CN109486974A - 一种布鲁氏杆菌重组酶聚合酶扩增检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种布鲁氏杆菌重组酶聚合酶扩增检测试剂盒及其应用 Download PDF

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曹小安
周建华
刘永生
尚佑军
李学瑞
兰喜
葛志毅
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Abstract

本发明属于基因工程技术和诊断试剂技术领域，具体涉及一种布鲁氏杆菌重组酶聚合酶扩增(RPA)检测试剂盒及应用，所述检测试剂盒包括特异性引物组和探针。本发明以试纸条检测RPA扩增产物，只需10min左右扩增后，滴加至试纸条内读取结果，不需要PCR扩增仪器及定量PCR仪。所得的方法具有特异性强、敏感性好、操作过程简单、检测快速等优点，为野外田间布病的检测提供了一种可能，也为不以疾病的诊断和治疗为目的的对布鲁氏杆菌的研究提供了一种方法。

Description

一种布鲁氏杆菌重组酶聚合酶扩增检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术和诊断试剂技术领域，具体涉及一种布鲁氏杆菌重组酶聚合酶扩增(RPA)检测试剂盒及应用。
背景技术
布鲁氏杆菌病(brucellosis)简称布病，是布鲁氏杆菌(brucella)引起的细菌性人兽共患病，有急性，亚急性和慢性几种形式。其病原布鲁氏杆菌为革兰氏阴性兼性细胞内寄生菌，可由口、鼻、咽喉、结膜等途径侵害易感动物，造成妊娠母畜流产、死胎，及公畜睾丸炎等主要症状，同时伴有发热、关节疼痛、淋巴结肿大等症状，对养殖业发展造成了巨大经济损失，同时作为一种典型的人兽共患病，对人类的健康也存在着极大的威胁。
现在实验室布病主要诊断技术为血清学检测和定量PCR检测，血清学检测由于抗原蛋白分离纯化的不同，其检测抗体不同，易与其他检测结果出现分歧。定量PCR检测是目前有效的检测方法，特异性高，但是由于其需要PCR仪器及操作场地人员限制，并不利于野外田间的检测。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种布鲁氏杆菌重组酶聚合酶扩增(RPA)检测试剂盒，只需要在恒温器中加入基因组短暂扩增后，取扩增产物在侧流试纸上进行检测即可，相比于传统RPA扩增产物荧光检测方法而言，具有特异性强、敏感性好、操作过程简单、检测快速等优点，为野外田间检测提供一种可能，同时也为不以疾病的诊断和治疗为目的的对布鲁氏杆菌的研究提供了一种方法。
本发明提供用于检测布鲁氏杆菌的重组酶聚合酶扩增引物组和探针，所述引物组和探针分别为：
所述上游引物为：ggtgttgaaggtgatgcaggttattcctgggccaa；
所述下游引物为：biotin-cggcaataccagccgtgaggtacggcataac；
所述RPA探针为：FAM-ggcctggaagtcaagcagggctttgaaggctc(THF)ctgcgtgcccgcgtcgg-C3space。
本发明提供一种布鲁氏杆菌重组酶聚合酶扩增检测试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组和探针。
作为优选，所述试剂盒还包括Rehydration Buffer，RNase Inhibitor和dH2O、DNA样本和乙酸镁。
作为优选，所述试剂盒中，上下游引物的浓度为10μM，RPA探针的浓度为10μM。
本发明提供上述试剂盒在如下任一中的应用：
(1)不以疾病的诊断和治疗为目的的检测或辅助检测布鲁氏杆菌；
(2)制备用于检测或辅助检测布鲁氏杆菌的产品；
(3)不以疾病的诊断和治疗为目的的检测或辅助检测待测动物样品是否感染布鲁氏杆菌；
(4)制备用于检测或辅助检测待测动物样品是否感染布鲁氏杆菌的产品；
(5)不以疾病的诊断和治疗为目的的检测病菌是否为布鲁氏杆菌；
(6)制备用于检测或辅助检测待测病菌是否为布鲁氏杆菌的产品。
本发明提供一种检测或辅助检测待测动物样品是否感染布鲁氏杆菌的方法，该方法不以疾病的诊断和治疗为目的，包括以下步骤：
(1)以待测动物样品中提取的基因组DNA作为模板，采用权利要求1-4任一项所述的试剂盒进行重组酶聚合酶扩增快速等温扩增，得到扩增产物；
(2)将扩增产物用PCRD试剂盒侧流试纸进行检测，判断检测结果：当出现质控带时，出现阳性条带为待测动物样品感染布鲁氏杆菌。
作为优选，步骤(1)中，所述快速等温扩增的方法为：在38℃反应10min。
本发明提供一种检测或辅助检测待测病菌是否为布鲁氏杆菌的方法，该方法不以疾病的诊断和治疗为目的，包括以下步骤：
(1)以待测病菌中提取的基因组DNA作为模板，采用权利要求1-4任一项所述的试剂盒进行重组酶聚合酶扩增快速等温扩增，得到扩增产物；
(2)将扩增产物用PCRD试剂盒侧流试纸进行检测，判断检测结果：当出现质控带时，出现阳性条带为待测病菌为布鲁氏杆菌。
作为优选，步骤(1)中，所述快速等温扩增的方法为：在38℃反应10min。
相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：本发明以试纸条检测RPA扩增产物，只需10min左右扩增后，滴加至试纸条内读取结果，不需要PCR扩增仪器及定量PCR仪。所得的方法具有特异性强、敏感性好、操作过程简单、检测快速等优点，为野外田间布病的检测提供了一种可能，也为不以疾病的诊断和治疗为目的的对布鲁氏杆菌的研究提供了一种方法。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为最佳反应时间实验侧流试纸检测结果。
图2为最佳反应时间实验核酸电泳检测结果。
图3为最佳反应温度实验侧流试纸检测结果。
图4为最佳反应温度实验核酸电泳结果。
图5为特异性实验侧向流动试纸检测结果。
图6为特异性实验电泳结果。
图7为敏感性实验侧向流动试纸检测结果。
图8为敏感性实验电泳检测结果。
图9为QPCR检测样品。
图10为侧流试纸检测样品。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。
实施例1
1实验过程
1.1实验试剂及仪器
试剂：RPA引物探针，Rehydration Buffer，RNase Inhibitor和dH2O，乙酸镁，5×Extration Buffer，TaKaRa MiNiBEST Universal Genomic DNA Extraction KitVer.5.0。侧流试纸购自ABINGDON HEALTH公司，其商品名为Nucleic Acid Detection-Nucleic Acid Detection-PCRD。
仪器：恒温扩增仪、单道移液器、涡旋器，小型离心机。
1.2基因组提取
基因组提取参照TaKaRa MiNiBEST Universal Genomic DNA Extraction KitVer.5.0试剂说明书提取，所需检测样本和特异性实验其他细菌的基因组均为本方法，具体方法如下：
1.①取10mg的组织进行研磨，研磨后的组织加入200μlPBS溶液或RnasefreedH2O。
②加入200μl的Buffer VGB、20μl的Proteinase K和1.0μl的CarrierRNA，充分混匀于56℃水浴温浴10分钟。
③向裂解液中加入200μl无水乙醇，充分吸打混匀。
2.将Spin Column安置于Collection Tube上，溶液移至Spin Column中，12,000rpm离心2分钟，弃滤液。
3.将500μl的Buffer RWA加入至Spin Column中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。
4.将700μl的Buffer RWB加入至Spin Column中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。注：需确认Buffer RWB中已经加入了指定体积的100％乙醇。沿Spin Column管壁四周加入Buffer RWB，这样有助于完全冲洗沾附于管壁上的盐份。
5.重复操作步骤4。
6.将Spin Column安置于Collection Tube上，12,000rpm离心2分钟。
7.将Spin Column安置于新的1.5mlRNase free collection tube上，在SpinColumn膜的中央处加入30～50μl的RNase free dH2O，室温静置5分钟。注：洗脱制备膜上的RNA时，需使用RNase free dH2O。
8.12,000rpm离心2分钟洗脱DNA。如需获得更大收量，可将离心液重新加入到SpinColumn膜的中央或再加入30～50μl的RNase free dH2O，室温静置5分钟后，12,000rpm离心2分钟洗脱DNA。
需指出特异性实验中细菌基因组提取不需要组织研磨，只需将菌液离心后按照步骤2继续提取即可，同时标准布鲁氏杆菌基因组为实验室保存的M5基因。
1.3引物与探针
根据布鲁氏杆菌的特异基因的保守序列设计引物与探针，具体见表1。针对的布鲁氏杆菌的特异基因为omp25，其保守序列的核苷酸序列如下(下划线标记出部分为目的检测片段)。
atgcgcactcttaagtctctcgtaatcgtctcggctgcgctgctgccgttctctgcgaccgcttttgctgccgacgccatccaggaacagcctccggttccggctccggttgaagtagctccccagtatagctgggctggtggctataccggtctttaccttggctacggctggaacaaggccaagaccagcaccgttggcagcatcaagcctgacgattggaaggctggcgcctttgctggctggaacttccagaaggaccagatcgtatacggtgttgaaggtgatgcaggtta ttcctgggccaagaagtccaaggacggcctggaagtcaagcagggctttgaaggctcgctgcgtgcccgcgtcggc tacgacctgaacccggttatgccgtacctcacggctggtattgccggttcgcagatcaagcttaacaacggcttggacggcgaaagcaagttccgcgtgggttggacggctggtgccggtctcgaagccaagctgacggacaacatcctgggccgcgttgagtaccgttacacccagtacagcaacaagaactatgatctggccggtacgactgttcgcaacaagctggacacgcaggatatccgcgtcggcatcggctacaagttctaa
表1针对布鲁氏杆菌特异基因的保守序列设计的引物与探针
1.4RPA侧流试纸反应条件的优化
RPA加样体系：上、下游引物(10μM)各2.1μl，RPA探针(10μM)0.6μl，RehydrationBuffer 29.5μl，RNase Inhibitor的dH2O 11.2μl，DNA样本2μl，混合后加入RPA酶管中震荡混匀，再加入2.5μl的乙酸镁在加热器上反应。反应时间和温度的不同往往会影响到实验的结果，出现假阳性的情况，所以确定一个最适的反应条件至关重要。
1.4.1最佳反应时间确定
加样完成后，以标准菌株布鲁氏杆菌M5作为阳性菌株，以沙门菌株作为阴性菌株，在反应5min-30min内探寻最佳反应时间，阳性分别设置5min、10min、20min三个时间梯度，阴性分别设置10min、20min、30min三个时间梯度，反应温度为38℃，反应后取扩增产物侧流试纸检测。
侧流试纸检测加样体系为：取6μl扩增产物，加入84μl的5×Extration Buffer，充分混匀后，取75μl滴加至侧流试纸反应孔中，10min内读取结果，一般按照5×体系加样，扩增产物控制在5-10μl左右即可，对实验结果不会有太大影响。
1.4.2最佳反应温度确定
同样加样完成后，以标准菌株布鲁氏杆菌M5作为阳性菌株，以沙门菌株作为阴性菌株，在36℃、38℃、40℃三个温度条件下反应，反应时间为10min，反应后取扩增产物侧流试纸检测。
1.5特异性实验
分别用沙门氏菌、大肠杆菌、衣原体、肠球菌、金色葡萄球菌以同样基因组提取试剂盒以同样的方法提取基因组，加入体系以最优反应条件扩增，反应结束后用侧流试纸检测，验证引物与探针的特异性。
1.6敏感性实验
用布鲁氏杆菌的M5基因组作为RPA的标准品，以10倍的梯度稀释，加入体系以最优反应条件扩增，反应结束后用侧流试纸检测，来验证引物与探针的敏感性，布鲁氏杆菌的M5基因组的初始浓度为4×104基因拷贝/ul(通过QPCR定量获得)，阴性对照为沙门氏菌基因组。
1.7临床验证
检测16份样品，6份为绵羊乳汁提取DNA，10份为羊组织提取DNA，经过QPCR检测，以CT值25作为阴阳性判断标准，11个阳性，5个阴性，用RPA侧流试纸进行检测，验证其与QPCR检测结果的符合率。
2实验结果
2.1RPA侧流试纸反应条件的优化：
2.1.1最佳反应时间的确定
按照上述方法进行检测，侧流试纸结果表明布鲁氏杆菌M5阳性样品在10min就能出现明显阳性条带，20min同样如此。阴性样品检测结果显示在10min内只出现质控带，而20min和30min时有一条很弱的阳性条带。实验结果如图1所示。
图1为最佳反应时间实验侧流试纸检测结果；其中，左侧从上至下依次是布鲁氏杆菌M5阳性5min，10min，20min检测结果；右侧从上至下依次是沙门菌阴性10min，20min，30min检测结果。
综合考虑，还是以最大程度保证特异性为主，避免假阳性的存在，以反应时间在10min内作为最佳反应时间。
用核酸PCR检测扩增产物进行佐证，其结果与侧流试纸检测结果一致，结果如图2所示。
图2为最佳反应时间实验核酸电泳检测结果；其中，从左到右依次是Mark，布鲁氏杆菌M5 5min，10min，20min，沙门10min，20min，30min。
2.1.2最佳反应温度的确定
按照上述方法进行检测，侧流试纸结果表明M5阳性样品在36℃就能出现阳性条带，38℃时阳性条带很明显，40℃同样明显。而阴性样品检测结果显示在36℃，38℃条件下只出现质控带，不出现任何阳性条带，但是在40℃条件下，会出现一条很弱很弱的阳性条带。实验结果如图3所示。
图3为最佳反应温度实验侧流试纸检测结果；其中，左侧从上至下依次是布鲁氏杆菌M5阳性36℃，38℃，40℃的检测结果；右侧从上至下依次是沙门菌36℃，38℃，40℃的检测结果。
综合考虑，为了充分保证实验特异性，避免假阳性出现，应该以38℃为最佳反应温度。
为了进一步说明实验结果的真实性，对不同温度的RPA扩增产物进行核酸电泳电泳，其结果与侧流试纸结果一致，在100-200bp之间，阳性38℃和40℃有一条很明显条带，阴性40℃有一条很浅很浅的条带。实验结果如图4所示。
图4为最佳反应温度实验核酸电泳结果；其中，从左到右依次是Mark，布鲁氏杆菌M5 36℃，38℃，40℃，沙门菌36℃，38℃，40℃。
综上，本发明为了确保最大程度检测出阳性样品，同时避免阴性样品出现假阳性情况，将反应条件定位38℃10min作为最佳反应条件，但这仅仅是作为一种参考，还需要根据实际情况进行调整。
2.2特异性实验
特异性实验结果表明：滴加至侧流试纸10min内，只有布鲁氏杆菌M5阳性出现明显阳性条带，其他菌株及阴性均只出现质控条带，实验结果如图5所示，证明引物和探针存在高度特异性。
图5为特异性实验侧向流动试纸检测结果；其中，左侧从上至下依次是布鲁氏杆菌M5，沙门氏菌，大肠杆菌，衣原体，肠球菌，阴性对照，右侧是金黄色葡萄球菌。
同样对其扩增产物进行核酸电泳，结果与侧向流动试纸检测结果一致，结果如图6所示。
图6为特异性实验电泳结果；其中，从左到右依次是Mark，布鲁氏杆菌M5，沙门氏菌，大肠杆菌，衣原体，肠球菌，金黄色葡萄球菌，阴性对照。
2.3敏感性实验
敏感性实验结果表明：将标准DNA稀释到10-4后(80个基因拷贝数)，侧流试纸仍有一条可见阳性带，而到了10-5后(8个基因拷贝数)，阳性条带已经很弱，所以其敏感性以达到10-4为准，存在良好的敏感性。其结果如图7所示。
图7为敏感性实验侧向流动试纸检测结果；其中，从上到下依次为10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，阴性对照。
同样扩增产物电泳，结果与侧向流动试纸检测结果一致，结果如图8所示。
图8为敏感性实验电泳检测结果；其中，从左到右依次是Mark，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，阴性对照。
2.4临床验证
用QPCR检测了16个不同样品，以CT值25作为阴阳性判断标准，11个阳性，5个阴性，检测结果如图9所示。
图9为QPCR检测样品。
对这些样品进行RPA扩增，侧流试纸进行检测，其检测结果为13个阳性，3个阴性，检测结果如图10所示。
图10为侧流试纸检测样品；其中，左侧为绵羊乳汁提取DNA样品，右侧为羊组织提取DNA样品。
QPCR检测出11份阳性，,5份阴性；RPA检测出13份阳性，3份阴性。即11份阳性检测结果相同，3份阴性检测结果相同。
3讨论
布鲁氏杆菌病一直以来对我国的养羊业，养牛业造成很大的经济损失，同时其作为一种重要的人畜共患病，严重威胁着牧民，养殖户以及相关科研工作人员的健康安全，对其检测防控一直以来是一个主要的课题，目前实验室布鲁氏病主要检测诊断技术为血清学检测和定量PCR检测，血清学检测由于抗原蛋白分离纯化的不同，其检测抗体不同，易与其他检测结果出现分歧。定量PCR检测是目前有效的检测方法，特异性高，但是由于其需要PCR仪器及操作场地人员限制，并不利于野外田间的检测。
本发明方法旨在提供一种供田间布病快速检测的方法，通过反应体系条件优化，特异性实验，敏感性实验以及与临床QPCR检测比较，最终确定该方法。平时只需要配置好RPA扩增体系，分装到小管中，检测时只需加入样本DNA和醋酸镁，恒温器38℃反应10min后，混入侧流试纸体系中，取适量加入侧流试纸读取结果即可，这为田间检测提供了一种可能。但是需要指出的是，本发明DNA是通过试剂盒提取，而现在有一种煮沸粗提取DNA的方法，如果能够应用于布病DNA提取，再结合本方法，将进一步促进本方法在田间检测的可能性。当然本发明方法也能应用于实验室中不以疾病的诊断和治疗为目的的对布鲁氏杆菌的研究。
而本方法有以下不足之处：1.本方法条件优化是以保证特异性为主，避免假阳性的出现，所以在检测样本是会出现假阴性的可能性，如果实验情况中，样品浓度低可以适当调整反应时间和反应温度，同时注意样品体系的充分混合。2.本方法虽然操作简单、快速，特异性高，对仪器要求低，但是扩增体系和侧流试纸价格都不便宜，如果能够自己设计一种侧流试纸将大大降低成本。
本方法特异性强，操作简单，快速，不过多依赖实验仪器，为田间布病检测提供一种可能。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 一种布鲁氏杆菌重组酶聚合酶扩增检测试剂盒及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgcgcactc ttaagtctct cgtaatcgtc tcggctgcgc tgctgccgtt ctctgcgacc 60
gcttttgctg ccgacgccat ccaggaacag cctccggttc cggctccggt tgaagtagct 120
ccccagtata gctgggctgg tggctatacc ggtctttacc ttggctacgg ctggaacaag 180
gccaagacca gcaccgttgg cagcatcaag cctgacgatt ggaaggctgg cgcctttgct 240
ggctggaact tccagaagga ccagatcgta tacggtgttg aaggtgatgc aggttattcc 300
tgggccaaga agtccaagga cggcctggaa gtcaagcagg gctttgaagg ctcgctgcgt 360
gcccgcgtcg gctacgacct gaacccggtt atgccgtacc tcacggctgg tattgccggt 420
tcgcagatca agcttaacaa cggcttggac ggcgaaagca agttccgcgt gggttggacg 480
gctggtgccg gtctcgaagc caagctgacg gacaacatcc tgggccgcgt tgagtaccgt 540
tacacccagt acagcaacaa gaactatgat ctggccggta cgactgttcg caacaagctg 600
gacacgcagg atatccgcgt cggcatcggc tacaagttct aa 642

Claims (9)

1.用于检测布鲁氏杆菌的重组酶聚合酶扩增引物组和探针，其特征在于：所述引物组和探针分别为：
所述上游引物为：ggtgttgaaggtgatgcaggttattcctgggccaa；
所述下游引物为：biotin-cggcaataccagccgtgaggtacggcataac；
所述RPA探针为：FAM-ggcctggaagtcaagcagggctttgaaggctc(THF)ctgcgtgcccgcgtcgg-C3space。
2.一种布鲁氏杆菌重组酶聚合酶扩增检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组和探针。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括Rehydration Buffer，RNase Inhibitor和dH2O、DNA样本和乙酸镁。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中，上下游引物的浓度为10μM，RPA探针的浓度为10μM。
5.权利要求1-4任一项所述的试剂盒在如下任一中的应用：
(1)不以疾病的诊断和治疗为目的的检测或辅助检测布鲁氏杆菌；
(2)制备用于检测或辅助检测布鲁氏杆菌的产品；
(3)不以疾病的诊断和治疗为目的的检测或辅助检测待测动物样品是否感染布鲁氏杆菌；
(4)制备用于检测或辅助检测待测动物样品是否感染布鲁氏杆菌的产品；
(5)不以疾病的诊断和治疗为目的的检测病菌是否为布鲁氏杆菌；
(6)制备用于检测或辅助检测待测病菌是否为布鲁氏杆菌的产品。
6.一种检测或辅助检测待测动物样品是否感染布鲁氏杆菌的方法，该方法不以疾病的诊断和治疗为目的，其特征在于：包括以下步骤：
(1)以待测动物样品中提取的基因组DNA作为模板，采用权利要求1-4任一项所述的试剂盒进行重组酶聚合酶扩增快速等温扩增，得到扩增产物；
(2)将扩增产物用PCRD试剂盒侧流试纸进行检测，判断检测结果：当出现质控带时，出现阳性条带为待测动物样品感染布鲁氏杆菌。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述快速等温扩增的方法为：在38℃反应10min。
8.一种检测或辅助检测待测病菌是否为布鲁氏杆菌的方法，该方法不以疾病的诊断和治疗为目的，其特征在于：包括以下步骤：
(1)以待测病菌中提取的基因组DNA作为模板，采用权利要求1-4任一项所述的试剂盒进行重组酶聚合酶扩增快速等温扩增，得到扩增产物；
(2)将扩增产物用PCRD试剂盒侧流试纸进行检测，判断检测结果：当出现质控带时，出现阳性条带为待测病菌为布鲁氏杆菌。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述快速等温扩增的方法为：在38℃反应10min。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111154739A (zh) * 2020-02-06 2020-05-15 广州普世利华科技有限公司 一种新型重组酶依赖型扩增方法及试剂盒
CN112322764A (zh) * 2020-12-11 2021-02-05 武汉博杰生物医学科技有限公司 布鲁氏杆菌的检测试剂盒与检测方法
CN112725472A (zh) * 2019-10-14 2021-04-30 中国兽医药品监察所 一种对多种羊的疫病进行联检的基因芯片以及试剂盒
CN114134240A (zh) * 2021-12-08 2022-03-04 中国动物卫生与流行病学中心 一种对动物布鲁氏菌病的通用快速检测方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103243095A (zh) * 2013-01-30 2013-08-14 天津市动物疫病预防控制中心 用于布鲁杆菌环介导等温扩增的引物及检测反应体系
CN103276061A (zh) * 2013-04-28 2013-09-04 华南农业大学 一种检测布鲁菌的lamp核酸试纸条试剂盒及其应用
CN106319054A (zh) * 2016-08-23 2017-01-11 中央民族大学 检测布鲁氏菌的引物及检测方法
CN108220461A (zh) * 2018-01-29 2018-06-29 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测布鲁氏菌的引物、探针和试剂盒

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103243095A (zh) * 2013-01-30 2013-08-14 天津市动物疫病预防控制中心 用于布鲁杆菌环介导等温扩增的引物及检测反应体系
CN103276061A (zh) * 2013-04-28 2013-09-04 华南农业大学 一种检测布鲁菌的lamp核酸试纸条试剂盒及其应用
CN106319054A (zh) * 2016-08-23 2017-01-11 中央民族大学 检测布鲁氏菌的引物及检测方法
CN108220461A (zh) * 2018-01-29 2018-06-29 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测布鲁氏菌的引物、探针和试剂盒

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
孙祖越等: "《药物生殖与发育毒理学》", 31 January 2015, 上海科学技术出版社 *
李秀梅等: "环介导等温扩增技术与横向流动试纸条法快速检测布鲁氏杆菌", 《食品与生物技术学报》 *
杨玉红等: "《生命科学综合实验指导》", 31 July 2016, 东北大学出版社 *
陈火英: "《遗传学与社会》", 30 November 2015, 上海交通大学出版社 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112725472A (zh) * 2019-10-14 2021-04-30 中国兽医药品监察所 一种对多种羊的疫病进行联检的基因芯片以及试剂盒
CN111154739A (zh) * 2020-02-06 2020-05-15 广州普世利华科技有限公司 一种新型重组酶依赖型扩增方法及试剂盒
CN112322764A (zh) * 2020-12-11 2021-02-05 武汉博杰生物医学科技有限公司 布鲁氏杆菌的检测试剂盒与检测方法
CN114134240A (zh) * 2021-12-08 2022-03-04 中国动物卫生与流行病学中心 一种对动物布鲁氏菌病的通用快速检测方法

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