KR20210054417A - H5 및 h7 아형 조류인플루엔자 바이러스 동시 검출 실시간 유전자 진단키트 - Google Patents

H5 및 h7 아형 조류인플루엔자 바이러스 동시 검출 실시간 유전자 진단키트 Download PDF

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Abstract

현재 AI 국가예찰 및 진단에 사용되는 M/H5/H7형 AI 실시간 유전자 진단법은 유럽지역에 유행하는 조류인플루엔자 바이러스를 기반으로 제작된 표준 Primer 및 Probe를 사용하여 국제적으로 대표적이고 일반적으로 사용되는 방법이나, 최근 AI 바이러스의 변이가 빠르게 진행되어 국내 유입가능성이 큰 유라시아 지역의 유행주에 최적화된 진단키트의 개발 필요성이 제기되었다. 본 발명은 국내 분리주 및 유라시아 유행주 분석을 통해 최적화된 Primer 및 Probe를 새롭게 선정하고 이를 이용하여 실시간 유전자진단법을 적용한 진단키트에 관한 것이다. 본 발명의 진단키트로 다양한 국내 분리주 및 야외 임상시료들에 대한 실험결과 현행 방법 대비 높은 민감도를 나타내는 것으로 확인되었으며 특이도도 높은 것으로 확인되었다. 본 발명을 AI 국가예찰 및 진단에 적용하여 H5/H7형 고병원성 조류인플루엔자는 물론 조류인플루엔자 바이러스를 신속, 정확하게 진단함으로써 가금 산업의 피해를 최소화하고 국가방역에 기여하여 사회적, 경제적 기대효과가 클 것으로 예상된다.

Description

H5 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 동시 검출 실시간 유전자 진단키트{Real-time PCR Diagnostic Kit for Simultaneous Detection of H5 and H7 Subtype Avian Influenza Virus}
본 발명은 H5 및 H7 아형 (subtype) 조류인플루엔자 바이러스 (avian influenza virus) 진단 키트에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 H5 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 표적 서열을 특이적으로 증폭 검출할 수 있는 각 아형에 대한 프라이머/프로브 (primer/probe) 각 2 세트 및 이를 포함하는 동시 검출용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 H5 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 실시간 유전자 진단 키트 및 상기 진단 키트를 이용하여 H5 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스를 동시에 검사하는 방법에 관한 것이다.
조류인플루엔자는 조류인플루엔자 바이러스 감염에 의해 발생하는 조류의 급성 전염병으로 닭, 칠면조, 오리 등 가금류에서 피해가 심각하게 나타난다. 조류인플루엔자 바이러스의 병원성 정도에 따라 저병원성 조류인플루엔자 (low pathogenic avian influenza; LPAI)와 고병원성 조류인플루엔자 (highly pathogenic avian influenza; HPAI)로 구분되는데, 고병원성 조류인플루엔자는 위험도가 높아 세계동물보건기구 (OIE)에서도 관리 대상 질병으로 지정하고 있으며, 발생 시 OIE에 의무적으로 보고하도록 되어 있다.
조류인플루엔자 바이러스는 Orthomyxoviridae 과 (科, family), Influenzavirus A 속 (屬, genus)으로 분류되며, 단일 가닥 RNA 바이러스로서 서로 다른 8개의 RNA 분절 (segment)로 구성되어 있는데, 혈구응집소 (hemagglutinin; HA) 및 뉴라미니다제 (neuraminidase; NA)의 표면 항원 유전자와 M, NP, PB2 등 6개의 내부 유전자로 나뉘어진다. 병원성은 주로 HA 유전자와 관련이 있으며, HA 단백질 분절 부위에 특정한 병원성 관련 유전자 배열을 나타내면 고병원성으로 간주되고 있다.
A형 인플루엔자 바이러스는 다양한 아형이 있는데, 바이러스 표면에 존재하는 혈구응집소의 특성에 따라 H1부터 H16까지 16종의 아형이 있으며, 뉴라미니다제라는 효소가 나타내는 표면 단백질의 특성에 따라 N1부터 N9까지 9종의 아형이 있다. 따라서, H형과 N형을 조합할 경우, A형 인플루엔자 바이러스는 이론적으로 총 144종의 아형이 존재하게 된다. 조류인플루엔자 바이러스는 아형이 매우 많고, 변이가 쉽게 일어나며, 자연 생태계의 야생 조류에 다양한 종류의 바이러스가 분포되어 있으면서도 이들에게는 감염되어도 뚜렷한 증상이 없이 경과될 수 있기 때문에 방역 측면에서 볼 때 가장 주의하여야 할 가축 전염병 중 하나이다.
현재까지 가금류에서 고병원성 조류인플루엔자를 일으키는 조류인플루엔자 바이러스는 모두 H5 또는 H7 아형에 속하는 것이었지만, 자연계에 존재하는 H5 및 H7 아형의 조류인플루엔자 바이러스는 대부분 비병원성 또는 저병원성 바이러스이다. 그러나, 극히 드물지만 때로는 야생 조류에서 가금류로 종간의 전파 (interspecies transmission)가 이루어져 숙주 (host)가 변할 경우나 또는 야생 조류의 바이러스가 오리나 거위 등을 거쳐 닭이나 칠면조의 가금류로 전파되어 왔을 경우 유전자의 급격한 변이가 일어나 H5 또는 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 중 일부가 고병원성의 특성을 발현하는 것으로 알려져 있다. 1994년 멕시코에서의 H5N2, 1999년 이탈리아에서의 H7N1 그리고 2004년 캐나다에서의 H7N2에 의한 고병원성 조류인플루엔자는 닭이나 칠면조에서 저병원성 조류인플루엔자 감염으로 시작되어 이것이 확산되고 지속적으로 순환 감염되면서 바이러스 유전자가 변이되어 고병원성을 나타낸 사례들이다. 따라서, H5 또는 H7 아형의 조류인플루엔자 바이러스가 확인될 경우에는 저병원성이라 할지라도 고병원성 조류인플루엔자 바이러스에 준하여 강도 높은 방역 대책을 적용하는 것이 필요하다.
조류인플루엔자 진단법으로는 질병의 원인이 되는 바이러스를 분리하는 방법, 단백 항원이나 유전자를 검출하는 방법, 바이러스 감염 후 동물 체내에 생성되는 항체를 검출하는 혈청학적 방법 등이 이용되고 있다. 이 중 가장 기준이 되는 방법은 바이러스 분리로서, 바이러스 분리 후에 간접 면역형광법 (indirect immunofluorescence method)이나 혈구 응집 억제 시험법 (hemagglutination inhibition test) 등을 통해 동정을 하지만, 최근에는 조류인플루엔자 바이러스 특이 유전자 부위를 검출하는 역전사 중합효소 연쇄 반응 (reverse transcription-polymerase chain reaction; RT-PCR)과 같은 분자생물학적인 방법이 많이 이용된다. HA 및 NA 유전자 염기서열을 기초로 RT-PCR 방법 등을 이용하여 조류인플루엔자 바이러스 아형 검출 및 감염 진단을 신속하게 수행하려는 것으로, 대한민국 등록특허 제 10-1618435호에는 5종의 H형과 5종의 N형을 2개의 튜브에서 다중 실시간 RT-PCR (multiplexed real-time RT-PCR)을 통해 검출할 수 있는 진단 키트가 개시되어 있으며, 제 10-1809721호에는 16종의 H형을 각각의 튜브에서 종래 RT-PCR (conventional RT-PCR)을 통해 검출할 수 있는 진단 키트가 개시되어 있고, 제 10-1809710호에는 9종의 N형을 각각의 튜브에서 종래 RT-PCR을 통해 검출할 수 있는 진단 키트가 개시되어 있다. PCR에 기반한 분자생물학적인 방법들은 신속하고 민감하게 결과를 확인할 수 있다는 장점을 가지지만, 변이가 쉽게 일어나는 조류인플루엔자 바이러스 특성 상 검출 커버리지 (detection coverage)에 대한 지속적인 모니터링 및 필요 시 검출능 향상을 위한 프라이머/프로브 개선 등이 요구되고 있다.
이러한 기술적 배경 하에서, 본 발명자들은 최근 국내 및 유라시아 지역에서 분리된 H5 및 H7 아형의 조류인플루엔자 바이러스들에 대한 검출능을 향상시키고, 변이에 의한 영향을 상대적으로 덜 받는 실시간 유전자 진단 키트를 개발하고자 예의 연구노력한 결과, H5 아형 조류인플루엔자 바이러스 표적 서열을 특이적으로 증폭 검출할 수 있는 서로 다른 위치의 프라이머/프로브 2 세트 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 표적 서열을 특이적으로 증폭 검출할 수 있는 서로 다른 위치의 프라이머/프로브 2 세트를 고안하고, 이들을 단일 튜브 내 다중 실시간 원스텝 RT-PCR (multiplexed real-time one-step RT-PCR) 반응에 함께 사용함으로써 H5 아형 조류인플루엔자 바이러스 2개 검출 부위 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 2개 검출 부위의 동시 검출이 가능하도록 다중 올리고 혼합 조성물 (multi oligo mix) 및 이 조성물을 포함하는 진단 키트를 구성한 다음, 상기 진단 키트를 이용하여 국내 분리주 및 야외 임상 시료들에서 H5 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 검출 성능을 확인하고, 본 발명을 완성하였다. 특히, 각 아형의 조류인플루엔자 바이러스 진단을 위해 검출 부위를 2군데씩 사용함으로써 하나의 검출 부위에 변이 등으로 인해 문제가 생기더라도 다른 하나의 검출 부위를 통해 검출이 이루어지도록 하여 진단의 정확성을 유지하는데 도움이 되도록 하였다.
본 발명의 배경이 되는 기술 부분에 기재된 내용은 오직 본 발명의 배경에 대한 이해를 향상시키기 위한 것으로서, 단순히 본 실시예에 대한 배경 정보를 제공할 뿐 종래 기술을 구성하는 것은 아니다.
본 발명의 하나의 목적은 H5 아형 조류인플루엔자 바이러스 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스의 표적 서열을 특이적으로 증폭 검출하기 위한 프라이머/프로브 세트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 H5 아형 조류인플루엔자 바이러스 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스의 표적 서열을 특이적으로 증폭 검출하기 위한 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 H5 아형 조류인플루엔자 바이러스 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 검사용 진단 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 진단 키트를 이용하여 H5 아형 조류인플루엔자 바이러스 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스를 동시에 검사하는 방법을 제공하는 데 있다.
한편, 이러한 본 발명의 목적은 상기의 목적들로 국한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명자들은 최근 국내 및 유라시아 지역에서 분리된 것들을 포함하여 유라시아 계통 (Eurasian lineage)에 속하는 H5 및 H7 아형의 조류인플루엔자 바이러스들에 대해 우수한 검출능을 가지면서 향후 발생할 수 있는 변이에 의한 영향을 상대적으로 덜 받는 사용이 편리한 다중 실시간 원스텝 RT-PCR 진단 키트를 개발하기 위해, 미국 국립생물공학정보센터 (National Center for Biotechnology Information; NCBI)의 GenBank 데이터베이스로부터 2014년 이후 보고된 염기서열들을 중심으로 유라시아 계통에 속하는 H5 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스의 HA 유전자 염기서열들을 수집한 다음, H5 아형 조류인플루엔자 바이러스 HA 유전자 염기서열들 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 HA 유전자 염기서열들을 각각 정렬 (sequence alignment)하고 자신 이외 아형들의 HA 유전자 염기서열들과 비교함으로써, H5 아형 조류인플루엔자 바이러스만 특이적으로 증폭 검출할 수 있는 프라이머/프로브 세트 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스만 특이적으로 증폭 검출할 수 있는 프라이머/프로브 세트를 설계하였다. 이 때, 각 아형에 대해 유전자 상에서 멀리 떨어져있는 서로 다른 위치의 프라이머/프로브 2 세트씩을 설계함으로써, 검출 시 민감도 및 커버리지를 높이는 동시에 하나의 검출 부위에 문제가 생기더라도 다른 하나의 검출 부위를 통해 검출이 이루어지도록 하여 향후 발생할 수 있는 변이에 의한 영향을 단일 검출 부위만을 대상으로 하는 진단 키트에 비해 상대적으로 덜 받도록 하였다. 이어서, 상기와 같이 설계된 프라이머/프로브 세트들의 가상 환경 분석 (in silico analysis)을 수행하였는데, 농림축산검역본부의 자체 데이터베이스, 최근 국내 분리주들 및 인플루엔자 유전자 정보 데이터베이스인 GISAID(Global Initiative on Sharing All Influenza Data)에서 조회되는 최근 중국 분리주들에 대한 검출 커버리지가 아주 높고 자신 이외 아형들에 대한 특이도에 문제가 없을 것으로 분석되었다.
설계 및 가상 환경 분석이 완료된 모든 프라이머 및 프로브를 합성한 다음, 각 프라이머/프로브 세트별로 실시간 원스텝 RT-PCR 반응에서 잘 작동하는지 확인하고, H5 아형 조류인플루엔자 바이러스 검출을 위한 프라이머/프로브 2세트 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 검출을 위한 프라이머/프로브 2세트를 모두 혼합한 다중 올리고 혼합 조성물을 구성하였다. 다중 올리고 혼합 조성물 구성 시에는 단일 프라이머/프로브 세트와의 성능 비교 및 다중 올리고 혼합 조성물 내 개별 프라이머와 프로브의 양 조정을 통해 다중 동시 검출에 문제가 없도록 하였다. 상기와 같이 구성된 단일 튜브 내 다중 실시간 원스텝 RT-PCR 반응을 통한 H5 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 검사를 위한 다중 올리고 혼합 조성물 및 이를 포함하는 진단 키트를 이용하여, H5 또는 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 국내 분리주 및 H5 또는 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 양성으로 확인된 야외 임상 시료들로부터의 핵산 추출액과 이의 연속 희석액을 대상으로 한 기존 프라이머/프로브 세트와의 비교 테스트를 통해 높은 민감도를 확인하였으며, 자신 이외 다른 아형들에 대한 테스트를 통해 특이도에 문제가 없음을 확인하였다.
본 발명은 다음 1. 내지 17.의 발명을 개시한다.
1. 다음을 포함하는 H5 아형 조류인플루엔자 바이러스의 표적서열 검출용 조성물:
(a) 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머, 또는 이들의 조합; 및 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프라이머; 또는
(b) 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 프라이머, 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프라이머, 또는 이들의 조합; 및 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 프라이머;
또는 이들의 조합.
2. 1.에 있어서, 상기 (a)는 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 프로브를 추가적으로 포함하고, 상기 (b)는 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 프로브를 추가적으로 포함하는, 조성물.
3. 2.에 있어서, 상기 프로브들은 동일한 표지자로 표지된 것인, 조성물.
4. 1. 내지 3.의 조성물을 포함하는 H5 아형 조류인플루엔자 바이러스 유전자 검사용 진단 키트.
5. 다음을 포함하는 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스의 표적서열 검출용 조성물:
(c) 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 프라이머; 또는
(d) 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 13의 염기서열로 표시되는 프라이머;
또는 이들의 조합.
6. 5. 에 있어서, 상기 (c)는 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 프로브를 추가적으로 포함하고, 상기 (d)는 서열번호 14의 염기서열로 표시되는 프로브를 추가적으로 포함하는, 조성물.
7. 6.에 있어서, 상기 프로브들은 동일한 표지자로 표지된 것인, 조성물.
8. 5. 내지 7.의 조성물을 포함하는 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 유전자 검사용 진단 키트.
9. 다음을 포함하는 H5 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스의 표적서열 검출용 조성물:
(a) 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머, 또는 이들의 조합; 및 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프라이머; 또는
(b) 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 프라이머, 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프라이머, 또는 이들의 조합; 및 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 프라이머;
또는 이들의 조합, 및
(c) 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 프라이머; 또는
(d) 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 13의 염기서열로 표시되는 프라이머;
또는 이들의 조합.
10. 9.에 있어서, 상기 (a)는 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 프로브를 추가적으로 포함하고, 상기 (b)는 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 프로브를 추가적으로 포함하며, 상기 (c)는 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 프로브를 추가적으로 포함하고, 상기 (d)는 서열번호 14의 염기서열로 표시되는 프로브를 추가적으로 포함하는, 조성물.
11. 10.에 있어서, 상기 (a)와 (b)에 추가되는 프로브들은 제1 표지자로 표지된 것이고, 상기 (c)와 (d)에 추가되는 프로브들은 제2 표지자로 표지된 것이며, 상기 제1 표지자와, 제2 표지자는 서로 다른 것인, 조성물.
12. 9. 내지 11.의 조성물을 포함하는 H5 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 유전자 검사용 진단 키트.
13. 12.에 있어서, 상기 진단 키트는 H5 아형 조류인플루엔자 바이러스 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스를 단일 튜브 내에서 동시 검출하는 것인, 진단 키트.
14. (a) 검체에서 RNA를 분리하는 단계; 및
(b) 상기 분리된 RNA를 대상으로, 1. 내지 4. 중 어느 하나의 조성물 또는 진단 키트를 이용하여 다중 실시간 원스텝 RT-PCR 반응을 통해 표적 서열을 특이적으로 증폭 검출하는 단계를 포함하는 H5 아형 조류인플루엔자 바이러스 동시 검사 방법.
15. (a) 검체에서 RNA를 분리하는 단계; 및
(b) 상기 분리된 RNA를 대상으로, 5. 내지 8. 중 어느 하나의 조성물 또는 진단 키트를 이용하여 다중 실시간 원스텝 RT-PCR 반응을 통해 표적 서열을 특이적으로 증폭 검출하는 단계를 포함하는 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 동시 검사 방법.
16. (a) 검체에서 RNA를 분리하는 단계; 및
(b) 상기 분리된 RNA를 대상으로, 9. 내지 13. 중 어느 하나의 조성물 또는 진단 키트를 이용하여 다중 실시간 원스텝 RT-PCR 반응을 통해 표적 서열을 특이적으로 증폭 검출하는 단계를 포함하는 H5 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 동시 검사 방법.
17. 16.에 있어서, 상기 (b) 단계의 검출 결과, 제1 표지자의 신호가 확인되면 H5 아형 조류인플루엔자 바이러스의 유전자가 검출된 것으로 판정하고, 제2 표지자의 신호가 확인되면 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스의 유전자가 검출된 것으로 판정하는 것인, H5 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 동시 검사 방법.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 H5 아형 조류인플루엔자 바이러스의 표적서열 검출용 조성물을 제공한다:
(a) 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머, 또는 이들의 조합; 및 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프라이머; 또는
(b) 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 프라이머, 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프라이머, 또는 이들의 조합; 및 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 프라이머;
또는 이들의 조합.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 (a)는 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 프로브를 추가적으로 포함하고, 상기 (b)는 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 프로브를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 프로브들은 동일한 표지자로 표지된다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스의 표적서열 검출용 조성물을 제공한다:
(c) 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 프라이머; 또는
(d) 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 13의 염기서열로 표시되는 프라이머;
또는 이들의 조합.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 (c)는 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 프로브를 추가적으로 포함하고, 상기 (d)는 서열번호 14의 염기서열로 표시되는 프로브를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 프로브들은 동일한 표지자로 표지된 다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 H5 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스의 표적서열 검출용 조성물을 제공한다:
(a) 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머, 또는 이들의 조합; 및 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프라이머; 또는
(b) 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 프라이머, 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프라이머, 또는 이들의 조합; 및 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 프라이머;
또는 이들의 조합, 및
(c) 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 프라이머; 또는
(d) 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 13의 염기서열로 표시되는 프라이머;
또는 이들의 조합.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 (a)는 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 프로브를 추가적으로 포함하고, 상기 (b)는 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 프로브를 추가적으로 포함하며, 상기 (c)는 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 프로브를 추가적으로 포함하고, 상기 (d)는 서열번호 14의 염기서열로 표시되는 프로브를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 (a)와 (b)에 추가되는 프로브들은 제1 표지자로 표지된 것이고, 상기 (c)와 (d)에 추가되는 프로브들은 제2 표지자로 표지된 것이며, 상기 제1 표지자와, 제2 표지자는 서로 다른 것이다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, H5 및/또는 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 검출을 위한 조성물의 조성은 실시간 원스텝 RT-PCR 반응당 서열번호 1의 핵산을 2-8 pmole, 서열번호 2의 핵산을 3-9 pmole, 서열번호 3의 핵산을 2-8 pmole, 서열번호 4의 핵산을 2-8 pmole, 서열번호 5의 핵산을 2-8 pmole, 서열번호 6의 핵산을 2-8 pmole, 서열번호 7의 핵산을 2-8 pmole, 서열번호 8의 핵산을 2-8 pmole, 서열번호 9의 핵산을 2-8 pmole, 서열번호 10의 핵산을 2-8 pmole, 서열번호 11의 핵산을 0.5-4.5 pmole, 서열번호 12의 핵산을 2-8 pmole, 서열번호 13의 핵산을 0.5-6.5 pmole 및 서열번호 14의 핵산을 0.5-6.5 pmole의 농도로 포함한다.
본 발명의 보다 구체적인 구현예에 있어서, H5 및/또는 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 검출을 위한 조성물의 조성은 실시간 원스텝 RT-PCR 반응당 서열번호 1의 핵산을 5 pmole, 서열번호 2의 핵산을 6 pmole, 서열번호 3의 핵산을 5 pmole, 서열번호 4의 핵산을 5 pmole, 서열번호 5의 핵산을 5 pmole, 서열번호 6의 핵산을 5 pmole, 서열번호 7의 핵산을 5 pmole, 서열번호 8의 핵산을 5 pmole, 서열번호 9의 핵산을 5 pmole, 서열번호 10의 핵산을 5 pmole, 서열번호 11의 핵산을 1.5 pmole, 서열번호 12의 핵산을 5 pmole, 서열번호 13의 핵산을 3.5 pmole 및 서열번호 14의 핵산을 3.5 pmole이 사용되도록 프라이머 및 프로브들을 혼합한 것이다.
본 발명의 상기 프라이머/프로브 세트에 있어서, 서열번호 1 내지 4는 H5 아형 조류인플루엔자 바이러스의 HA 유전자에 있어 3'말단 (3'-end)쪽 검출 부위를 위한 프라이머/프로브 세트이며, 서열번호 5 내지 8은 H5 아형 조류인플루엔자 바이러스의 HA 유전자에 있어 5'말단 (5'-end)쪽 검출 부위를 위한 프라이머/프로브 세트이다. 또한, 서열번호 9 내지 11은 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스의 HA 유전자에 있어 3'말단쪽 검출 부위를 위한 프라이머/프로브 세트이며, 서열번호 12 내지 14는 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스의 HA 유전자에 있어 5'말단쪽 검출 부위를 위한 프라이머/프로브 세트이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "조류인플루엔자 바이러스 (avian influenza virus)"는 닭, 칠면조, 오리, 야생 조류 등에서 조류인플루엔자를 유발할 수 있는 원인 바이러스를 의미한다. 조류인플루엔자 바이러스는 표면 항원들을 암호화하고 있는 HA 유전자 및 NA 유전자에 따라 HA는 16종, NA는 9종으로 나누어지는 등 그 아형이 다양하며, 다른 아형 간에 교차 방어가 되지 않는다고 알려져 있다. 조류인플루엔자 바이러스의 다양한 아형 중 현재까지 발생한 고병원성 조류인플루엔자는 모두 H5 또는 H7 아형에 의한 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "다중 실시간 원스텝 RT-PCR (multiplexed real-time one-step RT-PCR)"은 각각의 의미를 가지는 PCR, RT-PCR, 원스텝 RT-PCR, 실시간 (RT-)PCR 및 다중 (RT-)PCR의 총합을 의미한다. 각각의 의미를 살펴보면, PCR은 DNA의 특정 영역을 시험관 내에서 대량으로 증폭하는 기술을 의미하며, RT-PCR은 시험관 내에서 RNA를 DNA로 역전사시킨 다음, 이렇게 만들어진 상보적 DNA (complementary DNA; cDNA)의 특정 영역을 대량으로 증폭하는 기술을 의미한다. 원스텝 RT-PCR은 cDNA를 만드는 역전사 과정과 cDNA의 특정 영역을 대량으로 복제하는 증폭 과정이 하나의 시험관 내에서 이루어지는 것을 의미하고, 실시간 (RT-)PCR은 특정 영역 증폭의 결과가 실시간으로 모니터링되는 것을 의미하며, 다중 (RT-)PCR은 한 번의 반응 수행으로 동시에 2개 이상의 다른 특정 영역들을 대량으로 증폭하는 것을 의미한다. 다중 실시간 원스텝 RT-PCR을 통해 경제적으로 빠르고 간편하게 조류인플루엔자 바이러스 검출 여부 및 아형 감별 진단을 할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "프라이머 (primer)"는 주형 (template) 핵산에 상보적으로 결합하여 합성을 위한 시발점으로 기능하는 자유 3'-수산화기 (free 3'-hydroxyl group)를 가지는 짧은 핵산 단편을 의미한다. 프라이머는 적절한 반응 완충 용액 (buffer) 및 온도에서 중합 반응을 위한 효소 [DNA 중합 효소 (DNA polymerase), 역전사 효소 (reverse transcriptase) 등] 및 상이한 4가지 데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트 (deoxynucleoside triphosphates; dNTPs)의 존재 하에서 주형에 상보적인 가닥의 합성을 개시할 수 있는데, 프라이머 길이 및 반응 조건 등은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다. 프라이머는 필요할 경우 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있으며, 표지의 예로는 효소, 방사선 동위원소, 형광성 분자, 화학 그룹 등이 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 H5 또는 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스를 검출할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 서열번호 1 내지 3, 서열번호 5 내지 7, 서열번호 9와 10 및 서열번호 12와 13의 올리고뉴클레오티드 (oligonucleotide)들을 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "프로브 (probe)"는 혼성화 (hybridization)에 의해 상보적인 목적 핵산 서열의 존재를 검출하는데 사용되어지는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 DNA 또는 RNA 핵산 단편을 의미하는데, 올리고뉴클레오티드 프로브, 단일 가닥 DNA 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 프로브는 해당 염기서열의 5'과 3'말단에 각각 검출에 이용되는 표지자를 포함할 수 있으며, 이러한 표지자로는 형광단 (fluorophore)과 소광체 (quencher)가 각각 5'과 3'말단에 표지될 수 있다. 이에 따라, 프로브에 형광단과 소광체가 서로 결합한 형태로 존재할 때에는 상호 간섭에 의해 발광이 억제되고, PCR 반응 등을 통해 프로브의 분해가 이루어지면 프로브에 표지된 형광단과 소광체 간의 간섭이 사라져 발광을 하게 된다. 상기 5'말단에 표지될 수 있는 형광단은 당업계에서 통상적으로 사용되는 형광 물질이 제한 없이 사용될 수 있는데, 예를 들면 플루오레세인 (Fluorescein), 6-카르복시플루오레세인 (6-Carboxyfluorescein; FAM), 핵사클로로-6-카르복시플루오레세인 (Hexachloro-6-carboxyfluorescein; HEX), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인 (Tetrachloro-6-carboxyfluorescein), VIC, JOE, 5-(2'-아미노에틸)아미노 나프탈렌-1-술폰산 (5-(2'-Aminoethyl)amino naphthalene-1-sulfonic acid), 쿠마린 (Coumarin) 및 이의 유도체, 시아닌-5 (Cyanine-5; Cy5), 텍사스 레드 (Texas Red), 테트라메틸로다민 (Tetramethylrhodamine), 칼 플루오르 레드 610 (CAL Fluor Red 610), 엘씨 레드 610 (LC Red 610) 등이 사용될 수 있다. 상기 3'말단에 표지될 수 있는 소광체 또한 당업계에서 통상적으로 사용되는 소광제가 제한 없이 사용될 수 있는데, 예를 들면 테트라메틸로다민, 6-카르복시테트라메틸로다민 (6-Carboxytetramethylrhodamine), BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, 4-다이메틸아미노페닐아조페닐-4'-말레이미드 (4-Dimethylaminophenylazophenyl-4'-maleimide) 등이 사용될 수 있다. 이처럼 형광 물질이 표지된 프로브를 사용하여 실시간 (RT-)PCR을 수행하면, 증폭된 산물을 실시간으로 모니터링할 수 있고, DNA 및 RNA의 정량이 가능하며, 전기영동이 필요 없어 빠르고 간편하게 정확한 진단이 가능하다는 장점을 갖는다.
본 발명에 있어서, 상기 프로브는 H5 또는 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스를 검출할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 서열번호 4, 서열번호 8, 서열번호 11 및 서열번호 14의 올리고 뉴클레오티드들을 사용할 수 있다.
상기 프라이머 및 프로브는 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입하는 것이 가능하다. 즉, 본 발명에서 목적으로 하는 H5 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스를 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당업계에 공지된 통상적인 수단을 이용하여 프라이머 및 프로브가 변형될 수 있다.
본 명세서에서는 프라이머 및 프로브의 염기서열을 나타냄에 있어 국제 생화학 연합 (International Union of Biochemistry; IUB) 중의성 코드 (ambiguity code)를 사용하였다. 염기서열에서 A는 아데닌 (adenine)을, C는 시토신 (cytosine)을, G는 구아닌 (guanine)을, T는 티민 (thymine)을, R은 아데닌과 구아닌 둘 다 가능한 자리를, Y는 시토신과 티민 둘 다 가능한 자리를, K는 구아닌과 티민 둘 다 가능한 자리를 나타낸다. 이는 본 명세서의 모든 염기서열을 제시하는 데에 있어 동일하게 적용되었다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머, 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프라이머, 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 프로브, 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 프라이머, 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프라이머, 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 프라이머, 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 프로브, 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 프라이머, 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 프라이머, 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 프로브, 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 프라이머, 서열번호 13의 염기서열로 표시되는 프라이머 및 서열번호 14의 염기서열로 표시되는 프로브를 모두 포함하는, 시료 중의 H5 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스의 표적 서열을 특이적으로 증폭 검출하기 위한 다중 실시간 원스텝 RT-PCR용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 H5 아형 조류인플루엔자 바이러스 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스의 단일 튜브 내 동시 검사를 위한 다중 올리고 혼합 조성물로서, 특히 각 아형의 검출을 위해 서로 다른 위치에 결합하는 프라이머/프로브 2 세트씩을 포함시켜 검출 시 민감도 및 커버리지를 높이는 동시에 하나의 검출 부위에 문제가 생기더라도 다른 하나의 검출 부위를 통해 검출이 이루어지도록 하여 향후 발생할 수 있는 변이에 의한 영향을 덜 받도록 하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 H5 아형 조류인플루엔자 바이러스의 표적서열 검출용 조성물을 포함하는 H5 아형 조류인플루엔자 바이러스 유전자 검사용 진단 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스의 표적서열 검출용 조성물을 포함하는 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 유전자 검사용 진단 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 H5 아형 조류인플루엔자 바이러스의 표적서열 검출용 조성물 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스의 표적서열 검출용 조성물을 모두 포함하는 H5 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 유전자 검사용 진단 키트를 제공한다.
상기 유전자 검사용 진단 키트는 구체적으로 시료 중의 H5 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 검사용 다중 실시간 원스텝 RT-PCR 진단 키트이다.
본 발명의 진단 키트는 H5 아형 조류인플루엔자 바이러스 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스의 감염 여부 확인 및 아형 감별을 경제적으로 빠르고 간편하게 수행하기 위한 다중 실시간 원스텝 RT-PCR 진단 키트로서, 상기 조성물에 포함되는 서열번호 1 내지 14 중 1 이상의 프라이머 및 프로브 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있다.
구체적인 일례로서, 본 발명의 진단 키트는 역전사 반응 및 PCR 분석을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. 상기 진단 키트는 각 검출 부위에 대한 특이적인 각각의 프라이머/프로브 세트 외에도 조류인플루엔자 바이러스 RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사 효소, cDNA의 특정 영역을 대량으로 증폭하기 위한 DNA 중합 효소, 반응 완충 용액, dNTPs, RNA 분해 효소 억제제 (RNase inhibitor), 멸균수, 테스트 튜브 또는 다른 적절한 용기 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 각 테스트 튜브에 포함되는 성분들로는, 이에 국한되지 않지만, H5 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 동시 검사를 위한 다중 올리고 혼합 조성물, DNA 중합 효소, 역전사 효소, RNA 분해 효소 억제제, dATP, dCTP, dGTP, dTTP, Tris-HCl, MgCl2, KCl, BSA, 핵산 분해 효소 제거수 (nuclease-free water) 등이 있으며, 특정 반응을 위해 사용되는 성분 또는 반응물의 최적량은 당업자에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 진단 키트를 이용하여 시료 중의 H5 및/또는 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스를 동시에 검사하는 방법을 제공한다.
구체적으로 본 발명의 H5 아형 조류인플루엔자 바이러스를 검사하는 방법은 (a) 검체에서 RNA를 분리하는 단계; 및 (b) 상기 분리된 RNA를 대상으로, 1. 내지 4. 중 어느 하나의 조성물 또는 진단 키트를 이용하여 다중 실시간 원스텝 RT-PCR 반응을 통해 표적 서열을 특이적으로 증폭 검출하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명의 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스를 검사하는 방법은 (a) 검체에서 RNA를 분리하는 단계; 및 (b) 상기 분리된 RNA를 대상으로, 5. 내지 8. 중 어느 하나의 조성물 또는 진단 키트를 이용하여 다중 실시간 원스텝 RT-PCR 반응을 통해 표적 서열을 특이적으로 증폭 검출하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명의 H5 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스를 동시에 검사하는 방법은 구체적으로, (a) 조류인플루엔자 바이러스 감염이 의심되는 동물로부터의 검체에서 RNA를 분리하는 단계; 및 (b) 상기 분리된 RNA를 대상으로, 상기 H5 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 검출용 진단 키트를 이용하여 다중 실시간 원스텝 RT-PCR 반응을 통해 표적 서열을 특이적으로 증폭 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 검체는 조류, 가축 및 인간으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 이로부터 분리된 혈액, 혈청, 혈장, 분변, 조직 등을 포함한다.
본 발명에 따르면, 당업계에서의 공지의 방법에 따라 검체에서 RNA를 추출한 다음, 추출된 RNA를 함유한 추출액에 본 발명의 프라이머/프로브 세트들로 이루어진 조성물을 포함하는 진단 키트를 이용하여 단일 튜브에서 다중 실시간 원스텝 RT-PCR을 실시한다. 증폭 및 검출의 결과는 실시간으로 확인되는데, 예를 들어 서열번호 4와 서열번호 8의 프로브들에 공통으로 표지된 형광 물질의 발광이 확인되면, 이는 검체 내에 조류인플루엔자 바이러스가 존재하며 그 아형은 H5임을 의미하고, 마찬가지 방식으로 서열번호 11과 서열번호 14의 프로브들에 공통으로 표지된 형광 물질의 발광이 확인되면, 이는 검체 내에 조류인플루엔자 바이러스가 존재하며 그 아형은 H7임을 의미한다. 즉, 검체 내의 H5 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 검출 여부와 함께 H5 또는 H7 아형에 대한 감별이 가능하다.
본 발명에서는 H5 아형 조류인플루엔자 바이러스를 특이적으로 증폭 검출할 수 있는 신규한 프라이머/프로브 세트들 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스를 특이적으로 증폭 검출할 수 있는 신규한 프라이머/프로브 세트들을 설계하고, 상기 프라이머/프로브 세트들로 이루어진 조성물 및 이를 포함하는 진단 키트를 이용하여 H5 아형 조류인플루엔자 바이러스 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스를 동시에 선택적으로 진단할 수 있음을 확인하였다. 본 발명의 조성물 및 이를 포함하는 진단 키트는 단일 튜브 내 다중 실시간 원스텝 RT-PCR 반응을 통해 경제적으로 빠르고 간편하게 검사를 할 수 있도록 구성되어 있으며, 각 아형에 대해 프라이머/프로브 2 세트씩이 작용하여 검출 시 민감도 및 커버리지를 높이는 동시에 향후 발생할 수 있는 변이에 의한 영향을 덜 받도록 제작되어 있으므로, H5 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 검출 여부 및 아형 감별에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
본 발명의 H5 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 검출용 조성물 및 이를 포함하는 진단 키트를 이용하면, 단일 튜브에서 한 번의 원스텝 RT-PCR 반응만으로 고병원성 조류인플루엔자를 일으킬 가능성이 있는 H5 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 감염 자체뿐만 아니라 상기 바이러스 아형에 대한 확인을 빠르고 간편하면서도 매우 높은 신뢰도로 동시에 검사할 수 있으므로, 조류인플루엔자 바이러스의 감염 진단과 이를 이용한 조류인플루엔자 모니터링에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 각 아형의 검출을 위해 서로 다른 위치의 프라이머/프로브 2 세트씩을 사용하는 본 발명의 H5 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 검출용 조성물 및 이를 포함하는 진단 키트를 이용하면, 검출 시 민감도 및 커버리지가 높을 뿐만 아니라 하나의 검출 부위에 문제가 생기더라도 다른 하나의 검출 부위를 통해 검출이 이루어져 향후 발생할 수 있는 변이에 의한 영향이 단일 검출 부위만을 대상으로 하는 진단 키트에 비해 상대적으로 적을 것이므로, H5 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스의 정확한 진단이 가능하다. 따라서, 본 발명을 조류인플루엔자 바이러스 정밀 진단에 적용하여 H5 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스를 신속, 정확하게 진단함으로써, 가금 산업의 피해를 최소화하고 국가 방역에 크게 기여할 수 있을 것으로 예상된다.
아울러, 상술한 효과 이외의 다양한 효과들이 후술될 본 발명의 실시예에 따른 상세한 설명에서 직접적 또는 암시적으로 개시될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 프라이머/프로브 세트들로 증폭 검출되는 H5 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 유전자 상의 검출 부위들을 표시한 도면이다.
도 2a-2f는 본 발명에 따른 각각의 프라이머/프로브 세트만을 이용한 실시간 원스텝 RT-PCR 반응 결과를 나타낸 도면이다.
도 3a-3g는 본 발명의 모든 프라이머/프로브 세트들을 혼합한 다중 올리고 혼합 조성물을 이용한 다중 실시간 원스텝 RT-PCR 반응 결과를 나타낸 도면이다.
도 4a-4j는 H5 아형 조류인플루엔자 바이러스 양성 시료들로부터의 핵산 추출액의 연속 희석액에서 본 발명의 다중 올리고 혼합 조성물의 기존 프라이머/프로브 세트와의 민감도 비교 테스트 결과를 나타낸 도면이다.
도 5a-5e는 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 양성 시료들로부터의 핵산 추출액의 연속 희석액에서 본 발명의 다중 올리고 혼합 조성물의 기존 프라이머/프로브 세트와의 민감도 비교 테스트 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 다중 올리고 혼합 조성물의 다른 아형들에 대한 특이도 테스트 결과를 나타낸 도면이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명할 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적, 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다. 한편, 본 명세서에서 사용된 용어들은 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로서, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한 복수의 표현을 포함한다.
실시예 1: H5 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 유전자 증폭 검출을 위한 프라이머 및 프로브 설계
본 발명자들은 H5 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 유전자의 증폭 검출을 위한 프라이머 및 프로브들을 설계하기 위해, 먼저 GenBank 데이터베이스로부터 2014년 이후 보고된 염기서열들을 중심으로 유라시아 계통에 속하는 H5 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스의 HA 유전자 염기서열들을 수집하였다. 이어서, 수집된 550여개의 H5 아형 조류인플루엔자 바이러스 HA 유전자 염기서열들을 H5 아형 이외 다른 아형들의 HA 유전자 염기서열들과 함께 정렬한 다음, 유전자의 3'말단 및 5'말단 부위에서 각각 H5 아형 조류인플루엔자 바이러스만 특이적으로 증폭 검출할 수 있는 프라이머/프로브 2 세트를 설계하였다(도 1). 정방향 프라이머 (forward primer)의 경우 변이에 기인한 염기서열의 다양성 때문에 민감도 및 커버리지를 높이기 위해서 프라이머/프로브 1 세트당 2개씩을 설계하였다. 또한, 수집된 250여개의 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 HA 유전자 염기서열들을 H7 아형 이외 다른 아형들의 HA 유전자 염기서열들과 함께 정렬한 다음, 유전자의 3'말단 및 5'말단 부위에서 각각 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스만 특이적으로 증폭 검출할 수 있는 프라이머/프로브 2 세트를 설계하였다 (도 1). 각 아형에 대해 프라이머/프로브 2 세트씩을 설계한 이유는 민감도 및 커버리지를 높이는 동시에 하나의 검출 부위에 문제가 생기더라도 다른 하나의 검출 부위를 통해 검출이 이루어지도록 하여 향후 발생할 수 있는 변이에 의한 영향을 덜 받도록 하기 위함이었다.
도 1은 본 발명에 따른 프라이머/프로브 세트들로 증폭 검출되는 H5 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 HA 유전자 상의 검출 부위들을 표시한 도면으로서, 각 아형 유전자에 대한 3'말단쪽 검출 부위 및 5'말단쪽 검출 부위가 증폭 산물의 예상 크기와 함께 표시되어 있다.
구체적으로, H5 아형 조류인플루엔자 바이러스 HA 유전자의 3'말단쪽 검출 부위를 위해 H5A_F1 (서열번호 1)과 H5A_F2 (서열번호 2)라는 정방향 프라이머들, H5A_R1 (서열번호 3)이라는 역방향 프라이머 (reverse primer) 및 H5A_P1 (서열번호 4)이라는 프로브가 설계되었으며; H5 아형 조류인플루엔자 바이러스 HA 유전자의 5'말단쪽 검출 부위를 위해 H5B_F3 (서열번호 5)와 H5B_F4 (서열번호 6)라는 정방향 프라이머들, H5B_R2 (서열번호 7)라는 역방향 프라이머 및 H5B_P2 (서열번호 8)라는 프로브가 설계되었으며; H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 HA 유전자의 3'말단쪽 검출 부위를 위해 H7A_F1 (서열번호 9)이라는 정방향 프라이머, H7A_R1 (서열번호 10)이라는 역방향 프라이머 및 H7A_PS (서열번호 11)라는 프로브가 설계되었으며; H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 HA 유전자의 5'말단쪽 검출 부위를 위해 H7B_F2 (서열번호 12)라는 정방향 프라이머, H7B_R2 (서열번호 13)라는 역방향 프라이머 및 H7B_P2 (서열번호 14)라는 프로브가 설계되었다 (표 1). 상기와 같이 설계된 프로브들의 합성 시 5'말단에 형광 물질을 표지시켰는데, H5A_P1 및 H5B_P2는 FAM으로 표지되었고, H7A_PS 및 H7B_P2는 LC Red 610으로 표지되었다. 또한, 프로브들의 합성 시 3'말단에 소광제를 표지시켰는데, H5A_P1 및 H5B_P2는 BHQ-1으로 표지되었고, H7A_PS 및 H7B_P2는 BHQ-2로 표지되었다.
H5 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 HA 유전자 검출용 프라이머 및 프로브
표적 아형 서열번호 이름 염기서열 및 프로브 표지 정보
H5 1 H5A_F1 AGAGAGGAAATAAGTGGRGTAA
2 H5A_F2 AGRGAAGAAATAAGCGGRGTGA
3 H5A_R1 CACATCCATAAAGATARACCAGC
4 H5A_P1 [FAM] ACCAAATACTGTCAATTTATTCAACAG [BHQ-1]
H5 5 H5B_F3 TTTGCATTGGTTAYCATGCA
6 H5B_F4 GGAGAAAATAGTGCTTCTTYTTGC
7 H5B_R2 GGGCATGTGTAACAGTRACGTT
8 H5B_P2 [FAM] GCAGGTTGACACRATAATGGA [BHQ-1]
H7 9 H7A_F1 GCTAYAAAGATGTGATACTTTGGTTTAG
10 H7A_R1 ACACATATGAAGACAAGGCCCAT
11 H7A_PS [LC Red] CATCATGTTTCATACTTCTKGCCAT [BHQ-2]
H7 12 H7B_F2 GAAAAGGACRGTTGACCTCGGT
13 H7B_R2 ARACATCACTYCCTTCTCGCCT
14 H7B_P2 [LC Red] TGGGGACRATCACTGGACCACCYCA [BHQ-2]
다음으로, 상기와 같이 설계된 프라이머/프로브 세트들의 가상 환경 분석을 수행하였다.
먼저, 예상 검출 커버리지 분석을 수행하였다. H5 아형 조류인플루엔자 바이러스 HA 유전자 검출용 프라이머/프로브 2 세트는 설계 시 사용한 데이터베이스에 대해 99.6% (염기서열 556개 중 554개 검출 가능)의 예상 검출 커버리지를 나타냈고, 농림축산검역본부의 자체 데이터베이스, 최근 국내 분리주들 및 GISAID에서 조회되는 최근 중국 분리주들을 통합한 데이터베이스에 대해서는 99.5% (염기서열 565개 중 562개 검출 가능)의 예상 검출 커버리지를 나타냈다. 또한, H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 HA 유전자 검출용 프라이머/프로브 2 세트는 설계 시 사용한 데이터베이스에 대해 100.0% (염기서열 255개 중 255개 검출 가능)의 예상 검출 커버리지를 나타냈고, 농림축산검역본부의 자체 데이터베이스, 최근 국내 분리주들 및 GISAID에서 조회되는 최근 중국 분리주들을 통합한 데이터베이스에 대해 99.8% (염기서열 991개 중 989개 검출 가능)의 예상 검출 커버리지를 나타냈다.
이어서, 예상 특이도 분석을 수행하였다. 예상 특이도 분석은 NCBI의 Blast 프로그램을 사용하여 진행되었으며, 정방향 프라이머, 역방향 프라이머, 프로브로 이루어진 각 세트별로 NCBI 데이터베이스 상에서 목적 염기서열을 제외하고 검출될 가능성이 있는 다른 염기서열이 있는지를 확인하는 방법으로 진행되었다. 그 결과, 목적 염기서열을 제외하고 검출될 가능성이 있는 다른 염기서열은 전혀 확인되지 않았으며, 이에 따라 H5 아형 조류인플루엔자 바이러스 검출용 프라이머/프로브 2 세트 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 검출용 프라이머/프로브 2 세트 모두 자신 이외 아형들에 대한 특이도에 문제가 없을 것으로 분석되었다.
실시예 2: 각 프라이머/프로브 세트별 성능 확인
상기 실시예 1에서 설계된 모든 프라이머 및 프로브들을 합성한 다음, 각 프라이머/프로브 세트별로 표적 핵산을 특이적으로 증폭 검출하는지 여부를 확인하기 위해 실시간 원스텝 RT-PCR 반응을 수행하였다. 실시간 원스텝 RT-PCR 반응을 위한 주형으로는 프라이머/프로브 세트에 따라 시험관 내 전사물 (in vitro transcript) 또는 RNA 추출액을 희석하여 사용하였다. 시험관 내 전사물은 해당 증폭 산물의 앞뒤 염기서열을 포함하여 DNA 단편을 합성한 다음 RNA로의 전사 (transcription) 과정을 통해 얻어진 것이며, RNA 추출액은 해당 조류인플루엔자 바이러스 아형 양성 시료로부터 ㈜제놀루션 NX-48 Viral NA Kit를 사용하여 추출된 것이다.
각 반응 혼합물 (15 μL)은 상기와 같이 준비된 RNA 주형 5 μL [106, 104 또는 102 카피 (copy)/5 μL], 정방향 프라이머 5 pmole, 역방향 프라이머 5 pmole, 프로브 2.5 pmole, Taq DNA 중합 효소 (Taq DNA polymerase) 1.8 U, 역전사 효소 6 U, RNA 분해 효소 억제제 3 U, 0.16 mM dNTPs, 1X 반응 완충 용액 [75 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0.3% BSA] 및 핵산 분해 효소 제거수 잔량을 포함하였다.
실시간 원스텝 RT-PCR 반응은 바이오-라드 (Bio-Rad)사의 CFX96 실시간 PCR 기기 (CFX96 Real-time PCR Detection System)를 사용하여 다음과 같은 조건에서 수행하였다: 역전사 단계 50℃ 10분; 전변성 (pre-denaturation) 단계 95℃ 10분; [변성 (denaturation) 단계 95℃ 20초 -> 어닐링/신장 (annealing/extension) 단계 60℃ 30초] X 45회. 음성 대조군의 경우, 핵산 분해 효소 제거수를 RNA 주형 대신 사용하였다.
그 결과, 본 발명의 각 프라이머/프로브 세트들은 목적하는 H5 또는 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 유전자를 특이적으로 증폭시켜서 검출할 수 있음을 확인하였다 (도 2 및 표 2).
주형 농도별 Ct값
주형 농도 (a) (b) (c) (d) (e) (f)
106카피 19.18 19.52 21.19 18.20 18.27 18.37
19.23 19.52 21.03 18.08 18.30 18.23
104카피 25.81 26.19 28.62 24.88 24.95 25.02
25.82 26.33 28.62 24.87 25.04 24.92
102카피 32.35 32.57 36.30 31.53 32.03 31.51
32.72 32.96 36.45 31.44 31.50 31.43
음성
대조군		 - - - - - -
- - - - - -
도 2는 본 발명에 따른 각각의 프라이머/프로브 세트만을 이용한 실시간 원스텝 RT-PCR 반응 결과를 나타낸 도면으로서, (a)는 H5 아형 조류인플루엔자 바이러스 유전자의 3'말단쪽 검출 부위를 위한 H5A_F1, H5A_R1 및 H5A_P1으로 구성된 프라이머/프로브 세트의 반응 결과이며; (b)는 H5 아형 조류인플루엔자 바이러스 유전자의 3'말단쪽 검출 부위를 위한 H5A_F2, H5A_R1 및 H5A_P1으로 구성된 프라이머/프로브 세트의 반응 결과이며;
(c)는 H5 아형 조류인플루엔자 바이러스 유전자의 5'말단쪽 검출 부위를 위한 H5B_F3, H5B_R2 및 H5B_P2로 구성된 프라이머/프로브 세트의 반응 결과이며; (d)는 H5 아형 조류인플루엔자 바이러스 유전자의 5'말단쪽 검출 부위를 위한 H5B_F4, H5B_R2 및 H5B_P2로 구성된 프라이머/프로브 세트의 반응 결과이며;
(e)는 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 유전자의 3'말단쪽 검출 부위를 위한 H7A_F1, H7A_R1 및 H7A_PS로 구성된 프라이머/프로브 세트의 반응 결과이며; (f)는 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 유전자의 5'말단쪽 검출 부위를 위한 H7B_F2, H7B_R2 및 H7B_P2로 구성된 프라이머/프로브 세트의 반응 결과이다.
상기 표 2 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 프라이머/프로브 세트들을 이용하면, H5 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 검출 여부 및 아형 감별 진단에 사용 가능한 조성물 및 이를 포함하는 진단 키트를 제작할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 3: 다중 올리고 혼합 조성물 구성 및 진단 키트의 제작
상기 실시예 2에서 성능이 확인된 프라이머/프로브 세트들을 모두 혼합한 다중 실시간 원스텝 RT-PCR용 다중 올리고 혼합 조성물을 구성하기 위해 조성물 내 개별 프라이머와 프로브의 양을 조정해가면서 단일 프라이머/프로브 세트와의 반응 결과 비교를 통해 다중 동시 검출에 문제가 없는 최적의 조성을 탐색하였다.
상기와 같은 방법으로 구성된 H5 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 동시 검출을 위한 다중 올리고 혼합 조성물의 최적 조성은 다중 실시간 원스텝 RT-PCR 반응당 H5A_F1 5 pmole, H5A_F2 6 pmole, H5A_R1 5 pmole, H5A_P1 5 pmole, H5B_F3 5 pmole, H5B_F4 5 pmole, H5B_R2 5 pmole, H5B_P2 5 pmole, H7A_F1 5 pmole, H7A_R1 5 pmole, H7A_PS 1.5 pmole, H7B_F2 5 pmole, H7B_R2 3.5 pmole 및 H7B_P2 3.5 pmole이 사용되도록 프라이머 및 프로브들을 혼합한 것이다.
상기 다중 올리고 혼합 조성물의 성능을 검증하기 위해 시험관 내 전사물 또는 RNA 추출액의 희석액을 주형으로 사용하여 다중 실시간 원스텝 RT-PCR 반응을 수행하였다. 각 반응 혼합물 (15 μL)은 RNA 주형 5 μL (106, 104, 102, 50 또는 20 카피/5 μL), 상기와 같이 제조된 1X 다중 올리고 혼합 조성물, Taq DNA 중합 효소 1.8 U, 역전사 효소 6 U, RNA 분해 효소 억제제 3 U, 0.16 mM dNTPs, 1X 반응 완충 용액 [75 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0.3% BSA] 및 핵산 분해 효소 제거수 잔량을 포함하였다. 다중 실시간 원스텝 RT-PCR 반응은 CFX96 실시간 PCR 기기를 사용하여 다음과 같은 조건에서 수행하였다: 역전사 단계 50℃ 10분; 전변성 단계 95℃ 10분; (변성 단계 95℃ 20초 -> 어닐링/신장 단계 62℃ 30초) X 45회. 음성 대조군의 경우, 핵산 분해 효소 제거수를 RNA 주형 대신 사용하였다.
결과는 표 3 및 도 3에 나타내었다.
주형 농도별 Ct값
주형
농도		 (a) (b) (c) (d) (e) (f) (g)
106카피 19.75 20.36 18.29 19.81 18.97 19.58 19.53
19.50 20.21 18.03 19.88 19.02 19.49 19.48
104카피 26.08 26.56 24.71 26.41 25.44 26.23 26.07
26.29 26.58 24.60 26.34 25.50 26.14 26.08
102카피 32.30 32.57 30.52 32.52 32.25 32.49 32.62
32.23 32.18 30.99 32.38 32.46 32.21 32.21
50 카피 33.23 33.25
33.55 33.42
20 카피 33.75 35.37
34.31 34.29
음성
대조군		 - -
- -
그 결과, 본 발명의 다중 올리고 혼합 조성물은 다중 실시간 원스텝 RT-PCR 반응에서 단일 프라이머/프로브 세트를 이용한 개별 실시간 원스텝 RT-PCR 반응과 거의 성능 차이 없이 H5 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 유전자를 특이적으로 증폭 검출할 수 있음을 확인하였다 (도 3 및 표 3).
따라서, 본 발명의 다중 올리고 혼합 조성물 및 이를 포함하는 진단 키트를 이용하면, H5 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 검출 여부 및 아형 감별 진단을 경제적으로 빠르고 간편하게 할 수 있음을 알 수 있었다.
도 3은 본 발명의 모든 프라이머/프로브 세트들을 혼합한 다중 올리고 혼합 조성물을 이용한 다중 실시간 원스텝 RT-PCR 반응 결과를 나타낸 도면으로서, (a)는 H5A_F1과 상보적인 염기서열이 들어있는 H5 아형 조류인플루엔자 바이러스 유전자의 3'말단쪽 검출 부위를 포함하는 시험관 내 전사물을 주형으로 사용한 반응 결과이며; (b)는 H5A_F2와 상보적인 염기서열이 들어있는 H5 아형 조류인플루엔자 바이러스 유전자의 3'말단쪽 검출 부위를 포함하는 시험관 내 전사물을 주형으로 사용한 반응 결과이며; (c)는 H5 아형 조류인플루엔자 바이러스 (GISAID EPI509704) RNA 추출액을 주형으로 사용한 반응 결과이며; (d)는 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 유전자의 3'말단쪽 검출 부위를 포함하는 시험관 내 전사물을 주형으로 사용한 반응 결과이며; (e)는 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 유전자의 5'말단쪽 검출 부위를 포함하는 시험관 내 전사물을 주형으로 사용한 반응 결과이며; (f)는 H5 아형 조류인플루엔자 바이러스 (GISAID EPI509698) RNA 추출액을 주형으로 사용한 더 낮은 농도까지의 반응 결과이며; (g)는 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 (Genbank FJ750852) RNA 추출액을 주형으로 사용한 더 낮은 농도까지의 반응 결과이다.
상기 H5 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 동시 검출을 위한 다중 올리고 혼합 조성물을 포함하는 진단 키트는 다음과 같은 3종의 구성품으로 구성되어진다: 5X 다중 올리고 혼합 조성물; Taq DNA 중합 효소, 역전사 효소 및 RNA 분해 효소 억제제를 포함하는 효소 혼합물 (enzyme mix); dNTPs 및 반응 완충 용액을 포함하는 5X 반응 완충 용액 혼합물 (buffer mix). 상기 진단 키트는 사용자의 편의를 위해 핵산 분해 효소 제거수를 포함하여 4종의 구성품으로 구성될 수도 있다.
실시예 4: 임상적 유용성 확인 - 민감도
상기 실시예 3에서 구성된 다중 올리고 혼합 조성물 및 이를 포함하는 진단 키트의 H5 또는 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 국내 분리주 및 H5 또는 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 양성으로 확인된 야외 분리주에 대한 민감도를 기존 프라이머/프로브 세트와 비교하여 확인하였다. 상기 국내외 분리주는 농림축산검역본부에서 보관 중인 것들을 사용하였으며 (표 4), RNA 핵산을 ㈜제놀루션의 NX-48 Viral NA kit를 사용하여 추출한 다음, 10배 간격으로 연속 희석하여 사용하였다.
다중 올리고 혼합 조성물 및 이를 포함하는 진단 키트를 이용한 각 반응 혼합물 (15 μL)은 RNA 주형 5 μL (RNA 추출 원액 또는 이의 연속 희석액), 5X 다중 올리고 혼합 조성물 3 μL, 효소 혼합물 1.2 μL, 5X 반응 완충 용액 혼합물 3 μL 및 핵산 분해 효소 제거수 2.8 μL를 포함하였다.
기존 프라이머/프로브 세트로는 OIE에서 권장하는 유라시아 계통 H5 아형 조류인플루엔자 바이러스 검출용 프라이머/프로브 세트 및 유라시아 계통 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 검출용 프라이머/프로브 세트를 사용하였다. 기존 프라미어/프로브 세트의 염기서열 및 프로브 표지 정보는 다음과 같다:
H5 정방향 프라이머, ACATATGACTACCCACARTATTCAG; H5 역방향 프라이머, AGACCAGCTAYCATGATTGC; H5 프로브, [FAM] TCWACAGTGGCGAGTTCCCTAGCA [BHQ-1]; H7 정방향 프라이머, GGCCAGTATTAGAAACAACACCTATGA; H7 역방향 프라이머, GCCCCGAAGCTAAACCAAAGTAT; H7 프로브, [LC Red] CCGCTGCTTAGTTTGACTGGGTCAATCT [BHQ-2].
기존 프라이머/프로브 세트를 이용한 각 반응 혼합물 (15 μL)은 RNA 주형 5 μL (RNA 추출 원액 또는 이의 연속 희석액), 정방향 프라이머 5 pmole, 역방향 프라이머 5 pmole, 프로브 4 pmole (H5 프로브의 경우) 또는 2.5 pmole (H7 프로브의 경우), Taq DNA 중합 효소 1.8 U, 역전사 효소 6 U, RNA 분해 효소 억제제 3 U, 0.16 mM dNTPs, 1X 반응 완충 용액 [75 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM MgCl2, 50 mM KCl, 0.3% BSA] 및 핵산 분해 효소 제거수 잔량을 포함하였다.
실시간 원스텝 RT-PCR 반응은 CFX96 실시간 PCR 기기를 사용하여 다음과 같은 조건에서 수행하였다: 역전사 단계 50℃ 10분; 전변성 단계 95℃ 10분; (변성 단계 95℃ 20초 -> 어닐링/신장 단계 60℃ 30초) X 45회. 형광 검출은 첫 5회를 제외하고 나머지 40회에서만 진행되었으며, Ct값은 5회를 더해 표기되었다.
민감도 실험에 사용된 분리주 정보
시료번호 분리주명 병원성 HA 유전형
(Clade)		 Gene Accession number
1 A/broiler duck/Korea/Buan2/2014(H5N8) HPAI 2.3.4.4 EPI509704
2 A/broiler duck/Korea/H1731/2014(H5N8) HPAI 2.3.4.4 EPI573221
3 A/duck/Korea/H1924/2014(H5N8) HPAI 2.3.4.4 EPI573239
4 A/mallard duck/Korea/H2102/2015(H5N8) HPAI 2.3.4.4 EPI837542
5 A/duck/Korea/ES2/2016(H5N6) HPAI 2.3.4.4 EPI866093
6 A/duck/Korea/HD1/2017(H5N6) HPAI 2.3.4.4 EPI1123317
7 A/spot-billed duck/Korea/WA696/2014(H5N3) LPAI - EPI888272
8 A/wild bird/Korea/H2016/2014(H5N3) LPAI - EPI888273
9 A/mallard/Korea/H95-4/2016(H5N3) LPAI - unpublished
10 A/mallard/Korea/A32-3/2017(H5N2) LPAI - unpublished
11 A/mandarin duck/Korea/H539-3/2016(H7N7) LPAI - EPI1226587
12 A/mallard/Korea/H982-6/2017(H7N7) LPAI - EPI1226507
13 A/duck/Japan/AQ-HE28-3/2016(H7N9) LPAI - EPI1564434
14 A/duck/Japan/AQ-HE29-22/2017(H7N9) HPAI - EPI1075315
15 A/duck/Japan/AQ-HE29-52/2017(H7N9) HPAI - EPI1140614
그 결과, 본 발명의 다중 올리고 혼합 조성물 및 이를 포함하는 진단 키트는 기존 프라이머/프로브 세트 대비 동등 이상의 높은 민감도를 나타냄을 확인하였다. 구체적으로 H5 아형 조류인플루엔자 바이러스 양성 시료 10개 중 5개에서 본 발명의 다중 올리고 혼합 조성물 및 이를 포함하는 진단 키트가 상대적으로 더 좋은 결과를 나타냈으며 (도 4 및 표 5), H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 양성 시료 5개 중 4개에서 본 발명의 다중 올리고 혼합 조성물 및 이를 포함하는 진단 키트가 상대적으로 더 좋은 결과를 나타냈다 (도 5 및 표 6). 따라서, 본 발명의 다중 올리고 혼합 조성물 및 이를 포함하는 진단 키트를 이용하면, H5 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 검출 여부 및 아형 감별 진단을 상당히 정확하게 할 수 있음을 알 수 있었으며, 각 아형에 대해 프라이머/프로브 2 세트씩을 사용하는 것의 긍정적인 영향을 간접적으로 알 수 있었다.
도 4는 H5 아형 조류인플루엔자 바이러스 양성 시료들로부터의 핵산 추출액의 연속 희석액에서 본 발명의 다중 올리고 혼합 조성물의 기존 프라이머/프로브 세트와의 민감도 비교 테스트 결과를 나타낸 도면으로서, 각 핵산 추출액의 연속 희석액들 중 마지막 2개씩의 결과만을 나타낸 것이다. 도 4에서 (a)는 시료 1에 대한 비교 결과이며; (b)는 시료 2에 대한 비교 결과이며; (c)는 시료 3에 대한 비교 결과이며; (d)는 시료 4에 대한 비교 결과이며; (e)는 시료 5에 대한 비교 결과이며; (f)는 시료 6에 대한 비교 결과이며; (g)는 시료 7에 대한 비교 결과이며; (h)는 시료 8에 대한 비교 결과이며; (i)는 시료 9에 대한 비교 결과이며; (j)는 시료 10에 대한 비교 결과로서, (a) 내지 (j)에 있어 상단의 그래프는 다중 올리고 혼합 조성물을 이용한 결과이며, 하단의 그래프는 기존 프라이머/프로브 세트를 이용한 결과이다.
주형 농도별 Ct값
주형 농도 조성물 기존 세트 주형 농도 조성물 기존 세트
- (a) - (b)
10-7 33.17 35.83 10-6 33.54 36.91
32.92 36.14 33.35 36.16
10-8 37.32 37.25 10-7 - -
41.78 38.83 - -
- (c) - (d)
10-6 32.44 35.62 10-6 33.09 35.68
32.79 36.06 33.16 34.79
10-7 35.68 - 10-7 38.39 38.44
37.11 38.33 37.28 41.83
- (e) - (f)
10-7 33.38 38.32 10-5 32.70 33.04
33.20 37.02 33.08 32.67
10-8 37.30 - 10-6 36.45 35.97
35.76 - 38.26 37.25
- (g) - (h)
10-5 31.38 36.11 10-5 31.98 36.27
31.36 35.96 31.76 36.14
10-6 42.95 - 10-6 35.61 37.26
34.07 - 34.71 -
- (i) - (j)
10-5 - - 10-5 32.07 32.20
34.17 - 32.05 31.84
10-6 - - 10-6 34.61 35.47
- - 35.25 34.97
도 5는 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 양성 시료들로부터의 핵산 추출액의 연속 희석액에서 본 발명의 다중 올리고 혼합 조성물의 기존 프라이머/프로브 세트와의 민감도 비교 테스트 결과를 나타낸 도면으로서, 각 핵산 추출액의 연속 희석액들 중 마지막 2개씩의 결과만을 나타낸 것이다. 도 5에서 (a)는 시료 11에 대한 비교 결과이며; (b)는 시료 12에 대한 비교 결과이며; (c)는 시료 13에 대한 비교 결과이며; (d)는 시료 14에 대한 비교 결과이며; (e)는 시료 15에 대한 비교 결과로서, (a) 내지 (e)에 있어 상단의 그래프는 다중 올리고 혼합 조성물을 이용한 결과이며, 하단의 그래프는 기존 프라이머/프로브 세트를 이용한 결과이다.
주형 농도별 Ct값
주형 농도 조성물 기존 세트 주형 농도 조성물 기존 세트
- (a) - (b)
10-7 35.04 - 10-7 35.54 41.69
34.41 44.79 35.98 -
10-8 - - 10-8 - -
39.78 - - -
- (c) - (d)
10-6 33.58 37.26 10-6 31.95 32.68
33.52 36.43 32.41 33.03
10-7 36.46 - 10-7 34.58 35.54
35.87 39.08 36.40 36.76
- (e) -
10-7 35.49 35.16
34.37 35.12
10-8 36.77 -
- -
실시예 5: 임상적 유용성 확인 - 특이도
상기 실시예 3에서 구성된 다중 올리고 혼합 조성물 및 이를 포함하는 진단 키트의 H5 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 이외 다른 아형들에 대한 특이도를 확인하였다. H5 및 H7 아형 각 2주를 포함하여 조류인플루엔자 바이러스 총 32주를 사용하였다 (표 7). 각 반응 혼합물 (15 μL)은 조류인플루엔자 바이러스 양성 시료로부터 추출된 RNA 주형 5 μL, 5X 다중 올리고 혼합 조성물 3 μL, 효소 혼합물 1.2 μL, 5X 반응 완충 용액 혼합물 3 μL 및 핵산 분해 효소 제거수 2.8 μL를 포함하였다. 다중 실시간 원스텝 RT-PCR 반응은 CFX96 실시간 PCR 기기를 사용하여 다음과 같은 조건에서 수행하였다: 역전사 단계 50℃ 10분; 전변성 단계 95℃ 10분; (변성 단계 95℃ 20초 -> 어닐링/신장 단계 60℃ 30초) X 45회.
그 결과, 본 발명의 다중 올리고 혼합 조성물 및 이를 포함하는 진단 키트는 목적하는 아형들 이외 다른 아형들에 대한 특이도에 전혀 문제가 없음을 확인하였다 (도 6 및 표 7). 따라서, 민감도 테스트 결과와 함께 종합적으로 볼 때, 본 발명의 다중 올리고 혼합 조성물 및 이를 포함하는 진단 키트를 이용하면, H5 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 검출 여부 및 아형 감별 진단을 매우 높은 신뢰도를 가지고 할 수 있음을 알 수 있었다.
도 6은 본 발명의 다중 올리고 혼합 조성물의 다른 아형들에 대한 특이도 테스트 결과를 나타낸 도면이다. 양성 대조군으로 사용된 시료 11, 12, 17 및 18을 제외하고는 증폭 신호가 확인되지 않는다.
특이도 실험에 사용된 분리주 정보 및 양성 대조군 Ct값
시료번호 분리주명 HA 혈청아형 H5 검출 채널 Ct값 H7 검출 채널 Ct값 Gene Accession number
1 A/mallard/Korea/WA167/2019(H1N1) H1 - - unpublished
2 A/mallard/Korea/H227/2018(H1N2) H1 - - unpublished
3 A/spot-billed duck/Korea/H232/2018(H1N3) H1 - - unpublished
4 A/spot-billed duck/Korea/H002/2019(H2N1) H2 - - unpublished
5 A/mallard/Korea/H215/2018(H2N2) H2 - - unpublished
6 A/spot-billed duck/Korea/H301-5/2018(H3N1) H3 - - unpublished
7 A/mallard/Korea/A46/2016(H3N2) H3 - - unpublished
8 A/mallard/Korea/H407-2/2016(H4N5) H4 - - unpublished
9 A/duck/Korea/H027/2019(H4N6) H4 - - unpublished
10 A/oriental turtle dove/Korea/H281-1/2018(H4N8) H4 - - unpublished
11 A/eurasian wigeon/Korea/WA228CL/2019(H5N1) H5 LPAI 27.43 - unpublished
12 A/mallard/Korea/H95-4/2016(H5N3) H5 LPAI 23.82 - unpublished
13 A/common teal/Korea/WA719/2018(H6N2) H6 - - unpublished
14 A/white-fronted goose/Korea/H256/2018(H6N5) H6 - - unpublished
15 A/spot-billed duck/Korea/H277/2018(H6N6) H6 - - unpublished
16 A/mallard/Korea/T107-9/2016(H6N8) H6 - - unpublished
17 A/mallard/Korea/WB1192/2010(H7N4) H7 LPAI - 17.46 unpublished
18 A/duck/Korea/H337/2018(H7N5) H7 LPAI - 17.38 unpublished
19 A/duck/Korea/H001/2019(H8N4) H8 - - unpublished
20 A/chicken/Korea/04164/2004(H9N8)　 H9 - - unpublished
21 A/mallard/Korea/H037/2019(H10N3) H10 - - unpublished
22 A/spot-billed duck/Korea/H298/2018(H10N4) H10 - - unpublished
23 A/mallard/Korea/H206/2018(H10N5) H10 - - unpublished
24 A/spot-billed duck/Korea/H299-1/2018(H11N2) H11 - - unpublished
25 A/mallard/Korea/WA266/2016(H11N3) H11 - - unpublished
26 A/duck/England/1956(H11N6) H11 - - EPI242283
27 A/duck/Korea/H034/2019(H11N9) H11 - - unpublished
28 A/spot-billed duck/Korea/H310/2018(H12N2) H12 - - unpublished
29 A/duck/Alberta/60/1976(H12N5) H12 - - EPI744935
30 A/environment/Korea/H1237/2014(H13N8) H13 - - unpublished
31 A/mallard/Gurjev/263/1982(H14N5) H14 - - EPI129967
32 A/shearwater/Australia/2576/1979(H15N9)　 H15 - - EPI129343
<110> REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Real-time PCR Diagnostic Kit for Simultaneous Detection of H5 and H7 Subtype Avian Influenza Virus <130> PN190297 <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H5A_F1 <400> 1 agagaggaaa taagtggrgt aa 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H5A_F2 <400> 2 agrgaagaaa taagcggrgt ga 22 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H5A_R1 <400> 3 cacatccata aagataracc agc 23 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H5A_P1 <400> 4 accaaatact gtcaatttat tcaacag 27 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H5B_F3 <400> 5 tttgcattgg ttaycatgca 20 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H5B_F4 <400> 6 ggagaaaata gtgcttctty ttgc 24 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H5B_R2 <400> 7 gggcatgtgt aacagtracg tt 22 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H5B_P2 <400> 8 gcaggttgac acrataatgg a 21 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H7A_F1 <400> 9 gctayaaaga tgtgatactt tggtttag 28 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H7A_R1 <400> 10 acacatatga agacaaggcc cat 23 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H7A_PS <400> 11 catcatgttt catacttctk gccat 25 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H7B_F2 <400> 12 gaaaaggacr gttgacctcg gt 22 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H7B_R2 <400> 13 aracatcact yccttctcgc ct 22 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H7B_P2 <400> 14 tggggacrat cactggacca ccyca 25

Claims (12)

  1. 다음을 포함하는 H5 아형 조류인플루엔자 바이러스의 표적서열 검출용 조성물:
    (a) 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머, 또는 이들의 조합; 및 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프라이머; 또는
    (b) 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 프라이머, 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프라이머, 또는 이들의 조합; 및 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 프라이머;
    또는 이들의 조합.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (a)는 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 프로브를 추가적으로 포함하고, 상기 (b)는 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 프로브를 추가적으로 포함하는, 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 프로브들은 동일한 표지자로 표지된 것인, 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항의 조성물을 포함하는 H5 아형 조류인플루엔자 바이러스 유전자 검사용 진단 키트.
  5. 다음을 포함하는 H5 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스의 표적서열 검출용 조성물:
    (a) 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 프라이머, 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 프라이머, 또는 이들의 조합; 및 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프라이머; 또는
    (b) 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 프라이머, 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프라이머, 또는 이들의 조합; 및 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 프라이머;
    또는 이들의 조합, 및
    (c) 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 프라이머; 또는
    (d) 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 13의 염기서열로 표시되는 프라이머;
    또는 이들의 조합.
  6. 제5항에 있어서, 상기 (a)는 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 프로브를 추가적으로 포함하고, 상기 (b)는 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 프로브를 추가적으로 포함하며, 상기 (c)는 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 프로브를 추가적으로 포함하고, 상기 (d)는 서열번호 14의 염기서열로 표시되는 프로브를 추가적으로 포함하는, 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 (a)와 (b)에 추가되는 프로브들은 제1 표지자로 표지된 것이고, 상기 (c)와 (d)에 추가되는 프로브들은 제2 표지자로 표지된 것이며, 상기 제1 표지자와, 제2 표지자는 서로 다른 것인, 조성물.
  8. 제5항 내지 제7항의 조성물을 포함하는 H5 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 유전자 검사용 진단 키트.
  9. 제8항에 있어서, 상기 진단 키트는 H5 아형 조류인플루엔자 바이러스 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스를 단일 튜브 내에서 동시 검출하는 것인, 진단 키트.
  10. (a) 검체에서 RNA를 분리하는 단계; 및
    (b) 상기 분리된 RNA를 대상으로, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 조성물 또는 진단 키트를 이용하여 다중 실시간 원스텝 RT-PCR 반응을 통해 표적 서열을 특이적으로 증폭 검출하는 단계를 포함하는 H5 아형 조류인플루엔자 바이러스 동시 검사 방법.
  11. (a) 검체에서 RNA를 분리하는 단계; 및
    (b) 상기 분리된 RNA를 대상으로, 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항의 조성물 또는 진단 키트를 이용하여 다중 실시간 원스텝 RT-PCR 반응을 통해 표적 서열을 특이적으로 증폭 검출하는 단계를 포함하는 H5 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 동시 검사 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 (b) 단계의 검출 결과, 제1 표지자의 신호가 확인되면 H5 아형 조류인플루엔자 바이러스의 유전자가 검출된 것으로 판정하고, 제2 표지자의 신호가 확인되면 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스의 유전자가 검출된 것으로 판정하는 것인, H5 및 H7 아형 조류인플루엔자 바이러스 동시 검사 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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