CN102605104B - 鸭圆环病毒和鸭肝炎病毒二重pcr检测试剂盒 - Google Patents
鸭圆环病毒和鸭肝炎病毒二重pcr检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种鸭圆环病毒和鸭肝炎病毒二重PCR检测试剂盒。本发明提供了一种检测鸭圆环病毒与鸭肝炎病毒的引物组，由引物1、引物2、引物3和引物4组成；所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。本发明的实验证明，本发明建立一次PCR反应就能同时检测和鉴别DuCV、DHV两种病原体的二重PCR技术，具有良好特异性，而且本试验在引物设计上利用扩增片段长度的不同直接判定扩增结果，使得该方法在结果判定时更简便、直观和实用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种鸭圆环病毒和鸭肝炎病毒二重PCR检测试剂盒。
背景技术
鸭圆环病毒(DuckCircovirus，DuCV)和鸭肝炎病毒(DHV)均常见于鸭，鸭圆环病毒(DuCV)可造成鸭生长迟缓、羽毛凌乱、体重减轻等症状，可感染禽类的免疫系统，引起免疫抑制。鸭肝炎病毒(DHV)引起的鸭病毒性肝炎是一种可使病鸭高度致死的迅速传播的病毒性疾病，病程短且死亡快，死亡率可高达100％。这两种疾病流行广泛，传播迅速，发病率和死亡率高，易混合感染，目前对世界范围水禽危害较为严重，给养鸭业带来巨大的经济损失。鸭圆环病毒破坏病鸭的免疫系统，造成免疫抑制，鸭肝炎病毒流行广泛且高度致死，病鸭极易同时感染这两种病毒，一旦同时发生感染则会造成极大的损失。目前对DuCV和DHV的鉴别诊断主要依靠传统的病原分离鉴定与血清学试验，但这些方法存在诊断时间长，特异性差，敏感性低，而且操作繁琐等的缺点，不利于快速诊断这两种疾病。
PCR技术由于具有敏感性高、特异性好、快速、简便等特点，已经走进临床诊断实验室并广泛应用于各种禽病病原体的检测，包括用于DuCV和DHV的检测。二重PCR是一种特殊的PCR形式，其突出特点是，一次PCR反应，能同时检测并鉴别出两种病原体，在临床上具有很高的应用价值。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测鸭圆环病毒与鸭肝炎病毒的引物组。
本发明提供的引物组，由引物1、引物2、引物3和引物4组成；
所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。
上述引物组中，所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩尔比为2∶2∶(1.5-2)∶(1.5-2)；
上述引物组中，所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩尔比具体为2∶2∶1.8∶1.8。
本发明的另一个目的是提供一种检测鸭圆环病毒与鸭肝炎病毒的PCR试剂。
本发明提供的PCR试剂，由上述的引物组、PCR缓冲液和水组成；
所述引物组中的引物1在所述PCR试剂中的终浓度具体为2μmol/L；
所述引物组中的引物2在所述PCR试剂中的终浓度具体为2μmol/L；
所述引物组中的引物3在所述PCR试剂中的终浓度具体为1.5-2μmol/L；
所述引物组中的引物4在所述PCR试剂中的终浓度具体为1.5-2μmol/L；
所述引物组中的引物3在所述PCR试剂中的终浓度进一步具体为1.8μmol/L；
所述引物组中的引物4在所述PCR试剂中的终浓度进一步具体为1.8μmol/L。
本发明的第三个目的是提供一种检测鸭圆环病毒与鸭肝炎病毒的PCR试剂盒。
本发明提供的PCR试剂盒，包括上述的引物组或上述PCR试剂。
上述的引物组或上述PCR试剂或上述试剂盒在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有鸭圆环病毒与鸭肝炎病毒产品中的应用也是本发明保护的范围。
上述检测和/或辅助检测待测样品中是否含有鸭圆环病毒与鸭肝炎病毒为用上述的引物组或上述PCR试剂或上述试剂盒对所述待测样品进行二重PCR扩增。
上述应用中，所述二重PCR扩增的退火温度为50℃-55℃，所述二重PCR扩增的退火温度具体为55℃。
本发明的第四个目的是提供一种检测鸭圆环病毒的引物对A。
本发明提供的引物对A，由上述的引物组中的所述引物1和所述引物2组成；
本发明的第五个目的是提供一种检测鸭肝炎病毒的引物对B。
本发明提供的引物对B，由上述的引物组中的所述引物3和所述引物4组成。
上述的引物对A在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有鸭圆环病毒产品中的应用也是本发明保护的范围；
上述的引物对B在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有鸭肝炎病毒产品中的应用也是本发明保护的范围。
本发明的实验证明，本发明建立一次PCR反应就能同时检测和鉴别DuCV、DHV两种病原体的二重PCR技术，具有良好特异性，而且本试验在引物设计上利用扩增片段长度的不同直接判定扩增结果，使得该方法在结果判定时更简便、直观和实用。利用二重PCR一次可以扩增多个目的基因特点，一次PCR反应就可以检测多种病原体，这在临床应用中，对检测不同病原体感染，具有十分重要实用价值和实践意义。
附图说明
图1为二重PCR的特异性试验
图2为二重PCR的敏感性试验
图3为二重PCR检测待测样本
图4为鸭肝炎病毒其他PCR验证
图5为鸭圆环病毒其他PCR验证
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的病毒、试剂具体如下：
实验菌株：
鸭圆环病毒(DuCV)记载在“广西部分地区鸭圆环病毒感染情况调查”，中国畜牧兽医，2010，37(11)：156-158，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
鸭肝炎病毒为鸭I型肝炎病毒(DHV I)AV2111株购自中国兽医药品监察所；
对照菌(毒)株：
番鸭细小病毒(MDPV)记载在“广西番鸭细小病毒的分离和鉴定”，广西畜牧兽医，2002，18(6)：5-7，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
小鹅瘟病毒记载在“小鹅瘟病毒荧光定量PCR检测方法的建立”，上海畜牧兽医通讯，2008，160(06)：30-31，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
新城疫病毒记载在“新城疫植物油乳剂苗的研究”，中国预防兽医学报，2000，(04)：23-27，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
H9亚型禽流感病毒记载在“多重反转录聚合酶链反应快速检测鉴别H9亚型禽流感病毒方法的建立”，中国人兽共患病学报，2006，(09)：858-860，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
试剂：TIAN amp Genomic DNA Kit购自天根公司，AMV反转录酶、RibonucleaseInhibitor、dNTP购自TaKaRa公司。SPF鸡胚购自北京梅里亚公司。TRIzol LS Reagent购自Invitrogen公司。DU 800紫外分光光度计购自BECKMAN COULTER公司。
实施例1、引物的设计和合成
根据已发表鸭圆环病毒DuCV、鸭肝炎病毒DHV的基因文库，应用DNA Star软件，设计针对DuCV和DHV基因序列的2对特异性引物，引物核酸序列见表1。引物由上海Invitrogen公司合成。
表1为DuCV和DHV引物的核苷酸序列
实施例2、二重PCR检测
一、样本的制备
病毒的增殖和收集：将种毒适当稀释后分别接种于10日龄的SPF鸡胚和无特异病原体健康鸭胚，增殖并收集120h死亡的胚体尿囊液。
上述种毒为鸭I型肝炎病毒(DHV I)AV2111株(以下简称为DHV I)、番鸭细小病毒、新城疫病毒、小鹅瘟病毒和H9亚型禽流感病毒。
将上述的经过增殖的DHV I、新城疫病毒和H9亚型禽流感病毒参照TRIzol LSReagent使用说明书提取RNA，再分别转录，采用10μL体系，于EP管中依次加入：2μL5×RT Buffer、10mmol/L dNTP 1μL、5U/μL AMV 0.5μL，20U/μL RNA酶抑制剂0.5μL，自由引物0.5μL，待检总RNA模板2μL，用无RNA酶灭菌水补足体积为10μL，瞬离后，置于PCR仪，42℃1h，99℃5min；得到DHV I cDNA、新城疫病毒cDNA、H9亚型禽流感病毒cDNA，用DU 800紫外分光光度计测定核酸浓度和纯度，分别为56ng/mlDHV I cDNA、77ng/ml新城疫病毒cDNA、12ng/mlH9亚型禽流感病毒cDNA，置于-70℃保存备用。
分别用TIAN amp Genomic DNA Kit试剂盒提取鸭圆环病毒(DuCV)、番鸭细小病毒和小鹅瘟病毒的基因组DNA，得到鸭圆环病毒(DuCV)DNA、番鸭细小病毒DNA和小鹅瘟病毒DNA，用DU 800紫外分光光度计测定核酸浓度和纯度，为6ng/mlDuCV DNA、24ng/ml番鸭细小病毒DNA和34ng/ml小鹅瘟病毒DNA，置于-70℃保存备用。
二、二重PCR扩增体系的建立
通过对DuCV、DHV 2种引物浓度的测定及二重PCR扩增的温度、时间等的优化，最后确定二重PCR中最佳上下游引物的终浓度分别为DuCV上/下游引物为2μmol/L，DHV上/下游引物为1.8μmol/L。
PCR反应体系的总体积为25μL，其中2×Master Mix(TIANG/MLEN公司，目录号：KT201)12.5μL，DHV I cDNA和DuCV DNA共2μL(体积比是1∶1)作为混合模板，DuCV上下游引物终浓度均为2μmol/L，DHV上下游引物终浓度均为1.8μmol/L，最后用双蒸水补至25μL。
二重PCR的最佳反应模式为：94℃预变性4min后，进入循环：94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸2min。35个循环后，72℃延伸7min，16℃结束反应。
三、二重PCR的特异性试验
按照上述二的PCR反应体系和反应模式进行二重PCR扩增，不同的是模板分别如下：
DuCV DNA、DHV I cDNA、DuCV DNA与DHV I cDNA混合样本(体积比是1∶1)、阴性对照(水)、番鸭细小病毒DNA、新城疫病毒cDNA、小鹅瘟病毒DNA、H9亚型禽流感病毒cDNA。
结果如图1所示，M为100bpMARKER；1泳道为DuCV DNA；2泳道为DHV I cDNA；3泳道为DuCV DNA与DHV I cDNA混合样本；4泳道为阴性对照；5泳道为番鸭细小病毒DNA、6泳道为新城疫病毒cDNA、7泳道为小鹅瘟病毒DNA、8泳道为H9亚型禽流感病毒cDNA，可以看出，DuCV DNA得到245bp目的片段，DHV cDNA得到569bp的片段，DuCV DNA与DHV I cDNA混合样本得到245bp目的片段和569bp的片段；而其他病毒没有扩增片段。
说明，本发明的引物和方法有高特异性。
因此，上述引物和方法可应用于鉴定未知样本是否感染鸭圆环病毒(DuCV)和DHVI：若得到245bp的片段，则样本中含有DuCV，反之则没有；
若得到569bp的片段，则样本中含有DHV I，反之则没有；
若得到245bp和569bp的片段，则样本中含有DuCV和DHV I，反之则没有。
四、二重PCR的敏感性试验
将上述DuCV DNA与DHV I cDNA分别作10倍递稀释后再等体积混合作为模板，按照上述二的PCR反应体系和反应模式进行二重PCR扩增。
结果如图2所示，M为100bpMARKER；泳道1为56ng/mlDHV I和6ng/mlDuCV；泳道2为5.6ng/mlDHV I和0.6ng/mlDuCV；泳道3为0.56ng/mlDHV I和0.06ng/mlDuCV；泳道4为56pg/mlDHV I和6pg/mlDuCV；泳道5为5.6pg/ml DHV I和0.6pg/mlDuCV；泳道6为0.56pg/mlDHV I和0.06pg/mlDuCV，可以看出，该二重PCR最低能同时检测到6pg/ml的DuCV、56pg/ml的DHV I核酸模板。
实施例3、二重PCR检测待测样本
对采集的12份(编号为1-12)鸭病料(采肝)，将其磨成悬液再进行病毒分离鉴定，分别提取鸭病料DNA和RNA，并将RNA反转录得到cDNA，将各个样本的DNA和cDNA混合(体积比为1∶1)，得到编号为1-12的混合样本。
分别将上述编号为1-12的混合样本作为模板，按照实施例2二的PCR反应体系和反应模式进行二重PCR检测。
若得到245bp的片段，则样本中含有DuCV，反之则没有；
若得到569bp的片段，则样本中含有DHV I，反之则没有；
若得到245bp和569bp的片段，则样本中含有DuCV和DHV I，反之则没有。
结果如图3所示，M为100bpMARKER；1-12为编号为1-12的样本；可以看出，1、2、5、7仅得到569bp的片段，说明均为DHV I感染；3和12仅得到245bp的片段，说明均为DuCV感染，6、10得到245bp和569bp的片段，说明均为DuCV和DHV I感染，而4、8、9、11没有片段，说明不感染DuCV和DHV I。
将编号为1-12的鸭病料分别用文献1(Fu Yu，Pan Meng，Wang Xiao-yan，et al.《Molecular detection and typing of duck hepatitis A virus directly fromclinical specimens》.Veterinary Microbiology，2008，131；247-257.)中的引物和方法进行鉴定鸭肝炎病毒，结果如图4所示，1-12分别为编号为1-12的鸭病料，可以看出，1、2、5、6、7、10为感染鸭肝炎病毒；
将编号为1-12的鸭病料分别用文献2(施少华，万春和《鸭圆环病毒感染的检测》，中国家禽2010年第32卷第1期31-33页)中记载的引物和方法鉴定鸭圆环病毒，结果如图5所示，1-12分别为编号为1-12的鸭病料，可以看出，3、6、10、12为感染鸭圆环病毒。
与本发明的方法一致，证明本发明的方法正确。
Claims (14)
1.检测鸭圆环病毒与鸭肝炎病毒的引物组，由引物1、引物2、引物3和引物4组成；
所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分别依次为序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于：
所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩尔比为2:2:（1.5-2）:（1.5-2）。
3.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于：
所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩尔比为2:2:1.8:1.8。
4.检测鸭圆环病毒与鸭肝炎病毒的PCR试剂，由权利要求1-3中任一所述的引物组、PCR缓冲液和水组成；
所述引物组中的引物1在所述PCR试剂中的终浓度为2μmol/L；
所述引物组中的引物2在所述PCR试剂中的终浓度为2μmol/L；
所述引物组中的引物3在所述PCR试剂中的终浓度为1.5-2μmol/L；
所述引物组中的引物4在所述PCR试剂中的终浓度为1.5-2μmol/L。
5.根据权利要求4所述的PCR试剂，其特征在于：
所述引物组中的引物3在所述PCR试剂中的终浓度为1.8μmol/L；
所述引物组中的引物4在所述PCR试剂中的终浓度为1.8μmol/L。
6.检测鸭圆环病毒与鸭肝炎病毒的PCR试剂盒，包括权利要求1-3中任一所述的引物组或权利要求4或5所述的PCR试剂。
7.权利要求1-3中任一所述的引物组或权利要求4或5所述PCR试剂或权利要求6所述试剂盒在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有鸭圆环病毒与鸭肝炎病毒产品中的应用。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于：所述检测和/或辅助检测待测样品中是否含有鸭圆环病毒与鸭肝炎病毒为用权利要求1-3中任一所述的引物组或权利要求4或5所述PCR试剂或权利要求6所述试剂盒对所述待测样品进行二重PCR扩增。
9.根据权利要求7或8所述应用，其特征在于：
所述二重PCR扩增的退火温度为50℃-55℃。
10.根据权利要求9所述应用，其特征在于：
所述二重PCR扩增的退火温度为55℃。
11.一种检测鸭圆环病毒的引物对A，由权利要求1-3中任一所述的引物组中的所述引物1和所述引物2组成。
12.一种检测鸭肝炎病毒的引物对B，由权利要求1-3中任一所述的引物组中的所述引物3和所述引物4组成。
13.权利要求11所述的引物对A在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有鸭圆环病毒产品中的应用。
14.权利要求12所述的引物对B在制备检测和/或辅助检测待测样品中是否含有鸭肝炎病毒产品中的应用。
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