CN103243095A - 用于布鲁杆菌环介导等温扩增的引物及检测反应体系 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于布鲁杆菌环介导等温扩增的引物及检测反应体系，针对布鲁杆菌保守的OMP25蛋白基因设计了4条LAMP的特异性引物，通过优化反应条件，建立了布鲁杆菌的LAMP快速检测方法。特异性和敏感性试验结果显示，该方法能够特异地检测布鲁杆菌，其最低检测限为5copies/μL。扩增产物可通过琼脂糖凝胶电泳、显色反应进行判定。LAMP可以快速、直观、准确地检测布鲁杆菌，是一种适合基层现场应用的检测方法。

Description

用于布鲁杆菌环介导等温扩增的引物及检测反应体系

技术领域

本发明涉及一种用于布鲁杆菌环介导等温扩增的引物及反应检测体系。

背景技术

布鲁杆菌病是由布鲁杆菌(Brucella)引起的以流产和发热为特征的人兽共患病，严重地威胁着人和多种动物的生命健康，导致巨大的经济损失和严重的公共卫生危害。布鲁杆菌病的防控和治疗关键在于对病原微生物的快速、准确、及早的检测并确诊。目前用于常规的布鲁杆菌诊断技术有细菌分离培养、血清凝集试验、补体结合试验、酶联免疫吸附试验、PCR等方法，但上述方法花费时间较长，而且判定结果需要借助精密仪器设备，难以在基层生产中普及应用，因此建立一种简单、快速、准确的病原诊断方法显得十分必要。

Notomi等于2000年发明了环介导等温核酸扩增（LAMP）技术，该技术依赖4条特异性引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下快速、高效、高特异、高灵敏地扩增靶序列（Notomi T,Okayama H,MAsubuchi H,etal.Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J].Nucleic Acids Res,2000,28(12):e63.）。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种方法操作简便，实验仪器要求较低的用于布鲁杆菌环介导等温扩增的引物及检测反应体系。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种用于布鲁杆菌环介导等温扩增的引物，包含扩增布鲁杆菌保守基因omp25特异碱基序列的正向内引物FIP、正向外引物F3、反向内引物BIP、反向外引物B3，序列如下：

外引物：F3     5’-ATTGCCGGTTCGCAGATC-3’

B3     5’-GCGGAAATCCTGCGTGTC-3’

内引物：FIP    5’-TCAGCTTGGCTTCGAGACCGCTTAACAACGGCTTGGACGA-3’

BIP    5’-GGCCGCGTTGAGTACCGTTAAGCTTGTTGCGAACAGTCG-3’

所述引物与基因omp25的412-618bp位的核酸序列的一部分或其互补链互补。

采用上述的用于布鲁杆菌环介导等温扩增的引物的检测反应体系，25μL反应体系为：

外引物F3：5pmol·L^-1、0.5μL

外引物B3：5pmol·L^-1、0.5μL

内引物FIP：40pmol·L^-1、0.5μL

内引物BIP：40pmol·L^-1、0.5μL

Mg²⁺：100mM、2μL

甜菜碱：5M、4μL

dNTP混合液：10mM、3.5μL

不含Mg²⁺的10×buffer：2.5μL

Bst DNA聚合酶：8U·μL^-1、1μL

模板：2μL

去离子水：8μL

反应温度为63℃。

本发明的有益效果是：本发明针对布鲁杆菌的OMP25基因设计了一套LAMP特异性引物，建立了一种用于布鲁杆菌基因检测的方法。与传统PCR相比，该方法操作简便，实验仪器要求较低，在普通恒温水浴锅中反应45min即可完成，而且可以通过在终产物中加入染料的方法直接用肉眼观察结果，能快速准确地鉴定布鲁杆菌，在基层生产中具有广阔的推广应用前景。

附图说明

图1是布鲁杆菌LAMP产物电泳图（M.100bp DNA ladder marker（100bp梯状DNA分子量标准）；1.布鲁杆菌LAMP扩增产物；2.阴性对照）。

图2是敏感性试验结果（M.100bp DNA ladder marker；1～7.布鲁杆菌DNA稀释液浓度分别为5×10⁵～5×10^-1copies/μL；8.阴性对照）。

图3是特异性试验结果（M.DNA标准DL2000；1.羊种布鲁杆菌；2.胎儿弯曲杆菌；3.大肠杆菌；4.沙门氏菌；5.犬种布鲁杆菌；6.金黄色葡萄球菌；7.猪种布鲁杆菌；8.牛种布鲁杆菌；9.阴性对照）。

图4是本发明布鲁杆菌OMP25基因引物设计位点。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：

本发明的用于布鲁杆菌环介导等温扩增的引物，包含扩增布鲁杆菌保守基因omp25特异碱基序列的正向内引物FIP、正向外引物F3、反向内引物BIP、反向外引物B3，序列如下：

外引物：F3     5’-ATTGCCGGTTCGCAGATC-3’

B3     5’-GCGGAAATCCTGCGTGTC-3’

内引物：FIP    5’-TCAGCTTGGCTTCGAGACCGCTTAACAACGGCTTGGACGA-3’

BIP    5’-GGCCGCGTTGAGTACCGTTAAGCTTGTTGCGAACAGTCG-3’

所述引物与基因omp25的412-618bp位的核酸序列的一部分或其互补链互补。

采用上述的用于布鲁杆菌环介导等温扩增的引物的检测反应体系，25μL反应体系为：

外引物F3：5pmol·L^-1、0.5μL

外引物B3：5pmol·L^-1、0.5μL

内引物FIP：40pmol·L^-1、0.5μL

内引物BIP：40pmol·L^-1、0.5μL

Mg²⁺：100mM、2μL

甜菜碱：5M、4μL

dNTP混合液：10mM、3.5μL

不含Mg²⁺的10×buffer：2.5μL

Bst DNA聚合酶：8U·μL^-1、1μL

模板：2μL

去离子水：8μL

反应温度为63℃。

布鲁杆菌OMP25基因库登录号：U33003.1

布鲁杆菌OMP25基因引物设计位点见图4。

1材料和方法

1.1材料

Bst DNA聚合酶、EcoR I限制性内切酶、MgSO₄购自纽英伦生物技术（北京）有限公司；Betaine Solution（甜菜碱）、DNA marker、全血基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、普通质粒小提试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；布鲁杆菌弱毒疫苗（S2株）购自中牧实业股份有限公司兰州生物药厂；胎儿弯曲杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌菌株购自广州粤晨生物科技有限公司；羊、牛、猪、犬种布鲁杆菌基因组核酸由中国农业科学院兰州兽医研究所惠赠。

1.2引物设计与合成

采用引物设计软件Primer4.0(http://primerexlorer.jp;EikenChemical Co.Ltd,Japan)，针对布鲁杆菌保守的OMP25蛋白基因设计了4条LAMP的特异性引物，包括2条外引物（F3和B3）以及2条内引物（FIP和BIP），引物序列见表1。

表1引物序列表

1.3布鲁杆菌DNA模板的提取

使用全血基因组DNA提取试剂盒对布鲁杆菌弱毒疫苗提取基因组DNA，经核酸蛋白定量仪定量后，-20℃保存备用。

1.4布鲁杆菌LAMP检测方法反应体系的建立

根据反应体系优化策略，依次对反应温度、Mg²⁺浓度、甜菜碱浓度、引物浓度进行优化，具体梯度如下：反应温度分别为61、62、63、64、65℃；Mg²⁺终浓度分别为2、3、4、6、8、10mmol·L^-1；甜菜碱终浓度分别为：0、0.5、1、1.5、2mol·L^-1；内、外引物比例分别为：4、6、8、10；内外引物终浓度分别为：内引物1.2、1.6、1.8、2.4、3.0、3.6、4μmol·L^-1，其对应的外引物终浓度分别为0.2、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0μmol·L^-1。在25μL的反应体系中dNTP混合液终浓度为1.4mmol·L^-1，10×buffer(Mg²⁺free)0.1%，Bst DNA聚合酶8U，模板2μL。所有体系在63℃分别反应45min，80℃加热2min终止反应，取5μL反应产物上样于1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，以确定最佳的反应体系。

1.5布鲁杆菌LAMP反应产物的鉴定

1.5.1电泳分析与测序鉴定

将含LAMP反应液的PCR反应管置于水浴锅中63℃等温扩增45min后，取5μL反应产物用1.5％琼脂糖凝胶分析和测序验证。

1.5.2可视化鉴定

反应后在LAMP扩增产物中加入1μL的SYBR Green Ⅰ染料，用肉眼观察LAMP反应液颜色变化。反应液颜色呈现绿色为阳性，反应液呈现橘红色为阴性。

1.6LAMP的敏感性试验

将抽提的布鲁杆菌弱毒疫苗DNA模板定量后进行10倍梯度稀释，用建立的LAMP检测方法分别对各稀释度布鲁杆菌弱毒疫苗DNA模板进行扩增，以确定检测方法的敏感性。

1.7LAMP的特异性试验

将布鲁杆菌（羊种布鲁杆菌、牛种布鲁杆菌、猪种布鲁杆菌、犬种布鲁杆菌）与非布鲁氏菌菌株（胎儿弯曲杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌）基因组核酸，按照建立的LAMP检测方法，进行特异性试验。

2结果

2.1LAMP检测方法反应条件的建立

优化后的反应体系（25μL）确定为：外引物（F3和B3）(5pmol·L^-1)0.5μL，内引物（FIP和BIP）(40pmol·L^-1)0.5μL，Mg²⁺(100mM)2μL，甜菜碱(5M)4μL，dNTP混合液(10mM)3.5μL，10×buffer(Mg²⁺free)2.5μL，Bst DNA聚合酶(8U·μL^-1)1μL，模板2μL，去离子水8μL。最佳反应温度为63℃。

2.2LAMP产物的电泳与测序分析结果

将提取的布鲁杆菌DNA进行LAMP扩增，取5μL反应产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1，布鲁杆菌DNA扩增出了梯状条带，而阴性对照没有扩增产物，表明建立的LAMP检测方法可以用于布鲁杆菌核酸的检测。测序结果分析表明，扩增产物目的片段与布鲁杆菌（NCBI的序列号AY89220）的同源性达到99.94%，证明LAMP产物为布鲁杆菌基因片段。

2.3LAMP产物的可视化鉴定结果

在LAMP反应结束后添加SYBR Green Ⅰ，通过肉眼观察，阳性样品管呈绿色，而对照阴性管橘红色，其结果与LAMP产物电泳结果一致，表明加入SYBR Green Ⅰ后所呈现的颜色反应具有特异性。

2.4LAMP敏感性试验

将布鲁杆菌DNA进行10倍梯度稀释后，分别进行扩增，扩增产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果见图2。表明建立的布鲁杆菌LAMP检测方法可检测样品中5Copies/μL的布鲁杆菌DNA。

2.5LAMP特异性试验

用布鲁杆菌LAMP引物分别对布鲁杆菌菌株（羊种布鲁杆菌、牛种布鲁杆菌、猪种布鲁杆菌、犬种布鲁杆菌）与非布鲁杆菌菌菌株（胎儿弯曲杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌）的基因组DNA进行LAMP反应，结果表明，只有布鲁氏菌的DNA出现目的条带，其他均未扩增出任何条带（见图3）。

从本发明可以看出，LAMP扩增方法具有普通PCR无法比拟的优点：(1)只需一恒定温度就能扩增反应。(2)高特异性。原理上LAMP法扩增的特异性很高，因此可以根据是否扩增就能判断目标基因的存在与否，即能够进行细菌或病毒的定性检测。(3)快速、高效扩增。整个扩增大约1h即可完成。(4)灵敏度高：扩增模板可达约5个拷贝。(5)步骤简单。反应不需PCR仪和特殊试剂，在水浴锅中就能进行。(6)鉴定简便。LAMP扩增过程中，核酸大量合成时，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生大量的副产物—焦磷酸镁沉淀，使阳性反应管有明显的变浑浊现象，肉眼即可直接观察结果。但在本发明中发现产生这种沉淀的重复性不高且量很小，其灵敏度也低于琼脂糖凝胶电泳分析法，同时大量的扩增产物在结合核酸染色剂SYBR Green Ⅰ的情况下，有肉眼可见的颜色变化（阴性为橙黄色，阳性偏绿色），结果肉眼可视。

LAMP引物的设计是其关键。根据LAMP的原理，F2引物5′端与B2引物5′物5′距离应控制在120～180bp，F2引物与F3引物之间的距离、B2引物与B3引物之间的距离应在20bp以内。引物Tm值的确定视模板GC含量而定，应满足F2大于F3、B3，B2小于F1、B1，B2大于F2，且在60℃和65℃之间。F1c和B1c引物5′端及F2、B2引物和F3、B3引物3′端的6个碱基的△G值应少于－4kcal/mol。引物GC含量应为40％～60％，设计时尽量避免二级结构的产生，尤其是在引物的3′端。为了提高检测效率，缩短检测周期，本发明建立了检测布鲁杆菌的LAMP检测方法。结果显示该方法是一种快速、实用、灵敏的检测技术，如果进一步优化、完善和推广，该技术将会在布鲁杆菌病的早期诊断及预防控制方面发挥重要作用。

综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明的范围之内。

Claims (2)

1.一种用于布鲁杆菌环介导等温扩增的引物，其特征在于，包含扩增布鲁杆菌保守基因omp25特异碱基序列的正向内引物FIP、正向外引物F3、反向内引物BIP、反向外引物B3，序列如下：

外引物：F3     5’-ATTGCCGGTTCGCAGATC-3’

B3     5’-GCGGAAATCCTGCGTGTC-3’

内引物：FIP    5’-TCAGCTTGGCTTCGAGACCGCTTAACAACGGCTTGGACGA-3’

BIP    5’-GGCCGCGTTGAGTACCGTTAAGCTTGTTGCGAACAGTCG-3’

所述引物与基因omp25的412-618bp位的核酸序列的一部分或其互补链互补。

2.采用如权利要求1所述的用于布鲁杆菌环介导等温扩增的引物的检测反应体系，其特征在于，25μL反应体系为：

外引物F3：5pmol·L^-1、0.5μL

外引物B3：5pmol·L^-1、0.5μL

内引物FIP：40pmol·L^-1、0.5μL

内引物BIP：40pmol·L^-1、0.5μL

Mg²⁺：100mM、2μL

甜菜碱：5M、4μL

dNTP混合液：10mM、3.5μL

不含Mg²⁺的10×buffer：2.5μL

Bst DNA聚合酶：8U·μL^-1、1μL

模板：2μL

去离子水：8μL

反应温度为63℃。

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