CN101189344A - 传染性法氏囊病病毒超强毒的检测 - Google Patents
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Abstract
提供了鉴定动物感染vvIBDV的方法。该方法包括使获自动物的核酸样品或从动物扩增RNA获得的核酸产物与一种或多种探针对接触，其中每个探针对都包括一个突变探针与一个锚定探针，然后确定任何杂交复合物的解链温度，该杂交复合物是当一个或多个探针对与样品中的核酸杂交时形成的。这种测定是使用FRET分析进行。在一个实施方案中，突变探针含有与SEQ ID NO：1的第一个突变靶序列或其反向互补物相同的序列，其中827位的胞嘧啶置换为胸腺嘧啶，830位的胞嘧啶置换为胸腺嘧啶，而且833位的胸腺嘧啶置换为胞嘧啶。在另一个实施方案中，突变探针含有与SEQ ID NO：1的第二个突变靶序列相同的序列，其中897位的鸟嘌呤置换为腺嘌呤，905位的胞嘧啶置换为胸腺嘧啶，而且908位的胞嘧啶置换为胸腺嘧啶。这里还提供了含有可用于本发明的核苷酸探针对的试剂盒。
Description
发明领域
本发明涉及检测核酸样品中的法氏囊病病毒超强毒的新方法。
背景
传染性法氏囊病(IBD)是一种发生在小鸡中的免疫抑制疾病。起病性因子，传染性法氏囊病病毒(IBDV)，天然以几种抗原和致病形式存在。病毒的致病形式为从减毒到超强(vvIBDV)。所有形式看来似乎都对免疫系统引起某些程度的损害。vvIBDV株最初描述于20世纪80年代晚期，而且确定为会引起特征为在易受影响的小鸡群中高发病率和致死率的急性疾病(Van Den Berg，T.P.家禽中的急性传染性法氏囊病：综述.Avian Pathology 29：175-194.2000.)。
IBDV的超强表型最先在欧洲发现(Domanska，K.，等人，在出现病毒超强毒之前传染性法氏囊病病毒的早期欧洲分离株的抗原和基因多样性：传染性法氏囊病的以前欧洲流行再次来临？Archives ofVirology 149：465-480.2004，Van Den Berg，T.P家禽中的急性传染性法氏囊病：综述.Avian Pathology 29：175-194.2000)。它迅速蔓延到亚洲和日本，其描述于20世纪90年代初期(Van Den Berg，T.P.家禽中的急性传染性法氏囊病：综述.Avian Pathology 29：175-194.2000)。1995年，63rd国际动物流行病Office总会议期间(OIE)，80％的成员国报道了急性的IBD案例(Van Den Berg，T.P.家禽中的急性传染性法氏囊病：综述.Avian Pathology 29：175-194.2000)。尽管在世界的几乎每个大陆都鉴定到了vvIBDV，但是在北美洲，澳大利亚和新西兰还没有发现。存在现实而且紧急的担忧，超强形式的IBDV将继续传播，直到它在每个大陆都存在。
早期检测对控制急性IBD是关键的(Van Den Berg，T.P.家禽中的急性传染性法氏囊病：综述.Avian Pathology 29：175-194.2000)。还没有使用监测程序，是由于还没有开发出可靠检测vvIBDV株标记的快速而且经济的分析方法。用于鉴定vvIBDV表型的限制性内切酶标记(SspI)的RT/PCR-RFLP分析已经有描述(Ikuta，N.，等人，巴西传染性法氏囊病病毒的分子表征.Unknown.2000，Jackwood，D.J.和S.E.Sommer.得自美国以外地区的传染性法氏囊病病毒的VP2基因中的限制片段长度多态现象.Avian Diseases 43：310-314.1999，Lin，Z.，等人，在日本流行的传染性法氏囊病病毒超强毒的序列比较.AvianDiseases 37：315-323.1993)。然而，这种分析是昂贵的，而且对于测试大量样品是不实用的。而且，SspI标记已经发现于一些没有显示超强表型的IBDV株中(Banda，A.，等人，得自市售烧鸡的传染性法氏囊病病毒的七个地区分离株的分子表征.Avian Diseases 45：620-630.2001)，所以它的特异性是可疑的。因此，需要用于检测动物中存在vvIBDV的另外的方法。快速并可靠，而且可用于测试大量样品的方法是尤其需要的。
发明概述
本发明提供了鉴定感染vvIBDV的动物的方法。本方法包括使获自动物的核酸样品或从动物扩增RNA获得的核酸产物与一种或多种寡核苷酸探针对接触，其中每个探针对都包括一个突变探针与一个锚定探针，然后确定一个或多个突变探针从杂交复合物解离的温度，该杂交复合物是当一个或多个探针对与样品中核酸杂交时形成的。突变探针与样品中的核酸之间形成的杂交复合物的解链温度(Tm)，高于当突变探针与含有SEQ ID NO：1或其反向互补物的核酸杂交时形成的杂交复合物的解链温度，和/或在突变探针和锚定探针与含有靶序列的核酸样品杂交时形成的杂交复合物的解链温度的4℃之内时的结果，表明该动物具有或已经感染vvIBDV。
在一个实施方案中，突变探针含有与SEQ ID NO：1的第一个突变靶序列或其反向互补物相同的序列，其中827位的胞嘧啶置换为胸腺嘧啶，830位的胞嘧啶置换为胸腺嘧啶，而且833位的胸腺嘧啶置换为胞嘧啶。在这个实施方案中，锚定探针靶向突变靶序列上游的序列。在另一个实施方案中，突变探针含有与SEQ ID NO：1的第二个突变靶序列或其反向互补物相同的序列，其中897位的鸟嘌呤置换为腺嘌呤，905位的胞嘧啶置换为胸腺嘧啶，而且908位的胞嘧啶置换为胸腺嘧啶。在该实施方案中，锚定探针靶向第二个突变靶序列下游的序列。每个突变探针从杂交复合物解离的温度可通过荧光共振能量转移(FRET)分析确定。
本发明还涉及含有可用于本方法的一个或多个寡核苷酸探针对的试剂盒，而且涉及使用这种试剂盒确定核酸样品是否含有全部或部分vvIBDV的VP2基因的方法。
应当理解，上述的概述以及下面的详细说明都只是示例性和说明性的，而不是对要求保护的本发明的限制。
附图，其引入本说明书，并构成本说明书的一部分，可举例说明本发明的实施方案，而且与描述一起，用来阐明本发明的原则。
附图简述
图1显示了IBDV的非超强STC毒株的VP2基因的有义链的核酸序列，SEQ ID NO：1。Kibenge等，J.Gen.Virol.71：569-571，1990首次报道了该序列，其Gen Bank登录号为D00499。
图2显示了相较于vvIBDV和非vvIBDV株的相同区域的vv232探针的核苷酸序列，SEQ ID NO：4。与探针序列不同的核苷酸是粗体形式的。
图3显示了相较于vvIBDV和非vvIBDV株的相同区域的vv256探针的核苷酸序列，SEQ ID NO：8。与探针序列不同的核苷酸是粗体形式的。
图4显示了第一个突变探针的两个实施方案的靶位点，其中一个实施方案含有序列TAATATC，SEQ ID NO：2，另一个实施方案含有序列GATATTA，SEQ ID NO：3，与第一个锚定探针的靶位点相关；以及第二个突变探针的两个实施方案的靶位点，其中一个实施方案含有序列ATACTGGGTGCT，SEQ ID NO：6，另一个实施方案含有序列AGCACCCAGTAT，SEQ HD NO：7，与第二个锚定探针的靶位点相关。
实施方案描述
现在将通过参考更详细的实施方案，并偶尔参考附图对本发明进行描述。但是，本发明可以不同的形式实施，而且不会构成对前面所述的实施方案的限定。更确切地，为本领域的技术人员提供这些实施方案以便该描述是全面的而且完整的，而且完全覆盖本发明的范围。
除非另有限定，这里使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。本发明的说明书中使用的术语，只用于描述特定的实施方案，而不是为了限定本发明的目的。如本发明的说明书和附带的权利要求中使用的，单数形式的“一个”，“一种”和“该”也包括复数形式，除非本文中另外明确指出。这里提到的所有出版物，专利申请书，专利以及其他参考文献，都以其全部内容引入作为参考。
除非另有说明，表示成分的数量，反应条件，以及说明书和权利要求书中使用的所有数字都应当理解为在所有的情况中都通过术语“大约”进行了修饰。因此，除非指明与此相反，下面的说明书和附带的权利要求中的数字参数都是近似值，其可以根据希望通过本发明获得的所需特性而改变。至少，不是企图限定与权利要求的范围相等的原则的申请，每个数字参数应当根据有效数字和普通舍入方法的数字进行分析。
尽管本发明宽范围的数值范围和参数是近似值，但是对特定实施例中的数值还是尽可能精确的报道。然而，任何数值，固有地包含某些误差，其当然来源于它们各自的试验测定中发现的标准偏差。本说明书自始至终提供的每个数值范围将包括每个较窄的数值范围，其落入这种较宽的数值范围中，好像这种较窄的数值范围在这里都清楚地记录了。
本发明是基于以下发现，至少部分地，使用FRET分析，解链温度分析，和针对vvIBDV的VP2基因的特定区域的突变探针和锚定探针，可以容易地而且迅速地把含有vvIBDV的双链RNA基因组或vvIBDV的VP2基因的核酸样品与包含IBDV的非超强毒株的双链RNA基因组的核酸样品区别开。
如这里使用的，“核酸”可指DNA或RNA，或者含有脱氧和核糖核苷酸的分子。“核酸”或“寡核苷酸”或语法上的同等物这里指共价连接到一起的至少两个核苷酸。如这里使用的，“核酸”包含双链的和单链的核酸分子。本发明的核酸或寡核苷酸一般含有磷酸二酯键，尽管有时，具有本领域公知的修饰的核酸类似物，也包括在内。可以对核糖磷酸盐主链进行修饰，以有助于另外的部分如标记的添加，或增加这种分子在各种环境中的稳定性和半衰期。在一个实施方案中，寡核苷酸包括肽核酸(PNA)，与天然存在的核酸的高电荷磷酸二酯主链相反，其主链在中性条件下基本上是非离子的。
鉴定感染vvIBDV的动物的方法
这里提供了用于确定动物，尤其是鸟类，是否感染vvIBDV的方法。在一个实施方案中，动物是小鸡。该方法包括使获自动物的核酸样品或通过扩增获自动物的RNA获得的核酸产物，与至少一个探针对接触，该探针对含有一个寡核苷酸探针，下文中称为“突变探针”，其与vvIBDV的VP2基因中的特定突变基因座中的靶序列互补，以及至少一个寡核苷酸探针，下文中称为“锚定探针”，其与突变基因座的几个碱基对相邻的或内部的锚定基因座中的靶序列互补。本发明的锚定探针从它们的靶序列解离的温度比本发明的突变探针从它们的靶序列解离的温度至少高4℃。寡核苷酸探针对的一个成员用荧光能量转移供体标记，探针对的另一个成员用荧光能量转移受体标记。探针对与核酸样品在允许探针对的每个成员与测试样品中的核酸的至少一条链杂交的条件下接触，以提供探针对与核酸之间的杂交复合物。然后，杂交复合物的解链温度，也即，突变探针从核酸解离的温度，通过荧光共振能量转移(FRET)分析确定。突变探针与样品中的核酸之间形成的杂交复合物的解链温度(Tm)，高于当突变探针与含有SEQ IDNO：1或其反向互补物的核酸杂交时形成的杂交复合物(下文中称为“非vvIBDV对照杂交复合物”)的解链温度的结果，表明样品含有vvIBDV的VP2基因，或其部分。在某些实施方案中，把突变探针与测试样品中的核酸之间形成的杂交复合物的解链温度，与当突变探针和锚定探针与含有它们的靶序列的核酸杂交时形成的杂交复合物(下文中称为“vvIBDV对照杂交复合物”)的解链温度进行了比较。本发明的探针与测试样品之间形成的杂交复合物的解链温度，在vvIBDV对照杂交复合物的解链温度的4℃之内的结果表明，该样品含有vvIBDV的VP2基因的至少一条链或其部分。
寡核苷酸探针对
在某些实施方案中，本方法使用用来与vvIBDV的VP2基因中的第一个突变基因座中的靶序列杂交的第一突变探针，和用来与突变探针靶序列上游的几个核苷酸相邻或内部的第一个锚定基因座中的靶序列杂交的第一锚定探针。在某些实施方案中，第一突变探针含有与SEQID NO：1的第一个突变靶序列相同的序列，其中827位的胞嘧啶置换为胸腺嘧啶，830位的胞嘧啶置换为胸腺嘧啶，而且833位的胸腺嘧啶置换为胞嘧啶。在另一个实施方案中，本发明的第一突变探针是第一个突变靶序列的反向互补物。
在某些实施方案中，第一突变探针含有序列TAATATC，SEQ IDNO：2。在其他的实施方案中，第一突变探针含有序列GATATTA，SEQID NO：3。在某些实施方案中，第一突变探针长度为12到25个核苷酸，而且含有vv232突变探针序列的全部或部分，SEQ ID NO：4，如图2所示，条件是该部分含有SEQ ID NO：2，或SEQ ID NO：4的反向互补物的全部或部分，条件是该反向互补物的部分含有SEQ IDNO：3。在某些实施方案中，第一突变探针含有SEQ ID NO：4的12到18个连续核苷酸，或其反向互补物。在其他的实施方案中，第一突变探针含有SEQ ID NO：4的12到17个连续核苷酸，以及SEQ IDNO：1的827位核苷酸上游和/或833位核苷酸下游的1到13个连续核苷酸，或其反向互补物。
使用第一突变探针的方法也使用锚定探针，下文中称为“第一锚定探针”，用来与锚定基因座中的序列杂交，该锚定基因座与第一个突变基因座上游的几个碱基对相邻或位于其内部(参见图4)。锚定探针长度为12个或更多核苷酸，并且从它的靶序列解离的温度比第一突变探针从它的靶序列解离的温度至少高4℃。在一个实施方案中，第一锚定探针的序列与第一个突变靶序列中827位核苷酸上游的序列相同。在其他的实施方案中，第一锚定探针的序列是第一个突变靶序列上游的序列的反向互补物。在某些实施方案中，第一锚定探针的长度为12个或更多核苷酸，而且包括vv232锚定探针序列，SEQ ID NO：5的12-23个连续核苷酸，如表2所示，或其反向互补物。
在某些实施方案中，本方法使用第二突变探针，其用来与vvIBDV的VP2基因中的第二个突变基因座中的第二个突变靶序列杂交，以及第二锚定探针，其用来与第二个突变基因座下游的几个核苷酸相邻或其内部的第二个锚定基因座中的靶序列杂交(参见图4)。在某些实施方案中，第二突变探针含有与SEQ ID NO：1的第二个突变靶序列相同的序列，其中897位的鸟嘌呤置换为腺嘌呤，905位的胞嘧啶置换为胸腺嘧啶，而且908位的胞嘧啶置换为胸腺嘧啶。在另一个实施方案中，本发明的第二突变探针是第二个突变序列的反向互补物。在某些实施方案中，第二突变探针含有序列ATACTGGGTGCT，SEQ IDNO：6。在其他的实施方案中，第二突变探针含有序列AGCACCCAGTAT，SEQ ID NO：7。在某些实施方案中，第二突变探针的长度为12到25个核苷酸，而且含有vv256突变探针序列，SEQ IDNO：8的全部或部分，如图2所示，条件是该部分含有SEQ ID NO：6，或SEQ ID NO：8的反向互补物的全部或部分，条件是该部分含有SEQ ID NO：7。在某些实施方案中，第二突变探针含有SEQ ID NO：8的12到20个连续核苷酸，或其反向互补物。在其他的实施方案中，第二突变探针含有SEQ ID NO：8的12到19个连续核苷酸，以及SEQID NO：1的897位核苷酸上游和/或908位核苷酸下游的1到13个连续核苷酸，或其反向互补物。
使用第二突变探针的方法也使用锚定探针，下文中称为“第二锚定探针”，设计用来与第二个锚定基因座中的靶序列杂交，该锚定基因座位于vvIBDV的VP2基因中的第二个突变基因座的几个核苷酸下游而且相邻或位于其内部(参见图4)。在某些实施方案中，第二锚定探针的长度为12个或更多核苷酸，而且包括vv256锚定探针序列，SEQID NO：9的12-23个连续核苷酸，如表2所示。
在某些实施方案中，使核酸试验样品与第一寡核苷酸探针对与第二寡核苷酸探针对接触，并测定第一突变探针与第二突变探针分别从第一杂交复合物与第二杂交复合物解离的温度。
本发明的锚定探针从含有锚定探针与它的靶序列的杂交复合物解离的温度，比突变探针从含有突变探针与它的靶序列的杂交复合物解离的温度至少高4℃。因此，含有锚定探针与它的靶序列的杂交复合物的解链温度，可以比含有突变探针与它的靶序列的杂交复合物的解链温度高4、5、6、7、8、9、10℃甚至更高。探针解链温度取决于外界因素(盐浓度与pH)和内在因素(浓度，双螺旋长度，GC含量与最近邻相互作用)(Wetmur，Crit.Rev.Biochem.MoI.Biol.26：227-259(1991)；Wetmur.In：Meyers，R A，ed.Molecular Biology andBiotechnology，VCH，New York，pp.605-608(1995)；Brown等人，J MoI.Biol.212：437-440(1990)；Gaffhey等人，，Biochemistry 28：5881-5889(1989))。
本发明的方法涉及组合荧光标记的寡核苷酸探针与核酸试验样品，以便寡核苷酸探针杂交，该杂交允许探针对的一个成员上的供体荧光团与探针对的另一个成员的受体荧光团之间的荧光共振能量转移。然后以各种增加的温度测定从受体荧光团的发射。测定的Tm是发射突然减少时的温度。发射的颜色与Tm用于确定试验样品是否包含或不包含含有第一个突变基因座和/或第二个突变基因座的核酸。
当两个荧光团彼此物理邻近，而且一个荧光团的发射光谱与另一个荧光团的激发光谱重叠时，荧光共振能量转移(FRET)存在于两个荧光团之间。共振能量转移的速率是：
(8 785E-5)(t-1)(k2)(n-4)(qD)(R-6)(J.DA)，其中：
t＝缺乏受体时供体的激发态寿命；
k2＝供体与受体之间的取向因子；
n＝干预介质中可见光的折射率；
qD＝缺乏受体时供体的量子效率；
R＝供体与受体之间的距离，以埃为单位；
JDA＝(FD)(eA)(W4)相对于W的积分，以全部的重叠波长：
FD＝供体的峰值标准化荧光光谱；
A＝受体的摩尔吸光系数(M-1cm-1)；
W-4＝波长(nm)。
对于任何给定的供体与受体，可以计算其中存在50％共振能量转移的距离，并缩写为R0。因为共振能量转移的速率取决于供体与受体之间距离的6次幂，当R不同于R0时，共振能量转移迅速地改变。2 R0时，存在极少的共振能量转移，0.5 R0时，传递的效率几乎是完全的，除非其它形式的去激发占优势。
使用Wittwer等的方法(1997)，荧光标记的寡核苷酸已经用来与DNA序列的相同的链杂交，结果通过大约0到大约25个核苷酸的距离对供体与受体荧光团进行分离。在某些实施方案中，通过大约0-5个核苷酸的距离对供体与受体荧光团进行分离。在其他的实施方案中，通过大约0-2个核苷酸的距离对供体与受体荧光团进行分离。在另一个实施方案中，通过1个核苷酸对供体与受体荧光团进行分离。当荧光标记的寡核苷酸不与靶DNA上它们的互补序列杂交时，供体荧光团与受体荧光团之间的距离太大而不利于共振能量转移的存在。在这些条件下，受体荧光团与供体荧光团不能通过受体荧光团产生可检测的增加的荧光。
用作荧光共振能量转移对的可接受的荧光团对是本领域技术人员熟知的，而且包括，但不限于，作为供体的藻红蛋白和作为受体的Cy7，作为供体的荧光素，联合作为受体的Cy5，Cy5.5，IRD 700，LC Red 640和LC Red 705中的任何一个。应当理解任何功能性FRET供体/受体组合都可用于本发明。在某些实施方案中，例如，当第一组探针与第二组探针添加到单独的PCR小管时，来自每个受体荧光团的发射可能是相同的。在其他的实施方案中，例如，当两组探针都添加到相同的PCR小管时，来自每个受体荧光团的发射优选是不同的。标记的探针可以根据，例如，Wittwer等，BioTechniques 22：130-138，1997；Lay和Wittwer，Clin.Chem.43：2262-2267，1997；以及Bernard Ps等.，Anal.Biochem.255：101-107，1998的描述构建。这些描述中的每个都以其全部内容引入这里作为参考。适合的FRET受体包括，但不限于，LC Red 640，Cy 5，Cy 5.5和LC Red 705。
样品的制备
用于本方法的核酸样品，例如，核酸试验样品，可以是单链或双链核酸。在某些实施方案中，核酸试验样品是双链RNA，其已经分离自动物的组织，例如，血液，肌肉，等等。在其他的实施方案中，核酸样品是分离的双链RNA样品的一条链。一种特别有用的样品是分离自小鸡的粘液囊的dsRNA。从组织样品分离RNA的方法是本领域已知的。从小鸡的粘液囊分离dsRNA的方法描述于下面的实施例中。在另一个实施方案中，样品是cDNA产物，其由分离自动物的单链或双链RNA的逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增形成。cDNA分子使用本领域已知的RT-PCR技术制备，而且引物位于IBDV的VP2基因内部的本突变和锚定基因座的一侧或两侧。有用的引物对的一个例子显示于下面描述的实施例中。
探针对与试验样品的杂交
在允许突变探针和锚定探针与它们的靶序列杂交，并形成杂交复合物的条件下，使核酸样品与荧光标记的突变探针和锚定探针接触。适合的条件包括，但不限于，用于杂交探针的LightCycler-RNA扩增试剂盒中(Roche，Molecular Biochemicals，Alamedia，CA)提供的那些条件，其中每个反应包含4μl 5X RT-PCR反应混合物，4.5mM MgCl2，0.25μM的每个IBDV引物，0.2μM的每个探针，0.5μl模板核酸，以及添加无菌H2O到终反应体积为20μl。杂交将以61℃或更低的退火温度存在10秒。
杂交复合物的解链温度的测定
含有突变探针与核酸样品中的分子的杂交复合物的形成通过FRET分析进行研究，也即通过检测或测定试验样品发射的荧光。用于测定荧光发射的装置是本领域已知的。用于以变化的温度在两种不同的波长测定FRET受体发射的装置也是商业可获得的(也即，LightCyclerTM)。用于以变化的温度再超过两种波长同时检测FRET受体发射的装置描述如下。
在本发明的某个实施方案中，以第一个温度，在不同的波谱，优选大约它的最大发射波长，测定每个FRET受体的发射。然后以第二个温度重复该测定。在某些实施方案中，优选以逐渐增加的温度，重复进行这种测定。在确保每个探针杂交的足够低的温度进行第一个测定。一般，该温度至少为20℃。
得到的杂交复合物的解链温度(Tm)，通过测定接着较高温度的发射来确定。最终，随着温度的增加，突变探针将从与其杂交的核酸解离(解链)。这种解离导致FRET供体/受体结合的破坏，其看作是FRET受体发射的突然降低。
在某些实施方案中，每50到10,000msec进行FRET受体发射测定。例如，可以每100到1,000msec进行FRET受体发射测定。在其他的实施方案中，每100-200msec进行FRET受体发射测定。温度可以每秒变化0.01℃到每秒变化5℃。温度可以每秒变化0.5℃到1℃。在某些实施方案中，温度每秒变化至少0.5℃。
实施例
材料和方法
病毒。用于开发和证实本方法的vvIBDV株作为基因组RNA提供给我们实验室，其来自USDA，动植物检疫局，进口许可证#44226。该病毒来自于欧洲，亚洲，非洲加勒比海和中东。来自非vvIBDV株的遗传物质获自国内疫苗，以及美国传染性囊病(EBD)的爆发。这些非vvIBDV株包括变体和典型的病毒。用于本研究的全部病毒和它们的始发国列于表1。
表1.病毒样品和它们的地区来源
| 始发国 | 病毒样品 |
| 美国A | Del-E，D78，STC，F16，FDG，FDH，GA234，MO196，MS203，T1，AL186，AR113，WI240，AR272，AR80，AR84，F15，GA129 |
| 以色列B | Isr1，Isr2，Isr3，Isr4，Isr5，Isr6，Isr7，Isr8，Isr9，Isr10，Isr11，Isr12，Isr13，Isr14，Isr15，Isr16，Isr17，Isr19，Isr20，Isr21，Isr23，Isr24，Isr25，Isr29，Isr30 |
| 新加坡B | 179，182，183 |
| 韩国B | 9596，91108 |
| 法国B | AK2，AL1，AL4，AL6，AL10，AL13，FD7 |
| 多米尼加共和国B | DR4 |
| 南非B | SA2 |
| 西班牙B | Spain1 |
| 约旦B | Jordan E |
| 泰国B | Thai4 |
A来自美国的所有样品都是非vvIBDV株，而且包括血清型1变体，典型的和区域分离物。
B来自这些国家的样品提供作为怀疑的vvIBDV株。
病毒RNA提取。来自美国以外起源的IBDV样品的基因组RNA，在用苯酚和氯仿处理后，到达我们实验室，进口许可证#44226。在用蛋白酶K(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)和酸性的苯酚(pH 4.3)(AMRESCO，Solon，OH)，使用我们的标准程序(Jackwood，D.J.andS.E.Sommer.Avian Diseases 41：627-637.1997)处理之前，这些样品用TNE缓冲液[10mM Tris-HCl(pH 8.0)，100mM NaCl，1mM乙二胺四乙酸]漂洗两次。来自国内IBDV株的基因组RNA，使用蛋白酶K和酸性的苯酚(Jackwood，D.J.和S.E.Sommer.Avian Diseases 41：627-637.1997)从均质的粘液囊组织获得。
实时RT-PCR。使用LightCycler仪器(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)和LightCycler-RNA扩增试剂盒用于杂交探针(Roche，Molecular Biochemicals，Alamedia，CA)。每个反应包含4μl 5X RT-PCR反应混合物，4.5mM MgCl2，0.25μM的每种IBDV引物，0.2μM的每种探针，0.5μl的病毒RNA，以及添加无菌H2O到终反应体积为20μl。引物扩增VP2的743bp的区域(743-1：5′-GCCCAGAGTCTACACCAT-S′，SEQ ID NO：10和743-2：5′-CCCGGATTATGTCTTTGA-3′，SEQ ID NO：11)(Jackwood，D.J.and S.E.Sommer.Avian Diseases 42：321-339.1998)。LightCycler反应始于55℃逆转录酶孵育7min，接着95℃变性步骤5min，95℃变性1sec进行40个循环，61℃退火10sec，72℃延伸30sec。
探针设计。vvIBDV特异性探针使用分离自不同大陆的公开的vvIBDV株的序列(Banda，A.and P.Villegas.Avian Diseases 48：540-549.2004，Brown，M.D.and M.A.Skinner.Virus Research 40：1-15.1996，Chen，H.Y.，等人，Avian Diseases 42：762-769.1998，Domanska，K.，等人，Archives ofVirology 149：465-480.2004，Indervesh，A.K.等人，Acta virologica 47：173-177.2003，Kwon，H.等人，Avian Diseases44：691-696.2000，Lin，Z.，等人，Avian Diseases 37：315-323.1993，Liu，H.J.，等人，Research in Veterinary Science 70：139-147.2001，Owoade，A.A.，等人，Archives of Virology 149：653-672.2004，Parede，L.，等人，Avian Pathology 32：511-518.2003，Rudd，M.F.，等人，Archivesof Virology 147：1303-1322.2002，Zierenberg，K.，等人，Archives ofVirology 145：113-125.2000，Zierenberg，K.，等人，Avian Pathology 30：55-62.2001)和通过对以进口许可证#44226提供给我们实验室的17个vvIBDV株的VP2基因进行测序获得的序列设计。根据只有vvIBDV株才有的核苷酸突变来选择VP2基因的区域。
LightCycler技术使用探针对来鉴定核苷酸突变(Bernard，P.S.，等人，American Journal of Pathology 153：1055-1061.1998)。每对包括突变探针，用来检测点突变，其位于独特的核苷酸区域，以及锚定探针，其位于与突变探针邻近的基因组的更保守的区域。探针用荧光素(FITC)，Red 640或Red 705标记，以便一个探针上的FITC邻近它的对上的Red标记。当两个探针与RT-PCR产物结合时，FITC和Red染料产生荧光共振能量转移(FRET)，其在LightCycler仪器上进行检测(Bernard，P.S.，等人，Mutation detection by fluorescent hybridizationprobe melting curves.In：Rapid cycle realtime PCR methods andapplications.S.Meuer，C.Wittwer，and K.-I.nakagawara，eds，Spinger-Verlag，Berlin heidelberg，Germany.11-20.2001)。设计每个探针对，以便锚定探针的解链温度(Tm)比突变探针的高大约10℃(表2)。这确保了实时RT-PCR分析之后的熔点分析期间，突变探针在锚定探针之前解离。
数据分析。RT-PCR分析期间，在每个退火步骤结束，当突变和锚定探针都与RT-PCR产物结合时，检测640λ或705λ时的荧光并记录。这允许扩增有待实时检测的IBDV基因组。
40个循环的PCR扩增以后，把反应物慢慢冷却到35℃，然后慢慢加热到90℃。在这期间，突变探针从RT-PCR产物的解离导致荧光的损失，检测该荧光并用于计算Tm。与每个突变探针匹配的确切序列的Tm列于表2。
表2.本研究中测试的探针对。
| 突变探针 | vv232：5’-Red705-CTCAGCTAATATCGATGC-3’，SEQ ID NO：4 | Tm＝55℃ |
| 锚定探针 | vv232；5’-AGGTGGGGTAACAATCACACTGT-FITC-3’，SEQ ID NO：5 | Tm＝64℃ |
| 突变探针 | vv256：5’-CTTATACTGGGTGCTACCATC-FITC-3，SEQ ID NO：8’ | Tm＝58℃ |
| 锚定探针 | vv256：5’-Red640-CCTTATAGGCTTTGATGGGACTGCGG-3，SEQ ID NO：9 | Tm＝67℃ |
A每个探针的解链温度使用Idaho Technologies Inc.的TM Utility 1.5进行确定。
使用一种ANOVA分析vvIBDV组与非vvIBDV组每个探针的Tm平均值。
核苷酸序列分析。为了证实实时RT PCR的结果，选择作为怀疑的vvIBDV分离物提交给我们实验室的18个病毒进行序列分析。使用我们的标准RT-PCR方法(Jackwood，D.J.，等人，Avian Diseases 45：330-339.2001)对病毒进行扩增，并使用Geneclean Spin试剂盒(BIO101，Vista，CA)，根据厂家的指导对这些RT-PCR产物进行纯化。纯化的RT-PCR产物然后送到威斯康星大学生物工程中心DNA测序研究所(Madison，WI)进行核苷酸测序。核苷酸序列使用Chromas(Technelysium Pty Ltd.，Queensland，Australia)下载，并使用Omega软件(Oxford molecular，Campbell，Califomia)进行分析。这些序列的GenBank登录号以一组列出，以AY906997开始并以AY907014结尾。
结果
vvIBDV遗传标记。为了设计用于实时RT-PCR分析的探针对，对公开的vvIBDV序列进行分析，以确定可能的独特的核苷酸突变。对来自许多国家与大陆的一大列的超强病毒进行了比较。根据这些序列，3个区域确定具有一致的突变。突变与锚定探针设计用于这些区域。突变探针vv232用于开发827，830与833位核苷酸的3个沉默突变。第二探针，vv256，覆盖了894到914位核苷酸，用于检测导致非vvIBDV中256位缬氨酸与vvIBDV中异亮氨酸的核苷酸突变。905与908位核苷酸的2个沉默突变也包括在该探针内。
实时RT-PCR。在实时RT-PCR分析中扩增vvIBDV与非vvIBDV株。该分析期间vv232与vv256探针与所有的病毒杂交，并在退火步骤中产生FRET信号(数据未显示)。
用每个vvIBDV样品计算vv232与vv256探针的Tm。开始我们测试了提交给我们实验室作为怀疑的vvIBDV株的18个IBDV样品(表3)。报道的Tm值作为至少2个但是通常是3或4个单独的实时RT-PCR分析的平均值。使用vv232探针计算的解链温度，在与18个怀疑的vvIBDV样品中的17个匹配的确切序列计算的Tm的2个标准偏差范围内。Thai4样品的Tm为46.11℃，其显著低于vvIBDV株的期望值。再次除了Thai4病毒(Tm＝46.15℃)以及2个另外的病毒SA2与182外，其Tm值稍微低于分别期待的49.99℃与48.81℃，vv256探针的结果是类似的。
表3.在怀疑是vvIBDV的样品中vv232与vv256探针的平均Tm值。
| 怀疑的VvIBDV株 | vv232A平均Tm±SD | vv256B平均Tm±SD |
| 1839596AK2AL10AL13AL4DR4Isr30Isr4Isr7Spain1Jordan EFD7179SA2Isr13182Thai4 | 53.94±0.3955.67±0.1754.81±0.6854.49±0.0654.41±0.0653.88±0.3055.73±0.4354.16±0.0954.01±0.2853.97±0.1153.77±0.0256.24±1.145 5.05±0.5456.34±0.0151.98±1.5054.29±0.6754.46±0.3146.11±0.06 | 56.51±0.4756.08±0.5155.66±0.8555.90±0.4456.12±0.4856.27±0.4856.50±0.5154.31±0.0558.67±1.7158.00±1.3257.66±1.4955.23±0.415 5.04±0.3955.00±0.2949.99±0.7154.49±0.5548.81±0.5346.15±0.21 |
A用探针vv232获得的平均解链温度(Tm)和标准偏差(SD)。
B用探针vv256获得的平均解链温度(Tm)和标准偏差(SD)。
分析证实。为了更进一步地证实vv232与vv256探针，对提交给我们实验室作为怀疑的vvIBDV的26个附加样本，以及18个已知的非vvIBDV株进行了检验(表4)。每个怀疑vvIBDV的解链温度通常高于52℃，而且在任何情况中，都在与vv232或vv256探针匹配的确切序列期望的Tm的1或2度范围内。测试的所有非vvIBDV株的Tm值都低于49℃。
表4.vv232与vv256探针的证实。
| 怀疑的vvIBDV株A | vv232探针B平均Tm±SD | vv256探针C平均Tm±SD |
| 966491108AL1AL6Isr1Isr2Isr3Isr5Isr6Isr8Isr9Isr10Isr11Isr12Isr14Isr15Isr16Isr17Isr19Isr20Isr21Isr23Isr24 | 54.89±1.1754.11±0.7954.22±0.6453.33±0.3754.06±0.4955.20±0.5654.94±1.0155.08±0.6155.28±0.7754.56±1.2854.55±1.4854.45±0.7854.31±1.4954.06±1.1654.93±0.9454.55±1.0155.16±1.0555.24±0.7154.89±0.4555.04±1.0154.93±0.3955.20±0.1153.92±0.93 | 55.95±0.6756.13±0.4456.25±0.5056.22±0.4856.54±2.2956.5 8±0.8557.22±1.1756.37±0.7156.93±1.0257.09±1.3656.95±1.2056.58±1.3656.99±1.2256.41±2.0456.64±1.5356.83±1.2456.30±0.7156.46±0.7156.10±0.4656.33±0.0856.15±0.3956.32±0.1055.74±0.08 |
| Isr 25Isr 28Isr 29 | 54.23±1.1552.86±0.6654.14±0.72 | 56.18±0.2054.88±0.7855.19±0.74 |
| 非-vvIBDV株D | ||
| DelED78STCF16FDGFDHGA234MO196MS203T1AL186AR113WI240AR272AR80AR84F15GA129 | 45.80±0.1633.93±0.7245.29±0.3345.33±0.2845.56±0.0646.30±0.4445.80±0.3946.65±0.0645.33±0.3948.49±0.3345.84±0.3346.66±0.2847.32±0.3445.84±0.3345.80±0.0545.92±0.5441.97±0.0636.91±1.93 | 45.65±0.1946.67±0.5644.97±0.2845.19±0.2345.34±0.2446.26±0.5946.10±0.3846.81±0.2145.88±0.7048.30±0.2446.07±0.2647.03±0.5347.28±0.3445.96±0.1846.27±0.4946.36±0.1442.02±0.1239.39±0.72 |
A使用26个怀疑的vvIBDV株进行vv232与vv256探针的证实。
B用探针vv232获得的平均解链温度(Tm)和标准偏差(SD)。
C用探针vv256获得的平均解链温度(Tm)和标准偏差(SD)。
D使用来自美国的18个已知的非vvIBDV株进行vv232与vv256探针的证实。
使用vv232探针，测试的所有vvIBDV样品的总平均值与标准偏差是54.54±0.80℃。相反，使用该探针，非vvIBDV株包括Thai 4的总平均值和标准偏差是44.78±3.55℃。使用ANOVA，这些值是显著不同的(p＜0.01)。类似地，使用vv256探针，所有vvIBDV与非vvIBDV株的评价和标准偏差分别是55.94±1.69与45.67±1.96℃。当使用ANOVA对vv256进行比较时，vvIBDV与非vvIBDV组的Tm值也是显著不同的(p＜0.01)。
因为vv232探针对用Red 705标记，而vv256探针对用Red 640标记，它们可以组合在一个LightCycler反应中。当组合探针时获得的结果，基本上与当它们分别使用时获得的结果相同(数据未显示)。
核苷酸序列分析。17个vvIBDV样品与19个非vvIBDV病毒的核苷酸序列结果与观察到的Tm值相关。图1与2列出了突变探针的核苷酸序列，17个vvIBDV样品，18个已知的非vvIBDV株与Thai 4样品的对应序列。在突变探针与一些vvIBDV株之间观察到了序列突变。使用vv256探针，这些突变降低了这些特定病毒的Tm值，除了仅仅两个样品(182与SA2)以外，其Tm值低于50℃。相反，Thai 4与18个非vvIBDV株的Tm值一般低于49℃，不管使用什么探针。
讨论
进行实时RT-PCR分析，该分析以后接着进行的Tm分析能从非vvIBDV区分出vvIBDV。样品提交给我们实验室作为怀疑的vvIBDV株，因为其大量历史包括高的发病率与死亡率。由于仅仅遗传物质可以从美国以外进口(进口许可证#44226)，我们使用应激研究不能证实vvIBDV表型。因此，开发了遗传分析，其鉴定了只有vvIBDV株才有的特异性核苷酸序列。虽然超强毒表型表达所需的确切遗传成分还没有确定，我们的分析开发VP2基因的两个区域，其含有只有这些病毒才有的6个核苷酸突变。探针对vv232与vv256成功地与vvIBDV RT-PCR产物杂交，并在LightCycler中产生了FRET信号。当组合vv232与vv256探针时，我们能在一个反应中获得两个探针对的Tm数据；其降低了分析的成本以及获得结果所需的时间。
解链温度分析表明，探针vv232与vv256能从非vvIBDV株区分vvIBDV株。使用vv232探针，测试的所有vvIBDV样品的平均Tm是54.54℃，其在确切vvIBDV序列匹配的预测的Tm的半度范围内。虽然提交作为怀疑的vvIBDV，我们用vv232与vv256探针的结果表明，Thai 4样品不是超强毒株。
17个vvIBDV株的核苷酸测序证实了Tm结果，而且它们的序列与以前鉴定的vvIBDV株几乎相同。仅仅Jordan E病毒在vv232探针的区域中有一个点突变。该突变没有显著降低该病毒与探针的Tm，但是观察到了一个大的标准偏差(+1.41℃)，其表示样品中存在超过一种病毒。我们以前的研究表明，遗传准种经常发现于IBDV的区域分离物中(Jackwood，D.J.and S.E.Sommer.Vir 304：105-113.2002)。
在17个病毒测序跨过vv256探针区域中的7个观察到了点突变。7个病毒中的每个只有一个点突变，利用该探针，其没有显著地降低它们的Tm，除了两种情况中(SA2与182)。当不是用含有单突变的其他5个病毒的情况时，用探针vv256这两个病毒中的单突变为什么降低了它们的Tm是不清楚的。如果遗传准种存在于该样品中，测定占优势的病毒群体的核苷酸序列，这5个病毒中次要的准种群体，导致了比通过具有跨过vv256探针区域的单突变的病毒的相对纯培养物期望的Tm高的Tm。
我们的结果证明，一种或两种探针高于51℃的Tm值可用于鉴定vvIBDV。使用vv256探针，只有两个vvIBDV的Tm值低于51℃，而使用vv232探针没有低于51℃的值。在实时RT-PCR分析中使用该截止值和两种探针，有助于确保病毒如SA2与182可准确地确定为vvIBDV株，因为使用vv232探针，它们的Tm值分别是51.98与54.46℃。而且，利用两种探针，测试的所有非vvIBDV株的Tm值都低于49℃。使用vv232和vv256探针观察到的Tm差异，在vvIBDV与非vvIBDV株之间是p＜0.01统计上显著的。
每个突变探针用来检测只有vvIBDV株才有的3个核苷酸；总共6个独特的核苷酸。256位的氨基酸(Ile)是只有所有vvIBDV株才有的(Liu，H.J.，等人，Research in Veterinary Science 70：139-147.2001，Parede，L.，等人，Avian Pathology 32：511-518.2003)。在我们的vv256探针中一个核苷酸开发了这种独特的vvIBDV序列。通过我们的探针检测的5个其他的独特的核苷酸，不影响VP2的氨基酸序列，但是它们是vvIBDV株进化唯一的。用两种探针靶向6个核苷酸突变，降低了由于随机突变误诊的概率。用Jordon E病毒证实了该结论，Jordon E病毒在两种探针靶向的区域中具有单突变。
用设计用来与含有vvIBDV株的VP2基因的784到801位核苷酸的第三个突变序列杂交的突变探针，和针对第三个突变序列下游的序列的锚定探针获得的结果，没有鉴定到负责vvIBDV株中222位氨基酸的丙氨酸置换突变的核苷酸序列。尽管该丙氨酸突变是只有迄今测序的所有vvIBDV株才有的(Banda，A.and P.Villegas.Avian Diseases48：540-549.2004，Brown，M.D.and M.A.Skinner.Virus Research 40：1-15.1996，Chen，H.Y.，等人，Avian Diseases 42：762-769.1998，Domanska，K.，等人，Archives of Virology 149：465-480.2004，mdervesh，A.K.，等人，Acta virologica 47：173-177.2003，Kwon，H.M.，等人，Avian Diseases 44：691-696.2000，Lin，Z.，等人，Avian Diseases37：315-323.1993，Liu，H.J.，等人，Research in Veterinary Science 70：139-147.2001，Owoade，A.A.，等人，Archives of Virology 149：653-672.2004，Parede，L.，等人，Avian Pathology 32：511-518.2003，Rudd，M.F.，等人，Archives of Virology 147：1303-1322.2002，Zierenberg，K.，等人，Archives of Virology 145：113-125.2000，Zierenberg，K.，等人，Avian Pathology 30：55-62.2001)，对该第三个突变序列的突变与锚定探针没有产生准确的或可靠的数据。
考虑到这里公开的发明的说明书以及实施，本发明的其他实施方案对本领域的技术人员是显而易见的。说明书和实施例的目的只是示例性的，本发明的真实范围与精神通过以下的权利要求表明。
Claims (28)
1.一种鉴定动物感染传染性法氏囊病病毒超强毒(vvIBDV)的方法，所述方法包括
使核酸试验样品与设计用来与含有vvIBDV的VP2基因的有义链的827位核苷酸到833位核苷酸的第一个突变靶序列或其反向互补物杂交的第一突变探针接触，并与设计用来与第一个突变靶序列上游的0到5个核苷酸的第一锚定序列杂交的第一锚定探针接触；
其中核酸试验样品是获自动物的双链RNA，来源于双链RNA的cDNA，双链RNA的单链，或cDNA的单链，或其任何组合；
其中第一突变探针的长度为12个或更多个核苷酸，而且含有序列TAATATC，SEQ ID NO：2，或其反向互补物；
其中第一锚定探针长度为12个或更多个核苷酸，而且其从它的互补序列解离的温度，比第一突变探针从它的互补序列解离的温度至少高4℃；和
其中第一突变探针和第一锚定探针在下面的条件下与核酸试验样品接触，该条件为允许第一突变探针与第一锚定探针与vvIBDV的VP2基因的一条链或另一条链杂交，以提供第一杂交复合物；和
确定第一突变探针从第一个杂交复合物解离的温度；
其中第一突变探针与第一锚定探针中的一个用受体荧光团标记，第一突变探针与第一锚定探针的另一个用荧光能量转移对的供体荧光团标记；
其中第一杂交复合物的形成和第一杂交复合物的解离通过荧光共振能量转移(FRET)分析确定，和
其中第一突变探针从第一杂交复合物解离的温度，高于第一突变探针从SEQ ID NO：1解离的温度，或者在第一突变探针从它的互补序列解离的温度的4℃范围内，二者都表明该动物感染vvIBDV。
2.权利要求1的方法，更进一步地包括比较第一杂交复合物解链的温度，与当第一突变探针与含有SEQ ID NO：1的靶部分，或者它的反向互补物的核酸杂交时形成的杂交复合物的解链温度的步骤。
3.权利要求1的方法，更进一步地包括比较第一杂交复合物解链的温度，与当第一突变探针与含有它的互补序列的核酸杂交时形成的杂交复合物的解链温度的步骤。
4.权利要求1的方法，其中第一突变探针含有SEQ ID NO：4，而且其中含有所述突变探针和测试样品中的核酸的杂交复合物的49℃或更高的解链温度表明该动物感染vvIBDV。
5.权利要求1的方法，其中第一突变探针含有SEQ ID NO：4中12到18个连续核苷酸，或其反向互补物。
6.权利要求1的方法，其中核酸样品包括通过获自动物的双链RNA样品的逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增获得的cDNA产物。
7.权利要求1的方法，其中RNA样品获自鸟类。
8.权利要求1的方法，其中RNA样品获自小鸡。
9.权利要求1的方法，其中RNA样品获自小鸡的粘液囊。
10.权利要求1的方法，其中含有第一突变探针与它的互补序列的杂交复合物的解链温度，比含有第一锚定探针与它的互补序列的杂交复合物的解链温度至少低10℃。
11.权利要求1的方法，更进一步地包括使核酸试验样品与设计用来与含有vvIBDV的VP2基因的897位核苷酸到908位核苷酸的第二个突变靶序列，或其反向互补物杂交的第二突变探针接触，并与设计用来与第二个突变靶序列下游的0到5个核苷酸内的第二个锚定靶序列杂交的第二锚定探针接触；
其中第二突变探针的长度为12个或更多个核苷酸，而且含有序列ATACTGGGTGCT，SEQ ID NO：6，或其反向互补物；
其中第二锚定探针长度为至少12个核苷酸，而且其从它的互补序列解离的温度，比第二突变探针从它的互补序列解离的温度至少高4℃；
其中第二突变探针和第二锚定探针在下面的条件下与核酸试验样品接触，该条件为允许第二突变探针与第二锚定探针与vvIBDV的VP2基因的一条链杂交，以提供第二杂交复合物；和
确定第二突变探针从第二杂交复合物解离的温度；
其中第二突变探针与第二锚定探针中的一个用受体荧光团标记，第二突变探针与第二锚定探针中的另一个用荧光能量转移对的供体荧光团标记；
其中杂交复合物的形成和第二杂交复合物的解离通过FRET分析确定；和
其中第二突变探针从第二杂交复合物解离的温度，高于第二突变探针从SEQ ID NO：1解离的温度，或者在第二突变探针从它的互补序列解离的温度的4℃范围内，二者都表明该动物感染vvIBDV。
12.权利要求11的方法，其中核酸样品包括通过获自动物的双链RNA样品的逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增获得的cDNA产物。
13.权利要求11的方法，其中RNA样品获自小鸡的粘液囊。
14.权利要求11的方法，其中含有第二突变探针与它的互补序列的杂交复合物的解链温度，比含有第二锚定探针与它的互补序列的杂交复合物的解链温度至少低10℃。
15.一种鉴定动物感染传染性法氏囊病病毒超强毒(vvIBDV)的方法，所述方法包括
使核酸试验样品与设计用来与含有vvIBDV的VP2基因的897位核苷酸到908位核苷酸的突变靶序列，或其反向互补物杂交的突变探针接触，并与设计用来与突变靶序列下游的0到5个核苷酸内的锚定靶序列杂交的锚定探针接触；
其中核酸试验样品是获自动物的双链RNA，来源于双链RNA的cDNA，双链RNA的单链，或cDNA的单链，或其任何组合；
其中突变探针的长度为12个或更多个核苷酸，而且含有序列ATACTGGGTGCT，SEQ ID NO：6，或其反向互补物；
其中锚定探针长度为至少12个核苷酸，而且其从它的互补序列解离的温度，比突变探针从它的互补序列解离的温度至少高4℃；
其中突变探针和锚定探针在下面的条件下与核酸试验样品接触，该条件为允许探针与试验样品的核酸的至少一条链杂交，以提供杂交复合物；和
确定突变探针从杂交复合物解离的温度；
其中突变探针与锚定探针中的一个用受体荧光团标记，突变探针与锚定探针中的另一个用荧光能量转移对的供体荧光团标记；
其中杂交复合物的形成和杂交复合物的解离通过FRET分析确定，和
其中突变探针从杂交复合物解离的温度，高于突变探针从含有SEQ ID NO：1中的靶向序列或其反向互补物的核酸解离的温度，或者在突变探针从它的互补序列解离的温度的4℃范围内，二者都表明该动物感染vvIBDV。
16.权利要求15的方法，更进一步地包括比较杂交复合物解链的温度，与当突变探针与含有SEQ ID NO：1的靶部分，或者它的反向互补物的核酸杂交时形成的杂交复合物的解链温度的步骤。
17.权利要求15的方法，更进一步地包括比较杂交复合物解链的温度，与当突变探针与含有它的互补序列的核酸杂交时形成的杂交复合物的解链温度的步骤。
18.权利要求15的方法，其中突变探针含有SEQ ID NO：8的序列，而且其中突变探针从样品中的核酸解离的温度为51℃或更高，表明动物感染vvIBDV。
19.权利要求15的方法，其中突变探针含有SEQ ID NO：8中12到23个23个连续核苷酸，或其反向互补物。
20.权利要求15的方法，其中双链的样品是通过获自动物的双链RNA样品的逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增获得的cDNA产物。
21.权利要求15的方法，其中RNA样品获自小鸡的粘液囊。
22.权利要求15的方法，其中含有突变探针与它的互补序列的杂交复合物的解链温度，比含有锚定探针与它的互补序列的杂交复合物的解链温度至少低10℃。
23.一种用于鉴定动物感染vvIBDV的试剂盒，所述试剂盒包括：
以下至少一种：
a)第一对寡核苷酸探针，
其中所述的第一对寡核苷酸探针中的一个含有与第一个突变靶序列或其反向互补物互补的突变探针，该突变靶序列含有vvIBDV的VP2基因的827位核苷酸到833位核苷酸；
其中突变探针的长度为12个或更多个核苷酸，而且含有序列TAATATC，SEQ ID NO：2，或其反向互补物；
其中所述第一对寡核苷酸探针中的另一个含有与第一个锚定靶序列或其反向互补物相同的锚定探针，该第一锚定靶序列为第一个突变靶序列上游的0到5个核苷酸；
其中第一锚定探针长度为12个或更多个核苷酸，而且其从它的互补序列解离的温度，比第一突变探针从它的互补序列解离的温度至少高4℃；和
b)第二对寡核苷酸探针，
其中所述第二对寡核苷酸探针中的一个是含有与第二个突变靶序列或其反向互补物互补的序列的第二突变探针，该第二个突变靶序列含有vvIBDV的VP2基因的897位核苷酸到908位核苷酸；
其中第二突变探针的长度为12个或更多个核苷酸，而且含有序列ATACTGGGTGCT，SEQ ID NO：6，或其反向互补物；和
其中所述第二对寡核苷酸探针中的另一个是与第二个锚定靶序列或其反向互补物相同的锚定探针，该第二个锚定靶序列为第一个突变靶序列下游的0到5个核苷酸；
其中第二锚定探针长度为12个或更多个核苷酸，而且其从它的互补序列解离的温度，比第二突变探针从它的互补序列解离的温度至少高4℃。
24.权利要求23的试剂盒，其中对于每对寡核苷酸探针，探针对中的一个成员用荧光能量转移对的受体荧光团标记，另一个成员用荧光能量转移对的供体荧光团标记。
25.权利要求23的试剂盒，其中所述试剂盒含有第一对寡核苷酸探针和第二对寡核苷酸探针。
26.权利要求24的试剂盒，其中一对标记的寡核苷酸上受体荧光团的发射，与另一对标记的寡核苷酸上的受体荧光团的发射不同。
27.一种用于检测核酸样品中vvIBDV的VP2基因或其部分的方法，所述方法包括：
使核酸样品与权利要求20的寡核苷酸对中的一个或两个接触；
确定第一突变探针与样品中的核酸之间形成的杂交复合物，或第二突变探针与样品中的核酸之间形成的杂交复合物的温度，或两个杂交复合物解链的温度，并把每个杂交复合物的解链温度与下列中的一个或两个进行比较：
含有非超强毒IBDV的VP2基因的全部或部分，与突变探针中的一个或两个的第一个对照杂交复合物，和
含有vvIBDV的VP2基因的全部或部分，与突变探针中的一个或两个的第二个对照杂交复合物；
其中产生其解链温度高于第一个和/或第二个对照杂交复合物的解链温度的杂交复合物的样品，含有vvIBDV的VP2基因或其部分。
28.权利要求27的方法，其中在实时RT-PCR期间进行测定。
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