CN108753997A

CN108753997A - 一种用于检测布氏菌的荧光定量重组酶聚合酶扩增方法

Info

Publication number: CN108753997A
Application number: CN201810434374.2A
Authority: CN
Inventors: 陈义平; 秦立得; 南文龙; 陈羽琪
Original assignee: CHINA ANIMAL HEALTH AND EPIDEMIOLOGY CENTER
Current assignee: CHINA ANIMAL HEALTH AND EPIDEMIOLOGY CENTER
Priority date: 2018-05-08
Filing date: 2018-05-08
Publication date: 2018-11-06

Abstract

本发明提供通用型布氏菌的荧光定量RPA快速检测方法，本发明引物组及方法的优点如下：1)高效灵敏：20min即可完成扩增，扩增模板的最低检出限为10个拷贝；2)特异性强：采用PRA引物组和荧光探针特异性对布氏菌进行检测，与常见非布氏菌株无交叉反应；3)操作简便：配置好的RPA反应体系，设置好反应程序，置于荧光定量PCR仪或RPA反应仪中。4)高通量：可一次性进行大量样品检测，结果判定与统计由程序自动完成。

Description

一种用于检测布氏菌的荧光定量重组酶聚合酶扩增方法

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种应用重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification，RPA)进行布氏菌荧光定量快速检测方法。

背景技术

布氏菌病(简称布病)是由布氏菌引起的人兽共患病，近年来该病在我国呈扩散趋势，给畜牧业造成了重大损失并严重威胁公共卫生安全。布氏菌可感染猪、牛、羊、犬、鼠等多种哺乳动物，其中对公共卫生和畜牧业影响严重的为牛种布氏菌、羊种布氏菌、猪种布氏菌、绵羊附睾种布氏菌、犬种布氏菌和沙林鼠种布氏菌6种经典种型。布氏菌病主要危害动物的生产性能，公畜出现睾丸炎、附睾炎、精囊坏死等症状，患病母畜出现胎盘炎、乳房炎、流产、不孕不育等症状。人类由于接触布氏菌污染的环境、患病动物分泌物、尸体及产品而感染发病，患者病情反复不易彻底治愈，出现乏力、发热、盗汗、关节酸痛等症状，严重者丧失劳动能力。因此，实现布氏菌的快速检测，对该病的诊断、防控及净化具有重要意义，从而降低该病造成的损失以及公共卫生风险。

RPA是近年新开发的恒温核酸扩增技术，该技术在36～40℃恒温条件下，通过重组酶、聚合酶和单链DNA结合蛋白的作用，在20min内实现目的基因的大量扩增，具有特异性强、灵敏度高、反应速度快、操作简便等优点，并且反应仪器简单便携。根据反应原理和使用探针的差异，RPA分为普通RPA、exo-RPA、nfo-RPA和fpg-RPA，反应结果可通过琼脂糖凝胶电泳、荧光定量扩增曲线和LFD测流层析试纸条进行判定，因此在设计RPA检测方法时应根据需求设计相应的引物和探针。exo-RPA、nfo-RPA和fpg-RPA方法都可以通过荧光定量扩增曲线法判定结果，可实现样品的快速高通量检测，适用于检验检疫和流行病学调查；此外，nfo-RPA方法还可通过LFD试纸条读取检测结果，适用于野外及现场快速检测。

洪彬等申请了一种用于现场快速检测布鲁氏菌的通用RPA方法及其配套试剂盒(申请号201510293311.6)，该方法采用LFD测流层析试纸检测试验结果，反应完成后人工观察并判定检测结果。Hang Ren等(Ren，Y.Z.,et al.,Development of a rapidrecombinase polymerase amplification assay for detection of Brucella in bloodsamples.Molecular and Cellular Probes,2016.20:p.122.)公开了一种基于RPA方法建立的用于检测血液样品中布氏菌的荧光定量RPA方法。该方法扩增并检测的目的基因为Omp31蛋白编码基因，但该基因已经被证实在牛种布氏菌基因组中缺失，因此该方法不适用于牛种布氏菌的检测。

发明内容

本发明的目的是提供通用型布氏菌的荧光定量RPA快速检测方法，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供用于检测布氏菌的荧光定量RPA引物组和荧光探针，引物和探针信息如下：

BCSP 31-F:5'-TGCATCCCGGCGCAGAACGCTTTTACAAGGAA-3'、

BCSP 31-R:5'-ATAACGAGCTGCCGCAATGTCACCCTTCAATT-3'、

BCSP 31-Probe:5'-GCGGGCGTGCTGAAATAATCCCTCAAT

GA-FAM-dT-THF-GG-BHQ1-dTTCCTGATATCTTA-dSpacer-3'

其中，FAM-dT表示携带有荧光素基团的胸腺嘧啶核苷酸，THF表示四氢呋喃连接子，BHQ1-dT表示携带有荧光淬灭基团BHQ1的胸腺嘧啶核苷酸，3'用dSpacer阻断链的延伸。

本发明提供一种利用上述荧光定量RPA引物组和荧光探针检测布氏菌的方法，包括如下步骤：

1)待检测基因组DNA的提取：用细菌基因组DNA提取试剂盒(QIAGEN公司)提取细菌DNA；

2)RPA步骤：将本发明设计荧光定量RPA引物组和荧光探针及各反应组分，分别加入反应体系中，40℃反应20min，每30s收集一次FAM荧光信号。

3)结果检测：依据荧光定量扩增曲线判定检测结果。

本发明的荧光定量RPA引物组可用于制备检测试剂盒。

本发明引物组及方法的优点如下：1)高效灵敏：20min即可完成扩增，扩增模板的最低检出限为10个拷贝；2)特异性强：采用PRA引物组和荧光探针特异性对布氏菌进行检测，与常见非布氏菌株无交叉反应；3)操作简便：配置好的RPA反应体系，设置好反应程序，置于荧光定量PCR仪或RPA反应仪中。4)高通量：可一次性进行大量样品检测，结果判定与统计由程序自动完成。

附图说明

图1：阳性结果荧光扩增曲线图，其中：曲线1.阳性对照，质粒DNA的荧光扩增曲线；曲线2.阴性对照，水的荧光扩增曲线。

图2：荧光定量RPA方法检测阳性质粒DNA的灵敏度检测荧光扩增曲线图，其中：曲线1～7.质粒DNA的浓度分别为10⁷拷贝/μL、10⁶拷贝/μL，10⁵拷贝/μL、10⁴拷贝/μL、10³拷贝/μL、10²拷贝/μL、10¹拷贝/μL；曲线8.阴性对照。

图3:荧光定量RPA方法特异性检测荧光扩增曲线图，其中：曲线1.Brucella suisbiovar 1S1330；曲线2.B.suis biovar 2Thomsen；曲线3.B.suis biovar 3 686；曲线4.B.suis biovar 4 40；曲线5.B.abortus biovar 1A544；曲线6.B.abortus biovar 286/8/59；曲线7.B.abortus biovar 3Tulya；曲线8.B.abortus biovar 4 292；曲线9.B.abortus biovar 5B3196；曲线10.B.abortus biovar 6 870；曲线11.B.abortusbiovar 7 63/75；曲线12.B.abortus biovar 9C68；曲线13.B.melitensis biovar 1 16M；曲线14.B.melitensis biovar 2 63/9；曲线15.B.melitensis biovar 3Ether；曲线16.B.ovis 63/290；曲线17.B.canis RM6/66；曲线18.B.neotomae 5K33；曲线19.S2；曲线20.104M；曲线21.M5-90；曲线22.Escherichia coli K99；曲线23.Pasteurella multocidaC48-1；曲线24.Streptococcus suis ST171；曲线25.Pseudomonas aeruginosa DI-1；曲线26.阳性对照；曲线；27.阴性对照。

具体实施方式

下面结合实例对本发明的方法进行详细的描述。

一、用于检测布氏菌的RPA引物和荧光探针的设计

BCSP 31基因是布氏菌高度保守的基因，也是分子生物学方法检测布氏菌常选的靶基因，存在于所有的布氏菌中。本发明使用Oligo软件首先根据BCSP 31基因设计了适用于布氏菌通用检测的多组引物和荧光探针。设计筛选合适的引物是进行荧光定量RPA反应的关键，首先按exo-RPA方法要求设计了长度为46nt的探针。随后在探针的上游和下游位置设计引物，引物设计的要求包括：引物5′端最好为C，并避免出现连续的G，3′端最好为C或G；引物中避免出现回文序列、连续重复序列以及发卡结构；引物GC含量控制在30％～70％；引物长度最好为30～35nt，并避免形成引物二聚体。上游和下游引物按排列组合的方式列出所有可能的引物对，并统一进行试验，以筛选检测效果最好的引物对与荧光探针组合。

使用上述引物和荧光探针检测时，荧光定量RPA特异性扩增布氏菌目的基因并产生荧光信号，通过荧光定量扩增曲线即可判断检测样品是否来源于布氏菌。引物由北京睿博兴科生物技术有限公司合成，荧光探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物和荧光探针见表1。

表1荧光定量RPA引物和荧光探针

二、荧光定量RPA的效果检测

1.1试验材料

菌株：使用的布氏菌常见种、生物型参考株及布氏菌疫苗株，见表2；四个非布氏菌参考菌株：大肠杆菌K99、巴氏杆菌C48-1、猪链球菌ST171、绿脓杆菌DI-1。

表2：使用的布氏菌株及登录号

1.2细菌DNA提取

将上述菌株菌种接种于胰蛋白琼脂培养基，37℃培养24～72h，根据需要不添加或添加5～10％CO₂。培养菌落用含0.5％甲醛的生理盐水洗涤后，37℃灭活24h，用细菌基因组DNA提取试剂盒(QIAGEN公司)提取细菌DNA，微量核酸蛋白测定仪测定细菌基因组DNA浓度，-20℃冻存备用。

1.3质粒DNA标准品制备

分析布氏菌BCSP 31基因序列使用Oligo软件设计PCR引物，以布氏菌104M株为模板扩增BCSP 31基因片段(860bp)，并克隆到pEASY-T1载体中，质粒转化到工程菌中扩增，提取质粒并送北京睿博兴科生物技术有限公司测序，测序结果经NCBI BLAST比对证明与预期完全一致，质粒命名为pEASY-T1-BCSP 31。使用 dsDNA HS Assay Kit(lifetechnologies)测定质粒DNA浓度，并进行10倍倍比稀释，质粒浓度为10¹⁰～10¹拷贝/μL，-80℃保存备用。

1.4荧光定量RPA反应体系及条件

引物组和探针反应体系为：

反应条件：40℃20min，每30s进行一次FAM荧光信号采集。

1.5方法灵敏度评价

用荧光定量RPA方法分别检测浓度为10⁷～10¹拷贝/μL的质粒DNA标准品，每个反应加入1μL作为模板。评估该方法检测布氏菌株的灵敏性。

1.6方法的特异性评价

分别提取布氏菌常见种、生物型参考株与布氏菌疫苗株(见表2，编号1～23)以及大肠杆菌K99、巴氏杆菌C48-1、猪链球菌ST171、绿脓杆菌DI-1的基因组DNA。用所建立布氏菌荧光定量RPA检测体系进行特异性试验。以无菌水代替细菌DNA模板作为阴性对照。评估该方法检测布氏菌株的特异性。

2结果与分析

2.1以质粒DNA为模板，布氏菌荧光定量RPA扩增后出现典型扩增曲线(含明显对数增长期)，且Ct值≤18；以无菌水代替质粒DNA模板，荧光定量RPA后未出现扩增信号，无Ct值。

2.2荧光定量RPA灵敏度检测结果

图2显示，荧光定量RPA检测质粒DNA的灵敏度为10拷贝/反应。

2.3荧光定量RPA特异性检测结果

图3显示，荧光定量RPA方法可检测样品盘中常见种、生物型布氏菌及疫苗株基因组DNA，与大肠杆菌、巴氏杆菌、猪链球菌、绿脓杆菌基因组DNA均无交叉反应。结果说明，本研究建立的荧光定量RPA方法特异性好，灵敏度高，可实现布氏菌的有效检测。

上述结果表明，本发明的布氏菌通用型荧光定量RPA引物、荧光探针及检测方法灵敏度高，特异性好，可快速有效地检测样品是否为布氏菌株。而且，操作简便，反应时间短，可同时进行大批量样品检测。

Claims

1.一种用于检测布氏菌的荧光定量RPA引物组和荧光探针，其特征在于，所述的引物和探针的信息如下：

BCSP 31-F:5'-TGCATCCCGGCGCAGAACGCTTTTACAAGGAA-3'、

BCSP 31-R:5'-ATAACGAGCTGCCGCAATGTCACCCTTCAATT-3'、

BCSP 31-Probe:5'-GCGGGCGTGCTGAAATAATCCCTCAAT GA-FAM-dT-THF-GG-BHQ1-dTTCCTGATATCTTA-dSpacer-3'；

2.权利要求1所述的物组和荧光探针再制备检测布氏菌的制品中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的制品为荧光定量RPA检测试剂盒。

4.一种荧光定量RPA检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含有权利要求1所述的物组和荧光探针。

5.一种利用权利要求1所述的物组和荧光探针检测布氏菌的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：

1)待检测基因组DNA的提取：用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA；

2)RPA步骤：将权利要求1所述的物组和荧光探针及各反应组分，分别加入反应体系中，40℃反应20min，每30s收集一次FAM荧光信号；

3)结果检测：依据荧光定量扩增曲线判定检测结果。