CN113373148A - 一种调控app表达的靶标位点序列及其在防治ad上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种调控APP表达的靶标位点序列及其在防治AD上的应用，该靶标位点序列为环状RNA分子circRNA642，其人源核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述circRNA642的斑马鱼源核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示，本发明还提供了一种APPsw转基因斑马鱼痴呆模型。本发明提供的circRNA642靶标位点序列可用于调控APP表达和防治阿尔茨海默病；本发明提供的APPsw转基因斑马鱼痴呆模型可用于评价药物调控APP表达效果和评价药物防治阿尔茨海默病的效果。本发明提供的调控APP表达的靶标位点序列是通过本发明人团队建立的斑马鱼痴呆模型通过高通量测序发现的，通过细胞实验验证该靶标位点序列确实与APP表达有相关性，说明他们之间具有调控关系，是将来防治痴呆的新的靶点。

Description

一种调控APP表达的靶标位点序列及其在防治AD上的应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体为一种调控APP表达的靶标位点序列及其在防治AD上的应用。

背景技术

阿尔茨海默病(AD)患者脑内大量的神经元外大量Aβ沉积及神经元内纤维蛋白缠结是AD最典型的病理改变。淀粉样蛋白肽(Aβ)是阿尔茨海默病(AD)(早老性痴呆)中淀粉样蛋白斑块的主要成分，淀粉样前体蛋白(APP)是Aβ的唯一来源。淀粉样蛋白假说在AD中的相关性，高Aβ水平的毒性作用已被广泛研究。环形RNA(circRNA)是近年来发现的在DNA转录过程中产生的，它和翻译成蛋白质的mRNA有对应关系，环形RNA能够吸附和它对应的miRNA，miRNA被环形RNA吸附后,miRNA解除了对相应的mRNA表达蛋白质的抑制，起到了促进该蛋白表达的作用。

Aβ级联学说提出，Aβ沉积是AD发生的始动因素。大量Aβ沉积促使tau蛋白过度磷酸化，造成神经元死亡,最终导致认知功能障碍，而Aβ则来源于APP。APP是β淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)的前体蛋白，属I型跨膜糖蛋白，有细胞表面受体的结构特征。APP基因位于21号染色体长臂，APP基因转录后经不同剪接方式得到编码695-770个氨基酸多肽的mRNA。其中APP695、APP714、APP751和APP770的编码含Aβ肽，主要位于C-末端。APP基因含有19个外显子，7、8、15外显子为选择剪切位点，通过选择性剪切成不同的APP跨膜糖蛋白，APP695、APP751和APP770为主要形式，一般在神经元和神经胶质细胞中表达，由长的胞外区、跨膜信号转导区和短的胞浆区三个部分组成。神经元中以APP695(含有695个氨基酸残基)最常见。APP的代谢有两种途径，一种是正常情况下人体APP主要被α分泌酶代谢生成可溶性sAPPα和羧基末端片段C83，C83再由γ分泌酶降解。也有少量APP进入β分泌酶代谢途径，但是在病理条件下，进入β分泌酶代谢途径的APP量增加，促使被β分泌酶切割产生C99，之后经γ分泌酶顺序性错误酶切生成具有神经毒性的Aβ。APP裂解释放出的Aβ主要是含40个氨基酸残基的Aβ1-40，同时也释出少量的含42个氨基酸残基的Aβ1-42，Aβ1-42更易聚集，是淀粉样斑块的主要成分。APP基因突变会导致常染色体显性遗传的家族性AD发生。APP基因已知至少有6种点突变，目前研究较多的APP突变有APP瑞典型突变(Switch突变)(APPsw)和APP伦敦型突变(London突变)(APPlon)。APPsw主要是APP695第595和596位氨基酸由赖氨酸和甲硫氨酸变为天冬酰胺和亮氨酸，突变型APP基因产物可能更容易导致APP裂解代谢进入β分泌酶途径，从而导致Aβ的大量产生，或生成更多的易聚集的Aβ1-42，最终形成大量的老年斑。已经有足够的证据显示AD患者及动物模型的脑内出现APP的高表达现象，因此，调控APP的高表达将是治疗AD最有前景的治疗方法。

另外，大部分circRNA含有miRNA结合位点，能够结合miRNA，阻断miRNA对靶基因的抑制作用。circRNA还可以作为miRNA分子海绵，调节基因的表达，并与细胞功能和疾病有着密切的联系。miRNA是microRNA的缩写，是一种小RNA(一般小于20个碱基)，和作为信使RNA的mRNA不一样。circRNA分子富含microRNA(miRNA)结合位点，在细胞中起到miRNA海绵的作用，进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表达水平。circRNA能够吸附和它本身序列相关的miRNA，miRNA一般能够抑制和它对应的mRNA翻译成蛋白质。所以过表达circRNA，吸附miRNA的量就越多，进而miRNA的量减少了，抑制mRNA的作用就减少了，也就是mRNA翻译成蛋白质的量就增加了，反之亦然。因此，寻找能够调控APP表达的circRNA分子，具有非常重要的意义。

AD的痴呆动物模型，以往采用的是小鼠APP过表达模型，在一定程度上模拟了痴呆的病理特征，但是模型数量非常有限，并且有很多动物到达不了相当的月龄就死掉了，使痴呆研究得不到理想的动物模型。

发明内容

为解决以上问题，本发明提供了一种调控APP表达的靶标位点序列及其在防治AD上的应用。

本发明提供了一种调控APP表达的靶标位点序列，该靶标位点序列为环状RNA分子circRNA642，其人源核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

进一步，所述circRNA642的斑马鱼源核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示。

本发明还提供了一种APPsw转基因斑马鱼痴呆模型，其特征在于，在这种痴呆斑马鱼中APPsw过表达，而circRNA642表达下调。

本发明提供的circRNA642靶标位点序列在调控APP表达中的应用。

本发明提供的circRNA642靶标位点序列在防治阿尔茨海默病上的应用。

本发明提供的APPsw转基因斑马鱼痴呆模型在评价药物调控APP表达效果中的应用。

本发明提供的APPsw转基因斑马鱼痴呆模型在评价药物防治阿尔茨海默病效果上的应用。

本发明提供的circRNA642对应的斑马鱼和人的亲本基因及其序列号如下表所示：

斑马鱼基因	斑马鱼基因ID	对应人基因	对应人基因ID
				map3k5	555703	MAP3K5	4217
appb	170846	APP	351

与现有技术相比，本发明在应用中具备以下有益效果：

1、提供了调控APP表达的靶标位点序列：本发明提供的调控APP表达的靶标位点序列是通过本发明人团队建立的斑马鱼痴呆模型通过高通量测序发现的，通过细胞实验验证该靶标位点序列确实与APP表达有相关性，说明他们之间具有调控关系，是将来防治痴呆的新的靶点。不仅为阿尔茨海默病的发病机制的研究及诊断或治疗提供了新的检测位点，也为靶点药物的开发和评价提供了一个新的靶标位点。本发明通过构建斑马鱼转基因模型，过表达APP分子，模拟阿尔茨海默病发生发展机制，利用高通量基因测序手段，通过生物信息学分析，RT-qPCR方法筛选到调控APP基因表达的circRNA分子，通过该靶标序列可以评价药物调控APP表达效果，并研制阿尔茨海默病的防治药物。

2、提供了适合研究AD的动物模型：本发明提供了APPsw转基因斑马鱼痴呆模型，在这个模型中，因为转基因的APPsw在痴呆斑马鱼中过表达，抑制了斑马鱼自有内源性appb的表达，所以相应的circRNA642表达下调，而对照的野生型斑马鱼如果过表达circRNA642，则appb表达上调。斑马鱼痴呆模型是一种尝试，但我们建立了该模型以后，发现它很好的模拟了人渐进性的痴呆发展过程，并且痴呆的相关分子都发生了相应的变化，病理的结果也与人的痴呆病理结果相一致，已经传了10余代，遗传稳定，所以本模型是研究早老性痴呆(AD)理想的动物模型。本斑马鱼痴呆模型在动物水平上验证了circRNA642可以作为调控APP表达的靶标位点序列，可以用于研究如何防治阿尔茨海默病(AD)，可以用于评价药物调控APP表达和防治阿尔茨海默病(AD)的效果。

附图说明

图1appb在APPsw斑马鱼痴呆模型鱼脑内的表达情况；

图2不同月龄APPsw斑马鱼痴呆模型寻找到EC区潜伏时间对比；

图3APPsw斑马鱼痴呆模型鱼脑的病理学改变对比；

图4APPsw斑马鱼痴呆模型鱼脑中神经元数量变化对比；

图5APPsw斑马鱼痴呆模型鱼脑组织结构变化对比；

图6免疫组化检测APPsw斑马鱼痴呆模型的Aβ沉积情况；

图7circRNA642及appb在APPsw痴呆斑马鱼及AB野生斑马鱼中的表达情况；

图8AB野生型斑马鱼随月龄增加appb的表达增加；

图9AB野生型斑马鱼随月龄增加circRNA642的表达增加；

图10鱼卵注射appb-siRNA后circRNA642与appb的表达；

图11鱼卵注射circRNA642-siRNA后circRNA642与appb的表达；

图12pcDNA-mRFP质粒转染SH-SY5Y细胞(36h)荧光表达情况；

图13circRNA642质粒转染SH-SY5Y细胞36h circRNA642与APPmRNA表达情况。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1.斑马鱼痴呆模型的构建及验证

1.1载体构建

1.1.1APP基因启动子获得：调取斑马鱼appb启动子序列(Genbank ID：AJ315639.1)作为调控人源APP基因的启动子。利用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒提取正常野生型斑马鱼基因组。剪取6条成年斑马鱼鱼尾，加入200μl GA缓冲液，涡旋震荡15s；加入20μl蛋白酶K(20mg/ml)，蜗旋混匀，56℃孵育1h。加入200μl缓冲液GB，颠倒混匀后，70℃放置10min。加入200μl无水乙醇混匀后加入吸附柱中，12000rpm，离心1min，倒掉废液。向吸附柱加入500μl缓冲液GD，12000rpm，离心1min，倒掉废液。向吸附柱加入600μl漂洗液PW，12000rpm，离心1min，倒掉废液。重复上一步后将吸附柱空离3min后，放于滤纸上晾干。最后往吸附柱中加入50μl ddH2O，溶液收集到干净离心管中，得到斑马鱼基因组。设计PCR引物，并带有XhoI和HindIII酶切位点:

F:5’-CCCTCGAGCAAGGTAGCTTATTGT-3’

R:5’-CCAAGCTTGTGATTGGGTAGCTTT-3’

PCR反应体系：2×Pfu master Mix 25μl，上游引物1μl，下游引物1μl，基因组2μl，加ddH₂O至50μl。

PCR反应条件：95℃预变性30s；95℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；4℃保存。PCR结束后，将PCR反应产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离。凝胶成像仪观察DNA条带正确性后，切下目的条带，放入1.5ml的EP管中，称重后，利用琼脂糖回收试剂盒回收得到PCR片段产物。

1.1.2APP695瑞典型突变cDNA获得：人源APP695 cDNA片段由奥科公司合成。为了得到瑞典型突变APP，突变位点位为595-596碱基GA变成TC。根据点突变试剂盒要求设计引物序列：

F:5’-ATCTCTGAAGTGAATCTGGATGCAGAATTCC-3’

R:5’-GGAATTCTGCATCCAGATTCACTTCAGAGAT-3’

PCR反应条件：95℃预变性30s；95℃变性30s，60℃退火1min，72℃延伸8min，15个循环。PCR结束后，将反应体系立即置于冰浴中5min，室温加入1μl MutazymeTM酶，37℃孵育1h。反应结束后质粒DNA上会产生缺口，选择大肠杆菌DH5α感受态进行转化。得到的菌液送生工测序。测序正确的APPsw序列利用PCR扩增，设计PCR引物，并带有HindIII和SalI酶切位点：

F：5’-CCAAGCTTGCCACCATGCTGCCCGGTTTGG-3’

R：5’-GCGTCGACCTAGTTCTGCATCT GCTCA AAG-3’

PCR反应体系：2×Pfu master Mix 25μl，上游引物1μl，下游引物1μl，pEGFP-N1-APPsw 2μl，加ddH₂O至50μl。

PCR反应条件：95℃预变性30s；95℃变性30s，60℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环；PCR结束后，PCR反应产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离。凝胶成像仪观察DNA条带正确性后，切下目的条带，放入1.5ml的EP管中，称重后，利用琼脂糖回收试剂盒回收得到PCR片段产物。

1.1.3CMV启动子获得：利用人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus，CMV)启动子调控载体上EGFP表达，增加表达效率。CMV片段由pEGFP-N1载体GenBank Accession#U55762)提供，利用PCR反应扩增出CMV片段。设计PCR引物，并带有SalI和BamHI酶切位点：

F：5’-GCGTCGACTAGTT ATTAATAGTAATC-3’

R：5’-CGCGGATCCGGATCTGACGGTTCACT-3’

PCR反应体系:2×Pfu master Mix 25μl，上游引物1μl，下游引物1μl，pEGFP-N1-APPsw 2μl，加ddH₂O至50μl。

PCR反应条件：95℃预变性30s；95℃变性30s，60℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环；PCR结束后，PCR反应产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离。凝胶成像仪观察DNA条带正确性后，切下目的条带，放入1.5ml的EP管中，称重后，利用琼脂糖回收试剂盒回收得到PCR片段产物。

1.1.4Tol2载体构建：本实验利用转座效率高的Tol2载体pT2AL200R150L。用SalI和BamHI分别处理pT2AL200R150G(pTol2)载体和PCR的CMV片段后，酶切，回收，连接，转化后得到单菌落，挑取单菌落将质粒经菌落PCR鉴定后，将阳性菌落送至生工测序，测序正确后进行下一步构建。用XhoI和HindIII双酶切构建好的pTol2-CMV载体和appb片段后，酶切，回收，连接，转化后得到单菌落，挑取单菌落将质粒经菌落PCR鉴定后，将阳性菌落送至生工测序，测序正确后进行下一步构建。用HindIII和SalI双酶切构建好的pTol2-CMV-appb载体和APPsw片段后，酶切，回收，连接，转化后得到单菌落，挑取单菌落将质粒经菌落PCR鉴定后，将阳性菌落送至生工测序。

1.2转基因斑马鱼的建立

利用转座子表达载体时，需要转座酶的帮助。体外将含有转座酶基因质粒利用SP6mMESSAGE mMACHINE试剂盒进行体外转录，得到转座酶mRNA。注射前将pTol2-appb-APPsw-CMV-EGFP质粒(50ng/μl)和转座酶mRNA(50ng/μl)混匀后注入单细胞期的斑马鱼受精卵中。每只鱼卵注射约5nl质粒混合液。将注射后的胚胎放于28.5℃生化培养中培养。于受精后24h观察荧光表达情况，仔细挑选出绿色荧光表达的阳性胚胎继续培养至成鱼。得到F0，F0代与野生型交配得到杂合体F1代。F1代成鱼自交，筛选出纯合子胚胎即F2代，继续培养，获得的F2代成鱼就是APPsw斑马鱼痴呆模型。图1给出了F2代幼鱼脑中appb基因调控序列调控绿色荧光蛋白APPsw斑马鱼共聚显微成像，可见斑马鱼全脑(×40)、端脑部位放大如箭头所示(×200)、端脑中脑连接部位放大如箭头所示(×200)；绿色荧光起到示踪作用，在图1中表现为亮色条带，亮色表达部位主要在脑血管和神经元，亮色条带也就是APPsw的表达部位，说明appb基因在APPsw斑马鱼痴呆模型的鱼脑是能够表达的。

1.3APPsw斑马鱼痴呆模型行为学研究

利用“T”迷宫研究APPsw斑马鱼痴呆模型的行为改变情况。把斑马鱼放在T字型水槽的最底部，鱼会向T字的上面横向的T字的左侧或右侧游动，T字水槽的右侧比其他部位深一些，在深部的底下放食物或水草(带颜色的物)，即营养富集区(EC区)，因为斑马鱼有趋向食物或水草的特性，通过几次试验，鱼就会记住食物或水草在“EC区”，没有痴呆的鱼很快就会进入“EC区”，而痴呆的鱼很长时间也找不到“EC区”。利用斑马鱼行为红外视频跟踪分析系统自动记录动物行为参数，通过记录斑马鱼进入“EC区”的潜伏时间即为探索时间判定其是否痴呆。

如图2所示，纵坐标是找到EC区的时间，横坐标是次数，没有训练过的对照组的鱼第一次找到EC区时间，在120秒左右，随训练次数增加找到EC区的时间逐渐减少，正常的鱼第5次找到EC区的时间约39秒，6月龄模型鱼找到EC区约50秒，寿命对照组斑马鱼经过训练后潜伏时间明显减少，空间学习记忆能力正常。而没有训练过的痴呆斑马鱼第一次找到EC区时间，也在120秒左右，经过训练后，6月龄的鱼潜伏时间比对照组的长，同时12月龄的鱼潜伏时间没有明显减少，反而增加，甚至多次训练后12月龄的鱼找到EC区的时间还是约120秒，说明本APPsw斑马鱼痴呆模型随着鱼月龄增加，痴呆情况加重，并且随着月龄增加，痴呆鱼学习记忆能力和空间学习能力下降，痴呆越发明显。

1.4APPsw斑马鱼痴呆模型病理学改变

将上述对照组的正常鱼和12月龄的APPsw痴呆斑马鱼的鱼脑取出，进行HE染色观察其病理学改变。如图3所示，A:斑马鱼各脑区示意图；B：端脑和中脑皮质HE染色结果，可见痴呆组斑马鱼端脑和中脑皮质颗粒细胞稀疏，说明APPsw痴呆斑马鱼的鱼脑皮质颗粒细胞脱落缺失严重。

1.5APPsw斑马鱼痴呆模型神经元数量变化

将6和12月龄的对照组正常斑马鱼，和3、6、9、12月龄的APPsw痴呆斑马鱼鱼脑切片进行尼氏染色，观察和统计鱼神经元数量改变。如图4所示，尼氏染色是特异性染神经元的，黑色的点都是神经元，通过黑色点的稀疏判定神经元的缺失，点少表明缺失明显。图4中的箭头所示为神经元缺失，可见正常斑马鱼神经元丰富，而APPsw痴呆斑马鱼神经元数量稀少，出现缺失现象。从统计数量上看，12月龄的APPsw痴呆斑马鱼神经元数量出现显著缺失。

1.6APPsw斑马鱼痴呆模型鱼脑组织结构变化

通过透射电镜观察对照组正常斑马鱼和12月龄APPsw痴呆斑马鱼鱼脑组织结构，如图5所示，A、C是正常斑马鱼鱼脑，C是A的局部放大；B、D是痴呆斑马鱼鱼脑，D是B的局部放大。A中小箭头所示为线粒体、内质网、突触小泡，可见正常斑马鱼鱼脑血管完整、内皮细胞饱满、线粒体、内质网、突触小泡等细胞器丰富；而APPsw痴呆斑马鱼鱼脑血管结构变化内皮细胞皱缩，线粒体、内质网、突触小泡等细胞器缺失。

1.7免疫组化检测APPsw斑马鱼痴呆模型的Aβ沉积

将12月龄的APPsw痴呆斑马鱼进行免疫组化检测，结果如图6所示，A、B:APPsw痴呆斑马鱼鱼脑Aβ1-42的表达，箭头显示了Aβ斑块；D、E：APPsw痴呆斑马鱼鱼脑Aβ1-40的表达，箭头显示Aβ斑块；C、F：WT斑马鱼脑anti-Aβ1-42和Aβ1-40；G、H、I：通过免疫荧光技术表达Aβ1-42，箭头显示在神经元中表达的Aβ斑块呈红色，箭头显示在血管中表达的Aβ；J、K、L：用刚果红标记Aβ斑块，箭头显示细胞核阳性染色。

综上，实施例1说明本发明所建立的APPsw痴呆斑马鱼模型是有效的，是发现调控APP表达的circRNA642靶标序列的研究基础。

实施例2APPsw痴呆斑马鱼脑组织高通量测序及易感基因筛选

以6月龄APPsw痴呆型斑马鱼及AB野生型斑马鱼为模型，进行RNA-seq测序分析，取对照组AB野生型雄斑马鱼和APPsw痴呆型雄斑马鱼各6条，在冰水中快速麻醉，体式解剖显微镜下解剖取出脑组织，放入离心管中，快速放入液氮中，以保证上机检测组织质量。

2.1高通量测序实验步骤

2.1.1文库构建

本实验使用NEBNext RNA超快速定向文库制备试剂盒来构建转录组文库，主要操作如下：

(1)去除rRNA并片段化：总RNA中含有多种RNA，去除核糖体RNA，然后将RNA打断；

(2)第一链cDNA合成：使用片段化的RNA为模板，在随机引物和反转录酶的作用下合成第一链cDNA；

(3)第二链cDNA的合成：使用第一链cDNA为模板进而合成第二链cDNA，第二链以T替换U；

(4)纯化双链Cdna：使用AMPure XP Beads对双链cDNA进行纯化；

(5)末端修复：对纯化后的双链cDNA进行末端修复，使其生成磷酸化平齐末端，随后在3’末端加dA形成粘性末端，以与街头上的T突出端连接；

(6)连接接头：在DNA连接酶的作用下，在双链cDNA两端连接上环形接头，随后用USER酶将环打开并断开cDNA第二链；

(7)片段筛选：用AMPure XP Beads对片段长度进行筛选，片段长度范围在300-400bp；

(8)文库富集：本实验使用高保真的DNA聚合酶进行PCR扩增，生成稳定易用的文库用于测序，最终的文库分子两端含有测序必需的接头序列，以及用于区分不同样本的index序列；

(9)构建文库纯化：使用AMPure XP Beads对测序文库纯化。

2.1.2文库质检

(1)使用Qubit Fluorometer检测文库DNA质量浓度，浓度高于1.0ng/L合格。

(2)用Qseq100 DNA Analyzer检测文库DNA长度分布，长度集中在400左右、单一峰，无接头峰和大片段峰则认为合格。

(3)使用KAPA Library Quantication Kit对文库DNA的摩尔浓度进行定量，以此作为文库混合标准。

2.1.3上机测序

将文库混合、变性后，加入到Illumina HiSeq测序平台进行高通量并行测序。

2.2生物信息分析

2.2.1数据质控与转录组文库质量评估

(1)首先对高通量测序的下机数据(Raw Data)进行过滤，得到高质量数据(CleanData)。

(2)参考基因组比对：把Clean Data与实验指定的参考基因组比对，从而计算测序数据与参考基因组的比对效率，评估测序数据的饱和度和基因的覆盖度。

2.2.2基因表达谱构建

根据以上比对结果，进行转录本组装，进而计算基因在不同样本中的表达量，从而构建基因表达谱。

2.2.3差异表达circRNA筛选与功能富集

在不同样本分组中筛选差异基因，并对差异基因进行聚类分析以及火山图等可视化展示，对差异基因进行GO/KEGG功能注释以及功能富集分析，发掘差异基因差异化表达的功能和调控关系。高通量测序结果，当筛选条件设定为P≤0.05且log2(fold_change)>1或者<-1，筛选到166个circRNA差异分子。通过starBase网站进行靶向筛选，发现其中7个circRNA与APP之间存在靶向关系，分别是circRNA642、circRNA320、circRNA1068、circRNA391、circRNA667、circRNA470、circRNA824。进一步实验发现circRNA642对APPsw痴呆斑马鱼appb的表达显著相关。所述斑马鱼源circRNA642的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，其对应的人源circRNA642的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

如图7所示，AB是野生斑马鱼，APPsw是痴呆斑马鱼，从circRNA642的表达情况来看，野生斑马鱼的circRNA642相对表达量是2.0，而痴呆斑马鱼的circRNA642相对表达量是1.2左右，差异显著；从appb的表达情况来看，野生斑马鱼相对表达量是1.4左右，而痴呆斑马鱼相对表达量是1.2左右，也就是痴呆斑马鱼自身appb的相对表达量降低了，说明痴呆斑马鱼由于过表达了外源性人源的APPsw基因，而导致与斑马鱼自身与APPsw同源性非常高的appb基因相对表达量降低了，同时与appb相对的circRNA642的表达量也降低了。所以，本发明提供的circRNA642与APP之间存在靶向关系，当circRNA642下调，则APP也下调。

实施例3AB野生型斑马鱼circRNA642与appb表达情况

已知appb是斑马鱼基因，与人源的APPsw非常相似。取3、6、9、12月龄AB野生型斑马鱼脑组织，对circRNA642与appb转录水平进行实时荧光定量分析，验证circRNA642及appb在野生型斑马鱼脑内，随着月龄的增长，表达量不断增加。

3.1样品采集

将AB野生型斑马鱼在冰水中快速麻醉，在体式解剖显微镜下解剖取出脑组织，液氮速冻，以备后续提取RNA。RNA提取利用天根总RNA提取试剂盒，具体步骤如下：

(1)打开4℃离心机；

(2)加1ml裂解液RZ；

(3)在15-30℃放置5min，分离核酸蛋白复合物；

(4)4℃，12000r/min，5min，将上清转入一个新的无RNAase的离心管中。加200μL氯仿，剧烈震荡15s，室温静置3min；

(5)4℃，12000/min，10min，取上层水相(约二分之一体积的RZ)，转入新的无RNAase的离心管；

(6)加入无水乙醇，体积为水相体积的50％，混匀，一起转入吸附柱CR3中，4℃，12000r/min，1min，弃废液；

(7)加入500μL去蛋白也RD，确保RD已按说明加入无水乙醇，4℃，12000r/min，1min，弃废液；

(8)加入500μL漂洗液RW(已按说明加入无水乙醇)，室温下放置2min，4℃，12000r/min，5min，弃废液。重复此步骤一次；

(9)将吸附柱放入收集管中，4℃，12000r/min，2min，以去除残余液体，以免抑制下游反应；

(10)将吸附柱放入新的无RNAase的吸附柱中，加入30μL RNAase-FreeddH2O，静置2min，4℃，12000r/min，2min；

(11)重复一次。利用多功能酶标仪测浓度，-80℃保存。

3.2总RNA反转录

根据TAKARA PrimeScript^TMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒进行反转录反应

(1)基因组去除反应:5ⅹgRNA Erase Buffer 2μL,gRNA Eraser 1μL,Total RNA1μg,RNAase-Free ddH2O补充至10μL。冰上配置混合液，混匀后放入PCR仪中设置程序为42℃，2min；4℃，∞。

(2)反转录体系如下：Primer Script Enzymer Mix I 1μL，RT primer Mix 1μL，5ⅹPrimer Script Buffer 2 4μL，RNAase-Free ddH2O 4μL去除基因组的RNA 10μL。混合后，放入PCR仪中，设置程序为37℃，15min；85℃，5s；4℃，∞。取出样本，稀释5倍，-20℃保存。

3.3荧光定量PCR

所用引物如下：

Danio-circRNA642 Forward：5’-CAGGGACATTAAGGGGGATAA-3’

Danio-circRNA642 Reverse：5’-GTGTTTATGCAGGGCGATTT-3’

Danio-appb Forward：5’-GGAGTTTGTGTGCTGCCCAA-3’

Danio-appb Reverse：5’-ACCGTCACCGTCTTCATCGT-3’

Danio-β-actin Forward：5’-CTCAGGATGCGGAAACTGGC-3’

Danio-β-actin Reverse：5’-CATGGACGCCCATTGTGAGG-3’

RT-qPCR反应20μL体系如下：TB green 10L，上游引物0.8L，下游引物0.8L,模板2L，ddH2O 6.4L。反应程序为：95℃，5min；95℃，10s，60℃，30s，45个循环；95℃，10s；65℃，1min；97℃，1s。使用Gradphad Prism 8.0one-way Anova进行统计分析。统计结果如图8和图9所示，以β-Actin内参的表达做比较，可见随着AB野生型斑马鱼月龄的增加，circRNA642与appb表达增加。

实施例3以野生斑马鱼模型，证明普通人随着年龄增加，APP表达增加，患AD的概率也在增加。

实施例4动物水平验证circRNA642与appb之间的关系

4.1显微注射siRNA

将斑马鱼circRNA642及appb siRNA，注入单细胞期的斑马鱼受精卵中，每只鱼卵注射约5nl siRNA。分为两组，一组注射Danio-circRNA642 siRNA，一组注射Danio-appbsiRNA。将注射后的斑马鱼受精卵放于28.5℃生化培养箱中培养，24h后收集胚胎，并提取RNA。其中所述siRNA序列如下：Danio-circRNA642 siRNA sense(斑马鱼circRNA642 siRNA正义链)：

5’-GCACUGAAACAUUUACUGAUATT-3’Danio-circRNA642 siRNA antisense(斑马鱼circRNA642 siRNA反义链)：

5’-UAUCAGUAAAUGUUUCAGUGCTT-3’

Danio-appb siRNA sense(斑马鱼appb siRNA正义链)：

5’-GGCCAAACACCGAGAGAAATT-3’

Danio-appb siRNA antisense(斑马鱼appb siRNA反义链)：

5’-UUUCUCUCGGUGUUUGGCCTT-3’

4.2实时荧光定量PCR定量分析

将注射了siRNA的干涉组和未注射的对照野生组的appb和circRNA642表达进行对比，总RNA提取方式及RT-qPCR方法同3.1-3.3。本实施例通过动物水平验证circRNA642与appb之间的关系，用siRNA干涉circRNA642和appb的表达。结论：注射appb-siRNA干涉appb后，干涉组和对照组的circRNA642表达没有变化(如图10所示)；注射circRNA642-siRNA干涉circRNA642后，干涉组和对照组的appb表达下调(如图11所示)。

实施例4说明circRNA642对appb表达有调控作用。当干涉appb表达时，虽然appb的表达被干涉，但它的调控序列仍然转录表达，相应的circRNA642也仍然在转录表达，所以circRNA642表达量没有变化，但当circRNA642被干涉以后，circRNA642的量减少了，miRNA的量就增加了，从而appb被抑制了，appb的表达量就减少了。

实施例5细胞水平验证circRNA642与APP之间的关系

5.1载体构建

调取人源circRNA642序列，同源性比对，显示斑马鱼与人源同源性高达87％，将序列利用酶切位点EcoRV和SacII构建到载体pcDNA3.1(+)circRNA Mini Vector中，并转化感受态细胞Top10，进行单克隆测序，提取构建成功的circRNA642过表达质粒，利用转染试剂PEI转染SH-SY5Y细胞，由于pcDNA3.1(+)circRNA Mini Vector缺少报告基因，将pcDNA3.0mRPF作为转染对照(如图12所示)因为质粒中带有红色基因，起到示踪作用(图中亮点)，图12表明circRNA642基因在细胞内有表达。

5.2瞬时转染

(1)吸取97ul无血清和抗生素的DMEM培养基到无菌的1.5mL离心管中，加入3ul转染试剂PEI并吹打混匀，室温放置5分钟；

(2)向上述混合液中加入1ug质粒DNA并混匀，室温放置15分钟；

(3)将上述混合液滴加到细胞培养盘，并轻轻摇匀。置于37℃培养箱培养；

(4)4-6小时后更换成新鲜的培养基。

5.3实时荧光定量PCR定量分析

收集转染24h的细胞，并提取总RNA，进行实时荧光定量PCR定量分析，总RNA提取方式及RT-qPCR方法同3.1-3.3。

所用引物如下：

circRNA642 F：5’-CCGGGACATAAAGGGTGACAA-3’

circRNA642 R:5’-GCAATGCTATTTCTTCATGCAGG-3’

APP F：5’-CCGGGACATAAAGGGTGACAA-3’

APP R:5’-GCAATGCTATTTCTTCATGCAGG-3’

β-actin F:5’-GGCGGCACGACCATGTACCT-3’

β-actin R:5’-AGGGGCCGGACTCCTCATACT-3’。

如图13所示，ck是对照组，空是指转染的空载体，转1和2是携带circRNA642质粒的转染第一次和转染第二次的结果。左侧图是circRNA642表达结果，ck、空1和空2几乎没有表达，而转1相对表达量是0.5左右，转2相对表达量是0.7左右。右图APP的相对表达量，ck和空1、2的相对表达量是0.06多一点，而转1和2的相对表达量是接近0.1。从图13可见，当人源神经细胞(SH-SY5Y细胞)过表达circRNA642时，APP的表达也增加，说明可以用circRNA642来调控APP的表达吗。

实施例1-5，应用本发明提供的APPsw转基因斑马鱼痴呆模型，证明了circRNA642是调控APP表达的靶标位点序列之一，可应用于防治阿尔茨海默病上。本发明提供的APPsw转基因斑马鱼痴呆模型可应用在评价药物调控APP表达效果中，也可以用来评价药物防治阿尔茨海默病的效果。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 一种调控APP表达的靶标位点序列及其在防治AD上的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 371

<212> DNA/RNA

<213> 人(Human)

<400> 1

atactctcag cccctgcatg aagaaatagc attgcataaa cacctgaagc acaaaaatat 60

tgtccagtat ctgggctctt tcagtgagaa tggtttcatt aaaatcttca tggagcaggt 120

ccctggagga agtctttctg ctctccttcg ttccaaatgg ggtccattaa aagacaatga 180

gcaaacaatt ggcttttata caaagcaaat actggaagga ttaaaatatc tccatgacaa 240

tcagatagtt caccgggaca taaagggtga caatgtgttg attaatacct acagtggtgt 300

tctcaagatc tctgacttcg gaacatcaaa gaggcttgct ggcataaacc cctgtactga 360

aacttttact g 371

<210> 2

<211> 371

<212> DNA/RNA

<213> 斑马鱼(Brachydaniorerio)

<400> 2

atattcacag cctctgcatg aagaaatcgc cctgcataaa cacctcaagc acaagaacat 60

cgtgcagtac ctcggctcca tcagcgagaa cggcttcatc aagatcttca tggagcaggt 120

tcctggaggc agcctgtcag cattgcttcg ttcaaagtgg ggtcctctaa aaaacaatga 180

gcccaccatt ggcttctaca ctaagcagat tctggatggt cttaaatacc tgcatgacaa 240

ccagatcgtt cacagggaca ttaaggggga taatgtcttg ataaacacct acagtggagt 300

tttgaaaatc tccgattttg gaacgtccaa acgtctggct ggaataaacc cctgcactga 360

aacatttact g 371

Claims (7)

1.一种调控APP表达的靶标位点序列，其特征在于，该靶标位点序列为环状RNA分子circRNA642，其人源核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述调控APP表达的靶标位点序列，其特征在于，所述circRNA642的斑马鱼源核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示。

3.一种APPsw转基因斑马鱼痴呆模型，其特征在于，在这种痴呆斑马鱼中APPsw过表达，而circRNA642表达下调。

4.权利要求1或2所述circRNA642靶标位点序列在调控APP表达中的应用。

5.权利要求1或2所述circRNA642靶标位点序列在防治阿尔茨海默病上的应用。

6.权利要求3所述APPsw转基因斑马鱼痴呆模型在评价药物调控APP表达效果中的应用。

7.权利要求3所述APPsw转基因斑马鱼痴呆模型在评价药物防治阿尔茨海默病效果上的应用。

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