CN110643687A

CN110643687A - 一种srda等温核酸扩增试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN110643687A
Application number: CN201911134821.3A
Authority: CN
Inventors: 李泓彦; 邓春兴; 李荣华; 刘涛涛; 吴玉峰
Original assignee: Shenzhen Ai Weidi Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Ai Weidi Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2019-11-19
Filing date: 2019-11-19
Publication date: 2020-01-03

Abstract

本发明提供了一种SRDA等温核酸扩增试剂盒及其应用，所述试剂盒包括蛋白组合物，所述蛋白组合物包括recA重组酶、Ago蛋白、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶，所述试剂盒还包括逆转录酶，通过加入Ago蛋白，显著提高了等温扩增效率，通过加入逆转录酶，实现了对DNA和RNA的通用检测，本发明的试剂盒检测特异性好，灵敏度高，扩增DNA的灵敏度达50copies/μL，扩增RNA的灵敏度达100copies/μL，具有极高的理论价值和临床应用价值。

Description

一种SRDA等温核酸扩增试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，涉及一种SRDA等温核酸扩增试剂盒及其应用。

背景技术

目前，常用的核酸检测方法主要包括经典PCR、实时荧光定量PCR、基因芯片和等温核酸扩增技术等。其中，经典PCR作为核酸检测的金标准，应用范围最广、使用时间最长，是各种新兴的核酸检测方法的基础，但是存在特异性不足和易污染等问题；实时荧光定量PCR是在经典PCR的基础上发展起来的能够实时监测PCR进程的核酸扩增方法，特异性和灵敏度均优于经典PCR，近年来已经成为核酸诊断行业应用最广泛的一种核酸定量技术，但是该方法的扩增时间较长，一般需要约1.5h，而且需要配合价格昂贵的检测设备，不利于其在经济欠发达地区或非实验室条件下的应用。

随着核酸检测技术的进一步发展，等温核酸扩增技术得到了研究人员的广泛关注，逐渐发展出了包括环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、实时荧光等温扩增检测技术(Simultaneous Amplification and Testing，SAT)和重组酶聚合酶等温扩增技术((Recombinase Polymerase Amplification，RPA)在内的多种等温核酸扩增技术。其中，LAMP和SAT虽然不再依赖于昂贵的检测仪器，但是操作较复杂，扩增时间仍然需要大约1小时；RPA作为公认的检测时间最短、操作最便捷的等温核酸扩增技术，不依赖于笨重和昂贵的荧光定量检测设备，反应时间只需5～20min，已成为国内外研究的热点。

RPA技术最先由英国Twist DX公司推出，目前市面上销售的产品主要以英国TwistDX公司的RPA等温核酸检测试剂盒和中国杭州众测生物技术有限公司生产的RAA等温核酸扩增检测试剂盒为主，但是，他们的试剂盒在进行DNA和RNA检测时需要采用2套不同的体系，同时，对于RNA的扩增灵敏度较低，只能达到约1000copies/μL。

CN 105525040 A公开了快速检测猪2型圆环病毒的实时荧光RPA试剂盒、试纸条RPA试剂盒及其用途，该两种试剂盒分别包括SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2所示的引物及各自的探针，虽然针对同一靶标序列，但引物和探针的修饰碱基和检测平台不同，实验证明本发明的两个试剂盒的敏感性均为10²拷贝/反应，并均只能特异性检测猪2型圆环病毒，检测结果与qPCR的符合度均为100％，所述的两个试剂盒均能快捷、高效、灵敏的检测猪2型圆环病毒，为猪2型圆环病毒的鉴别诊断提供了有效技术手段，但是所述试剂盒采用试纸条的方法，通过条带的亮度进行结果判定，这样对于结果的判定容易因实验人员主观原因导致误判。

CN 107828913 A公开了对虾白斑综合症(WSSV)的RAA恒温荧光检测方法及试剂盒，检测试剂盒包括一条正向引物SEQ ID NO.1、一条反向引物SEQ ID NO.2、一条特异性荧光探针SEQ ID NO.3、反应液、重组聚合酶和对照品；所述试剂盒特异性强，检测灵敏度高，可达到0.1fg/μL，准确度高、可靠，操作简便快捷，适合现场检测，具有广泛的应用场景，但是所述试剂盒同样不能用于RNA检测。

因此，为进一步提高RPA的检测灵敏性，同时实现采用一套体系检测DNA和RNA的目的，有必要开发新的RPA检测试剂盒，在核酸诊断领域具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需要，本发明提供了一种增强型重组酶链置换扩增反应(Strengthened Recombinase Displacement Amplification，SRDA)等温核酸扩增试剂盒及其应用，通过向体系中加入与重组酶A(recA)相互作用的Ago蛋白，增强了recA介导的DNA链交换，提高了检测灵敏度，同时通过向体系中加入逆转录酶，实现了一套体系同时检测DNA和RNA的目的。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种蛋白组合物，所述蛋白组合物包括recA重组酶、Ago蛋白、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶。

本领域技术人员知晓，重组酶聚合酶等温扩增技术(Recombinase PolymeraseAmplification，RPA)主要依赖于三种酶：recA重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶，其中，recA重组酶与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，阻止细胞核内核酸酶对单链DNA的降解，同时负责基本的碱基配对，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding，SSB)的帮助下，使模板DNA解链，并在链置换DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，反应产物以指数级增长，通常在15～20min内便能得到可以用琼脂糖凝胶电泳检测的扩增片段，具有反应简单快速、条件简单等优势。

本发明中，Ago蛋白作为一种独立于其潜在酶活性的有效阳性选择系统，主要通过其与recA相互作用的PIWI样结构域来增强recA介导的DNA链置换反应，本发明通过向体系中加入Ago蛋白，利用其PIWI样结构域增强了recA介导的DNA链置换，显著增强了等温扩增效率，提高了现有RPA技术的检测灵敏度。

优选地，所述Ago蛋白包括NgAgo、MjAgo、TtAgo、PfAgo或NpAgo中的任意一种或至少两种的组合，优选为NgAgo。

优选地，所述NgAgo的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列为：

MTVIDLDSTTTADELTSGHTYDISVTLTGVYDNTDEQHPRMSLAFEQDNGERRYITLWKNTTPKDVFTYDYATGSTYIFTNIDYEVKDGYENLTATYQTTVENATAQEVGTTDEDETFAGGEPLDHHLDDALNETPDDAETESDSGHVMTSFASRDQLPEWTLHTYTLTATDGAKTDTEYARRTLAYTVRQELYTDHDAAPVATDGLMLLTPEPLGETPLDLDCGVRVEADETRTLDYTTAKDRLLARELVEEGLKRSLWDDYLVRGIDEVLSKEPVLTCDEFDLHERYDLSVEVGHSGRAYLHINFRHRFVPKLTLADIDDDNIYPGLRVKTTYRPRRGHIVWGLRDECATDSLNTLGNQSVVAYHRNNQTPINTDLLDAIEAADRRVVETRRQGHGDDAVSFPQELLAVEPNTHQIKQFASDGFHQQARSKTRLSASRCSEKAQAFAERLDPVRLNGSTVEFSSEFFTGNNEQQLRLLYENGESVLTFRDGARGAHPDETFSKGIVNPPESFEVAVVLPEQQADTCKAQWDTMADLLNQAGAPPTRSETVQYDAFSSPESISLNVAGAIDPSEVDAAFVVLPPDQEGFADLASPTETYDELKKALANMGIYSQMAYFDRFRDAKIFYTRNVALGLLAAAGGVAFTTEHAMPGDADMFIGIDVSRSYPEDGASGQINIAATATAVYKDGTILGHSSTRPQLGEKLQSTDVRDIMKNAILGYQQVTGESPTHIVIHRDGFMNEDLDPATEFLNEQGVEYDIVEIRKQPQTRLLAVSDVQYDTPVKSIAAINQNEPRATVATFGAPEYLATRDGGGLPRPIQIERVAGETDIETLTRQVYLLSQSHIQVHNSTARLPITTAYADQASTHATKGYLVQTGAFESNVGFL.

优选地，所述单链DNA结合蛋白包括T4噬菌体基因32编码蛋白(T4gp32)。

优选地，所述链置换DNA聚合酶包括BSU DNA聚合酶和/或金黄色葡萄球菌聚合酶(S.aureus Pol)，优选为BSU DNA聚合酶。

优选地，所述recA重组酶和Ago蛋白的质量比为10:(1～5)，例如可以是10:1、10:2、10:3、10:4或10:5，优选为10:(3～5)。

优选地，所述recA重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶的质量比为10:(5～8):(1～5)，优选为10:(7～8):(3～5)。

优选地，所述蛋白组合物还包括逆转录酶、核酸外切酶或磷酸激酶中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述逆转录酶包括M-MLV逆转录酶和/或AMV逆转录酶，优选为M-MLV逆转录酶。

本发明中，通过向体系中添加逆转录酶，并在扩增程序中加入1min逆转录过程，实现了在一个体系中同时进行DNA和RNA模板扩增的效果。

优选地，所述核酸外切酶包括大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ、λ噬菌体核酸外切酶或T7噬菌体基因核酸外切酶中的任意一种或至少两种的组合，优选为大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ。

本发明中，通过向体系中加入核酸外切酶，结合逆转录酶和探针技术，实现了对DNA模板和RNA模板的实时扩增。

本发明中，通过加入磷酸激酶，有利于促进ATP再生。

第二方面，本发明提供了一种增强型重组酶链置换扩增反应(StrengthenedRecombinase Displacement Amplification，SRDA)等温核酸扩增试剂盒，所述试剂盒包括如第一方面所述的蛋白组合物。

本发明中，加入Ago蛋白的扩增体系利用Ago蛋白的PIWI样结构域增强了recA介导的DNA链置换，显著增强了等温扩增效率，提高了现有RPA技术的检测灵敏度，是一种增强型重组酶链置换扩增反应(Strengthened Recombinase Displacement Amplification，SRDA)等温核酸扩增试剂盒。

优选地，所述试剂盒还包括缓冲液。

优选地，所述缓冲液包括PEG、海藻糖、磷酸肌酸、二硫苏糖醇、Tris-HCl、dNTPs或ATP中的任意一种或至少两种的组合，优选为PEG、海藻糖、磷酸肌酸、二硫苏糖醇、Tris-HCl、dNTPs和ATP的组合。

优选地，所述PEG的平均分子量为20000～40000，优选为20000～35000。

优选地，所述PEG在所述缓冲液中的百分比为10～25％，优选为20～25％。

优选地，所述二硫苏糖醇的浓度为10～15mM，优选为12～12.5mM。

本发明中，通过向体系中加入PEG35000和二硫苏糖醇，提高了体系稳定性和酶活性。

优选地，所述海藻糖作为体系稳定剂在所述缓冲液中的百分比为10～15％，优选为12～12.5％。

优选地，所述Tris-HCl的浓度为200～300mM，优选为200～250mM。

本发明中，Tris-HCl用于调节缓冲液的pH，使SRDA等温扩增反应处于弱碱性环境下，有利于促进扩增反应高效进行。

优选地，所述dNTPs的浓度为10～15mM，优选为12～12.5mM。

根据本发明，recA重组酶帮助DNA模板解链和促进模板与引物发生链交换，并在DNA聚合酶的催化下，扩增新的DNA片段，这一过程需要ATP来提供能量，因此，在缓冲体系中加入ATP。

优选地，所述ATP的浓度为3～5mM，例如可以是3mM、4mM或5mM。

根据本发明，ATP在肌酸激酶催化下利用磷酸肌酸(phosphocreatine)实现再生，使反应倾向于产物的合成，从而实现核酸的高效扩增，本发明通过向反应体系中加入磷酸肌酸，促进核酸扩增。

优选地，所述磷酸肌酸的浓度为200～300mM，例如可以是200mM、210mM、220mM、230mM、240mM、250mM、260mM、270mM、280mM、290mM或300mM，优选为200～250mM。

优选地，所述试剂盒还包括醋酸镁，作为酶的激活剂，其作用在于激活蛋白组合物，使各种酶发挥各自功能，从而使SRDA反应得以开始和延续。

优选地，所述醋酸镁的浓度为250～300mM，优选为280～300mM。

第三方面，本发明提供了一种核酸检测方法，所述方法包括以下步骤：

(1)提取样本核酸；

(2)利用如第一方面所述的蛋白组合物和/或如第二方面所述的试剂盒，结合靶基因的特异性引物和/或探针，进行等温扩增反应；

(3)对扩增曲线进行分析，确定样品中靶基因的表达量。

优选地，步骤(1)所述核酸包括DNA和/或RNA。

优选地，步骤(2)所述引物的长度为30～35bp。

优选地，步骤(2)所述引物的核酸序列如SEQ ID NO:2～5所示；

SEQ ID NO:2所示的核酸序列为：

GCACAGATAGCGGCAGTAGAAACGCTCAAC；

SEQ ID NO:3所示的核酸序列为：

GAAGTCGAGCCGTTCAAAACCTCGATCATCCTC；

SEQ ID NO:4所示的核酸序列为：

ATGTTGCAACTAATGGTTACTTAATATCTA；

SEQ ID NO:5所示的核酸序列为：

GCATTGTTGTAGAATCGGGCTCATGGGGT.

本发明中，采用如SEQ ID NO:2～5所示的引物扩增靶基因，得到的靶基因片段长度小于200bp，适用于荧光定量检测。

优选地，步骤(2)所述探针的长度为46～53bp。

优选地，步骤(2)所述探针标记包括荧光基团、淬灭基团、四氢呋喃残基标记(THFresidue)和3’封闭标记(3’spacer)。

优选地，所述荧光基团标记在探针四氢呋喃标记的5’端。

优选地，所述淬灭基团标记在探针的四氢呋喃标记的3’端。

优选地，所述的荧光基团包括FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LCRED460中的任意一种。

优选地，所述淬灭基团包括BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的任意一种。

优选地，步骤(2)所述探针的核酸序列如SEQ ID NO:6～7所示；

SEQ ID NO:6所示的核酸序列为：

AAAAGGCCCACGGCAAGCAACGTCAGCGCA/i6FAMdT/ATHFA/iBHQ1dT/CACAAATGGCCAGTCAC-3’Spacer；

SEQ ID NO:7所示的核酸序列为：

TCATCCTGTGTATTCGTCTCAGAATCAGCCA/i6FAMdT/TTHFG/iBHQ1dT/AGCCAGAACTCCCTAC-3’Spacer.

优选地，步骤(2)所述等温扩增反应的程序为：35～40℃预热1～2min，1个循环；35～42℃反应5～15min，该步骤为信号采集30～40s，10～30个循环。

优选地，步骤(3)所述靶基因的核酸序列如SEQ ID NO:8～9所示；

SEQ ID NO:8所示的核酸序列为：

GCACAGATAGCGGCAGTAGAAACGCTCAACGAAAAGGCCCACGGCAAGCAACGTCAGCGCATAGATCACAAATGGCCAGTCACGCGCGAATTTGAGGATGATCGAGGTTTTGAACGGCTCGACTTC；

SEQ ID NO:9所示的核酸序列为：

ATGTTGCAACTAATGGTTACTTAATATCTAACTTTGATGAGTCATCCTGTGTATTCGTCTCAGAATCAGCCATTTGTAGCCAGAACTCCCTATACCCCATGAGCCCGATTCTACAACAATGC.

第四方面，本发明提供了一种如第一方面所述的蛋白组合物和/或如第二方面所述的试剂盒在病原体等温核酸扩增检测中的应用。

优选地，所述病原体包括布鲁氏杆菌和/或犬瘟热病毒。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明的SRDA等温核酸扩增试剂盒通过加入与recA重组酶相互作用的Ago蛋白，利用Ago蛋白的PIWI样结构域增强了recA介导的DNA链置换，显著增强了等温扩增效率；

(2)本发明通过向反应体系中加入逆转录酶，实现了同一体系进行DNA和RNA实时荧光定量扩增的目的，结合荧光标记探针，实现了靶基因的实时定性、定量分析；

(3)本发明的试剂盒扩增DNA的灵敏度达50copies/μL，扩增RNA的灵敏度达100copies/μL，高于目前广泛使用的荧光定量PCR法和目前市售的RPA试剂盒；

(4)本发明的试剂盒能够实现在35～42℃等温条件下，5～15min内完成DNA或RNA的快速扩增检测，检测方法操作简单，反应时间短，检测准确性高、特异性好、重复性好，在临床实践中具有潜在应用价值。

附图说明

图1为筛选布鲁氏杆菌引物探针组合结果图；

图2为筛选犬瘟热病毒引物探针组合结果图；

图3为筛选不同AGO蛋白扩增布鲁氏杆菌DNA结果图；

图4为布鲁斯杆菌DNA阳性标准品的灵敏度扩增结果图；

图5为犬瘟热病毒RNA阳性标准品的灵敏度扩增结果图；

图6为加入AGO蛋白和不加AGO蛋白，扩增布鲁氏杆菌DNA的对比结果图；

图7为加入AGO蛋白和不加AGO蛋白，扩增犬瘟热病毒RNA的对比结果图。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1引物探针的设计、合成与筛选

为了对本发明的SRDA等温核酸扩增试剂盒进行全面评估，本实施例以DNA类的布氏杆菌基因和RNA类的犬瘟热病毒基因作为靶基因，分别设计特异性引物和探针，经过大量筛选实验，得到扩增布鲁氏杆菌基因SEQ ID NO:8和犬瘟热病毒基因SEQ ID NO:9的最佳引物探针组合，其中，布鲁氏杆菌引物如SEQ ID NO:2～3所示，探针如SEQ ID NO:6所示，犬瘟热病毒引物如SEQ ID NO:4～5所示，探针如SEQ ID NO:7所示。

扩增曲线(Amplification Plot)如图1和图2所示，图1为布鲁氏杆菌6个不同引物探针组扩增布鲁氏杆菌阳性标准品的扩增结果图，图1(1-1)为布鲁氏杆菌基因扩增的最佳实施例；图2为4个不同引物探针组扩增犬瘟热病毒阳性标准品的扩增结果图，图2(2-2)为犬瘟热病毒基因扩增的最佳实施例；采用本实施例的最佳引物探针组合进行布氏杆菌基因或犬瘟热病毒基因的扩增，灵敏度高，重复性好。

实施例2 AGO蛋白筛选实验

向检测体系中加入不同来源的AGO蛋白，具体为NgAgo(Natronobacteriumgregoryi)、MjAgo(Methanocaldococcus jannaschii)、TtAgo(Thermus thermophilus)、PfAgo(Pyrococcus furiosus)和NpAgo(Natrinema pellirubrum)，进行最佳AGO蛋白筛选。

结构如图3所示，NgAgo(F1)、MjAgo(F2)、TtAgo(F3)、PfAgo(F4)和NpAgo(F5)对SRDA检测灵敏度具有显著的增强效果，其中，NgAgo的增强效果最显著，灵敏度最高。

实施例3 SRDA等温核酸扩增检测DNA和RNA

(1)标准样品的制备

分别含有布鲁氏杆菌靶基因(DNA)和犬瘟热病毒靶基因(RNA)的DNA质粒由上海生工生物工程有限公司合成；其中，布鲁氏杆菌阳性标准品是将布鲁氏杆菌质粒进行直接溶解稀释后获得，犬瘟热病毒标准品是首先采用Thermo公司的体外转录试剂盒将犬瘟热病毒质粒逆转录为RNA，再进行溶解稀释后获得；

(2)阳性标准样品的梯度稀释

将配制的布鲁氏杆菌阳性标准品和犬瘟热病毒阳性标准品分别进行10倍梯度稀释，具体为：

布鲁氏杆菌阳性标准品：S1：5×10⁵copies/μL、S2：5×10⁴copies/μL、S3：5×10³copies/μL、S4：5×10²copies/μL、S5：5×10copies/μL、S6：5copies/μL；

犬瘟热病毒标准品：L1：1×10⁶copies/μL、L2：1×10⁵copies/μL、L3：1×10⁴copies/μL、L4：1×10³copies/μL、L5：1×10²copies/μL、L6：1×10copies/μL。

(3)SRDA等温核酸扩增检测

在最优体系和扩增条件下对稀释好的标准品分别进行扩增，扩增体系如表1所示，其中，Buffer A包括21％PEG35000、12.5％海藻糖、250mM磷酸肌酸、12.5mM二硫苏糖醇、250mM Tris-HCl、12.5mM dNTPs和5mM ATP，Buffer B为280mM醋酸镁溶液，Buffer C为500ng recA重组酶、150ng NgAgo、360ng单链结合蛋白、25ng磷酸激酶、60ng M-MLV逆转录酶、150ng BSU聚合酶和75ng大肠杆菌外切酶Ⅲ，扩增程序为：39℃逆转录1min；39℃等温扩增并采集信号30s，循环30次；

表1扩增体系

结构如图4和图5所示，布鲁氏杆菌的检测灵敏度可达50copies/μL，犬瘟热病毒的检测灵敏度可达100copies/μL，明显优于目前市售的RPA检测试剂盒。

对比例

与实施例3相比，Buffer C中不含有NgAgo，其他实验条件与实施例3相同。

结果如图6和图7所示，(6-1)和(7-1)的Buffer C中含有NgAgo，(6-2)和(7-2)的Buffer C中不含有NgAgo，与不含有NgAgo的反应体系相比，NgAgo显著增强了对布鲁氏杆菌DNA和犬瘟热病毒RNA的灵敏性。

综上所述，本发明的SRDA等温核酸扩增试剂盒通过加入与recA重组酶相互作用的Ago蛋白，利用Ago蛋白的PIWI样结构域增强了recA介导的DNA链置换，显著增强了扩增效率，同时向体系中加入逆转录酶，实现了同一体系进行DNA和RNA实时荧光定量扩增的目的，结合荧光标记探针，实现了靶基因的实时定性、定量分析，扩增DNA的灵敏度达50copies/μL，扩增RNA的灵敏度达100copies/μL，具有极高的理论价值和临床应用价值。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市艾伟迪生物科技有限公司

<120> 一种SRDA等温核酸扩增试剂盒及其应用

<130> 20190904

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 887

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Met Thr Val Ile Asp Leu Asp Ser Thr Thr Thr Ala Asp Glu Leu Thr

1 5 10 15

Ser Gly His Thr Tyr Asp Ile Ser Val Thr Leu Thr Gly Val Tyr Asp

20 25 30

Asn Thr Asp Glu Gln His Pro Arg Met Ser Leu Ala Phe Glu Gln Asp

35 40 45

Asn Gly Glu Arg Arg Tyr Ile Thr Leu Trp Lys Asn Thr Thr Pro Lys

50 55 60

Asp Val Phe Thr Tyr Asp Tyr Ala Thr Gly Ser Thr Tyr Ile Phe Thr

65 70 75 80

Asn Ile Asp Tyr Glu Val Lys Asp Gly Tyr Glu Asn Leu Thr Ala Thr

85 90 95

Tyr Gln Thr Thr Val Glu Asn Ala Thr Ala Gln Glu Val Gly Thr Thr

100 105 110

Asp Glu Asp Glu Thr Phe Ala Gly Gly Glu Pro Leu Asp His His Leu

115 120 125

Asp Asp Ala Leu Asn Glu Thr Pro Asp Asp Ala Glu Thr Glu Ser Asp

130 135 140

Ser Gly His Val Met Thr Ser Phe Ala Ser Arg Asp Gln Leu Pro Glu

145 150 155 160

Trp Thr Leu His Thr Tyr Thr Leu Thr Ala Thr Asp Gly Ala Lys Thr

165 170 175

Asp Thr Glu Tyr Ala Arg Arg Thr Leu Ala Tyr Thr Val Arg Gln Glu

180 185 190

Leu Tyr Thr Asp His Asp Ala Ala Pro Val Ala Thr Asp Gly Leu Met

195 200 205

Leu Leu Thr Pro Glu Pro Leu Gly Glu Thr Pro Leu Asp Leu Asp Cys

210 215 220

Gly Val Arg Val Glu Ala Asp Glu Thr Arg Thr Leu Asp Tyr Thr Thr

225 230 235 240

Ala Lys Asp Arg Leu Leu Ala Arg Glu Leu Val Glu Glu Gly Leu Lys

245 250 255

Arg Ser Leu Trp Asp Asp Tyr Leu Val Arg Gly Ile Asp Glu Val Leu

260 265 270

Ser Lys Glu Pro Val Leu Thr Cys Asp Glu Phe Asp Leu His Glu Arg

275 280 285

Tyr Asp Leu Ser Val Glu Val Gly His Ser Gly Arg Ala Tyr Leu His

290 295 300

Ile Asn Phe Arg His Arg Phe Val Pro Lys Leu Thr Leu Ala Asp Ile

305 310 315 320

Asp Asp Asp Asn Ile Tyr Pro Gly Leu Arg Val Lys Thr Thr Tyr Arg

325 330 335

Pro Arg Arg Gly His Ile Val Trp Gly Leu Arg Asp Glu Cys Ala Thr

340 345 350

Asp Ser Leu Asn Thr Leu Gly Asn Gln Ser Val Val Ala Tyr His Arg

355 360 365

Asn Asn Gln Thr Pro Ile Asn Thr Asp Leu Leu Asp Ala Ile Glu Ala

370 375 380

Ala Asp Arg Arg Val Val Glu Thr Arg Arg Gln Gly His Gly Asp Asp

385 390 395 400

Ala Val Ser Phe Pro Gln Glu Leu Leu Ala Val Glu Pro Asn Thr His

405 410 415

Gln Ile Lys Gln Phe Ala Ser Asp Gly Phe His Gln Gln Ala Arg Ser

420 425 430

Lys Thr Arg Leu Ser Ala Ser Arg Cys Ser Glu Lys Ala Gln Ala Phe

435 440 445

Ala Glu Arg Leu Asp Pro Val Arg Leu Asn Gly Ser Thr Val Glu Phe

450 455 460

Ser Ser Glu Phe Phe Thr Gly Asn Asn Glu Gln Gln Leu Arg Leu Leu

465 470 475 480

Tyr Glu Asn Gly Glu Ser Val Leu Thr Phe Arg Asp Gly Ala Arg Gly

485 490 495

Ala His Pro Asp Glu Thr Phe Ser Lys Gly Ile Val Asn Pro Pro Glu

500 505 510

Ser Phe Glu Val Ala Val Val Leu Pro Glu Gln Gln Ala Asp Thr Cys

515 520 525

Lys Ala Gln Trp Asp Thr Met Ala Asp Leu Leu Asn Gln Ala Gly Ala

530 535 540

Pro Pro Thr Arg Ser Glu Thr Val Gln Tyr Asp Ala Phe Ser Ser Pro

545 550 555 560

Glu Ser Ile Ser Leu Asn Val Ala Gly Ala Ile Asp Pro Ser Glu Val

565 570 575

Asp Ala Ala Phe Val Val Leu Pro Pro Asp Gln Glu Gly Phe Ala Asp

580 585 590

Leu Ala Ser Pro Thr Glu Thr Tyr Asp Glu Leu Lys Lys Ala Leu Ala

595 600 605

Asn Met Gly Ile Tyr Ser Gln Met Ala Tyr Phe Asp Arg Phe Arg Asp

610 615 620

Ala Lys Ile Phe Tyr Thr Arg Asn Val Ala Leu Gly Leu Leu Ala Ala

625 630 635 640

Ala Gly Gly Val Ala Phe Thr Thr Glu His Ala Met Pro Gly Asp Ala

645 650 655

Asp Met Phe Ile Gly Ile Asp Val Ser Arg Ser Tyr Pro Glu Asp Gly

660 665 670

Ala Ser Gly Gln Ile Asn Ile Ala Ala Thr Ala Thr Ala Val Tyr Lys

675 680 685

Asp Gly Thr Ile Leu Gly His Ser Ser Thr Arg Pro Gln Leu Gly Glu

690 695 700

Lys Leu Gln Ser Thr Asp Val Arg Asp Ile Met Lys Asn Ala Ile Leu

705 710 715 720

Gly Tyr Gln Gln Val Thr Gly Glu Ser Pro Thr His Ile Val Ile His

725 730 735

Arg Asp Gly Phe Met Asn Glu Asp Leu Asp Pro Ala Thr Glu Phe Leu

740 745 750

Asn Glu Gln Gly Val Glu Tyr Asp Ile Val Glu Ile Arg Lys Gln Pro

755 760 765

Gln Thr Arg Leu Leu Ala Val Ser Asp Val Gln Tyr Asp Thr Pro Val

770 775 780

Lys Ser Ile Ala Ala Ile Asn Gln Asn Glu Pro Arg Ala Thr Val Ala

785 790 795 800

Thr Phe Gly Ala Pro Glu Tyr Leu Ala Thr Arg Asp Gly Gly Gly Leu

805 810 815

Pro Arg Pro Ile Gln Ile Glu Arg Val Ala Gly Glu Thr Asp Ile Glu

820 825 830

Thr Leu Thr Arg Gln Val Tyr Leu Leu Ser Gln Ser His Ile Gln Val

835 840 845

His Asn Ser Thr Ala Arg Leu Pro Ile Thr Thr Ala Tyr Ala Asp Gln

850 855 860

Ala Ser Thr His Ala Thr Lys Gly Tyr Leu Val Gln Thr Gly Ala Phe

865 870 875 880

Glu Ser Asn Val Gly Phe Leu

885

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gcacagatag cggcagtaga aacgctcaac 30

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

gaagtcgagc cgttcaaaac ctcgatcatc ctc 33

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

atgttgcaac taatggttac ttaatatcta 30

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gcattgttgt agaatcgggc tcatggggt 29

<210> 6

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

aaaaggccca cggcaagcaa cgtcagcgca taatcacaaa tggccagtca c 51

<210> 7

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

tcatcctgtg tattcgtctc agaatcagcc attgtagcca gaactcccta c 51

<210> 8

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

gcacagatag cggcagtaga aacgctcaac gaaaaggccc acggcaagca acgtcagcgc 60

atagatcaca aatggccagt cacgcgcgaa tttgaggatg atcgaggttt tgaacggctc 120

gacttc 126

<210> 9

<211> 122

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

atgttgcaac taatggttac ttaatatcta actttgatga gtcatcctgt gtattcgtct 60

cagaatcagc catttgtagc cagaactccc tataccccat gagcccgatt ctacaacaat 120

gc 122

Claims

1.一种蛋白组合物，其特征在于，所述蛋白组合物包括recA重组酶、Ago蛋白、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶。

2.根据权利要求1所述的蛋白组合物，其特征在于，所述Ago蛋白包括NgAgo、MjAgo、TtAgo、PfAgo或NpAgo中的任意一种或至少两种的组合，优选为NgAgo；

优选地，所述NgAgo的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

优选地，所述单链DNA结合蛋白包括T4噬菌体基因32编码蛋白；

优选地，所述链置换DNA聚合酶包括BSU DNA聚合酶和/或金黄色葡萄球菌聚合酶，优选为BSU DNA聚合酶。

3.根据权利要求1或2所述的蛋白组合物，其特征在于，所述recA重组酶和Ago蛋白的质量比为10:(1～5)，优选为10:(3～5)；

4.根据权利要求1-3任一项所述的蛋白组合物，其特征在于，所述蛋白组合物还包括逆转录酶、核酸外切酶或磷酸激酶中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述逆转录酶包括M-MLV逆转录酶和/或AMV逆转录酶，优选为M-MLV逆转录酶；

5.一种SRDA等温核酸扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-4任一项所述的蛋白组合物。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括缓冲液；

优选地，所述缓冲液包括PEG、海藻糖、磷酸肌酸、二硫苏糖醇、Tris-HCl、dNTPs或ATP中的任意一种或至少两种的组合，优选为PEG、海藻糖、磷酸肌酸、二硫苏糖醇、Tris-HCl、dNTPs和ATP的组合；

优选地，所述PEG的平均分子量为20000～40000，优选为20000～35000；

优选地，所述PEG在所述缓冲液中的百分比为10～25％，优选为20～25％；

优选地，所述海藻糖在所述缓冲液中的百分比为10～15％，优选为12～12.5％；

优选地，所述磷酸肌酸的浓度为200～300mM，优选为200～250mM；

优选地，所述二硫苏糖醇的浓度为10～15mM，优选为12～12.5mM；

优选地，所述Tris-HCl的浓度为200～300mM，优选为200～250mM；

优选地，所述dNTPs的浓度为10～15mM，优选为12～12.5mM；

优选地，所述ATP的浓度为3～5mM。

7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括醋酸镁；

优选地，所述醋酸镁的浓度为250～300mM，优选为280～300mM。

8.一种核酸检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)提取样本核酸；

(2)利用如权利要求1-4任一项所述的蛋白组合物和/或如权利要求5-7任一项所述的试剂盒，结合靶基因的特异性引物和/或探针，进行等温扩增反应；

(3)对扩增曲线进行分析，确定样品中靶基因的表达量。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述核酸包括DNA和/或RNA；

优选地，步骤(2)所述引物的长度为30～35bp；

优选地，步骤(2)所述引物的核酸序列如SEQ ID NO:2～5所示；

优选地，步骤(2)所述探针的长度为46～53bp；

优选地，步骤(2)所述探针标记包括荧光基团、淬灭基团、四氢呋喃标记和3’封闭标记；

优选地，所述荧光基团标记在探针四氢呋喃标记的5’端；

优选地，所述淬灭基团标记在探针的四氢呋喃标记的3’端；

优选地，所述的荧光基团包括FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的任意一种；

优选地，所述淬灭基团包括BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的任意一种；

优选地，步骤(2)所述探针的核酸序列如SEQ ID NO:6～7所示；

优选地，步骤(2)所述等温扩增反应的程序为：35～40℃预热1～2min，1个循环；35～42℃反应5～15min。

优选地，步骤(3)所述靶基因的核酸序列如SEQ ID NO:8～9所示。

10.一种如权利要求1-4任一项所述的蛋白组合物和/或如权利要求5-7任一项所述的试剂盒在病原体等温核酸扩增检测中的应用；

优选地，所述病原体包括布鲁氏杆菌和/或犬瘟热病毒。