MX2007010387A - Deteccion de virus de la forma muy virulenta de la bursitis infecciosa. - Google Patents

Abstract

Metodos para identificar animales infectados con vvIDBV. Los metodos comprenden poner en contacto una muestra de acidos nucleicos obtenida del animal, o un producto de acidos nucleicos obtenido del animal, con uno o mas pares de sondas, cada uno de los cuales comprende una sonda de mutacion y una sonda de anclaje, y luego determinar la temperatura de fusion de cualquier complejo de hibridizacion que pueda formarse cuando los uno o mas pares de sondas hibridicen con un acido nucleico en la muestra. Esta determinacion se realiza usando un analisis FRET. En una realizacion, la sonda de mutacion comprende una secuencia identica a una primera secuencia blanco mutada de SEQ ID N?? 1, donde la citosina en la posicion 827 ha sido sustituida por una timidina, la citosina en la posicion 830 ha sido sustituida por una timidina, y la timidina en la posicion 833 ha sido sustituida por una citosina, o su complemento inverso. En otra realizacion, la sonda de mutacion comprende una secuencia identica a una segunda blanco mutada de SEQ ID N?? 1, donde la guanina en la posicion 897 ha sido sustituida por una adenina, la citosina en la posicion 905 ha sido sustituida por una timidina, y la citosina en la posicion 908 ha sido sustituida por una timidina. En la presente documentacion tambien se proporcionan conjuntos de elementos que contienen pares de sondas de nucleotidos que pueden usarse en los presentes metodos.

Description

DETECCIÓN DE VIRUS DE LA FORMA MUY VIRULENTA DE LA BURSITIS INFECCIOSA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con nuevos métodos para detectar virus de la forma muy virulenta de la bursitis infecciosa en muestras de ácidos nucleicos. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La bursitis infecciosa (IBD) es una enfermedad inmunosupresora que se da en pollos jóvenes. El agente etiológico, el virus de la bursitis infecciosa (IBDV) , existe en la naturaleza en varias formas antigénicas y patogénicas. Las formas patogénicas del virus varían entre atenuadas y muy virulentas (vvIBDV) . Todas parecen provocar algún grado de daño en el sistema inmune. Las cepas de vvIBDV fueron descriptas por primera vez hacia fines de la década de 1980, y se identificaron como causantes de una forma aguda de la enfermedad, caracterizada por una morbilidad y una mortalidad elevada en manadas de pollos susceptibles (Van Den Berg, T. P. Acute infectious bursal disease in poultry: a review. Avian Pathology 29: 175-194. 2000) . El fenotipo muy virulento de la IBDV fue descubierto por primera vez en Europa (Domanska, K. , et al. Antigenic and genetic diversity of early European isolates of Infectious bursal disease virus prior to the emergence of the very virulent viruses : early European epidemiology of Infectious bursal disease revisited? Archives of Virology 149: 465-480. 2004, Van Den Berg, T. P. Acute infectious bursal disease in poultry: a review. Avian Pathology 29: 175-194. 2000). Se dispersó rápidamente hacia Asia y Japón, donde se describió hacia el comienzo de la década de 1990 (Van Den Berg, T. P. Acute infectious bursal disease in poultry: a review. Avian Pathology 29: 175-194. 2000). En 1995, durante la 63a Sesión General de la Oficina Internacional de los Epizootios (OIE) , 80% de los países miembros informaron sobre casos agudos de IBD (Van Den Berg, T. P. Acute infectious bursal disease in poultry: a review. Avian Pathology 29: 175-194. 2000). Aunque la vvIBDV ha sido identificada en casi todos los continentes del mundo, aún ha de hallarse en América del Norte, Australia y Nueva Zelanda. Una preocupación real e inmediata es que la forma muy virulenta de la IBDV continúe dispersándose hasta que esté presente en cada continente. La detección temprana es crítica para controlar la IBD aguda (Van Den Berg, T. P. Acute infectious bursal disease in poultry: a review. Avian Pathology 29: 175-194. 2000). Aún no se están usando programas de vigilancia, debido a que no se ha desarrollado un ensayo rápido y económico para la detección detectable de las cepas de la vvIBDV. Se han descripto ensayos de RT/PCR-RFLP para identificar un marcador de enzimas de restricción (Sspl) para el fenotipo de vvlBDV (Ikuta, N., et al. Molecular Characterization of Brazillian Infectious Bursal Disease Viruses. Desconocido. 2000, Jackwood, D. J. y S. E. Sommer. Restriction Fragment Length Polimorphisms in the VP2 Gene of Infectious Bursal Disease Viruses from Outside the United States. Avian Diseases 43: 310-314. 1999, Lin, Z., et al. Sequence comparisons of a highly virulent infectious bursal disease virus prevalent in Japan. Avian Diseases 37: 315-323. 1993) . Sin embargo, este ensayo es costoso y no resulta práctico para evaluar grandes cantidades de muestras. Además, se ha hallado el marcador Sspl en algunas cepas de IBDV que no presentan el fenotipo muy virulento (Banda, A. , et al. Molecular Characterization of Seven Field Isolates de Infectious Bursal Disease Virus Obtained from Commercial Broiler Chickens. Avian Diseases 45: 620-630. 2001), por lo que su especificidad es cuestionable. Por consiguiente, se desean métodos adicionales para detectar la presencia del vvIBDV en animales. En particular, se desean métodos que sean rápidos y confiables, y que puedan usarse para evaluar grandes cantidades de muestras. SUMARIO DE LA INVENCIÓN En la presente invención se proveen métodos para identificar animales infectados con un vvlBDV. El método comprende poner en contacto una muestra de ácidos nucleicos obtenida del animal, o un producto de ácidos nucleicos obtenido mediante la amplificación de ARN del animal, con uno o más pares de oligonucleótidos sonda, cada uno de los cuales comprende una sonda de mutación y una sonda de anclaje, y luego determinar la temperatura a la que se disocian las una o más sondas de mutación de un complejo de hibridización, que se forma cuando las una o más sondas hibridizan con un ácido nucleico en la muestra. Los resultados donde la temperatura de fusión (Tm) del complejo de hibridización formado entre la sonda de mutación y un ácido nucleico en la muestra es mayor que la temperatura de fusión de un complejo de hibridización formado cuando la sonda de mutación hibridiza con un ácido nucleico que comprende SEQ ID N° 1, o su complemento inverso, y/o está dentro de un rango de 4°C de la temperatura de fusión de un complejo de hibridización que se forma cuando la sonda de mutación y la sonda de anclaje hibridizan con una muestra de ácido nucleico que comprende sus secuencias blanco, indica que el animal está o ha sido infectado con vvIBDV. En una realización, la sonda de mutación comprende una secuencia idéntica a una primera secuencia blanco mutada de SEQ ID N° 1, donde la citosina en la posición 827 ha sido sustituida por una timidina, la citosina en la posición 830 ha sido sustituida por una timidina, y la timidina en la posición 833 ha sido sustituida por una citosina, o su complemento inverso. En esta realización, la sonda de anclaje está dirigida a una secuencia hacia el extremo 5' de la secuencia blanco mutada. En otra realización, la sonda de mutación comprende una secuencia idéntica a una segunda secuencia blanco mutada de SEQ ID N° 1, donde la guanina en la posición 897 ha sido sustituida por una adenina, la citosina en la posición 905 ha sido sustituida por una timidina, y la citosina en la posición 908 ha sido sustituida por una timidina. En esta realización, la sonda de anclaje está dirigida a una secuencia hacia el extremo 3' de la segunda secuencia blanco mutada. La temperatura a la que cada sonda de mutación se disocia del complejo de hibridización se determina con un análisis de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) . La presente invención también se relaciona con conjuntos de elementos que comprenden uno o más de los pares de oligonucleótidos sonda que pueden usarse en los presentes métodos, y con métodos para usar estos conjuntos de elementos para determinar si una muestra de ácidos nucleicos comprende la totalidad o una porción del gen VP2 de un vvlBDV. Ha de interpretarse que la descripción general precedente y la descripción detallada que se proporcionará más adelante se proveen solamente a modo de ejemplo y explicación, y no restringen la invención reivindicada. En las figura adjunta, se incorporan y constituyen una parte de esta memoria descriptiva, pueden ilustrarse realizaciones de la invención, y junto con la descripción, sirven para explicar los principios de la invención. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 ilustra el sitio blanco de dos realizaciones de la primera sonda de mutación, donde una realización comprende la secuencia TAATATC, SEQ ID N° 2, y la otra realización comprende la secuencia GATATTA, SEQ ID.

N° 3, con relación al sitio blanco de la primera sonda de anclaje; y el sitio blanco de dos realizaciones de la segunda sonda de mutación, donde una realización comprende la secuencia ATACTGGGTGCT, SEQ ID N° 6, y la otra realización comprende la secuencia AGCACCCAGTAT, SEQ ID N° 7, con relación al sitio blanco de la segunda sonda de anclaje . DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La secuencia de nucleótidos SEQ ID N° 1 es la cadena en el sentido del marco de lectura del gen VP2 de una cepa no muy virulenta de IBDV. La secuencia, número de acceso Gen Bank D00499, se describió por primera vez en Kibenge et al., J. Gen. Virol. 71:569-571, 1990.

La secuencia de nucleótidos SEQ ID N° 4 es la sonda vv232, en comparación con la misma región de cepas de vvIDBDV y distintas de vvIBDV. Los nucleótidos que difieren de la secuencia de la sonda están en negrita. La secuencia de nucleótidos SEQ ID N° 8 es la sonda vv256, en comparación con la misma región de cepas vvIBDV y distintas de vvIBDV. Los nucleótidos que difieren de la secuencia de la sonda están en negrita. La presente invención se describirá a continuación con referencia a realizaciones más detalladas, con una referencia ocasional a los dibujos adjuntos. Sin embargo, esta invención puede realizarse de distintas formas, y no ha de interpretarse como limitada a las realizaciones detalladas en la presente documentación. En lugar de esto, estas realizaciones se proporcionan de modo que la descripción sea exhaustiva y completa, y transmitirá completamente el alcance de la invención a aquellos entrenados en la técnica. A menos que se indique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente documentación tienen el mismo significado que comúnmente le asignan aquellos entrenados en la técnica a los que concierne esta invención. La terminología usada en la descripción de la invención en la presente documentación tiene por único objeto describir realizaciones particulares, y no pretende limitar la invención. Como se las usa en la descripción de la invención y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un/uno" , "una" y "el/la" también incluyen las formas plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Todas las publicaciones, las solicitudes de patentes, las patentes y otras referencias mencionadas en la presente documentación se incorporan expresamente a modo de referencia en su totalidad. A menos que se indique lo contrario, ha de interpretarse que todos los números que expresan cantidades de ingredientes, condiciones de reacción, y semejantes, usados en la memoria descriptiva y las reivindicaciones, están modificados en todos los casos por el término "aproximadamente" . Por lo tanto, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos detallados en la siguiente memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se deseen obtener con la presente invención. Como mínimo, y sin la intención de limitar la aplicación de la doctrina de los equivalentes al alcance de las reivindicaciones, cada parámetro numérico ha de interpretarse a la luz de la cantidad de dígitos significativos, de acuerdo con protocolos de redondeo convencionales.

Más allá del hecho de que los rangos numéricos y los parámetros que definen el alcance amplio de la invención sean aproximaciones, los valores numéricos detallados en los ejemplos específicos se informan de la forma más precisa posible. Sin embargo, cualquier valor numérico contiene ciertos errores inherentes, que son el resultado de la desviación estándar hallada en sus mediciones de evaluación respectivas . Cada rango numérico indicado en esta memoria descriptiva incluirá todos los rangos numéricos más pequeños que se hallen dentro de dicho rango numérico más amplio, como si todos estos rangos numéricos más pequeños hubieran sido escritos en forma expresa en la presente documentación. La presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que es posible distinguir fácil y rápidamente muestras de ácidos nucleicos que contienen el genoma de ARN de cadena doble de un vvEBDV, o el gen VF2 de un vvIBDV, de muestras de ácidos nucleicos que contienen el genoma de ARN de cepas no muy virulentas de IBDV, usando un análisis FRET, análisis de temperatura de fusión, y sondas de mutación y sondas de anclaje dirigidas a regiones específicas del gen VP2 de vvIBDV. Como se lo usa en la presente documentación, un "ácido nucleico" puede hacer referencia a ADN o ARN, o a moléculas que contengan desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos. Un "ácido nucleico" o un "oligonucleótido" , o cualquier equivalente gramatical hallado en la presente documentación, denota al menos dos nucleótidos unidos entre sí en forma covalente. Como se lo usa en la presente documentación, un "ácido nucleico" abarca las moléculas de ácidos nucleicos de cadena doble y cadena simple. Un ácido nucleico o un oligonucleótido de la presente invención generalmente consistirá en enlaces fosfodiéster, aunque en algunos casos también se incluirán análogos de ácidos nucleicos con modificaciones bien conocidas en la técnica. Es posible efectuar modificaciones en el esqueleto de ribosa-fosfato para facilitar la adición de porciones adicionales, tales como marcas, o para incrementar la estabilidad y la vida media de estas moléculas en diversas realizaciones. En una realización, el oligonucleótido comprende ácidos nucleicos peptídicos (PNA) , cuyos esqueletos son sustancialmente no iónicos bajo condiciones neutras, en contraste con el esqueleto de fosfodiéster altamente cargado de los ácidos nucleicos de ocurrencia natural. MÉTODOS PARA IDENTIFICAR ANIMALES INFECTADOS CON WEBDV En la presente documentación se proporcionan métodos para determinar si un animal, particularmente una especie de ave, está infectado con vvIBDV. En una realización, el animal es un pollo. El método comprende poner en contacto una muestra de ácidos nucleicos obtenida del animal, o un producto de ácidos nucleicos obtenido mediante la amplificación de ARN obtenido del animal, con al menos un par de sondas, que comprende un oligonucleótido sonda conocido de aquí en adelante como "sonda de mutación", que es complementario con una secuencia blanco en un locus de mutación específico en el gen VP2 de vvIBDV, y al menos un oligonucleótido sonda conocido de aquí en adelante como "sonda de anclaje", que es complementario con una secuencia blanco en un locus de anclaje adyacente o localizado a unos pocos pares de bases del locus de mutación. La temperatura a la que se disocian las sondas de anclaje de la presente invención de sus secuencias blanco es al menos 4°C mayor que la temperatura a la que las sondas de mutación de la presente invención se disocian de sus secuencias blanco. Un miembro del par de oligonucleótidos sonda está marcado con un donante de transferencia de energía de fluorescencia, y el otro miembro del par de sondas está marcado con un aceptor de transferencia de energía de fluorescencia. El par de sondas se pone en contacto con la muestra de ácidos nucleicos bajo condiciones que permiten que cada miembro del par de sondas hibridice con al menos una cadena de un ácido nucleico en la muestra de prueba, para proporcionar un complejo de hibridización entre el par de sondas y el ácido nucleico. Luego se determina la temperatura de fusión del complejo de hibridización, es decir, la temperatura a la cual la sonda de mutación se disocia del ácido nucleico, con un análisis de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) . Los resultados donde la temperatura de fusión (Tm) del complejo de hibridización formado entre la sonda de mutación y un ácido nucleico en la muestra es mayor que la temperatura de fusión de un complejo de hibridización (conocido de aquí en adelante como "complejo de control de hibridización distinto de vvIBDV" ) , formado cuando la sonda de mutación hibridiza con un ácido nucleico que comprende SEQ ID N° 1, o su complemento inverso, indica que la muestra comprende el gen VP2 , o una porción de éste, de un vvIBDV. En determinadas realizaciones, la temperatura de fusión del complejo de hibridización que se forma entre la sonda de mutación y un ácido nucleico en la muestra de prueba se compara con la temperatura de fusión de un complejo de hibridización (conocido de aquí en adelante como "complejo de control de hibridización de vvIBDV" ) que se forma cuando la sonda de mutación y la sonda de anclaje hibridizan con un ácido nucleico que comprende sus secuencias blanco. Los resultados donde la temperatura de fusión del complejo de hibridización formado entre las sondas de la invención y la muestra de prueba está dentro de un rango de 4°C de la temperatura de fusión del complejo de control de hibridización de vvIBDV indica que la muestra comprende al menos una cadena del gen VP2, o una porción de éste, de un vvIBDV. Pares de oligonucleótidos sonda En determinadas realizaciones, en los presentes métodos se emplea una primera sonda de mutación diseñada para que hibridice con la secuencia blanco en un primer locus de mutación en el gen VP2 de vvIBDV, y una primera sonda de anclaje diseñada para que hibridice con una secuencia blanco en un primer locus de anclaje adyacente o localizado a unos pocos nucleótidos hacia el extremo 5' de la secuencia de la sonda de mutación blanco. En determinadas realizaciones, la primera sonda de mutación comprende una secuencia idéntica a una primera secuencia blanco mutada de SEQ ID N° 1, donde la citosina en la posición 827 ha sido sustituida por una timidina, la citosina en la posición 830 ha sido sustituida por una timidina, y la timidina en la posición 833 ha sido sustituida por una citosina. En otra realización, la primera sonda de mutación de la presente invención es el complemento inverso de la primera secuencia blanco mutada.

En determinadas realizaciones, la primera sonda de mutación comprende la secuencia TAATATC, SEQ !D N° 2. En otras realizaciones, la primera sonda de mutación comprende la secuencia GATATTA, SEQ ID N° 3. En determinadas realizaciones, la primera sonda de mutación tiene una longitud de entre 12 y 25 nucleótidos, y comprende la totalidad o una porción de la secuencia de la sonda de mutación vv232, SEQ ID N° 4, con la condición de que la porción comprenda SEQ ID N° 2, o la totalidad o una porción del complemento inverso de SEQ ID N° 4, con la condición de que la porción del complemento inverso comprenda SEQ ID N° 3. En determinadas realizaciones, la primera sonda de mutación comprende entre 12 y 18 nucleótidos contiguos de SEQ ID N° 4, o su complemento inverso. En otras realizaciones, la primera sonda de mutación comprende entre 12 y 17 nucleótidos contiguos de SEQ ID N° 4, y entre 1 y 13 nucleótidos contiguos que se hallan hacia el extremo 5' del nucleótido 827 y/o hacia el extremo 3' del nucleótido 833 de SEQ ID N° 1, o su complemento inverso. En los métodos donde se emplea la primera sonda de mutación también se emplea una sonda de anclaje, conocida de aquí en adelante como la "primera sonda de anclaje", diseñada para que hibridice con una secuencia en un locus de anclaje que está adyacente o se localiza a unos pocos pares de bases hacia el extremo 5' del primer locus de mutación (véase la Fig. 4.) La sonda de anclaje tiene 12 o más nucleótidos de longitud, y se disocia de su secuencia blanco a una temperatura al menos 4°C mayor que la temperatura a la cual la primera sonda de mutación se disocia de su secuencia blanco. En una realización, la primera sonda de anclaje tiene una secuencia que es idéntica a una secuencia localizada hacia el extremo 5' del nucleótido 827 en la primera secuencia blanco mutada. En otras realizaciones, la primera sonda de anclaje tiene una secuencia que es el complemento inverso de una secuencia localizada hacia el extremo 5' del nucleótido 827 de la primera secuencia blanco mutada. En determinadas realizaciones, la primera sonda de anclaje tiene 12 o más nucleótidos de longitud, y comprende entre 12-23 nucleótidos contiguos de la secuencia de la sonda de anclaje vv232, SEQ ID N° 5, indicada en la Tabla 2, o su complemento inverso. En determinadas realizaciones, en los presentes métodos se emplea una segunda sonda de mutación, diseñada para que hibridice con una segunda secuencia blanco mutada en un segundo locus de mutación en el gen VP2 gene de vvIBDV, y una segunda sonda de anclaje diseñada para que hibridice con una secuencia blanco en un segundo locus de anclaje, adyacente o localizado a unos pocos nucleótidos hacia el extremo 3' del segundo locus de mutación (véase la Figura 1) . En determinadas realizaciones, la segunda sonda de mutación comprende una secuencia idéntica a una segunda secuencia blanco mutada de SEQ ID N° 1, donde la guanina en la posición 897 ha sido sustituida por una adenina, la citosina en la posición 905 ha sido sustituida por una timidina, y la citosina en la posición 908 ha sido sustituida por una timidina. En otra realización, la segunda sonda de mutación de la presente invención es el complemento inverso de la segunda secuencia mutada. En determinadas realizaciones, la segunda sonda de mutación comprende la secuencia ATACTGGGTGCT, SEQ ID N° 6. En otras realizaciones la segunda sonda de mutación comprende la secuencia AGCACCCAGTAT, SEQ ID N° 7. En determinadas realizaciones, la segunda sonda de mutación tiene entre 12 y 25 nucleótidos de longitud, y comprende la totalidad o una porción de la secuencia de la sonda de mutación vv256, SEQ ID N° 8, con la condición de que la porción comprenda SEQ ID N° 6, o la totalidad o una porción del complemento inverso de SEQ ID N° 8, con la condición de que la porción comprenda SEQ ID N° 7. En determinadas realizaciones, la segunda sonda de mutación comprende entre 12 y 20 nucleótidos contiguos de SEQ ID N° 8, o su complemento inverso. En otras realizaciones, la segunda sonda de mutación comprende entre 12 y 19 nucleótidos contiguos de SEQ ID N° 8, y entre 1 y 13 de los nucleótidos localizados hacia el extremo 5' del nucleótido 897 y/o hacia el extremo 3' del nucleótido 908 de SEQ ID N° 1, o su complemento inverso.

En los métodos donde se emplea la segunda sonda de mutación también se emplea una sonda de anclaje, conocida de aquí en adelante como la "segunda sonda de anclaje", diseñada para que hibridice con una secuencia blanco en un segundo locus de anclaje localizado hacia el extremo 3', y que está adyacente o se localiza a unos pocos nucleótidos del segundo locus de mutación en el gen VP2 de vvIBDV (véase la Fig. 4). En determinadas realizaciones, la segunda sonda de anclaje tiene 12 o más nucleótidos de longitud, y comprende entre 12-23 nucleótidos contiguos de la secuencia de la sonda de anclaje vv256, SEQ ID N° 9, indicada en la Tabla 2. En determinadas realizaciones, la muestra de ácidos nucleicos se pone en contacto con el primer par de oligonucleótidos sonda y el segundo par de oligonucleótidos sonda, y se determinan las temperaturas a las que la primera sonda de mutación y la segunda sonda de mutación se disocian del primer complejo de hibridización y el segundo complejo de hibridización, respectivamente. La sondas de anclaje de la presente invención están diseñadas de modo que se disocien de un complejo de hibridización que comprende la sonda de anclaje y su secuencia blanco, a una temperatura al menos 4°C mayor que la temperatura a la cual la sonda de mutación se disocia de un complejo de hibridización que comprende la sonda de mutación y su secuencia blanco. Por ende, la temperatura de fusión de un complejo de hibridización que comprende la sonda de anclaje y su secuencia blanco puede ser 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o aún más grados mayor que la temperatura de fusión de un complejo de hibridización que comprende la sonda de mutación y su secuencia blanco. La temperatura de fusión de la sonda depende de factores externos (la concentración de sal el y pH) y factores intrínseco (concentración, longitud de los dobletes, contenido de GC e interacciones con el vecino más cercano) ( etmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26:227-259 (1991); Wetmur. en: Meyers, R A, editor.

Molecular Biology and Biotechnology, VCH, Nueva York, pp. 605-608 (1995); Brown et al. J Mol. Biol. 212:437-440 (1990); Gaffney et al., Biochemistry 28:5881-5889 (1989)). Los métodos de la invención comprenden combinar oligonucleótidos sonda marcados con fluorescencia con la muestra de ácidos nucleicos, de modo que los oligonucleótidos sonda hibridicen, donde la hibridización permitirá la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia entre un fluoróforo donante en un miembro del par de sondas y un fluoróforo aceptor en el otro miembro del par de sondas. Después, la emisión del fluoróforo aceptor se mide a distintas temperaturas crecientes. La Tm se determina como la temperatura a la cual hay una reducción abrupta en la emisión. El color de la emisión y la Tm se usan para determinar si la muestra de prueba contiene o no un ácido nucleico que comprende el primer locus de mutación y/o el segundo locus de mutación. La transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) ocurre entre dos fluoróforos cuando se hallan en proximidad física uno del otro, y el espectro de emisión de un fluoróforo se superpone con el espectro de excitación del otro. La velocidad de transferencia de energía por resonancia es: (8 785E"5) (t-l) (k2) (n"4) (qD) (R~6) (J.DA) , donde: t = período de vida del estado excitado del donante en ausencia del aceptor; k2 = un factor de orientación entre el donante y aceptor; n = índice de refracción de la luz visible en el medio presente; qD = eficiencia cuántica del donante en ausencia del aceptor; R = distancia entre el donante y el aceptor medida en Angstroms; JDA = la integral de (FD) (eA) (W4) respecto de W en todas las longitudes de onda superpuestas, con: FD = espectro de fluorescencia pico normalizado del donante; A = coeficiente de absorción molar del aceptor (M"1 cm" ' ) ; W4 = longitud de onda (nm) . Para cualquier donante y aceptor dado, es posible calcular la distancia en la cual ocurre 50% de la transferencia de energía por resonancia, la cual se abrevia R0. Como la velocidad de la transferencia de energía por resonancia depende de la 6a potencia de la distancia entre el donante y el aceptor, la transferencia de energía por resonancia cambia rápidamente a medida que R varía respecto de R0 • En 2 R0 ocurre una mínima transferencia de energía por resonancia, y en 0.5 R0, la eficiencia de la transferencia es casi completa, a menos que predominen otras formas de desexcitación. Usando el método de Wittwer et al. (1997), se diseñaron oligonucleótidos marcados con fluorescencia para que hibridizaran con la misma cadena de una secuencia de ADN, lo que resultó en la separación de los fluoróforos donante y aceptor por una distancia que varió entre aproximadamente 0 y aproximadamente 25 nucleótidos. En determinadas realizaciones, los fluoróforos donante y aceptor están separados por una distancia que varía entre aproximadamente 0 y 5 nucleótidos. En otras realizaciones, los fluoróforos donante y aceptor están separados por una distancia que varía entre aproximadamente 0 y 2 nucleótidos. En otra realización, los fluoróforos donante y aceptor están separados por l nucleótido. Cuando ambos oligonucleótidos marcados con fluorescencia no hibridizan con su secuencia complementaria en el ADN blanco, la distancia entre el fluoróforo donante y el fluoróforo aceptor es demasiado grande para que ocurra la transferencia de energía por resonancia. Bajo estas condiciones, el fluoróforo aceptor y el fluoróforo donante no producen una fluorescencia incrementada detectable a través del fluoróforo aceptor. Los pares de fluoróforos aceptables para usar como pares de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia son bien conocidos por aquellos entrenados en la técnica, e incluyen, sin limitaciones, ficoeritrina como donante y Cy7 como aceptor, fluoresceína como donante, en combinación con cualquiera de Cy5 , Cy5.5 , IRD 700, LC Rojo 640 y LC Rojo 705 como aceptor. Ha de comprenderse que en la invención puede usarse cualquier combinación funcional de donante/aceptor de FRET. En determinadas realizaciones, por ejemplo, cuando el primer conjunto de sondas y el segundo conjunto de sondas se agregan a recipientes de PCR separados, la emisión de cada fluoróforo aceptor puede ser igual. En otras realizaciones, por ejemplo, cuando ambos conjuntos de sondas se agregan al mismo recipiente de PCR, la emisión de cada uno de los fluoróforos aceptores preferiblemente es diferente. Las sondas marcadas pueden construirse de acuerdo con las descripciones, por ejemplo, de Wittwer et al., BioTechniques 22:130-135, 1997; Lay y Wittwer, Clin. Chem. 43:2262-2267, 1997; y Bernard Pset al., Anal. Biochem. 255:101-107, 1995. Cada una de estas descripciones se incorpora en la presente documentación en su totalidad. Los aceptores de FRET apropiados incluyen, sin limitaciones, LC Rojo 640, Cy 5 , Cy 5.5 y LC Rojo 705. Preparación de la muestra La muestra de ácidos nucleicos usada en los presentes métodos, es decir, la muestra de prueba de ácidos nucleicos, puede ser un ácido nucleico de cadena simple o cadena doble. En determinadas realizaciones, la muestra de prueba de ácidos nucleicos es un ARN de cadena doble que ha sido aislado de un tejido, por ejemplo, sangre, músculo, etcétera, de un animal. En otras realizaciones, la muestra de ácidos nucleicos es una de las cadenas de la muestra de ARN de cadena doble aislado. Una muestra particularmente útil es un ARNds aislado de la bursa de un pollo. Los métodos para aislar AR de muestras de tejidos son conocidos. En los ejemplos más adelante se describe un método para aislar ARNcd de la bursa de un pollo. En otra realización, la muestra es un producto de ADNc, que ha sido formado mediante la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa con ranscriptasa inversa (RT-PCR) de una muestra de ARN de cadena simple o cadena doble aislada de un animal . La molécula de ADNc se prepara usando procedimientos de RT-PCR conocidos en la técnica, y cebadores que rodean uno o ambos loci de mutación y anclaje dentro del gen VP2 de IBDV. En los ejemplos más adelante se describe un ejemplo de un par útil. Hibridización de los pares de sondas con la muestra de prueba La muestra de ácidos nucleicos y las sondas de mutación y las sondas de anclaje marcadas con fluoróforos se ponen en contacto bajo condiciones que permiten que las sondas de mutación y las sondas de anclaje hibridicen con sus secuencias blanco y formen un complejo de hibridización. Las condiciones apropiadas incluyen, sin limitaciones, aquellas proporcionadas en el conjunto de elementos de amplificación de ARN LightCycler para sondas de hibridización (Roche, Molecular Biochemicals, Alamedia, CA) , donde dada reacción contendría 4 µl de mezcla de reacción de RT-PCR 5X, MgCl2 4.5 mM, 0.25 µM de cada cebador IBDV, 0.2 µM de cada sonda, 0.5 µl de ácido nucleico molde y H20 estéril, agregada hasta un volumen de reacción final de 20 µl . La hibridización ocurriría a una temperatura de alineamiento de 61°C o menor, durante 10 segundos .

Determinación de la temperatura de fusión de los complejos de hibridización La formación de un complejo de hibridización que comprende la sonda de mutación y una molécula en la muestra de ácidos nucleicos se analiza con un análisis FRET, es decir, detectando o midiendo la fluorescencia emitida por la muestra de prueba. Los dispositivos para medir la emisión de fluorescencia son conocidos en la técnica. También se halla disponible comercialmente un dispositivo para medir la emisión del aceptor de FRET para dos longitudes de onda diferentes, a temperaturas variables (es decir, LightCycler™) . Más adelante se describirán dispositivos para detectar simultáneamente la emisión del aceptor de FRET para más de dos longitudes de onda, a temperaturas variables. En determinadas realizaciones de la invención, la emisión de cada aceptor de FRET se mide para un espectro de longitudes de onda diferente, preferiblemente alrededor de su longitud de onda de emisión máxima, a una primera temperatura. Después, esta medición se repite a una segunda temperatura. En determinadas realizaciones, estas mediciones se realizan de forma repetitiva, preferiblemente en un rango de temperaturas progresivamente crecientes. La primera medición se realiza a una temperatura suficientemente baja para asegurar que hibridice cada una de las sondas. En general, esta temperatura será de al menos 20 °C. La temperatura de fusión (Tm) de los complejos de hibridización resultantes se determina midiendo las emisiones a temperaturas subsiguientemente mayores. Eventualmente, a medida que se incrementa la temperatura, la sonda de mutación se disociará (se fundirá) del ácido nucleico con el cual había hibridizado. Esta disociación resulta en la ruptura de la asociación del donante/aceptor de FRET, que se observa como una caída abrupta en la emisión del aceptor de FRET. En determinadas realizaciones, las mediciones del aceptor de FRET se realizan cada 50-10000 milisegundos. Por ejemplo, las mediciones del aceptor de FRET pueden realizarse cada 100-1000 milisegundos. En otras realizaciones, las mediciones del aceptor de FRET se realizan cada 100-200 milisegundos. La temperatura puede variar entre 0.01°C por segundo y 5°C por segundo. La temperatura puede variar entre 0.5°C por segundo y 1°C. En determinadas realizaciones, la temperatura varía en al menos 0.5°C por segundo.

EJEMPLOS Materiales y métodos Virus Las cepas de vvIBDV usadas para desarrollar y convalidar los presentes métodos fueron proporcionadas como ARN genómico para el laboratorio empleado, de acuerdo con el permiso de importación #44226 del Servicio de Inspección de Salud de Animales y Plantas del USDA. Los virus fueron de Europa, Asia, África, el Caribe y Oriente Medio. El material genético de las cepas distintas de vvlBDV se obtuvo a partir de vacunas domésticas y erupciones de bursitis infecciosa (IBD) en los Estados Unidos. Estas cepas distintas de vvIBDV incluyeron virus variantes y clásicos. Todos los virus usados en este estudio, y su país de origen, se indican en la tabla 1.

Tabla 1. Muestras de virus y su origen geográfico.

País de origen Muestras de virus EEUUA Del-E, D78, STC, F16, FDG, FDH, GA234, M0196, MS 203, T1 , AM 86, AR113, WI240, AR272, AR80, AR84, F15, GA129 Israel8 Isrl, Isr2, Isr3, Isr4, Isrd, Isr6, Isr7, Isr8, Isr9, Isr10, Isr11 , Isr12, Isr13, Isr14, Isr15, Isr16, Isr17, Isr19, Isr20, Isr21 , Isr23, Isr24, Isr25, Isr29, Isr30 Singapur8 179, 182, 183 Korea8 9596, 91108 Francia8 AK2, AL1 , AL4, AL6, AL10, ALB, FD7 República dominicana8 DR4 Sudáfrica8 SA2 España8 Spainl Jordania8 Jordán E Tailandia8 Thai4 ATodas las muestras de los Estados Unidos fueron cepas distintas de vvlBDV, y consistieron en aislados de una variante de serotipo 1, clásicos y de campo. BLas muestras de estos países fueron proporcionadas como cepas vvlBDV probables . Extracción del RNA viral El ARN genómico de las muestras de IBDV originadas fuera de los EEUU llegó al laboratorio después de haber sido tratado con fenol y cloroformo, de acuerdo con el permiso de importación #44226. Estas muestras se lavaron dos veces con amortiguador THE [Tris-HCl 10 mM (pH 8.0), NaCl 100 mM, ácido etilendiaminotetraacético 1 mM] , antes de tratarlas con proteinasa K (Sigma Chemical Co . , St . Louis, MO) y fenol ácido (pH 4.3) (AMRESCO, Solón, OH), usando procedimientos convencionales (Jackwood, D. J. y S. E. Sommer. Avian Diseases 41: 627-637. 1997). El ARN genómico de las cepas de IBDV domésticas se obtuvo de tejido de bursa homogenizado usando proteinasa K y fenol ácido (Jackwood, D. J. y S. E. Sommer. Avian Diseases 41: 627-637.1997) . RT-PCR en tiempo real Se usó un instrumento LightCycler (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) y un conjunto de elementos de amplificación de ARN LightCycler para las sondas de hibridización (Roche, Molecular Biochemicals, Alamedia, CA) . Cada reacción contenía 4 µl de mezcla de reacción de RT-PCR 5X, MgCl2 4.5 mM, 0.25 µM de cada cebador IBDV, 0.2 µM de cada sonda, 0.5 µl de ácido nucleico molde y H20 estéril, agregada hasta un volumen de reacción final de 20 µl . Los cebadores amplificaron una región de 743 bp de VP2 (743-1: 5 ' -GCCCAGAGTCTACACCAT-3 ', SEQ ID N° 10, y 743-2: 5 ' -CCCGGATTATGTCTTTGA-3 ', SEQ ID N° 11) (Jackwood, D. J. y S. E. Sommer. Avian Diseases 42: 321-339. 1998). Las reacciones en el dispositivo LightCycler comenzaron con una incubación con transcriptasa inversa a 55 °C por 7 minutos, a lo que siguió un paso de desnaturalización a 95 °C por 5 minutos y 40 ciclos de desnaturalización a 95°C por 1 segundo, alineamiento a 6l°C por 10 segundos y elongación a 72 °C por 30 segundos.

Diseño de las sondas Las sondas específicas para vvIBDV se diseñaron usando secuencias publicadas de cepas de vvIBDV aisladas de distintos continentes (Banda, A. y P. Villegas. Avian Diseases 48: 540-549. 2004, Brown, M. D. y M. A. Skinner. Virus Research 40: 1-15. 1996, Chen, H. Y., et al. Avian Diseases 42: 762-769. 1998, Domanska, K. , et al. Archives of Virology 149: 465-480. 2004, Indervesh, A. K. et al. Acta virologica 47: 173-177. 2003, Kwon, H. et al. Avian Diseases 44: 691-696. 2000, Lin, Z., et al. Avian Diseases 37: 315-323. 1993, Liu, H. J., et al. Research in Veterinary Science 70: 139-147. 2001, Owoade , A. A., et al. Archives of Virology 149: 653-672. 2004, Parede, L., et al. Avian Pathology 32: 511-518. 2003, Rudd, M. F., et al. Archives of Virology 147: 1303-1322. 2002, Zierenberg, K. , et al. Archives of Virology 145: 113-125. 2000, Zierenberg, K., et al. Avian Pathology 30: 55-62. 2001) y secuencias obtenidas secuenciando el gen VP2 de de diecisiete cepas de vvlBDV enviadas al laboratorio bajo el permiso de importación #44226. Se seleccionaron regiones del gen VP2 sobre la base de mutaciones únicas de las cepas vvIBDV. La tecnoclogía LightCycler hace uso de pares de sondas para identificar mutaciones de nucleótidos (Bernard, P. S., et al. American Journal of Pathology 153: 1055-1061. 1998). Cada par consistió en una sonda de mutación, diseñada para detectar mutaciones puntuales, localizada en el mismo sitio de la región del nucleótido único, y una sonda de anclaje, localizada en una región más conservada del genoma, adyacente a la sonda de mutación. Las sondas se marcaron con fluoresceína (FITC), Rojo 640 o Rojo 705, de modo que la FITC en una sonda se hallara adyacente a la marca con Rojo en su par. Los colorantes FITC y Rojo crean una transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) , que es detectada con el instrumento LightCycler cuando ambas sondas están unidas a los productos de RT-PCR (Bernard, P. S., et al . Mutation detection by fluorescent hybridization probé melting curves, en: Rapid cycle real-time PCR methods and applications. S. Meuer, C. Wittwer, y K.-I. Nakagawara, editores, Spinger-Verlag, Berlín, heidelberg, Alemania. 11-20. 2001) . Cada par de sondas fue diseñado de modo tal que la sonda de anclaje tuviera una temperatura de fusión (Tm) aproximadamente 10 °C mayor que la de la sonda de mutación (Tabla 2) . Esto asegura la disociación de la sonda de mutación antes de la sonda de anclaje, durante los análisis de punto de fusión que siguieron al ensayo de RT-PCR en tiempo real. Análisis de los datos Durante el ensayo de RT-PCR, se detectó fluorescencia a 640 A o 705 Á, y se la registró al final de cada paso de alineamiento, cuando las sondas de mutación y anclaje estuvieron unidas a los productos de RT-PCR. Esto permitió amplificar el genoma de IBDV, que se detectaría en tiempo real . Después de 40 ciclos de amplificación por PCR, las reacciones se enfriaron lentamente a 35 °C, y luego se calentaron lentamente a 90°C. Durante este período, la disociación de la sonda de mutación de los productos de RTPCR provocó una pérdida de fluorescencia, que fue detectada y usada para calcular una Tm. La Tm para una coincidencia de secuencia exacta para cada sonda de mutación se indica en la Tabla 2. Tabla 2. Pares de sondas evaluados en este estudio. Sonda de mutación vv232: 5 ' -R?j?705-CTCAGCTAATATCGATGC 3 ' , SEQ ID N° 4 Tm = 55°C Sonda de anclaje vv232: 5 ' -AGGTGGGGTAACAATCACACTGT-FITC- 3 J SEQ ID N° 5 Tm = 64 °C Sonda de mutación vv256: 5 ' -CTTATACTGGGTGCTACCATC-FITC-3, SEQ ID N° 8' Tm = 58°C Sonda de anclaje vv256: 5'-Rojo640-CCTTATAGGCTTTGATGGGACTGCGG-3, SEQ ID N° 9 Tm = 67 °C Las temperaturas de fusión (Tm) para cada sonda se determinaron usando TM Utility 1.5, de Idaho Technologies Ine .

Se analizó la Tm promedio del grupo de vvlBDV y el grupo distinto de vvIBDV para cada sonda, usando un ANOVA de una vía . Análisis de las secuencias de nucleótidos Para convalidad los resultados de la RT-PCR en tiempo real, se seleccionaron 18 virus enviados al laboratorio como aislados de vvIBDV probables para realizar un análisis de secuencia. Los virus se amplificaron usando procedimientos de RT-PCR convencionales (Jackwood, D. J. , et al. Avian Diseases 45: 330-339. 2001), y estos productos de RT-PCR se purificaron usando un conjunto de elementos Geneclean Spin (BIO 101, Vista, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, después, los productos de RTPCR se enviaron a la Instalación de Secuenciación de ADN del Centro de Biotecnología de la Universidad de Wisconsin (Madison, Wl) determinar si secuencia de nucleótidos. Las secuencias de nucleótidos se descargaron usando Chromas (Technelysium Pty Ltd. , Queensland, Australia) , y se analizaron usando software Omega (Oxford molecular, Campbell, California) . Los números de acceso GenBank de estas secuencias se indican como un conjunto que comienza con AY906997 y termina con AY907014.

Resultados Marcadores genéticos de wlBDV Para diseñar pares de sondas para el ensayo de RT-PCR en tiempo real, se realizó un análisis de secuencias de vvlBDV publicadas para determinar mutaciones de nucleótidos potencialmente únicas. Se comparó una lista más bien grande de virus muy virulentos de numerosos países y continentes. Sobre la base de estas secuencias, se identificaron tres regiones con mutaciones consistentes. Se diseñaron sondas de mutación y anclaje para estas regiones. La sonda de mutación vv232 se diseñó para aprovechar tres mutaciones silenciosas en las posiciones de nucleótidos 827, 830 y 833. La segunda sonda, vv256, abarcó los nucleótidos 894 a 914, y se diseñó para detectar una mutación de nucleótidos que resulta en una valina en la posición 256 en cepas distintas de vvEBDV, y una isoleucina en vvIBDV. También se incluyeron dos mutaciones silenciosas en las posiciones de nucleótidos 905 y 908 de esta sonda. RT-PCR en tiempo real En el ensayo de RT-PCR en tiempo real se amplificaron las cepas vvlBDV y distintas de vvIBDV. Durante este ensayo, las sondas vv232 y vv256 hibridizaron con todos los virus y produjeron una señal de FRET durante el paso de alineamiento (datos no indicados) .

Se calculó una Tm para las sondas vv232 y vv256 con cada muestra de vvIBDV. Inicialmente se evaluaron 18 muestras de IBDV, que habían sido enviadas al laboratorio como probables cepas de vvIBDV (Tabla 3) . Los valores de Tm se informaron como el promedio de al menos 2, pero comúnmente 3 ó 4 ensayos de RT-PCR en tiempo real separados. Las temperaturas de fusión calculadas con la sonda vv232 se hallaron en el rango de dos desviaciones estándar de la Tm calculada para una coincidencia de secuencia exacta con 17 de las 18 muestras de vvIBDV probables. La muestra Thai 4 tuvo una Tm de 46.11°C, que fue considerablemente menor que la esperada para una cepa de vvIBDV. Los resultados con la sonda vv256 fueron similares, excepto una vez más por el virus Thai 4 (Tm = 46.15°C) y dos virus adicionales, SA2 y 182, donde los valores de Tm fueron ligeramente menores que los esperados, 49.99 y 48.81°C, respectivamente.

Tabla 3. Valores promedio de Tm para las sondas vv232 v256 en muestras probables de vvIBDV.

Cepas de vvIBDV Tm ± SD para Tm ± SD para vv2568 probables vv232A 183 53,94 ±0,39 56,51 ±0,47 9596 55,67 ±0,17 56,08 ±0,51 AK2 54,81 ±0,68 55,66 ±0,85 AL 10 54,49 ± 0,06 55,90 ±0,44 AL 13 54,41 ±0,06 56,12 ±0,48 Cepas de vvIBDV Tm ± SD para Tm ± SD para vv2568 probables vv232A AL 4 53,88 ±0,30 56,27 ± 0,48 DR4 55,73 ±0,43 56,50 ±0,51 Isr 30 54,16 ±0,09 54,31 ±0,05 Isr4 54,01 ±0,28 58,67 ±1,71 Isr 7 53,97 ±0,11 58,00 ±1,32 Spain 1 53,77 ±0,02 57,66 ± 1,49 Jordán E 56,24 ±1,14 55,23 ±0,41 FD7 55,05 ±0,54 55,04 ±0,39 179 56,34 ±0,01 55,00 ±0,29 SA2 51,98 ±1,50 49,99 ±0,71 Isr 13 54,29 ± 0,67 54,49 ± 0,55 182 54,46 ±0,31 48,81 ±0,53 Thai 4 46,11 ±0,06 46,15 ±0,21 BLa temperatura de fusión promedio (Tm) y la desviación estándar (SD) obtenida con la sonda vv256. Convalidación del ensayo Para realizar una convalidación adicional de las sondas vv232 y vv256, se examinaron otras 26 muestras enviadas al laboratorio como probables vvIBDV y 18 cepas distintas de IBDV conocidas (Tabla 4) . Las temperaturas de fusión de cada una de las probables vvIBDV siempre fueron mayores que 52 °C, y en todos los casos se hallaron en un rango de uno o dos grados de la Tm esperada para una coincidencia de secuencia exacta con las sondas vv232 o vv256. Todas las cepas distintas de vvIBDV evaluadas presentaron valores de Tm inferiores a 49 °C.

Tabla 4. Convalidación de las sondas vv232 y vv256 Tm promedio ± SD Cepas de wlBDV Tm promedio ± SD para la sonda probablesA para la sonda vv256c vv2328 9664 54,89 ±1,17 55,95 ±0,67 91108 54,11 ±0,79 56,13 ±0,44 AL 1 54,22 ± 0,64 56,25 ±0,50 AL 6 53,33 ±0,37 56,22 ± 0,48 Isr 1 54,06 ± 0,49 56,54 ± 22-29 Isr 2 55,20 ±0,56 56,58 ±0,85 Isr 3 54,94 ±1,01 57,22 ±1,17 Isr 5 55,08 ±0,61 56,37 ±0,71 Isr 6 55,28 ±0,77 56,93 ±1,02 Isr 8 54,56 ±1,28 57,09 ±1,36 Isr 9 54,55 ±1,48 56,95 ±1,20 Isr 10 54,45 ± 0,78 56,58 ±1,36 Isr 11 54,31 ±1,49 56,99 ±1,22 Isr 12 54,06 ±1,16 56,41 ±2,04 Isr 14 54,93 ±0,94 56,64 ±1,53 Isr 15 54,55 ±1,01 56,83 ±1,24 Isr 16 55,16 ±1,05 56,30 ±0,71 Isr 17 55,24 ±0,71 56,46 ±0,71 Isr 19 54,89 ± 0,45 56,10 ±0,46 Isr 20 55,04 ± 1,01 56,33 ±0,08 Tm promedio ± SD Cepas de wlBDV Tm promedio ± SD para la sonda probables1* para la sonda vv256 vv2328 Isr 21 54,93 ±0,39 56,15 ±0,39 Isr 23 55,20 ±0,11 56,32 ± OJO Isr 24 53,92 ±0,93 55,74 ±0,08 Isr 25 54,23 ±1,15 56,18 ±0,20 Isr 28 52,86 ±0,66 54,88 ±0,78 Isr 29 54,14 ±0,72 55,19 ±0,74 Cepas distintas de vvlBDVD DelE 45,80 ±0,16 45,65 ±0,19 D78 33,93 ±0,72 46,67 ±0,56 STC 45,29 ±0,33 44,97 ±0,28 F16 45,33 ±0,28 45,19 ±0,23 FDG 45,56 ±0,06 45,34 ± 0,24 FDH 46,30 ± 0,44 46,26 ±0,59 GA234 45,80 ±0,39 46,10 ±0,38 M0196 46,65 ± 0,06 46,81 ±0,21 MS203 45,33 ±0,39 45,88 ±0,70 T1 48,49 ±0,33 48,30 ±0,24 ALI86 45,84 ±0,33 46,07 ±0,26 AR113 46,66 ± 0,28 47,03 ±0,53 WI240 47,32 ± 0,34 47,28 ±0,34 AR272 45,84 ±0,33 45,96 ±0,18 AR80 45,80 ±0,05 46,27 ±0,49 AR84 45,92 ± 0,54 46,36 ±0,14 F15 41,97 ±0,06 42,02 ±0,12 GA129 36,91 ±1,93 39,39 ± 0,72 Convalidación de las sondas vv232 y vv256 se realizó usando 26 cepas probables de vvIBDV. BLa temperatura de fusión promedio (Tm) y la desviación estándar (SD) obtenida con la sonda vv232. cLa temperatura de fusión promedio (Tm) y la desviación estándar (SD) obtenida con la sonda vv256. "^Convalidación de las sondas vv232 y vv256 se realizó usando 18 cepas distintas de vvIBDV conocidas de los EEUU.

El promedio general y la desviación estándar de todas las cepas de vvIBDV evaluadas usando la sonda vv232 fue 54.54 + 0.80°C. En contraste, el promedio general y la desviación estándar de todas las cepas distintas de vvlBDV, incluyendo Thai 4, usando esta sonda, fue 44.78 ± 3.55°C.

Estos valores fueron significativamente diferentes al aplicar un ANOVA (p < 0.01) . De forma similar, el promedio general y la desviación estándar de todas las cepas vvIBDV y las cepas distintas de vvIBDV usando la sonda vv256 fue 55.94 + 1.69 y 45.67 ± 1.96°C, respectivamente. Cuando se los comparó usando un ANOVA, los valores de Tm para los grupos de vvIBDV y distintos de vvIBDV con vv256 también fueron significativamente diferentes (p < 0.01) .

Como el par de sondas vv232 estaba marcado con Rojo 705 y el par de sondas vv256 estaba marcado con Rojo 640, fue posible combinarlos en una reacción de LightCycler. Los resultados obtenidos cuando se combinaron las sondas fueron esencialmente idénticos a los resultados obtenidos cuando se las usó por separado (datos no presentados) . Análisis de la secuencia de nucleótidos Los resultados de las secuencias de nucleótidos de las 17 muestras de virus de vvIBDV y las 19 muestras de virus distintos de vvlIBDV se correlacionaron con los valores de Tm observados. En las secuencias SEQ ID NO. 1, 12-28 y 29-47 se indican las secuencias de nucleótidos las sondas de mutación, las secuencias correspondientes de las 17 muestras de vvIBDV, 18 cepas distintas de vvIBDV conocidas, y la muestra Thai 4. Se observaron mutaciones de secuencia entre las sondas de mutación y algunas cepas de vvIBDV. Estas mutaciones redujeron los valores de Tm para estos virus particulares, pero solamente en dos muestras (182 y SA2 ) en las que se usó la sonda vv256 los valores de Tm fueron inferiores a 50°C. En contraste, los valores de Tm para la cepa Thai 4 y las 18 cepas distintas de vvIBDV siempre fueron inferiores a 49 °C, independientemente de la sonda usada.

Discusión Se desarrolló un ensayo de RT-PCR en tiempo real, y el análisis de Tm posterior a este ensayo permitió distinguir cepas de vvIBDV de cepas distintas de vvIBDV. Las muestras fueron proporcionadas al laboratorio como probables cepas de vvIBDV, debido a que la historia de la manada incluía morbilidad y mortalidad elevada. Como solamente fue posible importar material genético desde el exterior de los EEUU (permiso de importación #44226) , fue imposible confirmar el fenotipo de vvIBDV usando estudios con ataques. Por ende, se desarrolló un ensayo genético que permitiera identificar secuencias de nucleótidos específicas únicas para las cepas de vvlBDV. Aunque los elementos genéticos exactos necesarios para la expresión del fenotipo muy virulento aún no han sido determinados, este ensayo se basó en dos regiones del gen VP2 que contenían 6 mutaciones de nucleótidos únicas para estos virus. Los pares de sondas vv232 y vv256 hibridizaron exitosamente con los productos de RT-PCR de vvIBDV, y produjeron una señal de FRET en el dispositivo LightCycler. Cuando se combinaron las sondas vv232 y vv256, fue posible obtener datos de Tm para ambos pares de sondas en una misma reacción, para reducir los costos del ensayo y el período de tiempo necesario para obtener los resultados. Los análisis de temperatura de fusión indicaron que las sondas vv232 y vv256 permitían distinguir cepas de vvIBDV de cepas distintas de vvlBDV. Usando la sonda vv232, la Tm promedio para todas las muestras de vvIBDV evaluadas fue de 54.54°C, que estuvo en un rango de medio grado de la Tm predicha para una coincidencia de secuencia exacta con vvlBDV. Aunque se la proporcionó como una cepa vvIBDV probable, los resultados obtenidos con ambas sondas vv232 y vv256 indicaron que la muestra Thai 4 no era una cepa muy virulenta. La secuenciación de nucleótidos de 17 cepas de vvIBDV confirmó los resultados de Tm, y sus secuencias fueron casi idénticas a las de las cepas de vvIBDV identificadas con anterioridad. Solamente el virus Jordán E presentó una mutación puntual en la región de la sonda vv232. Esta mutación no redujo marcadamente la Tm de este virus y esta sonda, pero se observó una gran desviación estándar (+ 1.41°C), lo que sugiere que podía haber más de un virus presente en la muestra. Los estudios realizados con anterioridad indicaron que comúnmente hay cuasiespecies genéticas presentes en los aislados de campo de IBDV (Jackwood, D. J. y S. E. Sommer. Vir 304: 105-113. 2002). Se observaron mutaciones puntuales en 7 de los 17 virus secuenciados en la región de la sonda vv256. Cada uno de los 7 solamente presentó una mutación puntual, que no redujo apreciablemente su Tm con esta sonda, excepto en dos casos (SA2 y 182) . No está claro por qué una sola mutación en estos dos virus redujo su Tm con la sonda vv256, cuando este no fue el caso con los otros 5 virus que contenían mutaciones únicas. Si hubieran cuasiespecies genéticas presentes en esta muestra y se determinara la secuencia de nucleótidos de la población viral dominante, es posible que las poblaciones de cuasiespecies subordinadas en estos 5 virus contribuyeran a una mayor Tm que la esperada con un cultivo de virus relativamente puro, con una única mutación en la región de la sonda vv256. Los resultados obtenidos demuestran que es posible usar un valor de Tm superior a 51°C para una o ambas sondas para identificar vvIBDV. Solamente dos vvlBDV presentaron valores de Tm inferiores a 51°C usando la sonda vv256, y ninguno presentó valores inferiores al mencionado usando la sonda vv232. El uso de este valor de corte y ambas sondas en el ensayo de RT-PCR en tiempo real permite asegurar la identificación precisa de virus tales como SA2 y 182 como cepas de vvEBDV, ya que sus valores de Tm empleando la sonda vv232 fueron 51.98 y 54.46°C, respectivamente. Además, todas las cepas distintas de vvIBDV evaluadas presentaron valores de Tm inferiores a 49°C con ambas sondas. Las diferencias de Tm observadas usando las sondas vv232 y vv256 presentaron significación estadística entre las cepas de vvIBDV y distintas de vvIBDV, con p < 0.01.

Cada sonda de mutación se diseñó de moro que permitiera detectar 3 nucleótidos únicos de las cepas de vvIBDV; un total de 6 nucleótidos únicos. Un aminoácido en la posición 256 (lie) es único para todas las cepas de vvIBDV (Liu, H. J., et al. Research in Veterinary Science 70: 139-147. 2001, Parede, L., et al. Avian Pathology 32: 511-518. 2003). Un nucleótido en la sonda vv256 usada presenta esta secuencia única de vvIBDV. Los otros 5 nucleótidos únicos detectados por las sondas usadas no afectan la secuencia de aminoácidos de VP2 , pero son propios de las cepas vvIBDV desde el punto de vista evolutivo. El direccionamiento de ambas sondas a las 6 mutaciones de nucleótidos reduce la probabilidad de realizar un diagnóstico erróneo debido a una mutación al azar. Esto se demostró con el virus Jordon E, que tenía mutaciones individuales en las regiones a las cuales se habían dirigido ambas sondas. Los resultados obtenidos con una sonda de mutación diseñada para que hibridizara con una tercera secuencia mutada, que se extendió entre los nucleótidos 784 y 801 del gen VP2 de las cepas vvIBDV, y una sonda de anclaje dirigida a una secuencia hacia el extremo 3' de la tercera secuencia mutada, no permitieron identificar una secuencia de nucleótidos responsable de la mutación de sustitución de alanina en el aminoácido 222 en las cepas vvlBDV. Aunque esta mutación de alanina es única para todas las cepa vvlBDV secuenciadas hasta la fecha (Banda, A. y P. Villegas. Avian Diseases 48: 540-549. 2004, Brown, M. D. y M. A. Skinner. Virus Research 40: 1-15. 1996, Chen, H. Y., et al. Avian Diseases 42: 762-769. 1998, Domanska, K. , et al. Archives of Virology 149: 465-480. 2004, Indervesh, A. K., et al. Acta virologica 47: 173-177. 2003, Kwon, H. M., et al. Avian Diseases 44: 691-696. 2000, Lin, Z., et al. Avian Diseases 37: 315-323. 1993, Liu, H. J. , et al. Research in Veterinary Science 70: 139-147. 2001, Owoade, A. A., et al. Archives of Virology 149: 653-672. 2004, Parede, L., et al. Avian Pathology 32: 511-518. 2003, Rudd, M. F., et al. Archives of Virology 147: 1303-1322. 2002, Zierenberg, K. , et al. Archives of Virology 145: 113-125. 2000, Zierenberg, K. , et al. Avian Pathology 30: 55-62. 2001), las sondas de mutación y anclaje para esta tercera secuencia mutada no produjeron datos precisos o confiables.

Otras realizaciones de la invención serán evidentes para aquellos entrenados en la técnica, a partir de la consideración de la memoria descriptiva y la práctica de la invención descripta en la presente documentación. Ha de considerarse que la memoria descriptiva y los ejemplos solamente se proporcionan a modo de ejemplo, y que el alcance y el espíritu verdadero de la invención está indicado en las siguientes reivindicaciones.

Claims (28)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES ; 1. Un método para identificar un animal infectado con un virus de la forma muy virulenta de la bursitis infecciosa (vvIBDV) , que comprende poner en contacto una muestra de prueba de ácidos nucleicos con una primera sonda de mutación diseñada para que hibridice con una primera secuencia blanco mutada, que se extiende entre el nucleótido 827 y el nucleótido 833 de la cadena en el sentido del marco de lectura del gen VP2 de vvIBDV, o su complemento inverso, y con una primera sonda de anclaje diseñada para que hibridice con una primera secuencia localizada entre 0 y 5 nucleótidos hacia el extremo 5' de la primera secuencia blanco mutada; donde la muestra de prueba de ácidos nucleicos es ARN de cadena doble obtenido del animal, un ADNc derivado del ARN de cadena doble, una cadena individual del ARN de cadena doble, o una cadena individual del ADNc, o cualquier combinación de éstos; donde la primera sonda de mutación tiene 12 o más nucleótidos de longitud, y comprende la secuencia TAATATC, SEQ ID N° 2, o su complemento inverso; donde la primera sonda de anclaje tiene 12 o más nucleótidos de longitud, y se disocia de su secuencia complementaria a una temperatura al menos 4°C mayor que la temperatura a la cual la primera sonda de mutación se disocia de su secuencia complementaria; y donde la primera sonda de mutación y la primera sonda de anclaje se ponen en contacto con la muestra de prueba de ácidos nucleicos bajo condiciones que permiten que la primera sonda de mutación y la primera sonda de anclaje hibridicen con una o la otra cadena del gen VP2 de un vvIBDV, para proporcionar un primer complejo de hibridización; y determinar la temperatura a la cual la primera sonda de mutación se disocia del primer complejo de hibridización; donde una de la primera sonda de mutación y la primera sonda de anclaje está marcada con un fluoróforo aceptor, y la otra de la primera sonda de mutación y la primera sonda de anclaje está marcada con un fluoróforo donante de un par de transferencia de energía de fluorescencia; donde la formación del primer complejo de hibridización y la disociación del primer complejo de hibridización se determina con un análisis de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) , y donde la disociación de la primera sonda de mutación del primer complejo de hibridización a una temperatura mayor que la temperatura a la cual la primera sonda de mutación se disocia de SEQ ID N° 1, o a una temperatura dentro de un rango de 4°C de la temperatura a la cual la primera sonda de mutación se disocia de su secuencia complementaria, o ambas, indica que el animal está infectado con vvIBDV.
2. 2. El método de la reivindicación 1, que comprende además el paso de comparar la temperatura a la cual se funde el primer complejo de hibridización con la temperatura de fusión de un complejo de hibridización formado cuando la primera sonda de mutación hibridiza con un ácido nucleico que comprende la porción blanco de SEQ ID N° 1, o su complemento inverso.
3. 3. El método de la reivindicación 1, que comprende además el paso de comparar la temperatura a la cual se funde el primer complejo de hibridización con la temperatura de fusión de un complejo de hibridización formado cuando la primera sonda de mutación hibridiza con un ácido nucleico que comprende su secuencia complementaria .
4. 4. El método de la reivindicación 1, donde la primera sonda de mutación comprende SEQ ID N° 4, y donde una temperatura de fusión de 49 °C o mayor, para un complejo de hibridización que comprende dicha sonda de mutación y un ácido nucleico en la muestra de prueba, indica que el animal está infectado con vvIBDV.
5. 5. El método de la reivindicación 1, donde la primera sonda de mutación comprende entre 12 y 18 nucleótidos consecutivos en SEQ ID N° 4, o su complemento inverso .
6. 6. El método de la reivindicación 1, donde la muestra de ácidos nucleicos comprende un producto de ADNc obtenido a través de una amplificación mediante una reacción de en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) de una muestra de ARN de cadena doble obtenida del animal.
7. 7. El método de la reivindicación 1, donde la muestra de ARN se obtiene de una especie de ave.
8. 8. El método de la reivindicación 1, donde la muestra de ARN se obtiene de un pollo.
9. 9. El método de la reivindicación 1, donde la muestra de ARN se obtiene de la bursa de un pollo.
10. 10. El método de la reivindicación 1, donde la temperatura de fusión de un complejo de hibridización que comprende la primera sonda de mutación y su secuencia complementaria es al menos 10 °C menor que la temperatura de fusión de un complejo de hibridización que comprende la primera sonda de anclaje y su secuencia complementaria.
11. 11. El método de la reivindicación 1, que comprende además poner en contacto la muestra de prueba de ácidos nucleicos con una segunda sonda de mutación diseñada para que hibridice con una segunda secuencia blanco mutada que se extiende entre el nucleótido 897 y el nucleótido 908 del gen VP2 de vIBDV, o su complemento inverso, y con una segunda sonda de anclaje diseñada para que hibridice con una segunda secuencia de anclaje blanco localizada entre 0 y 5 nucleótidos hacia el extremo 3' de la segunda secuencia blanco mutada; donde la segunda sonda de mutación tiene 12 o más nucleótidos de longitud, y comprende la secuencia ATACTGGGTGCT, SEQ ID N° 6, o su complemento inverso; donde la segunda sonda de anclaje tiene al menos 12 nucleótidos de longitud y se disocia de su secuencia complementaria a una temperatura al menos 4°C mayor que la temperatura a la cual la segunda sonda de mutación se disocia de su secuencia complementaria; donde la segunda sonda de mutación y la segunda sonda de anclaje se ponen en contacto con la muestra de prueba de ácidos nucleicos bajo condiciones que permiten que la segunda sonda de mutación y la segunda sonda de anclaje hibridicen con una cadena del gen VP2 de vvIBDV para proporcionar un segundo complejo de hibridización; y determinar la temperatura a la cual la segunda sonda de mutación se disocia de la segunda complejo de hibridización; donde una de la segunda sonda de mutación y la segunda sonda de anclaje está marcada un fluoróforo aceptor, y la otra de la segunda sonda de mutación y la segunda sonda de anclaje está marcada con un fluoróforo donante de un par de transferencia de energía de fluorescencia; donde la formación del complejo de hibridización y la disociación del segundo complejo de hibridización se determina con un análisis FRET; y donde la disociación de la segunda sonda de mutación del segundo complejo de hibridización a una temperatura mayor que la temperatura a la cual la segunda sonda de mutación se disocia de SEQ ID N° 1, o a una temperatura dentro de un rango de 4°C de la temperatura a la cual la segunda sonda de mutación se disocia de su secuencia complementaria, o ambas, indica que el animal está infectado con vvIBDV.
12. 12. El método de la reivindicación 11, donde la muestra de ácidos nucleicos comprende un producto de ADNc obtenido a través de una amplificación mediante una reacción de en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) de una muestra de ARN de cadena doble obtenida del animal.
13. .13. El método de la reivindicación 11, donde la muestra de ARN se obtiene de la bursa de un pollo.
14. 14. El método de la reivindicación 11, donde la temperatura de fusión de un complejo de hibridización que comprende la segunda sonda de mutación y su secuencia complementaria es al menos 10 °C menor que la temperatura de fusión de un complejo de hibridización que comprende la segunda sonda de anclaje y su secuencia complementaria.
15. 15. Un método para identificar un animal infectado con un virus de la forma muy virulenta de la bursitis infecciosa (vvIBDV) , que comprende poner en contacto una muestra de prueba de ácidos nucleicos con una sonda de mutación diseñada para que hibridice con una secuencia blanco mutada que se extiende entre el nucleótido 897 y el nucleótido 908 del gen VP2 de vvIBDV, o su complemento inverso, y con una sonda de anclaje diseñada para que hibridice con una secuencia de anclaje blanco localizada entre 0 y 5 nucleótidos hacia el extremo 3' de la secuencia blanco mutada; donde la muestra de prueba de ácidos nucleicos es ARN de cadena doble obtenido del animal, un ADNc derivado del ARN de cadena doble, una cadena individual del ARN de cadena doble, o una cadena individual del ADNc, o cualquier combinación de éstos; donde la sonda de mutación tiene 12 o más nucleótidos de longitud, y comprende la secuencia ATACTGGGTGCT, SEQ ID N° 6, o su complemento inverso; donde la sonda de anclaje tiene al menos 12 nucleótidos de longitud y se disocia de su secuencia complementaria a una temperatura al menos 4°C mayor que la temperatura a la cual la sonda de mutación se disocia de su secuencia complementaria; donde la sonda de mutación y la sonda de anclaje se ponen en contacto con la muestra de prueba de ácidos nucleicos bajo condiciones que permiten que las sondas hibridicen con al menos una cadena de un ácido nucleico en la muestra de prueba, para proporcionar un complejo de hibridización; y determinar la temperatura a la cual la sonda de mutación se disocia del complejo de hibridización; donde una de la sonda de mutación y la sonda de anclaje está marcada con un fluoróforo aceptor y la otra de la sonda de mutación y la sonda de anclaje está marcada con un fluoróforo donante de un par de transferencia de energía de fluorescencia; donde la formación del complejo de hibridización y la disociación del complejo de hibridización se determina con un análisis FRET, y donde la disociación de la sonda de mutación del complejo de hibridización a una temperatura mayor que la temperatura a la cual la sonda de mutación se disocia de un ácido nucleico que comprende la secuencia blanco en SEQ ID N° 1, o su complemento inverso, o a una temperatura dentro de un rango de 4°C de la temperatura a la cual la sonda de mutación se disocia de su secuencia complementaria, o ambas, indica que el animal está infectado con vvIBDV.
16. 16. El método de la reivindicación 15, que comprende además el paso de comparar la temperatura a la cual se funde el primer complejo de hibridización con la temperatura de fusión de un complejo de hibridización formado cuando la primera sonda de mutación hibridiza con un ácido nucleico que comprende la porción blanco de SEQ ID N° 1, o su complemento inverso.
17. 17. El método de la reivindicación 15, que comprende además el paso de comparar la temperatura a la cual se funde el primer complejo de hibridización con la temperatura de fusión de un complejo de hibridización formado cuando la primera sonda de mutación hibridiza con un ácido nucleico que comprende su secuencia complementaria .
18. 18. El método de la reivindicación 15, donde la sonda de mutación comprende la secuencia de SEQ ID N° 8, y donde una temperatura de disociación de 51 °C o más, para la sonda de mutación y un ácido nucleico en la muestra, indica que el animal está infectado con vvlBDV.
19. 19. El método de la reivindicación 15, donde la sonda de mutación comprende entre 12 y 23 nucleótidos contiguos en SEQ ID N° 8, o su complemento inverso.
20. 20. El método de la reivindicación 15, donde la muestra de cadena doble es un producto de ADNc obtenido a través de una amplificación mediante una reacción de en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) de una muestra de ARN de cadena doble obtenida del animal.
21. 21. El método de la reivindicación 15, donde la muestra de ARN se obtiene de la bursa de un pollo.
22. 22. El método de la reivindicación 15, donde la temperatura de fusión de un complejo de hibridización que comprende la sonda de mutación y su secuencia complementaria es al menos 10 °C menor que la temperatura de fusión de un complejo de hibridización que comprende la sonda de anclaje y su secuencia complementaria.
23. 23. Un conjunto de elementos para identificar animales infectados con vvIBDV, que comprende: al menos uno de los siguientes: a) un primer par de oligonucleótidos sonda, donde uno de dicho primer par de oligonucleótidos sonda comprende una sonda de mutación que es complementaria con una primera secuencia blanco mutada, que se extiende entre el nucleótido 827 y el nucleótido 833 del gen VP2 de vvIBDV, o su complemento inverso; donde la sonda de mutación tiene 12 o más nucleótidos de longitud, y comprende la secuencia TAATATC, SEQ ID N° 2, o su complemento inverso; donde el otro de dicho primer par de oligonucleótidos sonda comprende una sonda de anclaje que es idéntica a una primera secuencia de anclaje blanco localizada entre 0 y 5 nucleótidos hacia el extremo 5' de la primera secuencia blanco mutada, o su complemento inverso, donde la primera sonda de anclaje tiene 12 o más nucleótidos de longitud, y se disocia de su secuencia complementaria a una temperatura al menos 4°C mayor que la temperatura a la cual la primera sonda de mutación se disocia de su secuencia complementaria; y b) un segundo par de oligonucleótidos sonda, donde uno de dicho segundo par de oligonucleótidos sonda es una segunda sonda de mutación que comprende una secuencia complementaria con una segunda secuencia de mutación blanco, que se extiende entre el nucleótido 897 y el nucleótido 908 del gen VP2 de vvIBDV, o su complemento inverso; donde la segunda sonda de mutación tiene 12 o más nucleótidos de longitud, y comprende la secuencia ATACTGGGTGCT, SEQ ID N° 6, o su complemento inverso; y donde el otro de dicho segundo par de oligonucleótidos sonda es una sonda de anclaje que es idéntica a una segunda secuencia de anclaje blanco localizada entre 0 y 5 nucleótidos hacia el extremo 3' de la primera secuencia blanco mutada, o su complemento inverso; donde la segunda sonda de anclaje tiene 12 o más nucleótidos de longitud, y se disocia de su secuencia complementaria a una temperatura al menos 4°C mayor que la temperatura a la cual la segunda sonda de mutación se disocia de su secuencia complementaria.
24. 24. El conjunto de elementos de la reivindicación 23, donde para cada par de oligonucleótidos sonda, un miembro del par está marcado con un fluoróforo aceptor de un par de transferencia de energía de fluorescencia, y el otro miembro está marcado con un fluoróforo donante de un par de transferencia de energía de fluorescencia.
25. 25. El conjunto de elementos de la reivindicación 23, donde dicho conjunto de elementos comprende el primer par de oligonucleótidos sonda y el segundo par de oligonucleótidos sonda.
26. 26. El conjunto de elementos de la reivindicación 24, donde la emisión del fluoróforo aceptor en el oligonucleótido marcado de un par es diferente de la emisión del fluoróforo aceptor en el oligonucleótido marcado del otro par.
27. 27. Un método para detectar el gen VP2 de un vvIBDV, o una porción de éste, en una muestra de ácidos nucleicos, que comprende : poner en contacto la muestra de ácidos nucleicos con uno o ambos pares de oligonucleótidos de la reivindicación 20; determinar la temperatura a la cual se funde un complejo de hibridización formado entre la primera sonda de mutación y un ácido nucleico en la muestra, o un complejo de hibridización formado entre la segunda sonda de mutación y un ácido nucleico en la muestra, o ambos complejos de hibridización, y comparar la temperatura de fusión de cada complejo de hibridización con uno de los siguientes, o ambos : un primer complejo de control de hibridización que comprende la totalidad o una porción del gen VP2 de una forma no muy virulenta del IBDV, y una o ambas sondas de mutación, y un segundo complejo de control de hibridización que comprende la totalidad o una porción del gen VP2 de un vvIBDV, y una o ambas sondas de mutación; donde las muestras que producen complejos de hibridización cuyas temperaturas de fusión son mayores que las del primer y/o el segundo complejo de control de hibridización contienen el gen VP2 , o una porción de éste, de un vvEBDV.
28. 28. El método de la reivindicación 27, donde la determinación se realiza con una RT-PCR en tiempo real.