CN112126648A - 一种环状RNA circ_029155及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种环状RNA circ_029155及其应用，本发明以3月龄(性成熟前)、1岁龄(性成熟后)和3岁龄(成年)的健康雄性藏绵羊睾丸组织作为试验材料，通过RNA‑seq技术及相关生物信息学分析方法对睾丸中circRNA进行鉴定分析，筛选出与睾丸发育相关的环状RNA circ_029155，如SEQ ID No：1所示，进而了解其在绵羊精子发生及睾丸功能维持中的作用机制。在此基础上，本发明公开了上述环状RNA circ_029155在作为检测藏绵羊睾丸功能或发育状况的标志物、在制备调控藏绵羊睾丸功能或发育的药物以及在下游靶基因BOLL的表达分析或研究中的应用。本发明环状RNA circ_029155能够用于检测和评价绵羊的睾丸发育和生精功能，为进一步探索绵羊睾丸发育及精子发生的分子作用机制以及后续应用开发奠定基础。

Description

一种环状RNA circ_029155及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种环状RNA circ_029155及其应用。
背景技术
睾丸组织作为雄性动物特有的生殖器官，主要生物学功能是产生雄性配子 (精子发生)和分泌雄激素，是种族繁衍不可或缺的。揭示睾丸发育的调控机理对于提高种公畜的繁殖力及防治繁殖障碍性疾病具有重要意义。然而，目前在家畜，尤其绵羊上有关睾丸功能维持的分子机理还远未阐明。藏绵羊主要分布于海拔3000米以上的青藏高原及其毗邻地区，是当地农牧民重要的生产生活资料，并且在草地生态系统中扮演重要角色。然而，由于其长期放牧且缺乏补饲，其具有发育周期长、性成熟晚、繁殖力低等生殖特点，是探究种公羊睾丸发育及功能维持调控机制的理想绵羊品种。
环状RNA(circRNA)是前体mRNA在成熟过程中形成的一类丰富表达且具有闭合环状结构的内源性非编码RNA。其作为一种竞争性非编码RNA，可充当miRNA的海绵，从而调控下游基因的表达与功能。然而，目前尚未有 circRNA在绵羊睾丸发育及功能维持检测方面的应用。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种环状RNA circ_029155及其应用。
本发明是这样实现的，一种环状RNA circ_029155，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
本发明进一步公开了上述环状RNA circ_029155在作为检测藏绵羊睾丸功能或发育状况的标志物中的应用。
本发明进一步公开了上述环状RNA circ_029155在制备调控藏绵羊睾丸功能或发育的药物中的应用。
优选地，所述环状RNA circ_029155调控藏绵羊睾丸功能和发育是通过如下方式实现：所述环状RNA circ_029155竞争性靶向结合oar-miR-760-3p以调控下游靶基因BOLL的表达，实现藏绵羊睾丸功能或发育的调控。
本发明进一步公开了上述环状RNA circ_029155在下游靶基因BOLL的表达分析或研究中的应用。
为克服现有技术的缺点和不足，本发明公开了一种环状RNA circ_029155 及其应用。本发明环状RNA circ_029155的筛选方法包括步骤：
(1)对各具有4个生物学重复的3月龄、1岁龄和3岁龄藏绵羊睾丸组织进行circRNA测序；(2)根据测序数据，对3个年龄组间的差异表达circRNA 进行鉴定分析；(3)基于ceRNA假说，构建差异表达circRNAs的 circRNA-miRNA-mRNA网络；(4)对网络中的circRNA靶基因(mRNA)进行功能注释与富集分析；(5)基于上述分析发现，circ_029155可能靶向结合 oar-miR-760-3p而调控下游靶基因BOLL的表达与功能，进而参与调节藏绵羊睾丸发育与功能维持；(6)采用双荧光素酶报告系统对circ_029155和 oar-miR-760-3p以及oar-miR-760-3p和BOLL间的结合位点进行验证；(7)运用实时荧光定量PCR法对各具有8个生物学重复(含circRNA测序的4个生物学样本)的上述3个年龄组的睾丸组织中circ_029155、oar-miR-760-3p和BOLL 的表达量进行检测与验证。
在确定circ_029155、oar-miR-760-3p、BOLL的靶向竞争关系以实现藏绵羊睾丸功能或发育的调控的基础上，本发明可将上述环状RNA circ_029155在作为检测藏绵羊睾丸功能或发育状况的标志物，例如对环状RNA circ_029155 的表达丰量或circ_029155、oar-miR-760-3p、BOLL三者之间表达模式的相关性检测，根据检测结果为标记物判定绵羊睾丸功能、生精功能和发育状况；或者，本发明可将上述环状RNA circ_029155在作为制备调控藏绵羊睾丸功能或发育的外源性药物中的应用，该药物形式包括但不限于化学合成或重组表达等形式，定向表达或抑制表达下游相关靶标分子以调整靶向竞争关系，以最终实现藏绵羊睾丸功能或发育的调控；或者，本发明可将上述环状RNA circ_029155 在对绵羊睾丸发育及精子发生的分子作用机制的进一步研究中的应用，以丰富绵羊睾丸组织的转录组信息，进而了解其在绵羊精子发生及睾丸功能维持中的作用机制，为进一步深入揭示睾丸发育调控机制及高繁殖力种公羊选育提供理论基础。
相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：本发明环状 RNAcirc_029155能够用于检测和评价绵羊的睾丸发育和生精功能，丰富了绵羊睾丸组织的转录组信息，为进一步探索绵羊睾丸发育及精子发生的分子作用机制奠定了基础。
附图说明
图1为本发明实施例中circ_029155与oar-miR-760-3p(图a)和 oar-miR-760-3p与BOLL(图b)之间结合位点的双荧光素酶检测结果；
图2为本发明实施例中circ_029155的qRT-PCR检测结果与RNA-seq分析比对结果；
图3为本发明实施例中BOLL的表达量结果；
图4为本发明实施例中oar-miR-760-3p的表达量结果；
图5为本发明实施例中基于Sanger测序的circ_029155环化位点序列验证结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一、试验动物及样品收集
本申请选取3月龄、1岁龄和3岁龄雄性健康藏绵羊各8只，所有羊只遗传背景相似(相同父本，不同母本)，在海拔3000～3500m的天然草场围栏放牧，昼夜自由采食，无补饲。同一年龄组试验羊具有相似体重。屠宰后，收集每只羊右侧睾丸组织，用PBS冲洗血液并剥去白膜后，将其剪成小块，液氮速冻后存放于-80℃用于总RNA提取。
二、总RNA提取与质检
冻存的睾丸组织经液氮快速研磨后，使用Trizol试剂(Invitrogen)进行总 RNA提取。RNA质量和浓度分别经Agilent 2100生物分析仪和NanoDrop分光光度计进行评估，所有RNA完整值(RIN)大于7.5。随机选取每个年龄组的 4份RNA样本(来自4只试验羊)用于RNA-seq分析，而所有8只试验羊的睾丸RNA样本用于测序结果的验证。
三、文库构建及测序
去除总RNA中的核糖体RNA(rRNA)，剩余的RNA加入fragmentation buffer使其片断化为约200bp的短片段，进而以其为模板，合成双链cDNA。随后，经纯化、末端修复、加碱基A，并连接测序接头，再经琼脂糖凝胶电泳回收目的大小片段，进行PCR扩增，构建好的文库用Illumina HiSeqTM 4000进行测序。
四、原始测序数据质控
原始下机的测序数据，经下述步骤进行质控与过滤：
(1)去除含接头(adapter)的reads；
(2)去除含N较多(N占比大于10％，N表示不确定碱基序列信息)的 reads；
(3)去除低质量reads(质量值Q≤20的碱基数占整个reads的50％以上)。
五、circRNA鉴定及差异表达分析
基于所获得的高质量reads，去除通过bowtie2(2.2.8)工具比对上rRNA 的reads后，使用TopHat2(2.1.1)软件将其比对到绵羊参考基因组(Oar_v4.0) 上。提取剩余未比对上的reads两端序列(各20bp)，使用bowtie2比对工具重新比对到绵羊参考基因组上，得到的比对结果使用Find_circ进行circRNA鉴定。本发明所述circ_029155测序结果如SEQ IDNo：1所示。
采用RPM(每百万条reads中来自某一circRNA的reads数目)方法对鉴定到的circRNA进行定量分析，随后运用edgeR包，基于两个年龄组间表达量差异倍数>2且P值<0.05的阈值鉴定差异表达circRNAs。在3月龄vs 1岁龄、1岁龄vs 3岁龄、3月龄vs 3岁龄藏绵羊睾丸中分别发现3982、414、4060 个circRNAs是差异表达的。
六、circRNA-miRNA-mRNA调控网络及靶基因功能注释
根据前期源自相同藏绵羊睾丸样本的miRNA和mRNA测序数据，运用 Mireap、miRanda和TargetScan软件对miRNA与靶基因(circRNA和mRNA) 之间的相互作用进行预测。
进一步，基于“ceRNA假说”，选取miRNA与候选ceRNA间存在靶向关系且表达量负相关，而候选ceRNA之间表达量正相关的关系对，用于构建 circRNA-miRNA-mRNA调控网络。
随后，使用基因本体论(GO)数据库(http://www.geneontology.org/)对 circRNA的靶基因进行功能注释。通过分析寻找到差异表达环状RNA circ_029155与oar-miR-760-3p存在潜在的结合位点，并且oar-miR-760-3p与 BOLL存在靶向结合位点。BOLL作为circ_029155的下游靶基因，主要涉及生殖过程(GO:0022414)、配子产生(GO:0007276)、雄性配子生成(GO:0048232)、发育过程(GO:0032502)、细胞发育过程(GO:0048869)、细胞核分裂(GO:0000280)等生物学过程。
上述分析结果表明，circ_029155在正常的绵羊睾丸发育及功能维持(精子发生与形成)中发挥重要作用。
七、双荧光素酶基因报告系统验证靶向关系
将含有oar-miR-760-3p假定结合位点的绵羊BOLL基因3′UTR (XM_004004798.4，核苷酸位点1539～1843)和circ_029155的野生型(WT) 序列，以及它们对应的突变型(MUT)序列克隆至pmirGLO双荧光素酶miRNA 靶向表达载体(Promega，美国)的Xho I和Sal I位点。其中，所述circ_029155 野生型(WT)序列如SEQ ID No：2所示，所述circ_029155突变型(MUT) 序列如SEQ ID No：3所示，所述BOLL野生型(WT)序列为SEQ ID No：4 所示，所述BOLL突变型(MUT)序列SEQ ID No：5所示。
oar-miR-760-3p的模拟物(mimic)及其阴性对照物(mimic NC)由吉玛制药技术有限公司(上海)合成。复苏购自北京北纳生物的HEK-293T细胞，以 1.0×105/孔的密度接种于24孔板中，使用含10％FBS的DMEM高糖培养基，在5％CO2、37℃恒温箱静置培养24h后(汇合率为70％～80％)，根据 LipofectamineTM 2000转染试剂盒(Invitrogen，USA)操作说明，将构建的野生型及突变型重组双荧光素酶报告载体分别与对应的mimic或mimic NC共转染至293T细胞。48h后收集细胞，采用E1910双荧光素酶报告基因检测试剂盒 (Promega，USA)测定相对荧光素酶活性，结果以萤火虫荧光素酶活性与海肾素荧光素酶活性的比值来表示。每个试验设置3个重复，结果见附图1。相比对照组(mimic NC)，oar-miR-760-3p显著降低了293T细胞中的野生型BOLL 3′UTR(P＜0.01)和野生型circ_029155(P＜0.05)报告者的荧光素酶活性，但对相应的突变型报告者均无明显影响。这些结果表明，环状RNA circ_029155 可与BOLL共同竞争性靶向结合oar-miR-760-3p。
八、实时荧光定量PCR检测及Sanger测序
以上述第二部分内容中提取的所有RNA样本为模板，反转录合成第一链 cDNA。所涉及的反转录体系及条件如下：对于circRNA和mRNA而言，向0.2 mL PCR管(RNase-free)中加入1μL RNA模板(500ng/μL)、1μL gDNA Clean Reagent、2μL 5×gDNA Clean Buffer和6μL无RNase酶水，42℃孵育2min以去除基因组DNA，然后依次加入1μL Evo M-MLV RTaseEnzyme Mix(艾克瑞，湖南)、1μL RT Primer Mix(艾克瑞，湖南)、4μL 5×RTase ReactionBuffer Mix I和4μL无RNase酶水，在37℃孵育15min，85℃终止5s使酶失活；对于 miRNA而言，向0.2mL PCR管(RNase-free)中依次加入3.75μL RNA模板、 5μL mRQ Buffer(2×)和1.25μL逆转录酶(mRQ Enzyme，Takara，Japan)，在37℃孵育1h，随后85℃终止5min使酶失活。
随后，以cDNA为模板，使用LightCycler 96实时荧光定量PCR仪(Roche，瑞士)进行qRT-PCR扩增。以β-actin和U6分别作为内参，对circRNA/mRNA 和miRNA的表达量进行校正。
本发明所涉及的qRT-PCR扩增反应体系由1μL cDNA、0.4μL上游引物(10 μmol/L)、0.4μL下游引物(10μmol/L)、10μL 2×SYBR Green Pro Taq HS Premix (艾克瑞，湖南)和8.2μL ddH2O组成。qRT-PCR扩增反应体系中的引物信息见如下表1所示：
表1用于实时荧光定量PCR扩增的引物信息
Figure DEST_PATH_IMAGE001
qRT-PCR扩增程序采用两步法：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火 30s，共40个循环。
采用2-△△Ct方法对circ_029155、oar-miR-760-3p和BOLL的表达量进行计算。用SPSS21.0软件进行单因素方差分析，结果用均值±标准差(Mean±SD) 表示。采用Duncan多重检验比较各组间的差异，P<0.05和P<0.01分别表示组间差异显著和极显著。随着年龄的增加，circ_029155表达量逐渐增加，这与测序结果一致(见附图2)；BOLL表达量也呈现逐渐增加趋势(见附图3)(与 circ_029155改变趋势呈正相关)；oar-miR-760-3p的表达量呈现逐渐下降趋势 (见附图4)。
鉴于circRNA是反向剪切成环的，进一步对circ_029155的qRT-PCR扩增产物进行Sanger测序(擎科，西安)以验证其环化位点序列的可靠性，结果显示，其与测序结果获得的环化位点序列信息完全一致且反向成环(见附图5)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure BDA0002712180800000091
Figure BDA0002712180800000101
Figure BDA0002712180800000111
Figure BDA0002712180800000121
Figure BDA0002712180800000131

Claims (5)

1.一种环状RNA circ_029155，其核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
2.权利要求1所述的环状RNA circ_029155在作为检测藏绵羊睾丸功能或发育状况的标志物中的应用。
3.权利要求1所述的环状RNA circ_029155在制备调控藏绵羊睾丸功能或发育的药物中的应用。
4.权利要求3所述的应用，其特征在于，所述环状RNA circ_029155调控藏绵羊睾丸功能和发育是通过如下方式实现：所述环状RNA circ_029155竞争性靶向结合oar-miR-760-3p以调控下游靶基因BOLL的表达，实现藏绵羊睾丸功能或发育的调控。
5.权利要求1所述的环状RNA circ_029155在下游靶基因BOLL的表达分析或研究中的应用。
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