KR20230118752A - 주요 유전형의 감별이 가능한 돼지 인플루엔자 진단용 키트 및 진단 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 주요 유전형의 감별이 가능한 돼지 인플루엔자 진단용 키트 및 진단 방법에 관한 것이다. 본 발명의 돼지인플루엔자 바이러스 진단용 조성물 및 이를 포함하는 진단용 키트를 이용하는 경우, 돼지 인플루엔자의 민감한 검출 및 주요 유전형의 감별이 가능하여 인플루엔자 팬데믹에 대비하여 효과적인 돼지 인플루엔자의 예찰이 가능하다.
Description
본 발명은 주요 유전형의 감별이 가능한 돼지 인플루엔자 진단용 키트 및 진단 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 인플루엔자의 M, NA, HA 및 NS 유전자를 이용하여 돼지인플루엔자, 신종 인플루엔자, EA 인플루엔자, 및 G4를 감별하기 위한 유전자 진단용 키트, 유전자 진단 방법에 관한 것으로, 종래의 진단법과 비교하여 프라이머/프로브가 상이하고 민감도 및 특이도가 개선되었으며, 인플루엔자 팬데믹에 대비하여 효과적인 돼지 인플루엔자의 예찰이 가능하다.
현재까지 동물 인플루엔자가 종간전파를 통해 사람에 있어 팬데믹을 일으킨 사례는 총 4회로 알려져 있는데, 이중 3회는 조류 인플루엔자, 1회는 2009년 돼지 신종 인플루엔자(H1N1 pdm09)에 의한 팬데믹이었다. 당시 우리나라 농식품부는 인수공통전염병임을 사유로 돼지 H5, H7 및 신종 인플루엔자 A(H1N1)를 가축전염병예방법 상 제2종 가축전염병으로 지정하여 관리하였으며, 또한 검역본부는 산업체 공동연구를 통해 돼지 인플루엔자 RT-PCR법을 개발하여 보급한 바 있었다. 그러나 최근 이 키트를 사용시 i) H1N1의 경우 국내 바이러스가 변이됨에 따라 오진이 발생할 가능성 증가하였고, ii) 국내 발생 돼지 인플루엔자의 유전형이 H1N1 이외에도 H1N2와 H3N2가 있으나 subtyping이 불가능한 문제가 있었다.
특히, 2020년 6월 30일 중국에서는 2011∼2018년 도축장 등에서 3만건의 시료 중 검출된 179개의 돼지 인플루엔자 바이러스를 분리하여 분석한 결과, 2016년 이후 Eurasian avain-like(EA) H1N1 6가지 genotype중 G4의 검출율이 높아졌다는 연구결과가 발표된 바 있었다(Sun et al., 2020). 이에 따라 인플루엔자 EA H1N1 G4가 사람에 팬데믹을 일으킬 가능성이 높다고 제시하여 이를 모니터링할 필요성이 크게 제기되고 있다.
본 발명자들은 주요 유전형의 감별이 가능한 돼지 인플루엔자 진단용 키트를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 본 발명의 키트를 이용하면 돼지인플루엔자, 신종 인플루엔자, EA 인플루엔자, 및 인플루엔자 EA H1N1 G4를 정확하면서도 신속하게 감별진단할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 유전형의 감별진단이 가능한 돼지인플루엔자 바이러스 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 돼지인플루엔자 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물 또는 키트를 이용하여 돼지 인플루엔자 진단 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 용어, "돼지 인플루엔자"는 A형 인플루엔자 바이러스가 주원인체로서 다른 세균이나 바이러스와 더불어 돼지 호흡기 질병 증후군(PRDC, Porcine Respiratory Disease Complex)을 일으키는 것으로 알려져 있다. 특히, 돼지는 조류와 사람의 인플루엔자 A 바이러스와 결합하는 수용체를 모두 가지고 있어 이러한 새로운 재조합을 만들어낼 수 있는 혼합 용기(mixing vessels) 역할을 할 수 있다고 알려져 있다. 잠복기는 1~3일, 임상증상은 5~7일 그리고 바이러스 배출이 24시간 이내 시작되어 7~10일간 지속되는 것으로 보고되었다(OIE disease card). 돼지인플루엔자는 1918년 미국, 헝가리 및 중국에서 최초 보고 후 1930년 미국에서 최초 분리되었다. 우리나라를 포함하여 전세계적으로 주요하게 발생하는 아형(subtype)은 H1N1, H1N2 및 H3N2형 이다. 2009년 사람 신종인플루엔자 A(H1N1 pdm09)의 돼지 감염이 확인되면서 국내·외 모니터링과 연구가 강화되었고, 국내 돼지에서는 가축전염병예방법 상 신종 인플루엔자 A(H1N1), H5 및 H7 아형 바이러스는 제2종 가축전염병으로 관리되고 있다. 최근 중국에서 유라시아 조류 유사 (Eurasian avian like) EA H1N1 G4형이 보고되었으며, G4 H1N1은 사람 수용체에 잘 결합하고, 사람의 기도 상피 세포에서 잘 증식하며, 페렛 모델에서도 잘 감염되고 관련 업계 종사자에서 항체가가 높은 점을 들어 유행병(pandemic)으로 발전할 가능성이 높다고 보고되는 등 인수공통전염병으로서 공중보건학적으로 매우 중요한 질병이다.
본 발명자들은 상술한 돼지 인플루엔자 바이러스의 예찰을 위한 돼지인플루엔자 진단용 조성물 및 진단 키트를 개발하기 위하여, 2009년 팬데믹 이후 보고된 염기서열을 중심으로 유라시아, 북아메리카 지역의 재조합 돼지인플루엔자 바이러스 및 국내 분리 돼지인플루엔자 바이러스의 염기서열을 중심으로 M, HA, NA, NS 유전자들을 각각 정렬(Sequence alignment)하고, 비교함으로써, 각 유전형을 가진 돼지인플루엔자 바이러스를 특이적으로 증폭 검출할 수 있는 프라이머/프로브 세트를 설계하였다. 이때, 각 유전형에 대해서 필요한 경우에는 2개 이상의 forward 및/또는 reverse primer와 그에 상응하는 probe를 설계함으로써, 검출시의 민감도 및 커버리지를 높이도록 하였다.
이어서, 설계된 프라이머/프로브 세트를 합성한 다음 각 세트별로 실시간 PCR 반응에서 잘 작동하는지 확인하고 총 6종의 키트를 구성하였으며, 국내 분리주, 야외 임상 시료 및 표준 시료를 이용하여 높은 민감도를 확인하였으며, 다른 바이러스나 세균에는 교차반응성이 없어 특이도가 높음을 확인하였다.
구체적으로 상술한 프라이머 및 프로브의 설계 전략은 다음과 같은 사실을 기초로 검토되었다.
상기 도면에 나타낸 바와 같이, EA H1N1 G4는 8개의 유전자 중 ① PB2, PB1, PA, NP유전자의 경우 신종인플루엔자 A(H1N1, pdm09) 유래, ② HA, NA 유전자의 경우 EA 유래, ③ NS 유전자의 경우 TRA(Triple-ReAssortant) 유래인 것을 기초로 하기 표 1에 나타낸 바와 같은 전략을 검토하였다.
| Virus | A(common) | B(pdm09 H1N1) | C(H1 특이) | D(G4 확인) | ||
| M | M | NA | HA(Pig) | HA(EA) | NS(TRA) | |
| 1. pdm09가 아닌 SIV | ○ | Х | Х | ○ | Х | - |
| 2. pdm09 | ○ | ○ | ○ | ○ | Х | Х |
| 3. EA G1 | ○ | Х | Х | Х | ○ | Х |
| 4. EA G2 | ○ | Х | Х | Х | ○ | Х |
| 5. EA G3 | ○ | Х | Х | Х | ○ | ○ |
| 6. EA G4 | ○ | ○ | Х | Х | ○ | ○ |
| 7. EA G5 | ○ | Х | Х | Х | ○ | ○ |
| 8. EA G6 | ○ | Х | Х | Х | ○ | ○ |
먼저 상기와 같이, 돼지 인플루엔자의 주요 유전형 감별과 EA H1N1 G4 및 신종인플루엔자A(H1N1) 유전자를 감별 할 수 있는 민감도 높은 qRT-PCR 시스템 개발을 위하여 유전적 정보 수집 및 분석하고, 주요 유전형별로 유전정보 확보 및 진단 타겟 부위를 비교 분석한 후, 적합한 프라이머/프로브를 설계한다. 돼지 인플루엔자 바이러스의 유전자형별 표준바이러스 양성 패널을 구축하고 설계된 프라이머/프로브 세트의 반응성을 평가한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 돼지인플루엔자 바이러스 진단용 조성물을 제공한다:
(a) 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인플루엔자 M 유전자 검출용 프라이머, 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인플루엔자 M 유전자 검출용 프라이머.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 M 유전자 검출용 프로브를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 프라이머 및/또는 프로브는, pandemic influenza A/H1N1 2009, 유전형 G1 내지 G4의 돼지인플루엔자의 M 유전자를 검출하는 것이다.
또한, 본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 상기 조성물은 다음을 추가적으로 포함한다:
(b) 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 NA 유전자 검출용 프라이머, 및 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 NA 유전자 검출용 프라이머.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 NA 유전자 검출용 프로브를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 (a), (b) 프라이머 및/또는 프로브는, 신종 인플루엔자 A(H1N1)의 NA 유전자를 검출하는 것이다.
본 발명의 다른 구체적인 구현예에 있어서, 가검물에 포함된 바이러스가 신종인플루엔자 A(H1N1)인 경우에는 본 발명의 (a) 및 (b)를 포함하는 조성물을 이용하여 검출하였을 때 M 유전자 및 NA 유전자가 모두 검출된다.
또한, 본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 상기 조성물은 다음을 추가적으로 포함한다:
(c) 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HA 유전자 검출용 프라이머, 및 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HA 유전자 검출용 프라이머.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 상기 조성물은 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HA 유전자 검출용 프로브를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 프라이머 및/또는 프로브는, 유라시아 조류-유사 H1N1 인플루엔자(Eurasian avian-like H1N1, EA H1N1)의 HA 유전자를 검출하는 것이다.
본 발명의 다른 구체적인 구현예에 있어서, 가검물에 포함된 바이러스가 유라시아 조류-유사 H1N1 인플루엔자(Eurasian avian-like H1N1, EA H1N1)인 경우에는 본 발명의 (a) 및 (c)를 포함하는 조성물을 이용하여 검출하였을 때 본 발명의 조성물을 이용하여 검출하였을 때 M 유전자 및 HA 유전자가 모두 검출된다.
또한, 본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 상기 조성물은 다음을 추가적으로 포함한다:
(d) 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HA 유전자 검출용 프라이머, 및 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HA 유전자 검출용 프라이머.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 상기 조성물은 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HA 유전자 검출용 프로브를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 프라이머 및/또는 프로브는, 신종 인플루엔자 A(H1N1)의 HA 유전자를 검출하는 것이다.
본 발명의 다른 구체적인 구현예에 있어서, 가검물에 포함된 바이러스가 신종 인플루엔자 A(H1N1)인 경우에는 본 발명의 (a) 및 (d)를 포함하는 조성물을 이용하여 검출하였을 때 M 유전자, 및 HA 유전자가 모두 검출된다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 가검물에 포함된 바이러스가 신종 인플루엔자 A(H1N1)인 경우에는 본 발명의 (a), (b) 및 (d)를 포함하는 조성물을 이용하여 검출하였을 때 M 유전자, NA 유전자 및 HA 유전자가 모두 검출된다.
또한, 본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 상기 조성물은 다음을 추가적으로 포함한다:
(e) 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 NS 유전자 검출용 프라이머, 및 서열번호 13의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 NS 유전자 검출용 프라이머.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 상기 조성물은 서열번호 14의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 NS 유전자 검출용 프로브를 추가적으로 포함한다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 가검물에 포함된 바이러스가 G4 유전형의 돼지인플루엔자 바이러스인 경우에는 본 발명의 (a) 및 (e)를 포함하는 조성물을 이용하여 검출하였을 때 M 유전자, 및 NS 유전자가 모두 검출된다.
본 발명의 다른 구체적인 구현예에 있어서, 가검물에 포함된 바이러스가 EA H1N1 G4 유전형의 돼지인플루엔자 바이러스인 경우에는 본 발명의 (a), (c) 및 (e)를 포함하는 조성물을 이용하여 검출하였을 때 M 유전자, HA 및 NS 유전자가 모두 검출된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 상술한 일 구현예에 따른 상기 조성물 중 (a), (b), (c), (d), (e), 또는 이들의 조합의 구성에 상응하는 프로브들은 서로 동일하거나 상이한 표지자로 표지된다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 돼지인플루엔자 바이러스 검출을 위한 조성물의 조성은 실시간 원스텝 RT-PCR 반응당 프라이머에 해당하는 각 서열번호의 염기서열을 포함하는 뉴클레오타이드를 2-8 pmole, 또는 3-9 pmole로 포함하고, 프로브에 해당하는 각 서열번호의 핵산을 0.5-4.5 pmole의 농도로 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 보다 구체적인 구현예에 있어서, 상기 돼지인플루엔자 바이러스 검출을 위한 조성물의 조성은 실시간 원스텝 RT-PCR 반응당 프라이머에 해당하는 각 서열번호의 뉴클레오타이드를 5 pmole, 프로브에 해당하는 각 서열번호의 뉴클레오타이드를 1.5 pmole 또는 3.5 pmole 이 사용되도록 프라이머 및 프로브들을 혼합한 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "다중 실시간 원스텝 RT-PCR (multiplexed real-time one-step RT-PCR)"은 각각의 의미를 가지는 PCR, RT-PCR, 원스텝 RT-PCR, 실시간 (RT-)PCR 및 다중 (RT-)PCR의 총합을 의미한다. 각각의 의미를 살펴보면, PCR은 DNA의 특정 영역을 시험관 내에서 대량으로 증폭하는 기술을 의미하며, RT-PCR은 시험관 내에서 RNA를 DNA로 역전사시킨 다음, 이렇게 만들어진 상보적 DNA (complementary DNA; cDNA)의 특정 영역을 대량으로 증폭하는 기술을 의미한다. 원스텝 RT-PCR은 cDNA를 만드는 역전사 과정과 cDNA의 특정 영역을 대량으로 복제하는 증폭 과정이 하나의 시험관 내에서 이루어지는 것을 의미하고, 실시간 (RT-)PCR은 특정 영역 증폭의 결과가 실시간으로 모니터링되는 것을 의미하며, 다중 (RT-)PCR은 한 번의 반응 수행으로 동시에 2개 이상의 다른 특정 영역들을 대량으로 증폭하는 것을 의미한다. 다중 실시간 원스텝 RT-PCR을 통해 경제적으로 빠르고 간편하게 인플루엔자 바이러스 검출 여부 및 감별 진단을 할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "프라이머 (primer)"는 주형 (template) 핵산에 상보적으로 결합하여 합성을 위한 시발점으로 기능하는 자유 3'-수산화기 (free 3'-hydroxyl group)를 가지는 짧은 핵산 단편을 의미한다. 프라이머는 적절한 반응 완충 용액 (buffer) 및 온도에서 중합 반응을 위한 효소 [DNA 중합 효소 (DNA polymerase), 역전사 효소 (reverse transcriptase) 등] 및 상이한 4가지 데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트 (deoxynucleoside triphosphates; dNTPs)의 존재 하에서 주형에 상보적인 가닥의 합성을 개시할 수 있는데, 프라이머 길이 및 반응 조건 등은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다. 프라이머는 필요할 경우 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있으며, 표지의 예로는 효소, 방사선 동위원소, 형광성 분자, 화학 그룹 등이 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "프로브 (probe)"는 혼성화 (hybridization)에 의해 상보적인 목적 핵산 서열의 존재를 검출하는데 사용되어지는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 DNA 또는 RNA 핵산 단편을 의미하는데, 올리고뉴클레오티드 프로브, 단일 가닥 DNA 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 프로브는 해당 염기서열의 5'과 3'말단에 각각 검출에 이용되는 표지자를 포함할 수 있으며, 이러한 표지자로는 형광단 (fluorophore)과 소광체 (quencher)가 각각 5'과 3'말단에 표지될 수 있다. 이에 따라, 프로브에 형광단과 소광체가 서로 결합한 형태로 존재할 때에는 상호 간섭에 의해 발광이 억제되고, PCR 반응 등을 통해 프로브의 분해가 이루어지면 프로브에 표지된 형광단과 소광체 간의 간섭이 사라져 발광을 하게 된다. 상기 5'말단에 표지될 수 있는 형광단은 당업계에서 통상적으로 사용되는 형광 물질이 제한 없이 사용될 수 있는데, 예를 들면 플루오레세인 (Fluorescein), 6-카르복시플루오레세인 (6-Carboxyfluorescein; FAM), 핵사클로로-6-카르복시플루오레세인 (Hexachloro-6-carboxyfluorescein; HEX), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인 (Tetrachloro-6-carboxyfluorescein), VIC, JOE, 5-(2'-아미노에틸)아미노 나프탈렌-1-술폰산 (5-(2'-Aminoethyl)amino naphthalene-1-sulfonic acid), 쿠마린 (Coumarin) 및 이의 유도체, 시아닌-5 (Cyanine-5; Cy5), 텍사스 레드 (Texas Red), 테트라메틸로다민 (Tetramethylrhodamine), 칼 플루오르 레드 610 (CAL Fluor Red 610), 엘씨 레드 610 (LC Red 610) 등이 사용될 수 있다. 상기 3'말단에 표지될 수 있는 소광체 또한 당업계에서 통상적으로 사용되는 소광제가 제한 없이 사용될 수 있는데, 예를 들면 테트라메틸로다민, 6-카르복시테트라메틸로다민 (6-Carboxytetramethylrhodamine), BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, 4-다이메틸아미노페닐아조페닐-4'-말레이미드 (4-Dimethylaminophenylazophenyl-4'-maleimide) 등이 사용될 수 있다. 이처럼 형광 물질이 표지된 프로브를 사용하여 실시간 (RT-)PCR을 수행하면, 증폭된 산물을 실시간으로 모니터링할 수 있고, DNA 및 RNA의 정량이 가능하며, 전기영동이 필요 없어 빠르고 간편하게 정확한 진단이 가능하다는 장점을 갖는다.
상기 프라이머 및 프로브는 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입하는 것이 가능하다. 즉, 본 발명에서 목적으로 하는 돼지인플루엔자 바이러스를 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당업계에 공지된 통상적인 수단을 이용하여 프라이머 및 프로브가 변형될 수 있다.
본 명세서에서는 프라이머 및 프로브의 염기서열을 나타냄에 있어 국제 생화학 연합 (International Union of Biochemistry; IUB) 중의성 코드 (ambiguity code)를 사용하였다. 염기서열에서 A는 아데닌 (adenine)을, C는 시토신 (cytosine)을, G는 구아닌 (guanine)을, T는 티민 (thymine)을, R은 아데닌과 구아닌 둘 다 가능한 자리를, Y는 시토신과 티민 둘 다 가능한 자리를, K는 구아닌과 티민 둘 다 가능한 자리를 나타낸다. 이는 본 명세서의 모든 염기서열을 제시하는 데에 있어 동일하게 적용되었다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 조성물 중 (a), (b), (c), (d), (e), 또는 이들의 조합을 포함하는 돼지인플루엔자 바이러스 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명은 상술한 조성물 중 (a), (b), (c), (d), (e), 또는 이들의 조합에 상응하는 프로브를 추가적으로 포함하는 돼지인플루엔자 바이러스 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 돼지인플루엔자 바이러스는 신종인플루엔자 A(H1N1), 유라시아 조류-유사 H1N1 인플루엔자(Eurasian avian-like H1N1, EA H1N1), 또는 G4 유전형의 돼지인플루엔자 바이러스, EA H1N1 G4 유전형의 돼지인플루엔자 바이러스이다.
본 발명의 진단 키트는 상술한 각종 돼지인플루엔자 바이러스의 감염 여부 확인 및 유전형 감별을 경제적으로 빠르고 간편하게 수행하기 위한 다중 실시간 원스텝 RT-PCR 진단 키트로서, 상기 조성물에 포함되는 1 이상의 프라이머 및 프로브 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있다.
구체적인 일례로서, 본 발명의 진단 키트는 역전사 반응 및 PCR 분석을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. 상기 진단 키트는 각 검출 부위에 대한 특이적인 각각의 프라이머/프로브 세트 외에도 돼지인플루엔자 바이러스 RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사 효소, cDNA의 특정 영역을 대량으로 증폭하기 위한 DNA 중합 효소, 반응 완충 용액, dNTPs, RNA 분해 효소 억제제 (RNase inhibitor), 멸균수, 테스트 튜브 또는 다른 적절한 용기 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 각 테스트 튜브에 포함되는 성분들로는, 이에 국한되지 않지만, 돼지인플루엔자 바이러스 동시 검사를 위한 다중 올리고 혼합 조성물, DNA 중합 효소, 역전사 효소, RNA 분해 효소 억제제, dATP, dCTP, dGTP, dTTP, Tris-HCl, MgCl2, KCl, BSA, 핵산 분해 효소 제거수 (nuclease-free water) 등이 있으며, 특정 반응을 위해 사용되는 성분 또는 반응물의 최적량은 당업자에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 진단키트를 이용하여 시료 중의 1종 또는 2종 이상의 돼지인플루엔자 바이러스를 동시에 검사하는 방법을 제공한다.
구체적으로 본 발명의 상기 돼지인플루엔자 바이러스를 검사하는 방법은,
(a) 검체에서 RNA를 분리하는 단계; 및 (b) 상기 분리된 RNA를 대상으로, 상술한 본 발명의 일 양태에 따른 조성물 또는 진단키트를 이용하여 실시간 RT-PCR 반응을 통해 표적 서열을 특이적으로 증폭 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 검체는 조류, 가축 및 인간으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 이로부터 분리된 혈액, 혈청, 혈장, 분변, 조직 등을 포함한다.
본 발명에 따르면, 당업계에서의 공지의 방법에 따라 검체에서 RNA를 추출한 다음, 추출된 RNA를 함유한 추출액에 본 발명의 프라이머/프로브 세트들로 이루어진 조성물을 포함하는 진단 키트를 이용하여 단일 튜브에서 다중 실시간 원스텝 RT-PCR을 실시한다. 증폭 및 검출의 결과는 실시간으로 확인되는데, 예를 들어 본 발명의 프로브들에 공통으로 표지된 형광 물질의 발광이 확인되면, 이는 검체 내에 돼지인플루엔자 바이러스가 존재하며 그 유전형을 확인할 수 있다. 즉, 검체 내의 돼지인플루엔자 바이러스 존재 여부와 함께 유전형에 대한 감별이 가능하다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 돼지인플루엔자 바이러스 진단용 조성물 및 이를 포함하는진단용 키트를 제공한다:
(i) 본 발명의 돼지인플루엔자 바이러스 진단용 조성물 및 이를 포함하는 진단용 키트를 이용하는 경우, 돼지 인플루엔자의 민감한 검출 및 주요 유전형의 감별이 가능하여 인플루엔자 팬데믹에 대비하여 효과적인 돼지 인플루엔자의 예찰이 가능하다.
도 1은 신종플루, 2016-2019년에 동정된 SIV, G2, G4, G1, G3, G5, G6의 인플루엔자의 M 유전자를 얼라인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 신종 인플루엔자(H1N1), N2 유전형을 가진 돼지인플루엔자, G1 내지 G6 유전형의 유라시아 돼지인플루엔자의 NA 유전자를 얼라인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 Eurasian avian-like(EA) H1N1과 신종인플루엔자 A(H1N1)의 HA 유전자를 얼라인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 EA H1N1 G4 유전형을 확인하기 위하여 G3, G4, G5, G6의 북아메리카 재조합 인플루엔자 바이러스, G1 유전형의 유라시아 인플루엔자 바이러스, G2 유전형의 신종플루 바이러스 등의 NS 유전자를 얼라인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 H1 또는 H3 유전형을 가진 돼지인플루엔자 바이러스의 HA 유전자를 얼라인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 N1 유전형을 가진 돼지인플루엔자 바이러스의 NA 유전자를 얼라인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 N2를 비롯한 다양한 유전형을 가진 돼지인플루엔자 바이러스의 NA 유전자를 얼라인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8 내지 도 12는 본 발명의 실시예 1 내지 실시예 5에서 선발된 primer/probe의 반응성 및 검출한계 평가 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 야외 시료(폐 시료: 50개)를 이용한 기존 진단 키트와 본 발명의 개발된 진단키트의 효능을 비교하여 나타낸 도이다.
도 14 및 도 15는 본 발명의 돼지인플루엔자 진단용 키트의 조류(H5, H7, H9), 개(H3N2), 또는 말(H3N8) 인플루엔자 바이러스와 간섭 가능성을 확인하기 위하여 in silico 분석을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 신종 인플루엔자(H1N1), N2 유전형을 가진 돼지인플루엔자, G1 내지 G6 유전형의 유라시아 돼지인플루엔자의 NA 유전자를 얼라인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 Eurasian avian-like(EA) H1N1과 신종인플루엔자 A(H1N1)의 HA 유전자를 얼라인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 EA H1N1 G4 유전형을 확인하기 위하여 G3, G4, G5, G6의 북아메리카 재조합 인플루엔자 바이러스, G1 유전형의 유라시아 인플루엔자 바이러스, G2 유전형의 신종플루 바이러스 등의 NS 유전자를 얼라인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 H1 또는 H3 유전형을 가진 돼지인플루엔자 바이러스의 HA 유전자를 얼라인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 N1 유전형을 가진 돼지인플루엔자 바이러스의 NA 유전자를 얼라인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 N2를 비롯한 다양한 유전형을 가진 돼지인플루엔자 바이러스의 NA 유전자를 얼라인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8 내지 도 12는 본 발명의 실시예 1 내지 실시예 5에서 선발된 primer/probe의 반응성 및 검출한계 평가 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 야외 시료(폐 시료: 50개)를 이용한 기존 진단 키트와 본 발명의 개발된 진단키트의 효능을 비교하여 나타낸 도이다.
도 14 및 도 15는 본 발명의 돼지인플루엔자 진단용 키트의 조류(H5, H7, H9), 개(H3N2), 또는 말(H3N8) 인플루엔자 바이러스와 간섭 가능성을 확인하기 위하여 in silico 분석을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
본 발명자들은 돼지 인플루엔자의 주요 유전형을 감별할 수 있고, 최근 유행하는 EA H1N1 G4 및 신종인플루엔자 A(H1N1)의 검출을 위한 진단법을 개발하고자 하였다.
실시예 1: 돼지 인플루엔자 양성 여부 확인을 위한 공통 M gene과 신종인플루엔자(NF)에 특이적인 NA gene을 검출하기 위한 Primer/probe 디자인 및 선발
실시예 1-1. M gene 내에서 신종인플루엔자 특이적 primer/probe 디자인 및 선발
도 1은 신종 인플루엔자, 2016-2019년에 동정된 SIV, G2 및 G4 유전형의 신종 인플루엔자, G1, G3, G5 및 G6 유전형의 유라시아 돼지인플루엔자의 M 유전자를 얼라인한 결과를 나타낸 도이다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 상기 얼라인먼트를 통하여 상기다양한 돼지인플루엔자들을 공통적으로 검출할 수 있는 Forward/Reverse 프라이머 및 프로브를 도출하였다.
실시예 1-2. NA gene 내에서 신종인플루엔자A(H1N1) 특이적 primer/probe 디자인 및 선발
도 2는 신종 인플루엔자(H1N1), N2 유전형을 가진 돼지인플루엔자, G1 내지 G6 유전형의 유라시아 돼지인플루엔자의 NA 유전자를 얼라인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 상기 얼라인먼트를 통하여 신종인플루엔자(H1N1)의 N1 유전자를 특이적으로 검출할 수 있는 Forward/Reverse 프라이머 및 프로브를 도출하였다.
상기와 같이, Alignment 분석결과를 토대로 신종인플루엔자 A(H1N1)에 특이적인 M gene과 NA gene을 target으로 하여 신종인플루엔자 A일 경우 두 gene이 모두 증폭되도록 프라이머 및 프로브를 디자인하였다. 결과는 하기 표 2에 나타내었다.
| 구분 | Name | Oligo name (5'-3') | Target gene | Size | 서열번호 |
| SIV NF (M/NA) |
J1972F | GGCTAGCACTACGGCAAA | M | 18 | 1 |
| J1973R | GCTAGGATGAGTCCCAATAGT | M | 21 | 2 | |
| J2044P | FAM-ATGGAGGTTGCTAATYAGACTAGGC-BHQ1 | M | 25 | 3 | |
| J1945F | GAACGGATGGACTGGGACAGA | NA | 21 | 4 | |
| J1946R | CAATCCAGCCCTGTTAGTTCT | NA | 21 | 5 | |
| J1947P | FAM-AGTGGTCAGGATATAGCGGGAGT-BHQ1 | NA | 23 | 6 |
실시예 2: HA 유전자 내에서 Eurasian avian-like(EA) H1N1과 신종인플루엔자 A(H1N1) 구분을 위한 primer/probe 디자인 및 선발
본 발명자들은 HA 유전자 내에서 Eurasian avian-like(EA) H1N1과 신종인플루엔자 A(H1N1) 구분을 위한 프라이머 및 프로브를 선발하고자 다음과 같이 HA 유전자를 얼라인하고, 적합한 영역을 선택하였다.
도 3은 Eurasian avian-like(EA) H1N1과 신종인플루엔자 A(H1N1)의 HA 유전자를 얼라인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 상기 얼라인먼트를 통하여 HA 유전자 내에서 Eurasian avian-like(EA) H1N1과 신종인플루엔자 A(H1N1)를 구분할 수 있는 각각의 forward primer와 probe 를 아래와 같이 디자인하였다. 이때 EA H1N1과 신종 인플루엔자 A (H1N1)의 HA 유전자를 검출하는 reverse primer는 공유하여 동일하게 사용하였다.
결과는 표 3에 나타내었다.
| 구분 | Name | Oligo name (5'-3') | Target gene | Size | 서열번호 |
| SIV HA (EA/NF) |
J1961F | AGATTTTGGCGATCTACTCCAC | HA(EA) | 22 | 7 |
| J1962R | GACCCATTAGARCACATCCA | HA(EA/NF) | 20 | 8 | |
| J1964P | FAM-CCAGTTCCCTGGTCTTRTTAGTCTC-BHQ1 | HA(EA) | 25 | 9 | |
| J1960F | AGATTTTGGCGATCTATTCAAC | HA(NF) | 22 | 10 | |
| J1963P | Cy5-CCAGTTCATTGGTACTGGTAGTCTC-BHQ2 | HA(NF) | 25 | 11 |
실시예 3: EA H1N1 G4 확인을 위한 G4 검출용 primer/probe 디자인 및 선발
도 4는 EA H1N1 G4 유전형을 확인하기 위하여 G3, G4, G5, G6의 북아메리카 재조합 인플루엔자 바이러스, G1 유전형의 유라시아 인플루엔자 바이러스, G2 유전형의 신종플루 바이러스 등의 NS 유전자를 얼라인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 상기 G2 내지 G6 유전형을 가진 북아메리카 재조합 인플루엔자 바이러스의 NS 유전자의 얼라인먼트를 통하여 EA G4 유전형을 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머와 프로브를 디자인 하였다.
결과는 표 4에 나타내었다.
| 구분 | Name | Oligo name (5'-3') | Target gene | Size | 서열번호 |
| SIV TR(NS) | J1965F | TACCTACTTCGCGCTACATA | NS | 20 | 12 |
| J1966R | CCTGGTCCATTCGAACACAA | NS | 20 | 13 | |
| J1967P | FAM-CCTCGAGGARATGTCACGAGACTG-BHQ1 | NS | 24 | 14 |
실시예 4: HA 유전자(H1/H3) subtyping용 primer/probe 디자인 및 선발
도 5는 H1 또는 H3 유전형을 가진 돼지인플루엔자 바이러스의 HA 유전자를 얼라인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 상기 H1 또는 H3 유전형을 가진 돼지인플루엔자 바이러스에서 H1 또는 H3으로 HA 유전자의 서브타이핑이 가능하도록 프라이머 및 프로브를 디자인하였다.
결과는 표 5에 나타내었다.
| 구분 | Name | Oligo name (5'-3') | Target gene | Size | 서열번호 |
| SIV HA (H1/H3) |
J1960F | AGATTTTGGCGATCTATTCAAC | HA(H1) | 22 | 15 |
| J1989F | AGATTTTGGCGATCTACTCYAC | HA(H1) | 22 | 16 | |
| J1962R | GACCCATTAGARCACATCCA | HA(H1) | 20 | 17 | |
| J1994R | GACCCATTGGARCACATCCA | HA(H1) | 20 | 18 | |
| J1992F | GGATTCTGTCGATCTACTCAAC | HA(H1) | 22 | 19 | |
| J1993F | ATATYCTGGCGATCTACTCAAC | HA(H1) | 22 | 20 | |
| J1990P | FAM-CCAGTTCATTGGTACTGKTAGTCTC-BHQ1 | HA(H1) | 25 | 21 | |
| J1991P | FAM-TAGTCTCYCTGGGGGCAATCAGCT-BHQ1 | HA(H1) | 24 | 22 | |
| J1995F | TATGGATTTCCTTTGCCAYATCA | HA(H3) | 23 | 23 | |
| J1996R | ATTAATGCAYTCAAATGCAAATGTT | HA(H3) | 25 | 24 | |
| J1997P | CY5-CTAATGTTGCCYTTTTGGCAGGCCC-BHQ2 | HA(H3) | 25 | 25 |
실시예 5: NA유전자(N1/N2) subtyping용 primer/probe 디자인 및 선발
실시예 5-1. N1 특이적 primer/probe 디자인 및 선발
도 6은 N1 유전형을 가진 돼지인플루엔자 바이러스의 NA 유전자를 얼라인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 돼지인플루엔자 바이러스에서 N1으로 서브타이핑이 가능하도록 프라이머 및 프로브를 디자인 하였다.
실시예 5-2. N2 특이적 Oligo design alignment
도 7은 N2를 비롯한 다양한 유전형을 가진 돼지인플루엔자 바이러스의 NA 유전자를 얼라인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 돼지인플루엔자 바이러스에서 N2으로 서브타이핑이 가능하도록 프라이머 및 프로브를 디자인 하였다.
결과는 표 6에 나타내었다.
| 구분 | Name | Oligo name (5'-3') | Target gene | Size | 서열번호 |
| SIV NA (N1/N2) |
J1998F | CAGCATATCYTTTTGTGGTGT | N1 | 21 | 26 |
| J1999F | AGCGGAAGCAGCATTTCTTTYTGTG | N1 | 25 | 27 | |
| J2000R | TACTTGTCAATGGTRAATGGCA | N1 | 22 | 28 | |
| J2001P | FAM- TGGTCTTGGCCAGACGGTGCTGAG-BHQ1 | N1 | 24 | 29 | |
| J2002P | FAM-CTGGTCRTGGCCAGACGGAGCTGAT-BHQ1 | N1 | 25 | 30 | |
| J2003F | AAGTCTGGTGGACHTCAAACA | N2 | 21 | 31 | |
| J2006F | AGTATGGTGGACCTCAAAYAGTA | N2 | 23 | 32 | |
| J2004R | GCTTATATAGGCATGADATTGAT | N2 | 23 | 33 | |
| J2005P | Cy5-TGGAACAGGCTCATGGCCTGATGG-BHQ1 | N2 | 24 | 34 |
실시예 6: 선발된 primer/probe의 반응성 및 검출한계 평가
본 발명자들은 상기 실시예 1 내지 5에서 선발된 primer/probe의 반응성 및 검출한계를 평가하기 위하여 하기 표 7에 나타낸 바와 같은 돼지인플루엔자 바이러스 시료를 사용하였다.
| 구분 | 시료이름 | 아형 |
| 1 | 신종인플루엔자 A(H1N1, 2019년 분리주) | H1N1 |
| 2 | 신종인플루엔자 A(H1N1, 2011년 분리주) | H1N1 |
| 3 | 돼지인플루엔자(2018년 분리주) | H1N2 |
| 4 | 돼지인플루엔자(2011년 분리주) | H3N2 |
| 5 | 신종인플루엔자 A(H1N1, 2009년 분리주) | H1N1 |
| 6 | A/sw/Kor/Can01/2004(백신주) | H1N1 |
| 7 | A/sw/Kor/경남05K1(백신주) | H1N2 |
| 8 | A/sw/kor/can04/2005(백신주) | H3N2 |
상기 실시예 1 내지 5에서 선발한 primer/probe를 이용하기 위한 qRT-PCR 조건은 표 8에 나타내었다.
선발된 primer/probe의 반응성 및 검출한계 평가 결과는 도 8 내지 도 12에 나타내었다.
선발된 primer와 probe를 이용하여 상기 표 6에 나타낸 돼지인플루엔자 8개의 표준주를 검사한 결과, 검출용으로 적합한 것으로 판단되었으며, 해당 oligo 조합으로 plasmid DNA를 이용하여 이론적 검출한계를 확인한 결과, 1 copy/ul까지 각각 검출이 가능함을 확인하였다.
실시예 7: 시제품 제작 및 진단 키트 효능 평가
실시예 7-1. 시제품 제작
본 발명자들은 상기 표 1 내지 5에 나타낸 primer/probe 세트를 이용하여, 아래의 표 9와 같은 구성의 시제품을 총 6종 제작하여 돼지인플루엔자 국내분리주 및 야외시료에서 효능 평가를 수행하였다.
| 유전형 | NS-SIV-31(M) | NS-SIV-32 NF(M/NA) | NS-SIV-33 HA(EA/NF) | NS-SIV-34 NS(TR) |
NS-SIV-35 HA(H1/H3) | NS-SIV-36 NA(N1/N2) | ||||
| Common | M | NA | EA | NF | NS(TR) | H1 | H3 | N1 | N2 | |
| H1N1 | + | +/- | +/- | +/- | +/- | +/- | + | - | + | - |
| H1N2 | + | +/- | +/- | +/- | +/- | +/- | + | - | - | + |
| H3N2 | + | +/- | +/- | +/- | +/- | +/- | - | + | - | + |
| Newflu | + | + | + | - | + | - | + | - | + | - |
| G4 | + | + | - | + | - | + | + | - | + | - |
실시예 7-2. 진단 키트의 효능 평가
1) 국내 분리주에서 제작된 진단 키트 효능 평가
본 발명자들은 '09년~'20년 국내분리주(총 50주※)를 대상으로 제작된 진단 키트의 효능평가를 실시하였다.
※ H1N1(10주), 신종인플루엔자(20주), H1N2(10주), H3N2(10주)
결과는 표 10에 나타내었다.
| 구분 | 키트 | 양성두수 | ||||
| H1N1(10) | 신종인플루 엔자(20) |
H1N2(10) | H3N2(10) | |||
| 기존 키트 | 공통 | common M RT-PCR | 10 | 20 | 10 | 10 |
| 신종 | Newflu M RT-PCR | 8 | 20 | 7 | 4 | |
| 개발 키트 | 공통 | M qRT-PCR | 10 | 20 | 10 | 10 |
| 신종 & G4 |
NF, EA MP qRT-PCR (NF qRT-PCR, HA qRT-PCR, NS qRT-PCR) |
0※ | 20※ | 0※ | 0※ | |
| 아형 분류 | MP qRT-PCR (H1, H3) | 10(H1) | 20(H1) | 10(H1) | 0 | |
| MP qRT-PCR (N1, N2) | 10(N1) | 20(N1) | 10(N2) | 10(N2) | ||
※ NF, EA MP qRT-PCR (신종 H1N1과 G4 검출키트로 3종류 qRT-PCR 분석 후 최종 판단)
※※ NF: New Flu, MP: Multi-Plex
표 10에 나타낸 바와 같이, 기존의 common M RT-PCR 키트의 경우 50주 모두 양성이었으며, Newflu M RT-PCR 키트의 경우 신종인플루엔자 외에 H1N1 8주, H1N2 7주, H3N2 4주 역시 양성으로 검출하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 기존의 키트로는 신종 인플루엔자를 정확하게 측정할 수 없다는 점을 확인할 수 있었다.
또한, 상기 표 10에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들에 의해 개발된 진단 키트는 기존 키트보다 의양성을 줄이고 subtyping이 가능함을 확인하였다. 구체적으로 기존 키트는 민감도 100%, 특이도 37% 였으나, 본 발명의 개발된 키트는 민감도 100%, 특이도 100% 였다.
2) 돼지 인플루엔자 감염 의심 야외 시료(비즙)을 이용한 진단 키트 효능 평가
본 발명자들은 또한 2021년 수집된 돼지 인플루엔자 감염 의심 야외 시료(비즙) 44점(충북 음성군 소재 4개 농장)과 야외 시료에서 분리된 돼지 인플루엔자 바이러스 2주(H1N2)를 대상으로 개발된 진단 키트의 효능을 평가하였다.
결과는 표 11에 나타내었다.
| 구분 | 키트 | 양성두수 | Real-time PCR | |||
| 야외 시료(46) | Ct값 | IPC값 | ||||
| 기존 키트 | 공통 | common M RT-PCR | 46 | - | - | |
| 신종 | NewfluM RT-PCR | 6 | - | - | ||
| 개발 키트 | 공통 | M qRT-PCR | 15 | 12.6~32.8 | 25.6~29.4 | |
| 신종 & G4 |
NF qRT-PCR | M gene(FAM) | 15 | 15.1~33.7 | 23.5~25.8 | |
| NA gene(Cy5) | 0 | - | ||||
| HA qRT-PCR | Eurasian(FAM) | 14 | 14.1~32.1 | 23.4~25.7 | ||
| 신종인플루엔자(Cy5) | 0 | - | ||||
| (G4) NS qRT-PCR | NS gene(FAM) | 0 | - | 23.3~25.5 | ||
| 아형 분류 | MP qRT-PCR | H1(FAM) | 15 (1개 의양성) |
15.2~33.8 | 22.6~23.7 | |
| H2(Cy5) | 0 | - | ||||
| MP qRT-PCR | N1(FAM) | 1(의양성) | 14.8~32.5 | 23.9~26.0 | ||
| N2(Cy5) | 12 | - | ||||
표 11에 나타낸 바와 같이, 기존의 common M RT-PCR 키트의 경우 46개 모두 양성으로 확인되었다. 그러나, 개발된 common M qRT-PCR 키트는 기존 키트의 결과 중 46개 중 31개가 의양성이었고, 실제로는 음성(양성은 15개)이라는 점을 확인하였다.
또한, 기존의 Newflu M RT-PCR 키트의 경우, 6개를 신종인플루엔자 A(H1N1) 양성으로 검출하였다. 그러나, 본 발명의 신종 인플루엔자 진단 키트에서는 기존 키트의 6개가 모두 의양성이었고, 실제로는 전부 음성이라는 점을 확인함으로써 본 발명의 신규 키트는 기존의 키트에 비하여 신종 인플루엔자의 의양성 검출율을 현저하게 낮추었다는 점을 알 수 있었다.
또한, 본 발명의 신규 키트의 M 유전자가 양성으로 나타난 15개의 subtyping 결과 12개에서 H1N2인점을 확인하였다(3개는 subtyping 확인 불가).
3) 야외 시료(폐 시료: 50개)에서 시제품 평가
본 발명자들이 소속된 농림축산검역본부 질병진단과에 2021년에 의뢰가 들어온 돼지 폐 시료(50개)를 이용하여 야외 시료에서의 시제품의 효능을 평가하였다.
결과는 표 12에 나타내었다.
| 구분 | 키트 | 야외 시료(50) | |||
| 양성 | 음성 | ||||
| 기존 키트 | 공통 | Common M RT-PCR | 25 | 25 | |
| 개발 키트 | 공통 | M qRT-PCR | 25 | 25 | |
| 신종 & G4 |
NF qRT-PCR | M gene(FAM) | 6 | 0 | |
| NA gene(Cy5) | 11 | 0 | |||
| HA qRT-PCR | Eurasian(FAM) | 0 | 0 | ||
| Newflu(Cy5) | 8 | 0 | |||
| (G4) NS qRT-PCR |
NS gene(FAM) | 10 | 0 | ||
| 아형 분류 | MP qRT-PCR | H1(FAM) | 20 | 0 | |
| H3(Cy5) | 5 | 0 | |||
| MP qRT-PCR | N1(FAM) | 10 | 0 | ||
| N2(Cy5) | 15 | 0 | |||
표 12에 나타낸 바와 같이, 상기 야외 시료(폐 시료: 50개)를 이용한 기존 진단 키트와 개발된 진단키트의 효능을 구체적으로 확인한 결과는 도 13에 나타내었다.
그 결과, 돼지인플루엔자가 25개 양성으로 확인이 되었고 신종 인플루엔자/G4는 음성으로 확인된 바 있었다. 또한, 상기 돼지인플루엔자 양성(25개)을 subtyping 한 결과 H1N1(10), H1N2(10), H3N2(5)으로 최종 확인되었다.
또한, 상기 양성시료 25개를 확인한 결과 신종인플루엔자 시퀀스가 여러 gene에 삽입되어 있음을 확인하였으며, G4는 확인되지 않았다.
4) 개발 키트의 표준 시료에서 특이도 및 정확도 평가
본 발명자들은 표준 시료로 분리주 50주 및 양성시료(폐시료) 25점에 대한 시제품 평가를 수행하였다
결과는 표 13에 나타내었다.
| 구분 | 키트 | 표준 시료(분리주 50주 및 양성시료 25점) | |||
| H1N1(10) | Newflu(20) | H1N2(10) | H3N2(10) | ||
| 공통 | M qRT-PCR | 20 | 20 | 20 | 15 |
| 신종 & G4 |
NF, EA MP qRT-PCR (NF qRT-PCR, HA qRT-PCR, NS qRT-PCR) |
0 | 20 | 0 | 0 |
| 아형 분류 | MP qRT-PCR (H1, H3) | 20(H1) | 20(H1) | 20(H1) | 15(H3) |
| MP qRT-PCR (N1, N2) | 20(N1) | 20(N1) | 20(N2) | 15(N2) | |
표 13에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 개발키트는 특이도 100%, 정확도 100%인 것으로 확인되었다.
5) 개발한 돼지인플루엔자 subtyping primer & probe의 in silico 분석
본 발명자들은 본 발명의 개발된 돼지인플루엔자 subtyping kit의 primer를 HA gene 및 NA gene에서 in silico 분석한 결과를 도 14 및 도 15에 나타내었다.
도 14 및 도 15에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 돼지인플루엔자 진단용 키트는 조류(H5, H7, H9)와 개(H3N2), 말(H3N8) 인플루엔자 바이러스와 간섭 가능성이 없으며 돼지 인플루엔자 특이적이라는 확인하였다.
6) 개발한 돼지인플루엔자 subtyping primer & probe의 특이도 분석
본 발명자들은 본 발명의 개발된 돼지인플루엔자 진단용 키트가 돼지에서 전염성 질병을 일으키는 바이러스 원인체 (11종), 세균성 원인체 (14종)을 대상으로 비특이 반응을 나타내는지 여부를 확인하였다.
각각의 바이러스 원인체, 세균성 원인체는 다음과 같았다.
바이러스 원인체: CSFV(Classical Swine Fever Virus, 돼지열병바이러스), PRRSV(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, 돼지생식기호흡 기증후군바이러스), PCV2(Porcine Circovirus 2, 돼지써코바이러스 2형), PEDV(Porcine Epidemic Diarrhea Virus, 돼지유행성설사바이러스), TGEV(Transmissinble Gastroenteritis Virus, 전염성위장염바이러스), PPV (Porcine Parvovirus, 돼지파보바이러스), ADV (Aujesky Virus, 오제스키바이러 스), JEV(Japanese Encephalitis Virus, 일본뇌염바이러스), EMCV (Encephalomyocarditis Virus 뇌심근염 바이러스), PDCoV(Porcine Deltacoronavirus, 돼 지델타코로나바이러스), PCV3(Porcine Circovirus 3, 돼지써코바이러스 3형).
세균성원인체: ST(Salmonella Typhimurium, 살모넬라감염증), SEP(swine enzootic pneumonia, 돼지유행성폐렴), Hps(Haemophilus parasuis, 글래스병), Pm(Pasteurella multocida, 파스튜렐라폐렴), App(Actinobacillus pleuropneumoniae, 흉막폐렴), S. suis(Streptococcus suis, 연쇄상구균감염증), CpA(Clostridium perfringens A, 클로스트리디움 퍼프린젠스 A), Law(Lawsonia intracellularis, 로소 니아), SD(Swine Dysentery, 돼지적리), SE(Swine Erysipelas, 돼지단독), Cd(Clostridium difficile, 클로스트리디움 디피실), A. suis(Actinobacillus suis), S. hyicus(Staphylococcus hyicus, 삼출성 표피염).
이와 같이, 본 발명자들은 2009년 신종인플루엔자 A(H1N1)의 유행으로 바이러스질병과 전신성질병연구실에서 산업체공동연구로 개발한 conventional RT-PCR을 국내 돼지 인플루엔자 유행주 변이에 따라 real-time RT-PCR로 개량하고, 그간 국내 유행하는 아형(H1N1, H1N2 및 H3N2)을 감별할 수 있는 HA(H1, H3) 및 NA(N1, N2) subtyping real-time RT-PCR을 개발하였다.
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major genotypes of Swine influenza virus
<130> PN210559
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<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<220>
<223> SIV NA (N1/N2) J2005P
<400> 34
tggaacaggc tcatggcctg atgg 24
Claims (21)
- 다음을 포함하는 돼지인플루엔자 바이러스 진단용 조성물:
(a) 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인플루엔자 M 유전자 검출용 프라이머, 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 인플루엔자 M 유전자 검출용 프라이머.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 M 유전자 검출용 프로브를 추가적으로 포함하는 것인, 돼지인플루엔자 바이러스 진단용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 pandemic influenza A/H1N1 2009, 유전형 G1 내지 G4의 돼지인플루엔자의 M 유전자를 검출하기 위한 것인, 돼지인플루엔자 바이러스 진단용 조성물.
- 제1항에 있어서, 하기 (b)를 추가적으로 포함하는 돼지인플루엔자 바이러스 진단용 조성물:
(b) 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 NA 유전자 검출용 프라이머, 및 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 NA 유전자 검출용 프라이머.
- 제4항에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 NA 유전자 검출용 프로브를 추가적으로 포함하는 것인, 돼지인플루엔자 바이러스 진단용 조성물.
- 제4항에 있어서, 상기 (b)는 신종 인플루엔자 A(H1N1)의 NA 유전자를 검출하는 것인, 돼지인플루엔자 바이러스 진단용 조성물.
- 제1항에 있어서, 하기 (c)를 추가적으로 포함하는 돼지인플루엔자 바이러스 진단용 조성물:
(c) 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HA 유전자 검출용 프라이머, 및 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HA 유전자 검출용 프라이머.
- 제7항에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 9의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HA 유전자 검출용 프로브를 추가적으로 포함하는 것인, 돼지인플루엔자 바이러스 진단용 조성물.
- 제8항에 있어서, 상기 (c)는 유라시아 조류-유사 H1N1 인플루엔자(Eurasian avian-like H1N1, EA H1N1)의 HA 유전자를 검출하는 것인, 돼지인플루엔자 바이러스 진단용 조성물.
- 제1항에 있어서, 하기 (d)를 추가적으로 포함하는 돼지인플루엔자 바이러스 진단용 조성물:
(d) 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HA 유전자 검출용 프라이머, 및 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HA 유전자 검출용 프라이머.
- 제10항에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 11의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 HA 유전자 검출용 프로브를 추가적으로 포함하는 것인, 돼지인플루엔자 바이러스 진단용 조성물.
- 제10항에 있어서, 상기 (d)는 신종 인플루엔자 A(H1N1)의 HA 유전자를 검출하는 것인, 돼지인플루엔자 바이러스 진단용 조성물.
- 제10항에 있어서, 상기 조성물은 신종 인플루엔자 A(H1N1)의 M 유전자, 및 HA 유전자를 검출하는 것인, 돼지인플루엔자 바이러스 진단용 조성물.
- 제1항에 있어서, 하기 (e)를 추가적으로 포함하는 돼지인플루엔자 바이러스 진단용 조성물:
(e) 서열번호 12의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 NS 유전자 검출용 프라이머, 및 서열번호 13의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 NS 유전자 검출용 프라이머.
- 제14항에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 14의 염기서열로 표시되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 NS 유전자 검출용 프로브를 추가적으로 포함하는 것인, 돼지인플루엔자 바이러스 진단용 조성물.
- 제14항에 있어서, 상기 조성물은 G4 유전형의 돼지인플루엔자 바이러스의 M 유전자, 및 NS 유전자를 검출하는 것인, 돼지인플루엔자 바이러스 진단용 조성물.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 돼지인플루엔자 바이러스 진단용 키트.
- 다음 단계를 포함하는 1종 또는 2종 이상의 돼지인플루엔자 바이러스를 검사하는 방법:
(a) 검체에서 RNA를 분리하는 단계; 및
(b) 상기 분리된 RNA를 대상으로, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 진단용 조성물을 이용하여 실시간 RT-PCR 반응을 통해 표적 서열을 특이적으로 증폭 검출하는 단계.
- 제18항에 있어서, 상기 검체는 조류, 가축 또는 인간으로부터 분리된 것인, 방법.
- 제19항에 있어서, 상기 검체는 혈액, 혈청, 혈장, 분변, 또는 조직인, 방법.
- 다음 단계를 포함하는 1종 또는 2종 이상의 돼지인플루엔자 바이러스를 검사하는 방법:
(a) 검체에서 RNA를 분리하는 단계; 및
(b) 상기 분리된 RNA를 대상으로, 제17항의 진단용 키트를 이용하여 실시간 RT-PCR 반응을 통해 표적 서열을 특이적으로 증폭 검출하는 단계.
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- 2022-02-04 KR KR1020220015129A patent/KR20230118752A/ko not_active Application Discontinuation
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| E902 | Notification of reason for refusal |