T2; CN103562411B; MX339808B; CA2834449A1; JP5997764B2; KR20140024411A; MX2013014072A

Abstract

Un método para la detección de la presencia de VTTp de replicación en una muestra, caracterizado por que dicho método comprende las etapas de a) realizar una reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) de dicha muestra usando un conjunto de cebadores que comprende un cebador directo que se une a un tramo de al menos 14 nucleótidos consecutivos de un oligonucleótido FRNA-a que tiene una secuencia como se representa en SEQ ID NO.: 4 o un cebador directo que se une a un tramo de al menos 14 nucleótidos consecutivos de un oligonucleótido FRNA-b que tiene una secuencia como se representa en SEQ ID NO.: 5 y al menos un cebador inverso que se une a un tramo de al menos 14 nucleótidos consecutivos del extremo 5' de un oligonucleótido RRNA-1 que tiene una secuencia como se representa en SEQ ID NO.: 6, un oligonucleótido RRNA-2 que tiene una secuencia como se representa en SEQ ID NO.: 7 o un oligonucleótido RRNA-3 que tiene una secuencia como se representa en SEQ ID NO.: 8, y b) examinar el resultado de la amplificación por RT-PCR de la etapa (a).

Description

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un conjunto de cebadores que comprende un cebador directo que se une a un tramo de al menos 14 nucleótidos consecutivos de un oligonucleótido FDNA-VTT que tiene una secuencia como se representa en SEQ ID NO.: 1 y un cebador inverso que se une a un tramo de al menos 14 nucleótidos consecutivos de un oligonucleótido RDNA-VTTr2 que tiene una secuencia como se representa en SEQ ID NO.: 3 y una sonda que se une a un tramo de al menos 14 nucleótidos consecutivos de un oligonucleótido RDNA-VTT-r1 que tiene una secuencia como se representa en SEQ ID NO.: 2, según la invención. Una sonda que se une a un tramo de al menos 14 nucleótidos consecutivos de un oligonucleótido RDNA-VTT-r1 difiere de un cebador que se une a un tramo de al menos 14 nucleótidos consecutivos de un oligonucleótido RDNAVTT-r1 en que una sonda tal es un oligonucleótido con un fluoróforo y una molécula extintora unida a éste. Existen varias versiones de tales sondas cuando se llega al fluoróforo o extintor usado o el mecanismo de trabajo más allá de la combinación de sonda/extintor. Simplemente como un ejemplo, tales sondas están comercialmente disponibles como sondas TaqMan, sondas Scorpions y sondas de baliza molecular (véase más adelante).

En este método usando una sonda, la detección puede hacerse, por ejemplo, usando la sonda según la invención. Esta sonda se une, como se menciona anteriormente, de forma selectiva a una secuencia interna del ADNc hecho en una reacción de PCR usando, por ejemplo, el conjunto de cebadores de unión de FDNA-VTT / RDNA-VTT-r2 según la invención. Por ejemplo, en la cepa VTT2_ (HM633239.1)/1-2797 (véase la Tabla 1), la sonda, por ejemplo, se hibridaría en una etapa b) con la región RDNA-VTT-r2 de ADNc desde posición 380-396 del alineamiento. Sin embargo, esto sucede solo en caso de que el ADN amplificado sea de hecho de origen VTTp. En el improbable caso de que los dos cebadores selectivos amplificaran ADN no VTT, esto se notaría en la etapa b, debido a que la sonda no se hibridaría con éste. Por lo tanto, la sonda según la invención hace la detección de VTTp aún más específica que una mera reacción de PCR. Además, el uso de una sonda evita el uso de geles para la detección de los productos de PCR. Y, finalmente, el nivel de fluorescencia detectado en el ciclador térmico de PCR en tiempo real es directamente proporcional al fluoróforo liberado y, por lo tanto, la cantidad de molde de ADN presente en la PCR (véase más adelante). Por lo tanto, este método es muy adecuado en reacciones de PCR en tiempo real.

Métodos de RT-PCT en tiempo real basados en TaqMan son un desarrollo de Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, CA 94404, EE.UU. Métodos de RT-PCT en tiempo real basados en TaqMan se describen, entre otros, en las referencias bibliográficas 8, 10 y 33. Los métodos de RT-PCR en tiempo real basados en Scorpions y balizas moleculares están disponibles a través de PREMIER Biosoft International, 3786 Corina Way, Palo Alto CA 94303-4504, EE.UU.

El uso de PCR en tiempo real basándose en balizas moleculares se describe en detalle en, entre otros: Molecular Beacons; A New Tool to Identify Point Mutations and to Analyze Gene Expression in Mycobacterium tuberculosis by Manganelli, R., Tyagi, S. y Smith, I., en: Methods in Molecular Medicine, vol. 54: página 295-310, Mycobacterium Tuberculosis Protocols, Editado por: T. Parish and N. G. Stoker © Humana Press Inc., Totowa, NJ.

Las sondas TaqMan consisten en un fluoróforo unido covalentemente al extremo 5' de la sonda de oligonucleótido y un extintor en el extremo 3'. Están disponibles varios fluoróforos diferentes (por ejemplo, 6-carboxifluoresceína, acrónimo: FAM, o tetraclorofluorescina, acrónimo: TET) y extintores (por ejemplo, tetrametilrodamina, acrónimo: TAMRA, o ligando de unión al surco menor de tripéptido de dihidrociclopirroloindol, acrónimo: MGB). La molécula extintora extingue la fluorescencia emitida por el fluoróforo cuando se excita por la fuente de luz del ciclador mediante FRET (transferencia de energía por resonancia de fluorescencia). En tanto que el fluoróforo y el extintor estén en proximidad, la extinción inhibe cualquier señal de fluorescencia. Sondas TaqMan se diseñan tal que se hibriden dentro de una región de ADN amplificada por un conjunto específico de cebadores. Como la Taq polimerasa extiende el cebador y sintetiza la hebra naciente, la actividad de exonucleasa 5' a 3’ de la polimerasa degrada la sonda que se ha hibridado con la plantilla. La degradación de la sonda libera el fluoróforo de ésta y rompe la proximidad cercana al extintor, para así aliviar el efecto extintor y permitir la fluorescencia del fluoróforo. Por lo tanto, la fluorescencia detectada en el ciclador térmico de PCR en tiempo real es directamente proporcional al fluoróforo liberado y la cantidad de molde de ADN presente en la PCR.

Las sondas TaqMan son sondas preferidas para su uso en los métodos y herramientas de diagnóstico según la invención.

En realidad, la sonda Taqman Probe VTT-r1 descrita aquí es un oligonucleótido que se une a una secuencia de ADN como se representa en SEQ ID NO.: 2, sin embargo, con un fluoróforo y un extintor unido a ella. Pero como se ha explicado (véase anteriormente), la sonda también puede ser un oligonucleótido más largo o más corto que se une a un tramo de al menos 14 nucleótidos consecutivos de un oligonucleótido RDNA-VTT-r1 que tiene una secuencia como se representa en SEQ ID NO.: 2.

Como en este método tanto la hibridación de los cebadores como la sonda tiene lugar en un proceso, el desarrollo de una reacción de color tiene lugar prácticamente en el mismo momento que la amplificación del ADN. Por lo tanto, tal reacción se denomina una reacción de PCR en tiempo real.

Por lo tanto, otra forma preferida de esta realización se refiere a un método para la detección de la presencia del virus Torque teno porcino (VTTp) en una muestra, caracterizado por que dicho método comprende las etapas de

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a) realizar una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de dicha muestra usando un conjunto de cebadores que comprende un cebador directo que se une a un tramo de al menos 14 nucleótidos consecutivos de un oligonucleótido FDNA-VTT que tiene una secuencia como se representa en SEQ ID NO.: 1 y un cebador inverso que se une a un tramo de al menos 14 nucleótidos consecutivos de un oligonucleótido RDNA-VTT-r2 que tiene una secuencia como se representa en SEQ ID NO.: 3 y b) examinar el resultado de la amplificación por PCR de la etapa (a) usando una sonda que se une a un tramo de al menos 14 nucleótidos consecutivos de un oligonucleótido RDNA-VTT-r1 que tiene una secuencia como se representa en SEQ ID NO.: 2.

En una forma más preferida de esta realización, un cebador del conjunto de cebadores se une a la longitud completa del oligonucleótido FDNA-VTT que tiene una secuencia como se representa en SEQ ID NO.: 1 y el otro cebador del conjunto de cebadores se une a la longitud completa del oligonucleótido RDNA-VTT-r2 que tiene una secuencia como se representa en SEQ ID NO.: 3

En otra forma más preferida de esta realización, la sonda se une a la longitud completa del oligonucleótido RDNAVTT-r1 que tiene una secuencia como se representa en SEQ ID NO.: 2.

Como se ha mencionado anteriormente, VTTp podría estar presentes en tejido con o sin replicación allí. Se sabe que VTT se encuentra en prácticamente todos los tejidos y órganos, pero se desconoce si solo se encuentra en un tejido debido a que se transportó a ese tejido por la sangre o si está replicando activamente allí. Por lo tanto, es altamente necesaria una prueba que podría distinguir entre la mera presencia de VTTp en, por ejemplo, un tejido y replicación activa del virus en ese tejido. Una prueba tal permitiría además detectar si las trazas de VTTp en el cultivo celular están o no en una forma inactivada: la certeza sobre la falta de replicación viral de VTTp podría hacer que la producción de vacunas virales en cultivo celular fuera más segura.

La replicación del genoma de VTT continúa a través de un modelo de círculo rodante: durante la replicación se prepara un ADNmc de hebra positiva usando la hebra de ADN viral genómico de hebra negativa como molde, y este ADN de hebra positiva sirve a su vez de molde para producir nuevo ADN de hebra negativa. En principio, el ADN de hebra positiva podría usarse para la detección de replicación; entonces podría usarse una prueba de PCR específica hebra (PCReh) usando cebadores que se unen específicamente a la hebra de ADN positiva para mostrar la replicación del ADN. Sin embargo, surge un problema cuando VTT entra en una célula no permisiva, es decir, una célula que no soporta el ciclo completo, productivo, replicativo del virus que incluye la formación de nuevas partículas del virus. En tales células no permisivas, el mecanismo celular empezaría, sin embargo, la replicación de ADNmc viral y, por consiguiente, se formará ADN de hebra positiva, que sugiere incorrectamente la replicación viral productiva. Por lo tanto, una PCReh no es una prueba fiable para confirmar la replicación viral productiva.

Un indicador más fiable para la replicación viral es la presencia de ARNm de VTTp ya que la replicación del virus activa se revela por sí misma a través de la aparición de ARNm. Tales ARNm pudieron entonces detectarse mediante una reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa, denominada además RT-PCR. Sin embargo, la extrema variabilidad en la secuencia del genoma para los diversos VTTp hace muy difícil identificar cebadores universales para su uso en una reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR).

Se plantea un segundo problema por el hecho que no se sabe mucho sobre los patrones de corte y empalme de ARN en VTTp, excepto por el hecho de que parece haber una variación significativa en el patrón de corte y empalme entre diversos VTTp. Debido a las características de corte y empalme de la replicación viral de VTTp, es muy posible que algunos cebadores no puedan usarse en absoluto, ya que se hibridan con regiones que se pierden tras el corte y empalme del ARN. Después de realizar el corte y empalme del ARNm, tales regiones se perderían y, por consiguiente, no se encontraría ningún producto de RT-PCR. Y esto a su vez conduciría a una indicación falsa de que no tiene lugar replicación viral de VTTp.

Sorprendentemente se encontró ahora que las regiones de RDNA-VTT-r1 y RDNA-VTT-r2 a las que se unen los cebadores de PCR también están presentes en el ARNm de VTTp. Aún más sorprendente, se encontró que estas regiones se localizaron fuera de regiones que se cortan y empalman durante el proceso de corte y empalme de ARNm. Por lo tanto, estas regiones siempre están presentes en el ARNm de VTTp, independientemente del patrón de corte y empalme de ARNm seguido por cualquier VTTp.

Esto significa que las regiones de RDNA-VTT-r1 y RDNA-VTT-r2 pueden también usarse para desarrollar cebadores directos en una reacción de RT-PCR para la detección de ARNm durante la replicación viral de VTTp independientemente de su procedencia geográfica o su genotipo. Esta prueba permite así por primera vez diferenciar entre la mera presencia de ADNmc de VTTp en un tejido y la replicación activa del virus en ese tejido.

Una reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) comprende dos etapas de reacción. En una primera etapa, se permite que uno de los cebadores del conjunto de cebadores se una a ARN de VTT y este complejo forma el punto de partida para la síntesis de una hebra de ADNc de la hebra de ARN por la enzima

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para VTT. Sin embargo, una vez más, la longitud exacta de un producto de RT-PCR no es importante: solo es relevante la ausencia o presencia de un producto RT-PCR, no su tamaño exacto.

Los métodos según la invención que se basan en la RT-PCR pueden mejorarse además añadiendo un denominado ARN de control interno (ARN CI). En realidad, el control interno es un experimento paralelo en el que una cantidad de un ARN de control se añade a la muestra de prueba, además de cebadores y una sonda que son específicos para ese ARN de control (ARN CI). (O alternativamente, aunque menos preferido, el ARN de control y los cebadores y la sonda se prueban por separado en una prueba de RT-PCR paralela). Tales cebadores y la sonda no deben estar relacionados con VTT; si estuvieran relacionados con VTT podrían interferir con la parte específica de VTT del método. Es evidente que el color del fluoróforo de la sonda de VTT y el fluoróforo de la sonda no VTT deben ser diferentes, con el fin de discriminar entre la fluorescencia especifica de VTT y la fluorescencia específica de ARN CI. Como están presentes todos los componentes para una reacción satisfactoria que muestra la presencia del ARN CI, habrá una fluorescencia específica, que indica que las diversas etapas del proceso fueron satisfactorias. Preferentemente, la prueba del ARN CI se realiza en el mismo tubo de ensayo que la prueba de detección de VTTp. Así, si se detecta la fluorescencia del fluoróforo específico de ARN CI, la prueba como tal es fiable, y si además se detecta la fluorescencia del fluoróforo específico de VTT, eso demuestra la presencia de material de VTT. Si se detecta la fluorescencia del fluoróforo específico de ARN CI, pero no se detecta fluorescencia del fluoróforo específico de VTT, eso demuestra la ausencia de material de VTT. Si no se detecta fluorescencia del fluoróforo específico de ARN CI, la prueba no es fiable y no debe tenerse en cuenta. Así, el uso de un control interno es importante para excluir resultados negativos falsos debido a, por ejemplo, aislamiento ineficiente de ARN, reacción de transcriptasa inversa ineficiente o inhibición de PCR.

En principio, puede usarse un ARN sintético como material de partida para el control interno. Como alternativa a los fragmentos sintéticos de ARN, pueden usarse genes de mantenimiento o diferentes genes del huésped o de diferentes patógenos como control interno. Sus problemas de concentración desconocida y variable, inestabilidad y bioseguridad los hacen, sin embargo, más difícil de manipular e integrar en el ensayo PCR que el ARN transcrito in vitro.

Por esta razón, un sistema de control interno preferido es el sistema de control interno heterólogo universal diseñado por Hoffmann et al. Se basa en ARN y podría ser fácilmente adaptado e integrado en el ensayo para comprobar una satisfactoria extracción de ARN y RT-PCR.

Así, una forma incluso más preferida de esta realización se refiere a un método según la invención, caracterizado por que la etapa de realizar la reacción de RT-PCR en tiempo real de dicho método usa además al menos un conjunto de cebadores no relacionado con VTT y al menos un molde de ARN no relacionado con VTT.

Si se requiere cuantificación de la reacción de PCR, pueden ejecutarse pruebas paralelas separadas en las que están presentes cantidades conocidas de ADN de VTT o ARNm de VTT y los cebadores y la sonda según la invención. Esto permitiría dibujar curvas patrón que proporcionan una relación entre la cantidad de ADN o ARN en la prueba paralela y el número de ciclos requerido para alcanzar el umbral de detección de fluorescencia. Estas curvas patrón pueden entonces usarse posteriormente para determinar la cantidad desconocida de ADN de VTT o ARNm de VTT en la muestra. Por lo tanto, un método según la invención en el que se ejecutan pruebas paralelas separadas con el fin de hacer curvas patrón que posteriormente se usan para la cuantificación de la cantidad de ADN de VTT o ARNm de VTT en una muestra se denomina como un método cuantitativo.

Es evidente que el material biológico se somete preferentemente a etapas de purificación adicionales. Como el método para la detección de VTTp se basa en ADNmc y/o ARNm viral, este ADNmc y ARN se purifica preferentemente de la muestra hasta un cierto grado. La purificación en este sentido significa que material en la muestra distinto de ADN o ARNm de VTT se elimina hasta un cierto grado de la muestra antes de que la muestra se someta a un método según la invención. Tal purificación puede comprender, por ejemplo, desproteinización, eliminación de restos celulares, extracción de ADN, extracción de ARN y similares.

Así, una forma aún más preferida de la presente invención se refiere a un método según la invención, caracterizado por que dicho método comprende una etapa de purificación de ARN o ADN anterior a la etapa a).

Otra realización de la presente invención se refiere a un conjunto de cebadores que comprende un cebador directo que se une a un tramo de al menos 14 nucleótidos consecutivos de un oligonucleótido FDNA-VTT que tiene una secuencia como se representa en SEQ ID NO.: 1 y un cebador inverso que se une a un tramo de al menos 14 nucleótidos consecutivos de un oligonucleótido RDNA-VTT-r1 que tiene una secuencia como se representa en SEQ ID NO.: 2 o un cebador inverso que se une a un tramo de al menos 14 nucleótidos consecutivos de un oligonucleótido RDNA-VTT-r2 que tiene una secuencia como se representa en SEQ ID NO.: 3

Una realización adicional de la presente invención se refiere a un conjunto de cebadores que comprende un cebador directo que se une a un tramo de al menos 14 nucleótidos consecutivos de un oligonucleótido FRNA-a que tiene una

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secuencia como se representa en SEQ ID NO.: 4 o un cebador directo que se une a un tramo de al menos 14 nucleótidos consecutivos de un oligonucleótido FRNA-b que tiene una secuencia como se representa en SEQ ID NO.: 5 y al menos un cebador inverso que se une a un tramo de al menos 14 nucleótidos consecutivos del extremo 5' de un oligonucleótido RRNA-1 que tiene una secuencia como se representa en SEQ ID NO.: 6, un oligonucleótido RRNA-2 que tiene una secuencia como se representa en SEQ ID NO.: 7, o un oligonucleótido RRNA-3 que tiene una secuencia como se representa en SEQ ID NO.: 8

Otra realización aún de la presente invención se refiere a una sonda que se une a un tramo de al menos 14 nucleótidos consecutivos de un oligonucleótido RDNA-VTT-r1 que tiene una secuencia como se representa en SEQ ID NO.: 2 o a un tramo de al menos 14 nucleótidos consecutivos de un oligonucleótido FRNA-b que tiene una secuencia como se representa en SEQ ID NO.: 5.

Otra vez otra realización de la presente invención se refiere a kits de prueba de diagnóstico para la detección de la presencia del virus del Torque teno porcino (VTTp) en una muestra. Tales kits permiten que se pongan en práctica los métodos según la invención.

Así, una primera forma de esta realización se refiere a un kit de prueba de diagnóstico para la detección de la presencia del virus Torque teno porcino (VTTp) en una muestra, caracterizado por que dicho kit comprende al menos un conjunto de cebadores que comprende un cebador directo que se une a un tramo de al menos 14 nucleótidos consecutivos de un oligonucleótido FDNA-VTT que tiene una secuencia como se representa en SEQ ID NO.: 1 y un cebador inverso que se une a un tramo de al menos 14 nucleótidos consecutivos de un oligonucleótido RDNA-VTT-r1 que tiene una secuencia como se representa en SEQ ID NO.: 2 o un cebador inverso que se une a un tramo de al menos 14 nucleótidos consecutivos de un oligonucleótido RDNA-VTT-r2 que tiene una secuencia como se representa en SEQ ID NO.: 3.

En una forma preferida de esta realización, dicho kit de prueba de diagnóstico para la detección de la presencia de VTTp comprende además una sonda que se une a un tramo de al menos 14 nucleótidos consecutivos de un oligonucleótido RDNA-VTT-r1 que tiene una secuencia como se representa en SEQ ID NO. 2.

Otra vez otra realización se refiere a un kit de prueba de diagnóstico para la detección de la presencia de VTTp de replicación en una muestra, caracterizado por que dicho kit comprende un conjunto de cebadores que comprende un cebador directo que se une a un tramo de al menos 14 nucleótidos consecutivos de un oligonucleótido FRNA-a que tiene una secuencia como se representa en SEQ ID NO.: 4 o un cebador directo que se une a un tramo de al menos 14 nucleótidos consecutivos de un oligonucleótido FRNA-b que tiene una secuencia como se representa en SEQ ID NO.: 5 y al menos un cebador inverso que se une a un tramo de al menos 14 nucleótidos consecutivos del extremo 5' de un oligonucleótido RRNA-1 que tiene una secuencia como se representa en SEQ ID NO.: 6, un oligonucleótido RRNA-2 con una secuencia como se representa en SEQ ID NO.: 7, o un oligonucleótido RRNA-3 que tiene una secuencia como se representa en SEQ ID NO.: 8.

En una forma preferida de esta realización, dicho kit de prueba de diagnóstico para la detección de la presencia de VTTp de replicación comprende además una sonda que se une a un tramo de al menos 14 nucleótidos consecutivos de un oligonucleótido FRNA-b que tiene una secuencia como se representa en SEQ ID NO. 5.

Estos diversos cebadores y sondas pueden estar presentes en el kit en viales separados. También pueden estar presentes en el mismo vial. Para facilitar la manipulación y con el fin de evitar riesgos innecesarios de contaminación, incluso podrían estar presentes en el vial de prueba al que se añade la muestra. Preferentemente estarán presentes en una forma seca, con el fin de mantenerlos estables en condiciones de almacenamiento ambiental.

Otra realización aún se refiere a un kit de prueba de diagnóstico para la detección simultánea de la presencia de ADNmc de VTTp y replicación del virus VTTp en una muestra, caracterizado por que dicho kit comprende un conjunto de cebadores que comprende un cebador directo que se une a un tramo de al menos 14 nucleótidos consecutivos de un oligonucleótido FDNA-VTT que tiene una secuencia como se representa en SEQ ID NO.: 1 y un cebador inverso que se une a un tramo de al menos 14 nucleótidos consecutivos de un oligonucleótido RDNA-VTTr2 que tiene una secuencia como se representa en SEQ ID NO.: 3 y un conjunto de cebadores que comprende un cebador directo que se une a un tramo de al menos 14 nucleótidos consecutivos de un oligonucleótido FRNA-a que tiene una secuencia como se representa en SEQ ID NO.: 4 y al menos un cebador inverso que se une a un tramo de al menos 14 nucleótidos consecutivos de oligonucleótido RRNA que tiene una secuencia como se representa en SEQ ID NO.: 6, en SEQ ID NO.: 7 o en SEQ ID NO.: 8.

Otra vez otra realización se refiere a un kit de prueba de diagnóstico para la detección de la presencia de ADNmc de VTTp y la replicación del virus VTTp en una muestra, caracterizada en que dicho kit comprende un conjunto de cebadores que comprende un cebador directo que se une a un tramo de al menos 14 nucleótidos consecutivos de un oligonucleótido FDNA-VTT con una secuencia como se representa en SEQ ID NO.: 1 y un cebador inverso que se une a un tramo de al menos 14 nucleótidos consecutivos de un oligonucleótido RDNA-VTT-r1 que tiene una secuencia como se representa en SEQ ID NO.: 2 y un cebador directo que comprende un cebador directo que se

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Resultados

La Figura 1 muestran el gráfico de la curva de amplificación (Figura 1A) y de la curva patrón (Figura 1B) de la qPCR de amplio espectro para VTT porcino. En el gráfico de amplificación las curvas grises representan la serie de diluciones estándar y las curvas negras representan las muestras y no los controles de molde. En el gráfico de la curva patrón los puntos representan la serie de diluciones estándar y las cruces representan las muestras.

Tabla 1: Los datos pertenecen al gráfico de la curva de amplificación y de patrón. La cantidad inicial es la cantidad de partículas de VTTSu en la cepa clínica de ADN de 5 µl, que se pone en la PCR

Contenido: Objetivo Ciclo umbral (Ct) Cantidad inicial (SQ) Log SQ

Est-1: 2,50E+06 17,25 6,398

Est-2: 2,50E+05 21,04 5,398

Est-3: 2,50E+04 24,53 4,398

Est-4: 2,50E+03 27,30 3,398

Est-5: 2,50E+02 30,67 2,398

Est-6: 2,50E+01 34,13 1,398

Descon-01: Cerdo 141 34,20 2,34E+01 1,369

Descon-02: Cerdo 151 33,24 4,58E+01 1,661

Descon-03: Cerdo 161 29,06 8,34E+02 2,921

Descon-04: Cerdo 204 25,56 9,46E+03 3,976

Descon-05: Cerdo 205 25,06 1,34E+04 4,128

NTC: Agua N/A N/A N/A

NTC: Agua N/A N/A N/A

10 La Figura 2 muestra los picos de fusión de los amplicones. Las curvas grises representan la serie de diluciones estándar y las curvas negras representan las muestras. Todas las muestras mostraron un pico con una temperatura de fusión entre 85,0 ºC y 86,5 ºC, que indica que la fluorescencia medida se deriva solamente del producto de PCR.

15 Tabla 2. Los datos pertenecen al gráfico del pico de fusión.

Contenido: Objetivo Temperatura de fusión Altura del pico Temperatura inicial Temperatura final

Est-1: 2,50E+06 86,5 1939,64 80,5 91,0

Est-2: 2,50E+05 86,5 2049,13 80,5 93,5

Est-3: 2,50E+04 86,5 1891,92 80,0 93,5

Est-4: 2,50E+03 86,5 1959,75 79,0 93,0

Est-5: 2,50E+02 86,5 1781,68 80,0 94,0

Est-6: 2,50E+01 86,5 1570,47 80,0 90,5

Descon-01: Cerdo 141 85,5 1195,51 79,5 93,5

Descon-02: Cerdo 151 86,0 1299,24 79,5 91,0

Descon-03: Cerdo 161 85,5 1587,08 79,5 92,5

Descon-04: Cerdo 204 85,0 1735,64 79,0 91,5

Descon-05: Cerdo 205 85,5 1800,00 79,5 91,0

Conclusión

Se mostró que las 5 muestras eran positivas para VTT. La concentración osciló entre 1,34x104 y 2,34x101 20 copias/reacción, que es igual a entre 6,71x105 y 1,17x103 copias de ADN de VTT/ml de suero.

Ejemplo 2

RT-PCR para la detección de ARNm viral de VTTp

25 Se extraerá ARN de 2,5 x 105 células de riñón porcino (PK). Las células se disgregarán usando 600 µl de reactivo TRIZOL® (Invitrogen) y 120 µl de 1-bromo-3-cloropropano (BCP, Sigma), la suspensión se centrifugará posteriormente a 12.000 x g a 4 ºC durante 15 minutos. La fase acuosa se obtendrá, se precipitará con 300 µl de 100 % de alcohol isopropílico y después se centrifugará a 12.000 x g a 4 ºC durante 10 min. El sedimento de ARN

30 resultante se lava con 1 ml de 75 % de etanol y se seca al aire. El ARN se disuelve posteriormente en agua libre de RNasa Se elimina el ADN contaminante de preparaciones de ARN usando el kit TURBO DNA-free™ (Ambion, Applied Biosystems). Brevemente, se añaden 2 unidades de DNasa por cada 10 µg de ARN, se incuban a 37 ºC durante 30 min. La DNasa se inactiva y se elimina de la muestra de ARN por centrifugación a 10.000 x g durante 1,5 minutos y el ARN se transfiere a un tubo nuevo. Se cuantificará el ARN y la pureza se comprobará usando un

35 espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Fisher Scientific).

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Claims

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