KR102007951B1 - 조류인플루엔자 바이러스 실시간 유전자(m, h5, h7) 진단용 프라이머 및 프로브 세트 및 이의 이용 - Google Patents

조류인플루엔자 바이러스 실시간 유전자(m, h5, h7) 진단용 프라이머 및 프로브 세트 및 이의 이용 Download PDF

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이윤정
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윤성준
설재구
최윤혁
김철민
김준배
하성재
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Abstract

본 발명은 조류인플루엔자 바이러스(Avian influenza virus, AIV) 진단용 프라이머 및 프로브 세트, 상기 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 조류인플루엔자 바이러스 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 조류인플루엔자 바이러스 진단용 키트 및 조류인플루엔자 바이러스 진단 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조류인플루엔자 바이러스 진단용 프라이머 및 프로브 세트를 이용하면, 다른 회사의 제조방법으로 키트를 제조하여 이용하거나 다른 검출기기를 사용함에 있어서도 기존의 조류인플루엔자 바이러스 진단용 프라이머 및 프로브 세트보다 특이적으로 민감도 높게 M, H5 및 H7 유전자를 검출해낼 수 있다. 또한 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 검출 방법을 이용하면, 기존 방법보다 간단한 단계만으로 효율적인 검출이 가능하며 실시간으로 동시에 M, H5 및 H7 유전자를 검출해낼 수 있는 바, AI 상시예찰(야생조류 분변검사 및 오리 출하전 검사)에 적용하여 H5/H7형 조류인플루엔자 바이러스를 신속·정확하게 진단함으로써 가금 산업의 피해를 줄이는 데에 기여할 수 있다.

Description

조류인플루엔자 바이러스 실시간 유전자(M, H5, H7) 진단용 프라이머 및 프로브 세트 및 이의 이용{Primer and probe set for detection of type A avian influenza virus and the avian H5 and H7 subtype and uses thereof}
본 발명은 조류인플루엔자 바이러스(Avian influenza virus, AIV) 진단용 프라이머 및 프로브 세트, 상기 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 조류인플루엔자 바이러스 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 조류인플루엔자 바이러스 진단용 키트 및 조류인플루엔자 바이러스 진단 방법에 관한 것이다.
조류인플루엔자 바이러스(avian influenza virus, AIV)는 NP(nucleocapsid) 단백질과 M(matrix) 단백질의 항원성 차이에 따라 크게 A, B 및 C형으로 구분된다. 이중 A형은 다시 HA(hemagglutinin) 단백질의 항원 특성에 따라 H1형에서 H15형의 아형으로 분류되며, NA(Neuraminidase) 단백질의 항원 특성에 따라 N1형에서 N9형의 아형으로 분류된다.
기존의 조류인플루엔자 바이러스 진단은 SPF 종란접종법을 통해 바이러스를 배양하고 혈구응집 및 혈구응집억제시험법 등으로 동정하여 이루어진다. 그러나 이러한 기존의 진단방법은 진단시간에 많은 시간이 소요되어 최근에는 조류인플루엔자 바이러스의 특이 유전자를 검출하는 역전사 중합효소 연쇄반응법(RT-PCR) 및 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응(Real-time RT-PCR) 등의 분자생물학적 진단법을 많이 사용하고 있다. 특히 가금류에서 심각한 질병을 일으키는 고병원성 조류인플루엔자(HPAI)의 경우에는 H5, H7형 유전자에 대해 다양한 신속유전자진단법이 개발되어 왔다.
전 세계적으로 지속적으로 발생하는 고병원성 조류인플루엔자(HPAI)는 경제 및 사회적으로 문제시 되고 있으며 우리나라에서도 2003/2004년, 2006/2007년, 2008년, 2011년에 H5N1형, 2014~2016년에 H5N8형 고병원성 조류인플루엔자(HPAI) 발생이 있었고, 지정학적 특성상 중국, 러시아 등 주변국으로부터 야생조류를 통해 HPAI의 재유입 가능성이 높은 실정이다. 또한 우리나라는 HPAI 종식을 위해 살처분 정책을 사용하고 있기 때문에 동물들의 희생 및 막대한 경제적 손실이 뒤따르고 있다. 이를 줄이기 위해서는 발생 초기에 신속하게 진단하여 바이러스 전파를 막는 것이 가장 중요한 요소지만, 현재 AI 예찰 수행에 사용되는 H5/H7형 AI 실시간 유전자 진단 기법은 영국의 OIE 표준실험실에서 유럽지역에서 유행하고 있는 조류인플루엔자 바이러스를 기반으로 개발된 것이므로 우리나라의 실정에 맞는, 유라시아 지역의 유행주에 적합한 조류인플루엔자 바이러스 진단법 개발이 시급한 실정이다.
또한 AI 국가예찰 항목 중 오리 출하전 검사 등 신속한 결과를 요구하는 경우는 종란접종법을 이용한 바이러스 분리·배양법(평균 5일 전후 소요)을 대치하여 실시간 유전자 진단기법을 사용하고 있으나(2015년 이후 적용), 이러한 실시간 유전자 진단기법은 실험 환경(실험자, 진단키트, 진단기기 등)에 따라 동일 시료에 대한 편차가 발생할 가능성이 높기 때문에 진단결과의 신뢰성 및 안정성 향상을 위해 표준화된 진단키트 개발 및 보급이 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 우리나라 실정에 맞는 유라시아 지역의 유행주에 적합한 조류인플루엔자 바이러스 진단법을 개발하기 위하여 연구하던 중, 기존의 조류인플루엔자 바이러스 진단용 프라이머 및 프로브 세트에 비해 특이도 및 민감도가 우수하며 다른 키트 제조법 및 기기에서도 사용 가능한 프라이머 및 프로브 세트를 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은, 조류인플루엔자 바이러스(Avian influenza virus, AIV) 진단용 프라이머 및 프로브 세트, 상기 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 조류인플루엔자 바이러스 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 조류인플루엔자 바이러스 진단용 키트 및 조류인플루엔자 바이러스 진단 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1, 2 및 3으로 표시되는 염기서열을 포함하는 제 1 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 4, 5 및 6으로 표시되는 염기서열을 포함하는 제 2 프라이머 및 프로브 세트; 및 서열번호 7, 8 및 9로 표시되는 염기서열을 포함하는 제 3 프라이머 및 프로브 세트;로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는, 조류인플루엔자 바이러스(Avian influenza virus, AIV) 진단용 프라이머 및 프로브 세트를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는, 조류인플루엔자 바이러스 진단용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 조류인플루엔자 바이러스 진단용 조성물을 포함하는, 조류인플루엔자 바이러스 진단용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 a) 시료로부터 핵산을 얻는 단계; b) 상기 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 상기 a)단계에서 얻어진 핵산을 증폭하는 단계; 및 c) 상기 b)단계에서 얻어진 증폭 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 조류인플루엔자 바이러스 진단 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 조류인플루엔자 바이러스 진단용 프라이머 및 프로브 세트를 이용하면, 국내 유행가능성이 높은 유라시아 지역 유행주들에 대해 기존 진단용 프라이머 및 프로브 세트보다 특이적이고 향상된 민감도로 M, H5 및 H7 유전자를 검출해낼 수 있다. 또한 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 검출 방법을 이용하면, 기존 방법보다 간단한 단계만으로 효율적인 검출이 가능하며 실시간으로 동시에 M, H5 및 H7 유전자를 검출해낼 수 있는 바, AI 상시예찰(야생조류 분변검사 및 오리 출하전 검사)에 적용하여 H5/H7형 조류인플루엔자 바이러스를 신속·정확하게 진단함으로써 가금 산업의 피해를 줄이는 데에 기여할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 조류인플루엔자 바이러스 M 유전자 특이적 프라이머 및 프로브 세트의 M 유전자 검출 부위를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 조류인플루엔자 바이러스 H5 유전자 특이적 프라이머 및 프로브 세트의 H5 유전자 검출 부위를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 조류인플루엔자 바이러스 H7 유전자 특이적 프라이머 및 프로브 세트의 H7 유전자 검출 부위를 나타낸 도이다.
본 발명은 서열번호 1, 2 및 3으로 표시되는 염기서열을 포함하는 제 1 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 4, 5 및 6으로 표시되는 염기서열을 포함하는 제 2 프라이머 및 프로브 세트; 및 서열번호 7, 8 및 9로 표시되는 염기서열을 포함하는 제 3 프라이머 및 프로브 세트;로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는, 조류인플루엔자 바이러스(Avian influenza virus, AIV) 진단용 프라이머 및 프로브 세트를 제공한다.
본 발명의 용어 “조류인플루엔자 바이러스(Avian influenza virus, AIV)”는 NP(nucleocapsid) 단백질과 M(matrix) 단백질의 항원성 차이에 따라 크게 A, B 및 C형으로 구분된다. 이중 A형은 다시 HA(hemagglutinin) 단백질의 항원 특성에 따라 H1형에서 H15형의 아형으로 분류되며, NA(Neuraminidase) 단백질의 항원 특성에 따라 N1형에서 N9형의 아형으로 분류되는 바이러스이다.
본 발명에서 용어 "진단"은 시료(試料) 또는 실험 샘플 내에 화학종이나 미생물 따위의 존재 유무를 알아내는 것을 의미하며, 본 발명에서의 진단 또는 검출은 바람직하게 조류인플루엔자 바이러스의 존재 유무를 알아내는 것을 의미한다.
본 발명에서 용어 "프라이머"는 증폭하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명의 상기 프라이머는 조류인플루엔자 바이러스의 특정 영역에 대해서 특이적으로 증폭하는 프라이머일 수 있다.
또한 상기의 프라이머는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 즉 핵산 서열이 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다. 또한 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리 L 리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 알킬화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다. 또한 본 발명의 프라이머는 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트phosphorothioate) 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나, 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 프라이머 서열은 검출 가능한 시그날을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 프라이머는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출 될 수 있는 표지를 포함할 수 있다. 유용한 표지는 32P, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소(일반적으로 ELISA 에 이용되는 것), 바이오틴 또는 합텐 및 항혈청 또는 단일클론성 항체가 이용가능한 단백질을 포함한다.
또한 본 발명의 프라이머는 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소 분해 및 나랭(Narang)등의 포스포트리에스테르 방법(1979, Meth, Enzymol. 68:90-99), 보카지(Beaucage)등의 디에틸포스포라미다이트 방법(1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862), 및 미국 특허 제 4458066호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
본 발명에서 용어 “프로브”는 DNA 또는 RNA와 특이적으로 결합할 수 있는 수개 내지 수백 개의 염기에 해당하는 핵산 단편을 의미하며, 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브 또는 RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.
또한 상기 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 프로브는 조류인플루엔자 바이러스를 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예를 들어, 메틸포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예를 들어, 아크리딘, 프로랄렌 등), 킬레이트화제(예를 들어, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등) 및 알킬화제를 함유할 수 있다.
상기 프로브는 이의 5' 말단에 리포터가 추가로 더 접합될 수 있다. 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 본 발명에서 바람직하게는 FAM(6-carboxyfluorescein)일 수 있으며 이외에 당업계에서 리포터로 사용될 수 있는 물질이라고 알려진 것이라면 모두 사용할 수 있다.
상기 프로브는 이의 3' 말단에 소광자가 추가로 더 접합될 수 있다. 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1(black hole quencher 1), BHQ2(black hole quencher 2), BHQ3(black hole quencher 3), NFQ(nonfluorescent quencher), 답실(dabcyl), Eclipse, DDQ(Deep Dark Quencher), 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 아이오와 블랙(Iowa black) 및 MGB(minor groove binder)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 본 발명에서 바람직하게는 BHQ1(black hole quencher 1) 또는 MGB(minor groove binder) 일 수 있으며 이외에 당업계에서 소광자로 사용될 수 있는 물질이라고 알려진 것이라면 모두 사용할 수 있다.
상기 제 1 프라이머 및 프로브 세트는 조류인플루엔자 바이러스 M 유전자 검출용이며, 상기 제 2 프라이머 및 프로브 세트는 조류인플루엔자 바이러스 H5 유전자 검출용이며, 상기 제 3 프라이머 및 프로브 세트는 조류인플루엔자 바이러스 H7 유전자 검출용일 수 있다. 또한 상기 조류인플루엔자 바이러스 진단용 프라이머 및 프로브 세트는 조류인플루엔자 바이러스 M, H5 및 H7 유전자 동시진단용일 수 있다.
본 발명의 프라이머 및 프로브 세트에 포함되는 상기 서열번호 1 내지 9 에 기재된 염기서열은 이에 제한되지 않으며, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 프라이머 및 프로브 세트는 서열번호 1 내지 9 의 염기서열과 각각 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다. 또한 상기 서열번호 1 내지 9에 기재된 염기서열 중 “Y”는 T(thymine, 티민) 또는 C(cytosine, 사이토신)일 수 있으며, “R”은 A(adenine, 아데닌) 또는 G(guanine, 구아닌)일 수 있다.
상기 조류인플루엔자 바이러스 진단용 프라이머 및 프로브 세트는 실시간 역전사 중합효소연쇄반응(real-time RT-PCR, rRT-PCR)용 프라이머 및 프로브 세트일 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다. 실시간 역전사 중합효소연쇄반응용으로 사용됨으로써 AI 국가예찰 항목 중 오리 출하전 검사 등 신속한 결과를 요구하는 경우 사용하는 실시간 유전자 진단기법에서 효과적으로 사용할 수 있다.
또한 상기 조류인플루엔자 바이러스 진단용 프라이머 및 프로브 세트의 검출한계는 100 내지 103, 바람직하게는 101 내지 103 Copy number/μL 일 수 있다. 상기 범위에서 검출함으로써 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 민감도 높게 조류인플루엔자 바이러스를 검출할 수 있다.
본 발명의 조류인플루엔자 바이러스 진단용 프라이머 및 프로브 세트를 이용하면, 다른 회사의 제조방법으로 키트를 제조하여 이용하거나 다른 검출기기를 사용함에 있어서도 기존의 조류인플루엔자 바이러스 진단용 프라이머 및 프로브 세트보다 특이적으로 민감도 높게 M, H5 및 H7 유전자를 검출해낼 수 있다.
또한 본 발명은 상기 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는, 조류인플루엔자 바이러스 진단용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 반응 증폭 혼합물, 예컨대 중합효소, dNTPs, 반응 버퍼 등이 포함된 혼합물을 더 포함할 수 있고, 진단 여부를 육안으로 확인할 수 있는 형광 염색물질을 포함할 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다.
또한 본 발명은 상기 조류인플루엔자 바이러스 진단용 조성물을 포함하는, 조류인플루엔자 바이러스 진단용 키트를 제공한다.
상기 키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함할 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 키트는 병, 통 (tub), 작은 봉지 (sachet), 봉투 (envelope), 튜브, 앰플 (ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있으며, 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는, 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성, 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있다. 용기는 또한 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는, 스토퍼가 장착될 수 있다. 상기 키트는 외부 패키지를 포함할 수 있으며, 외부 패키지는 구성 요소들의 사용에 관한 사용설명서를 포함할 수 있다. 또한 상기 사용설명서는 키트 사용법, 예를 들면, 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서에 해당할 수 있다. 또한 사용설명서는 팸플릿 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상의 설명을 포함할 수 있으며, 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보에 해당할 수 있다.
또한 본 발명은 a) 시료로부터 핵산을 얻는 단계; b) 상기 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 상기 a)단계에서 얻어진 핵산을 증폭하는 단계; 및 c) 상기 b)단계에서 얻어진 증폭 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 조류인플루엔자 바이러스 진단 방법을 제공한다.
상기 조류인플루엔자 바이러스 진단은 조류인플루엔자 바이러스 M, H5 및 H7 유전자 동시진단일 수 있으며, 조류인플루엔자 바이러스 M, H5 또는 H7 유전자 진단일 수 있다.
상기 a) 단계의 시료는 조류인플루엔자 바이러스를 포함하는지 여부의 판별이 필요한 시료일 수 있다. 상기 b) 단계는 본 발명의 조류인플루엔자 바이러스 진단용 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 조류인플루엔자 바이러스 M, H5 및 H7 유전자를 특이적으로 검출하고 증폭시키는 단계이다. 상기 c) 단계는 b) 단계에서 얻어진 증폭 산물을 검출하여 조류인플루엔자 바이러스 M, H5 및 H7 유전자의 검출 여부를 판단할 수 있는 단계이다. 상기 b) 단계와 c) 단계는 실시간으로 연속하여 이루어질 수 있다.
상기 조류인플루엔자 바이러스 진단은 바람직하게는 실시간 역전사 중합효소연쇄반응(real-time RT-PCR, rRT-PCR)으로 이루어질 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다. 실시간 역전사 중합효소연쇄반응으로 조류인플루엔자 바이러스를 진단함으로써 AI 국가예찰 항목 중 오리 출하전 검사 등 신속한 결과를 요구하는 경우 사용하는 실시간 유전자 진단기법으로 효과적으로 사용될 수 있다.
또한 상기 b) 단계의 증폭하는 단계는, 45 내지 55 ℃, 바람직하게는 47 내지 53 ℃, 더욱 바람직하게는 50 ℃에서 25 내지 35 분, 바람직하게는 27 내지 33 분, 더욱 바람직하게는 30 분 및 90 내지 100 ℃, 바람직하게는 93 내지 97 ℃, 더욱 바람직하게는 95 ℃에서 10 내지 20 분, 바람직하게는 15 분 동안 1회 사이클링하는 1차 단계; 및 90 내지 100 ℃, 바람직하게는 94 ℃에서 10 내지 20 초, 바람직하게는 15 초 및 55 내지 65 ℃, 바람직하게는 60 ℃에서 55 내지 65 초, 바람직하게는 60초 동안 35 내지 45회, 바람직하게는 40회 사이클링하는 2차 단계를 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 1차 단계는 역전사 과정이며 2차 단계는 유전자 증폭 과정으로서, 유전자 증폭 과정은 해리-결합-연장 단계로 이루어진다. 기존에 조류인플루엔자 바이러스 검출에 사용되는 프라이머 및 프로브 세트에서 상기 유전자 증폭 과정은 3 step 으로 이루어지는 반면, 본 발명의 상기 2차 단계에 해당하는 유전자 증폭 과정은 상기와 같은 온도, 시간, 사이클링 횟수 범위의 2 step 으로 이루어질 수 있다. 따라서 상기와 같은 온도, 시간, 사이클링 횟수 범위의 1차 및 2차 단계를 포함하는 증폭을 실시함으로써, 기존 방법보다 간단한 단계만으로 효율적인 조류인플루엔자 바이러스 검출이 가능하다.
본 발명에 따른 조류인플루엔자 바이러스 진단용 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 조류인플루엔자 바이러스 진단 방법을 이용하면, 기존 방법보다 간단한 단계만으로 효율적인 검출이 가능하며 실시간으로 동시에 M, H5 및 H7 유전자를 검출해낼 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 조류인플루엔자 바이러스(AIV) M/H5/H7 유전자 특이적 프라이머 및 프로브 세트 후보군 제작
조류인플루엔자 바이러스의 M/H5/H7 유전자 특이적 프라이머 및 프로브 세트 후보군을 제작하기 위해, 우리나라를 포함한 유라시아지역에서 분리된 대표적인 조류인플루엔자 바이러스 80여 주의 유전정보를 바탕으로 유전자 분석프로그램을 이용하여 서열정렬(alignment) 및 공통 반응 부위를 선정하였다. 그 후 조류인플루엔자 바이러스의 M, H5, H7 유전자 각각에 특이적인 프라이머 및 프로브 세트 후보군, M-1 내지 M-4, H5-1 내지 H5-4, H7-1 내지 H7-4 를 제작하였다.
실시예 2. 실시간 역전사 중합효소연쇄반응(real-time RT-PCR, rRT-PCR) 수행 및 최종 M/H5/H7 유전자 특이적 프라이머 및 프로브 세트 선정
실시예 2-1. rRT-PCR 수행 및 최적 반응조건 선정
상기 실시예 1에서 제작한 본 발명의 M/H5/H7 유전자 특이적인 프라이머 및 프로브 세트 후보군의 유전자 검출 효율성을 비교하기 위해, 현재 영국의 OIE 표준실험실에서 유럽지역에서 유행하고 있는 조류인플루엔자 바이러스를 기반으로 개발한, 조류인플루엔자 예찰 수행에 사용되는 H5/H7형 조류인플루엔자 실시간 유전자 진단에 사용되는 프라이머 및 프로브 세트(Quanti-tect)를 대조군으로 하여 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트 후보군과 Qiagen사의 Quantitect one-step RT-PCR Kit를 사용하여 rRT-PCR을 수행하였다. Quantitect one-step RT-PCR Kit 사용매뉴얼에 따라 rRT-PCR 반응 튜브 당 증류수 16.5μl, 2x Quantitect Probe RT-PCR mastermix 25μl, Quantitect RT-mix 0.5μl, 프라이머 및 프로브 세트 각 1μl, 추출된 바이러스 핵산 5μl로 총 50μl로 반응 하였으며, 시험에 사용된 프라이머와 프로브 농도는 각각 0.4μM, 0.2μM로 동일하게 적용하였다. 그리고 프로브의 형광 및 형광제어물질은 5' 에는 6-carboxyfluorescein(FAM)을 사용하였고, 3' 의 경우 M 유전자 및 H7 유전자 특이적 프로브에는 Black Hole Quencher 1(BHQ1)를, H5 유전자 특이적 프로브의 경우에는 MGB를 사용하였다.
이 때 기존에 사용되는 대조군(OIE 프라이머 및 프로브 세트)에서 적용되는 rRT-PCR 조건(3 step 조건)을 간소화시키기 위해, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트 후보군에는 기존 대조군의 조건인 3 step 조건을 2 step 조건으로 변경하여 적용하였으며 이를 표 1에 나타내었다. rRT-PCR의 진행은 역전사 과정과 유전자 증폭 과정 두 가지 단계로 구성되며, 먼저 RNA 바이러스인 조류인플루엔자 바이러스의 핵산을 이용하여 cDNA를 합성하는 역전사 과정은 기존과 동일하게 적용한다. 그리고 PCR을 통한 유전자 증폭 과정인 해리-결합-연장 단계는 기존의 3 step 조건에서 각각 94℃, 10sec/ 50℃, 30sec/ 72℃, 10sec로 총 40회 반복된다. 2 step 조건은 본 발명의 새로운 프라이머 및 프로브 세트의 조건에 맞는 용해온도와 사용 편의성 등을 고려하여 결합-연장 단계를 60℃, 1min로 간소화시켜 적용하였다.
3 step 조건 (대조군 OIE) 2 step 조건 (본 발명)
온도 시간 cycle 온도 시간 cycle
50℃ 30min 1 50℃ 30min 1
95℃ 15min 1 95℃ 15min 1
94℃ 10sec 40 94℃ 15sec 40
50℃ 30sec 60℃ 1min
72℃ 10sec
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 대조군 및 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트에 각각 3 step 및 2 step 조건에 따라 rRT-PCR을 수행하였으며, M 유전자, H5 유전자 및 H7 유전자에 대한 CT(Cycle of threshold) 값을 비교하여 각각 표 2, 표 3 및 4, 표 5에 나타내었다.
No. Strain 구분 HA NA M gene
OIE M-1 M-2 M-3 M-4
1 chicken H5N1 1 국내 H5 N1 26.28 18.21 19.02 19.78 21.1
2 chicken H5N1 2 베트남 H5 N1 28.42 19.17 20.55 21.22 24.37
3 chicken H5N1 3 베트남 H5 N1 29.33 18.59 21.52 20.43 24.43
4 chicken H5N1 4 베트남 H5 N1 26.84 18.98 19.21 20.3 20.39
5 chicken H5N1 5 캄보디아 H5 N1 26 17.51 18.13 19.32 18.93
6 chicken H5N1 6 몽골 H5 N1 25.13 15.78 16.25 18.09 17.77
7 broiler duck H5N8 국내 H5 N8 17.01 16 16.51 18.02 18.53
8 chicken NDV 국내 - - - - - - -
9 Mallard duck H11N9 국내 H11 N9 22.25 20.67 21.06 22.13 22.04
10 Mallard duck H2N2 국내 H2 N2 23.52 22.55 22.71 24.07 25.13
11 Wild bird H7N1 국내 H7 N1 21.07 19 19.94 20.93 20.43
12 Wild bird H7N2 국내 H7 N2 21.24 20.75 20.35 21.43 21.63
13 wild bird H7N7 국내 H7 N7 19.67 18.33 18.58 20.01 19.98
14 mallard duck H7N7 국내 H7 N7 17.4 15.37 16.22 17.41 17.53
15 mallard duck H7N9 국내 H7 N9 20.82 18.74 19.11 20.33 20.27
16 16A H7N7 1 국내 H7 N7 19.05 18.4 17.56 18.94 18.45
17 16A H7N7 2 국내 H7 N7 21.16 19.71 20.51 22.17 21.28
18 D15 (IBV) 국내 - - - - - - -
19 DK0106 (NDV_class1) 국내 - - - - - - -
20 Jeonbuk 국내 - - - - - - -
상기 표 2에 나타낸 바와 같이 M 유전자 검출 효율성 비교 평가 결과, 본 발명에서 새로 제작한 프라이머 및 프로브 세트(M-1 내지 M-4)가 대조군(OIE 표준실험실 제공 프라이머 및 프로브 세트)에 비해 전반적으로 낮은 CT 값을 나타내어 본 발명 프라이머 및 프로브 세트의 검출 민감도가 더 높은 것을 확인하였다. 특히 M-1 및 M-2의 프라이머 및 프로브 세트가 좀 더 높은 민감도를 나타냈으며, 공통 RT-PCR 조건(60℃)을 고려하여 최종적으로 M 유전자 특이적 프라이머 및 프로브 세트로는 M-2의 프라이머 및 프로브 세트를 선정하였다.
No. Strain 구분 HA NA H5 gene
OIE H5-1 H5-2 H5-3 H5-4
1 chicken H5N1 1 국내 H5 N1 21.25 20 21.58 20.07 -
2 chicken H5N1 2 베트남 H5 N1 25.16 23.09 24.96 26.01 28.14
3 chicken H5N1 3 베트남 H5 N1 23.26 20.14 23.58 21.51 29.51
4 chicken H5N1 4 베트남 H5 N1 28.01 20.4 29.17 - 20.31
5 chicken H5N1 5 캄보디아 H5 N1 20.96 21.82 22.02 26.79 26.48
6 chicken H5N1 6 몽골 H5 N1 18.5 17.63 24.97 18.89 17.11
7 broiler duck H5N8 국내 H5 N8 21.24 18.63 21.75 17.38 26.57
8 chicken NDV 국내 - - - - - - -
9 Mallard duck H11N9 국내 H11 N9 - - - - -
10 Mallard duck H2N2 국내 H2 N2 - - - - -
11 Wild bird H7N1 국내 H7 N1 - - - - -
12 Wild bird H7N2 국내 H7 N2 - - - - -
13 wild bird H7N7 국내 H7 N7 - - - - -
14 mallard duck H7N7 국내 H7 N7 - - - - -
15 mallard duck H7N9 국내 H7 N9 - - - - -
16 16A H7N7 1 국내 H7 N7 - - - - -
17 16A H7N7 2 국내 H7 N7 - - - - -
18 D15 (IBV) 국내 - - - - - - -
19 DK0106 (NDV_class1) 국내 - - - - - - -
20 Jeonbuk 국내 - - - - - - -
상기 표 3에 나타낸 바와 같이 H5 유전자 검출 효율성 비교 평가 결과, 대조군(OIE 프라이머 및 프로브 세트)은 본 발명의 후보군, 특히 H5-1의 프라이머 및 프로브 세트에 비해 대체로 반응성이 낮았으며, 최근 아시아에서 가장 유행하는 clade2.3.2.1C(4번 시료) 및 clade2.3.4.4A형(7번 시료)에 대한 반응성 또한 낮은 것을 확인하였다. 또한 H5-3 및 H5-4의 프라이머 및 프로브 세트는 일부 H5 유전자를 검출하지 못하여 선정에서 제외하였다.
그 후 선정 후보인 본 발명의 H5-1 및 H5-2 프라이머 및 프로브 세트에 대해 추가적으로 실험을 진행하여 CT 값을 비교하였으며 이를 표 4에 나타내었다.
No. Strain 구분 HA NA M gene
H5-1 H5-2
1 chicken 03 H5N1 국내 H5 N1 24 20.8
2 chicken 06 H5N1 국내 H5 N1 22.1 18.8
3 chicken 08 H5N1 1 베트남 H5 N1 24.1 21
4 chicken 11 H5N1 1 베트남 H5 N1 33.9 23.6
5 chicken 08 H5N1 2 베트남 H5 N1 24.5 21.3
6 chicken 11 H5N1 3 베트남 H5 N1 20.5 19.8
7 duck 12 H5N1 캄보디아 H5 N1 27.8 20.4
8 wild bird 05 H5N3 국내 H5 N3　 23.1 19.9
9 chicken 16 H5N6 국내 H5 N6 36.8 14.3
10 common teal 16 H5N8 국내 H5 N8 19.2 13.8
상기 표 4에서와 같이, H5-1 및 H5-2 프라이머 및 프로브 세트에 대한 추가 실험 결과 H5-2 프라이머 및 프로브 세트의 민감도가 가장 우수한 것을 확인하여, H5 유전자 특이적 프라이머 및 프로브 세트로 H5-2의 프라이머 및 프로브 세트를 선정하였다.
No. Strain 구분 HA NA H7 gene
OIE H7-1 H7-2 H7-3 H7-4
1 chicken H5N1 1 국내 H5 N1 - - - - -
2 chicken H5N1 2 베트남 H5 N1 - - - - -
3 chicken H5N1 3 베트남 H5 N1 - - - - -
4 chicken H5N1 4 베트남 H5 N1 - - - - -
5 chicken H5N1 5 캄보디아 H5 N1 - - - - -
6 chicken H5N1 6 몽골 H5 N1 - - - - -
7 broiler duck H5N8 국내 H5 N8 - - - - -
8 chicken NDV 국내 - - - - - - -
9 Mallard duck H11N9 국내 H11 N9 - - - - -
10 Mallard duck H2N2 국내 H2 N2 - - - - -
11 Wild bird H7N1 국내 H7 N1 21.29 21.61 20.04 26.26 20.09
12 Wild bird H7N2 국내 H7 N2 22.47 25.46 20.47 22.73 20.64
13 wild bird H7N7 국내 H7 N7 20.98 21.07 19.2 21.27 19.74
14 mallard duck H7N7 국내 H7 N7 19.66 17.25 17.1 19.21 16.86
15 mallard duck H7N9 국내 H7 N9 22.59 20.41 19.65 24.62 19.36
16 16A H7N7 1 국내 H7 N7 20.98 20.13 18.21 19.37 18.19
17 16A H7N7 2 국내 H7 N7 23.26 22.58 31.25 23.09 20.13
18 D15 (IBV) 국내 - - - - - - -
19 DK0106 (NDV_class1) 국내 - - - - - - -
20 Jeonbuk 국내 - - - - - - -
상기 표 5에 나타낸 바와 같이 H7 유전자 검출 효율성 비교 평가 결과, 본 발명의 H7-1 내지 H7-4의 H7 유전자 특이적 프라이머 및 프로브 세트 중에서 H7-4가 가장 H7 유전자 검출 민감도가 높고 비특이적 반응이 없는 것으로 나타나, 최종적으로 H7 유전자 특이적 프라이머 및 프로브 세트로는 H7-4의 프라이머 및 프로브 세트를 선정하였다.
실시예 1-2. M/H5/H7 유전자 특이적 프라이머 및 프로브 세트 최종 선정
상기 실시예 1-1의 표 2 내지 5에서의 결과를 바탕으로, 최종적으로 선정한 M/H5/H7 유전자 특이적 프라이머 및 프로브 세트를 하기 표 6에 나타내었다. 또한 대조군(OIE 프라이머 및 프로브 세트)와 비교하여 본 발명의 M, H5 및 H7 유전자 특이적 프라이머 및 프로브 세트의 각 유전자 검출 부위를 도 1 내지 3에 나타내었다.
길이 (bp) 정방향 프라이머 시퀀스 역방향 프라이머 시퀀스 프로브 시퀀스
M 유전자 특이적 제 1 프라이머 및 프로브 세트 시퀀스
129 CGAGGTCGAAACGTACGTTCT
(서열번호 1)		 GTCTTTAGCCAYTCCATGAGAGC
(서열번호 2)		 TCAGGCCCCCTCAAAGCCGAG
(서열번호 3)
H5 유전자 특이적 제 2 프라이머 및 프로브 세트 시퀀스
88 TGCATTGGTTACCATGCAAAYAA
(서열번호 4)		 GTATGTCTTGGGCRTGTGTRACAGT
(서열번호 5)		 AGGTTGACACRATAATGGA
(서열번호 6)
H7 유전자 특이적 제 3 프라이머 및 프로브 세트 시퀀스
105 TGGTTTAGCTTCGGGGCATCA
(서열번호 7)		 TTATATACAAATRGTGCACCGCAT
(서열번호 8)		 TGAARACAAGGCCCATTGCAATGGC
(서열번호 9)
실시예 3. 본 발명의 M/H5/H7 유전자 특이적인 프라이머 및 프로브 세트의 검출한계(LOD) 평가
상기 실시예 2에서 선정한 본 발명의 M, H5 및 H7 유전자 특이적 프라이머 및 프로브 세트의 실제 검출한계를 알아보기 위해, 이를 이용하여 시제품 키트를 제조한 후 검출한계(LOD)를 평가하였다.
검출한계를 평가하기 위한 시료로는 M, H5, H7 각각의 목표부위가 포함된 유전자 단편을 증폭한 다음, Promega사의 pGEM-T-vector에 삽입하고 이를 주형으로 Promega사의 RiboMax Large Scale RNA Production System-T7 kit를 이용하여 제조사 매뉴얼에 따라 RNA를 합성 및 추출하였다. 추출된 RNA는 정량하여 PBS로 계단 희석하고, 제작된 각각의 표준시료를 시험에 사용하였다. 이에 대한 결과를 표 7에 나타내었다.
Target gene A사 B사 C사
M LOD 102 101 101
CT value 31.50-31.80 35.76-36.63 36.53
IC AV±SD 22.30±0.30 23.09±0.28 22.15±0.33
CV(%) - 1.21 1.51
H5 LOD 102 102 102
CT value 37.20-38.00 37.17-37.28 37.08
IC AV±SD 22.10±0.10 22.78±0.25 22.50±0.39
CV(%) - 1.08 1.75
H7 LOD 102 102 103
CT value 37.00 33.81-34.97 33.15
IC AV±SD 21.80 22.98±0.39 22.75±0.33
CV(%) - 1.68 1.45
상기 표 7에서와 같이, 본 발명의 M/H5/H7 유전자 특이적인 프라이머 및 프로브 세트를 사용하였을 때 모든 테스트에서 H, M5 및 M7 유전자를 모두 특이적으로 검출 가능함을 확인하였고 민감도 또한 우수한 것을 확인하였다.
실시예 4. 본 발명의 M/H5/H7 유전자 특이적인 프라이머 및 프로브 세트의 우수한 검출 특이도 및 민감도 확인
실시예 4-1. 국내 분리주(내부 시료 바이러스) 테스트
본 발명 M/H5/H7 유전자 특이적인 프라이머 및 프로브 세트의 실제 조류인플루엔자 바이러스에 대한 검출 특이도 및 민감도를 확인하기 위해, 상기 실시예 3에서 제조한 시제품 키트를 이용하여 두 가지 기기(ABI 7500 Fast, Bio-Rad CFX96)로 M/H5/H7 유전자 특이적 반응을 실험하였다. 시료로는 국내 분리주 등 74종, 즉 AIV 69종(H5 AIV 32종, H7 AIV 18종, 그 외 혈청형 AIV 19종) 및 NDV 등의 기타 조류 바이러스 5종 바이러스를 사용하였고 결과는 정리하여 하기 표 8에 나타내었다.
Target gene 양성/음성 여부 CFX96 AB7500
양성 검출수 양성 검출수
M 양성샘플 69 69
음성샘플 - -
H5 양성샘플 32 32
음성샘플 - -
H7 양성샘플 18 18
음성샘플 - -
상기 표 8에 나타낸 바와 같이, 본 발명 M, H5 및 H7 유전자 특이적인 프라이머 및 프로브 세트는 기타 조류 바이러스(음성샘플)과는 반응하지 않아 비특이적 반응을 전혀 나타내지 않았으며, 실제 조류인플루엔자 바이러스 무작위 시료에서 M, H5 및 H7 유전자 각각을 특이적으로 민감도 높게 검출 가능함을 확인하였다. 또한 이러한 결과를 통해 본 발명 M, H5 및 H7 유전자 특이적인 프라이머 및 프로브 세트를 이용하면 다른 검출기기를 사용함에 있어서도 조류인플루엔자 바이러스 M, H5 및 H7 유전자를 특이적으로 민감도 높게 검출 가능함을 확인하였다.
실시예 4-2. 1차 야외시료 테스트
또한 본 발명 M/H5/H7 유전자 특이적인 프라이머 및 프로브 세트의 실제 야외시료 내 조류인플루엔자 바이러스에 대한 검출 특이도 및 민감도를 확인하기 위해, 상기 실시예 3에서 제조한 본 발명 시제품 키트와 대조군인 OIE 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 두 가지 기기(ABI 7500 Fast, Bio-Rad CFX96)로 M/H5/H7 유전자 특이적 반응을 실험하였다. 시료로는 2017년 국내에서 채취 및 바이러스가 분리된 야외시료로서 야생조류 분변 및 가금류(닭, 오리 등) 분변의 스왑 시료 57종(AIV 음성시료 20종, H5 AIV 시료 17종, H7 AIV 시료 20종)을 사용하였으며 각 야외시료의 테스트 결과는 표 9에 나타내었다.
Target gene 양성/음성 여부 OIE(대조군) 시제품
양성 검출수 양성 검출수
M 양성샘플 29 30
음성샘플 - -
H5 양성샘플 10 15
음성샘플 - -
H7 양성샘플 6 13
음성샘플 - -
상기 표 9 에 나타낸 바와 같이, 대조군인 기존 OIE 프라이머 및 프로브 세트와 본 발명 M/H5/H7 유전자 특이적인 프라이머 및 프로브 세트는 모두 M/H5/H7 유전자에 대해 비특이적 반응을 나타내지 않음을 확인하였다. 그러나 검출 민감도는 대조군인 기존 OIE 프라이머 및 프로브 세트 대비 본 발명 M/H5/H7 유전자 특이적인 프라이머 및 프로브 세트의 양성 검출수가 더 높음을 확인함으로써, 기존 OIE 대비 민감도가 더욱 우수한 프라이머 및 프로브 세트임을 확인하였다.
실시예 4-3. 2차 야외시료 테스트
또한 본 발명 M 및 H5 유전자 특이적인 프라이머 및 프로브 세트의 검출 민감도를 추가 검증하기 위해, 2017년 국내에서 채취된 야생조류 분변 및 가금류(닭, 오리 등) 분변의 스왑 시료로써 바이러스 진단 결과 최종 양성으로 확인된 M 및 H5 유전자 야외시료(H5 AIV 111종)와 최종 음성으로 확인된 야외시료(246종)를 이용한 두 가지 기기에서의 테스트 결과를 하기 표 10에 나타내었다.
Target gene 양성/음성 여부 CFX96 AB7500
양성 검출수 양성 검출수
M 양성샘플 105 102
음성샘플 2 2
H5 양성샘플 102 100
음성샘플 1 -
H7 음성샘플 - -
상기 표 10 에서와 같이, 본 발명 M, H5 및 H7 유전자 특이적인 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 두 가지 기기에서의 야외시료 테스트 결과, 양성야외시료에서 M 및 H5 유전자 검출 민감도는 92 % 이상으로 매우 높은 것을 확인하였다. 음성야외시료에서는 M, H5 및 H7 유전자에 대해 비특이적 반응을 나타내지 않음을 확인하여 특이도 99 %임을 확인하였다. 따라서 본 발명 M/H5/H7 유전자 특이적인 프라이머 및 프로브 세트는 다른 검출기기를 사용함에 있어서도 조류인플루엔자 바이러스 M, H5 및 H7 유전자에 대한 민감도 및 특이도가 높음을 검증하였다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency) KoGene BioTech Co., LTD. INTRON BIOTECHNOLOGY CO., LTD MEDIAN Diagnostics Inc. <120> Primer and probe set for detection of type A avian influenza virus and the avian H5 and H7 subtype and uses thereof <130> 1.96P <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M Fwd Primer <400> 1 cgaggtcgaa acgtacgttc t 21 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M Rev Primer <400> 2 gtctttagcc aytccatgag agc 23 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M Probe <400> 3 tcaggccccc tcaaagccga g 21 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H5 Fwd Primer <400> 4 tgcattggtt accatgcaaa yaa 23 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H5 Rev Primer <400> 5 gtatgtcttg ggcrtgtgtr acagt 25 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H5 Probe <400> 6 aggttgacac rataatgga 19 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H7 Fwd Primer <400> 7 tggtttagct tcggggcatc a 21 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H7 Rev Primer <400> 8 ttatatacaa atrgtgcacc gcat 24 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H7 Probe <400> 9 tgaaracaag gcccattgca atggc 25

Claims (11)

  1. 서열번호 1, 2 및 3으로 표시되는 염기서열을 포함하는 제 1 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 4, 5 및 6으로 표시되는 염기서열을 포함하는 제 2 프라이머 및 프로브 세트; 및 서열번호 7, 8 및 9로 표시되는 염기서열을 포함하는 제 3 프라이머 및 프로브 세트;를 포함하는, 조류인플루엔자 바이러스(Avian influenza virus, AIV) 진단용 프라이머 및 프로브 세트.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 제 1 프라이머 및 프로브 세트는 조류인플루엔자 바이러스 M 유전자 검출용이며, 상기 제 2 프라이머 및 프로브 세트는 조류인플루엔자 바이러스 H5 유전자 검출용이며, 상기 제 3 프라이머 및 프로브 세트는 조류인플루엔자 바이러스 H7 유전자 검출용인 것을 특징으로 하는, 조류인플루엔자 바이러스 진단용 프라이머 및 프로브 세트.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 조류인플루엔자 바이러스 진단용 프라이머 및 프로브 세트는 조류인플루엔자 바이러스 M, H5 및 H7 유전자 동시진단용인 것을 특징으로 하는, 조류인플루엔자 바이러스 진단용 프라이머 및 프로브 세트.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 조류인플루엔자 바이러스 진단용 프라이머 및 프로브 세트는 실시간 역전사 중합효소연쇄반응(real-time RT-PCR, rRT-PCR)용 프라이머 및 프로브 세트인 것을 특징으로 하는, 조류인플루엔자 바이러스 진단용 프라이머 및 프로브 세트.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 조류인플루엔자 바이러스 진단용 프라이머 및 프로브 세트의 검출한계는 100 내지 103 Copy number/μL 인 것을 특징으로 하는, 조류인플루엔자 바이러스 진단용 프라이머 및 프로브 세트.
  7. 제1항, 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항의 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는, 조류인플루엔자 바이러스 진단용 조성물.
  8. 제7항에 따른 조류인플루엔자 바이러스 진단용 조성물을 포함하는, 조류인플루엔자 바이러스 진단용 키트.
  9. a) 시료로부터 핵산을 얻는 단계;
    b) 제1항, 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 상기 a)단계에서 얻어진 핵산을 증폭하는 단계; 및
    c) 상기 b)단계에서 얻어진 증폭 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 조류인플루엔자 바이러스 진단을 위한 정보제공방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 조류인플루엔자 바이러스 진단은 조류인플루엔자 바이러스 M, H5 및 H7 유전자 동시진단인 것을 특징으로 하는, 조류인플루엔자 바이러스 진단을 위한 정보제공방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 b) 단계의 증폭하는 단계는, 45 내지 55 ℃에서 25 내지 35 분 및 90 내지 100 ℃에서 10 내지 20 분 동안 1회 사이클링하는 1차 단계; 및
    90 내지 100 ℃에서 10 내지 20 초 및 55 내지 65 ℃에서 55 내지 65 초 동안 35 내지 45회 사이클링하는 2차 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조류인플루엔자 바이러스 진단을 위한 정보제공방법.
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