CN101984068A - 一种布鲁氏菌诊断试剂盒及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种微生物检测技术，特别是一种对布鲁氏菌进行诊断检测的试剂盒，以及这种试剂盒的使用方法。本发明的布鲁氏菌检测试剂盒至少由两对特异性扩增引物构成。本发明的原理是利用环介导等温扩增反应(简称LAMP反应)，由Bst DNA聚合酶和根据靶基因序列设计的两对特殊的内、外引物(即内引物FIP/BIP和外引物F3/B3)，特异性识别靶序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物。

Description

一种布鲁氏菌诊断试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及一种微生物检测技术，特别是一种对布鲁氏菌进行诊断检测的试剂盒，以及这种试剂盒的使用方法。

背景技术

布鲁氏菌病(Brucellosis)，是由革兰阴性、兼性细胞内寄生的布鲁氏菌属(Brucella)细菌引起的人兽共患传染病，已在世界范围内广泛流行，已有170多个国家报告有人、畜布鲁氏菌病疫情的发生。布鲁氏菌宿主范围广泛，可感染60多种家畜、野生动物及海洋哺乳动物。感染后主要导致动物生殖系统损害，引起怀孕母畜胎膜发炎，导致不孕、流产、死胎等，严重危害畜牧业和养殖业的发展。人常常由于接触感染动物的乳、肉、皮毛及疫畜流产物等发生感染，造成骨关节、神经系统、生殖系统、循环系统和免疫系统等损害，并常伴发菌血症、毒血症。疫情报告显示，人间2008年全国报告新发病例数27767例，发病率为2.15/10万，比2007年同期(19721例)上升了40.07％，首次超过新中国成立以来1963年的历史最高水平。而动物疫情也自20世纪90年代以来开始有所回升。

由于目前没有有效的预防人畜布鲁氏菌病的疫苗，早发现、早诊断、早治疗可能是控制人畜布鲁氏菌病的有效措施。目前布鲁氏菌病的检测方法主要有分离培养、血清学方法和普通PCR方法。分离培养虽然是确诊布鲁氏菌病的最佳证据，但由于费时、出菌率低以及生物安全等问题，临床应用较少。血清学检测方法如SAT，简便、快速，也是国际公认的布鲁氏菌病标准化诊断方法，但因其特异性低，特别是耶尔森氏菌(O：9)与布鲁氏菌抗原存在很大的相似性(Kittelberger，1997)，容易出现假阳性结果。普通PCR方法用于病原核酸检测，因其敏感、快速、无需活菌操作等优点，在布鲁氏菌病诊断方面具有一定价值，但需要专门的仪器、操作繁琐，不适合临床及基层生产使用。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种检测成本低、方便快捷、灵敏度高和特异性强的布鲁氏菌快速检测试剂盒及其检测方法。

本发明的布鲁氏菌检测试剂盒至少由两对特异性扩增引物构成，两对特异性引物序列如下：

内引物FIP：gccatagccaaggtaaagaccggcggttgaagtagctcccca

内引物BIP：cagcaccgttggcagcatcagatctggtcctgctggaagt

外引物F3：gacgccatccaggaacag

外引物B3：gcatcaccttcaacaccgtat。

采用上述试剂盒进行布鲁氏菌检测的方法：

(1)首先从待检测的样品中提取样品DNA；

(2)在以从待检测样品中提取的样品DNA为模板、以检测试剂盒的内引物FIP、内引物BIP、外引物F3和外引物B3为引物的反应体系中进行LAMP反应；

(3)反应结束后，加入显色液进行分析，判定阴阳性。

本发明的检测方法中LAMP反应体系中主要成分终浓度组成如下：

10×Thermopol缓冲液    终浓度为1×

内引物FIP和BIP         各1.2～2.0μM

外引物F3和B3           各0.1～0.4μM

脱氧核糖核苷酸混合物   0.4～2.0mM

Bst DNA聚合酶          5～10U/反应

甜菜碱                 0.5～1.2M

硫酸镁                 2～6mM

溶剂为DEPC水。

本发明的检测方法中，LAMP反应条件设置为：63～65℃ 1h，80℃2min；所用显色液为20倍SYBR Green I。

本发明的原理是利用Bst DNA聚合酶和根据靶基因序列设计的两对特殊的内、外引物(即内引物FIP/BIP和外引物F3/B3)，特异性识别靶序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物。进行环介导等温扩增反应(简称LAMP反应)，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物焦磷酸镁乳白色沉淀，即可通过肉眼观察判定结果。LAMP反应是在恒温(63～65℃)条件下45～90分钟内完成。这种比较温和的温度条件以及没有温度循环使所需仪器简单化，克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本高等缺点。此外，这种检测方法对检测人员的技术素质要求较低，实际操作极为简便，不需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。LAMP法是一种简便、快速、高度特异性的基因扩增法。将恒温基因扩增技术与PCR技术(包括荧光实时定量PCR技术)进行比较，可以发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围等方法学指标上相当于或优于PCR技术，且不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，而且检测成本远低于荧光定量PCR技术。目前国家标准中以微生物分离培养和形态学鉴定为主、结合生化分析和血清学分型鉴定的通行方法，初步鉴定需2-3天，完成鉴定报告需10-15天。而采用本发明的基因快速诊断试剂盒仅需2小时。并且，本发明的反应液中加入了显色液，使鉴定结果更为直观清晰。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.不需要特殊试剂与设备，检测成本低；2.具有高特异性，应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否；3.快速高效，检测时间约2小时；4.灵敏度高，扩增模板仅需10拷贝或更少，检测率达到99％；5.鉴定简便，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼直接观察鉴定，并且加入显色液后，阴阳性结果显色差异显著，明显可靠，验证率高。6.用途广：可广泛用于各种型布鲁氏菌的安全快速检测。

具体实施方式

下列实施例进一步说明本发明，但不应该当作对本发明的限制。

实施例1试剂盒的制备

本试剂盒至少由两对特异性扩增引物，即：

内引物FIP：gccatagccaaggtaaagaccggcggttgaagtagctcccca；

内引物BIP：cagcaccgttggcagcatcagatctggtcctgctggaagt；

外引物F3：gacgccatccaggaacag；

外引物B3：gcatcaccttcaacaccgtat；

试剂盒中的其余物质可以通过外购的方式解决。

实施例2优选的试剂盒

本发明优选的试剂盒应由以下内容组成：

两对前述的特异性扩增引物，其中，所述的外引物浓度为5pmol/μL，内引物浓度为20pmol/μL；Bst DNA聚合酶，Bst DNA聚合酶活力为8个活性单位/微升；脱氧核糖核苷酸混合物；缓冲液；甜菜碱；硫酸镁；显色液和阳性对照液组成，具体制备如下：

按实施例1中引物序列经DNA合成仪合成寡聚脱氧核酸引物，并以内引物20pmol/μL、外引物5pmol/μL浓度配置，分别分装于容器：

购置Bst DNA聚合酶置于容器；

购置甜菜碱，按5mol/L配置，分装置于容器；

购置脱氧核糖核苷酸，按脱氧核糖核苷酸混合物25mmol/L配置，分装置于容器；

购置硫酸镁，按100mmol/L配置，分装置于容器；

购置显色液SYBR Green I，按20倍配置，分装置于容器；

制作阳性对照液，分装置于容器。其制作方法为采用PCR扩增一段布鲁氏菌基因特异序列，然后装入PMD18-T载体，转化至DH5a感受态细菌，抽取质粒DNA经序列测定后，采用紫外分光光度计测定质粒DNA的浓度并用灭菌双蒸水调整拷贝数至10⁷拷贝/μL。

将上述八个容器组装成试剂盒，提供使用说明书，封装。

实施例3本发明的布鲁氏菌基因快速诊断试剂盒的应用

1、样品处理(模板DNA提取)

按照NY/T1467-2007中2.4款的方法采集待检样品，如血液或乳液；

按照NY/T1467-2007中2.5款的方法对待检样品进行核酸提取，获得样品模板，或使用等同的商品化核酸提取试剂盒按说明书操作提取待检样品的DNA模板。

2、环介导扩增反应过程

(1)反应体系：在0.2ml薄壁管中加入以下试剂：

10×Thermopol缓冲液    2.5μL

甜菜碱                 5.0μL

脱氧核糖核苷酸混合物       1.2μL

内引物(FIP/BIP)各          2.0μL

外引物(F3/B3)各            1.0μL

硫酸镁                     1.0μL

Bst DNA聚合酶              1.0μL

模板DNA                    3.0μL

DEPC水                     5.3μL

总体积                     25μL

(2)反应条件：63-65℃反应1h，然后80C水浴2min。

在进行环介异扩增反应的同时，用现有的普通PCR方法对待检样品进行平行检测；然后对用本试剂盒的方法和普通PCR方法均检测为阳性的待检样品DNA模板进行梯度稀释后，作为模板DNA再用此两种方法分别进行反应检测。此外，对耶尔森氏菌阳性样品也分别用此两种方法进行检测。

3、结果判定

在上述反应管和阳性对照管中分别加入1μL SYBR Green I显色液混匀，观察产物颜色变化，若反应管与对照管一样呈现明显绿色则为阳性，若反应管呈现橙色则为阴性。

经实际检测表明，用本发明检测试剂盒方法和现有普通PCR方法检测待检样品，对用此两种方法均检测为阳性的同一样品模板DNA进行10拷贝稀释后，再用此两种方法进行平行检测，发现用本发明检测试剂盒的方法仍可以检测为阳性，而普通PCR则不能检出。此外，用布鲁氏菌普通PCR方法对耶尔森氏菌阳性样品进行检测，有假阳性出现，而使用本发明检测试剂盒的方法则没有。这表明，本发明检测试剂盒的方法比现有的普通PCR方法具有更高的敏感性和特异性。

Claims (2)

1.一种布鲁氏菌诊断试剂盒，其特征是试剂盒至少由两对特异性扩增引物构成，两对特异性引物序列如下：

内引物FIP：gccatagccaaggtaaagaccggcggttgaagtagctcccca

内引物BIP：cagcaccgttggcagcatcagatctggtcctgctggaagt

外引物F3：gacgccatccaggaacag

外引物B3：gcatcaccttcaacaccgtat。

2.用权利要求1所述试剂盒检测布鲁氏菌的方法，其特征是该方法包括如下步骤：

(1)提取样品DNA；

(2)以待测样品DNA为模板、加入试剂盒的内引物FIP、内引物BIP、外引物F3和外引物B3为反应体系，并对反应体系进行LAMP反应；

(3)反应结束后，加入显色液，根据反应物所呈现的颜色判定被检样品的阴阳性。

本发明的方法中，所述的LAMP反应体系中主要成分终浓度组成如下：

10×Thermopol缓冲液                    终浓度为1×

内引物FIP和BIP                         各1.2～2.0μM

外引物F3和B3                           各0.1～0.4μM

脱氧核糖核苷酸混合物                   0.4～2.0mM

Bst DNA聚合酶                          5～10U/反应

甜菜碱                                 0.5～1.2M

硫酸镁                                 2～6mM

溶剂为DEPC水。

本发明的方法中，LAMP反应条件设置为：63～65℃1h，80℃2min；显色液采用20倍SYBR Green I。