CN111549148A - 一种布鲁氏菌环介导等温扩增技术可视化检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于布鲁氏菌环介导等温扩增技术检测的引物，包括两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP，以及两条环引物LF和LB；本发明还公开了利用上述LAMP引物的布鲁氏菌环介导等温扩增技术可视化检测方法，具体按照以下步骤实施：S1，提取细菌基因组DNA，存放于‑20～‑40℃冰箱备用。S2，LAMP检测的反应体系的建立，振荡形成均匀混合液。S3，设置反应条件，完成反应；S4，采用的方法为可视化HNB染料检测法确定检测结果。本发明的布鲁氏菌环介导等温扩增技术可视化检测方法可以准确、快速的检验布鲁氏菌，且因为设备简化，更适用于进行基层检验和现场检验。

Description

一种布鲁氏菌环介导等温扩增技术可视化检测方法

技术领域

本发明涉及一种布鲁氏菌检测方法，具体是一种布鲁氏菌环介导等温扩增技术可视化检测方法。

背景技术

布鲁氏菌(Brucella spp.)是一种无运动性、无荚膜、兼性厌氧的革兰氏阴性杆菌，且具有较强的致病性和宿主特异性。众所周知，布病已经对畜牧业造成了极大的经济损失并且严重影响其发展，甚至威胁到人类的健康安全。因此，建立一种快速、简单、灵敏的方法检验布鲁氏菌显得尤为重要。

近年来，消费者们越来越关注食品安全问题，同时食品行业和政府部门也表达了快速简便检验布鲁氏菌的迫切需求。目前，用于检测布鲁氏菌的方法主要包括病原学检测、血清学检测及分子生物学检测方法。其中最常用的检测方法是病原学检测，即分离培养出目标菌株，被称作是检测布病的“黄金标准”。但该方法对实验室的要求较高、检测周期较长、灵敏度较低且常用于发病期检测。血清学检测包括试管凝集试验、补体结合试验、虎红平板凝集试验等方法，但这些方法不能准确区分人为接种和自然感染。分子生物学检测包括聚合酶链式反应(PCR)、实时定量PCR(RT-PCR)等方法，具有灵敏度高、特异性强等优点，但这些大多需要昂贵的专业仪器设备，不适合现场检验。

与传统的检测方法比较，环介导等温技术具有高特异性、高灵敏度、快速简便等优点，适合基层与现场检验。基于以上优点，LAMP已经被广泛应用于病原微生物的快速检测方面，如金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、肠球菌耶尔森氏菌、志贺氏菌等。

虽然公开号CN103205493A的中国专利，公开了一种检测布鲁氏菌的LAMP方法，该方法也是利用环介导等温技术进行布鲁氏菌检测的方法，但采用该方法检测布鲁氏菌时，需要的设备复杂，对操作要求高，不能准确的适应现场的快速检测，并且该方法中采用的引物特异性和灵敏度不能满足精准和快速测试的要求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种布鲁氏菌环介导等温扩增技术检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种用于布鲁氏菌环介导等温扩增技术检测的引物，其特征在于，包括两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP，以及两条环引物LF和LB；所述的引物序列如下：

外引物F3的序列为：GGCCTGAAATATGCTGGCG；

外引物B3的序列为：TCGGGGGCAATGAACTTTG；

内引物FIP的序列为：GCCACGAACCTTTGTAGCCCAT-GGTTCGATCGCTGGTGTT；

内引物BIP的序列为：GCAGGGCGCATATTCGTCCG-ACCCCAGACAGCCCAATC；

环引物LF的序列为：CGATGACCGAGTCATAGGCA；

环引物LB的序列为：ACCAGAACTACGGTCAGTGG。

本发明还提供了另一技术方案：

一种布鲁氏菌环介导等温扩增技术可视化检测方法，采用了所述权利要求1中的LAMP引物，其特征在于，具体按照以下步骤实施：

S1，提取细菌基因组DNA，取布鲁氏菌活疫苗株S2接种于增菌培养基中，在35～37℃、180～220r/min摇床内培养36～48h后，在80～85℃(80℃最好)的水浴锅内灭活30～40min，按照细菌基因组提取试剂盒使用说明进行布鲁氏菌基因组的提取，测定DNA模板浓度及纯度，存放于-20～-40℃冰箱备用。

S2，LAMP检测的反应体系的建立，依次将2.3～2.7μL的10×ThermoPol Buffer、1.30～1.48mM dNTP Mix、0.36～0.44M甜菜碱、6.5～7.5mM Mg²⁺溶液、引物、117.6～122.4MHNB、4～12U Bst DNA Polymerase Large Fragment酶、1～5μL DNA模板于冰浴条件下加入到反应管中，然后用双蒸水补足至25μL，振荡形成均匀混合液。

S3，设置反应条件，完成反应；

S4，确定检测结果，确定检测结果时采用的方法为可视化HNB染料检测法。

作为本发明进一步的方案：所述的S1中的增菌培养基采用胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)液体培养基、基础肉汤培养基(LB)或血清葡萄糖培养基。

作为本发明再进一步的方案：所述S2中的引物的具体加入量为：FIP和BIP各1.44～1.76μM、F3和B3各0.16～0.24μM、LF和LB各0.64～0.96μM。

作为本发明再进一步的方案：所述S2中的Mg²⁺溶液采用MgSO₄溶液、MgCl₂溶液或不影响反应正常进行的其它Mg²⁺溶液。

作为本发明再进一步的方案：所述S3的反应具体方法为：将S2中最终得到的所述均匀混合液短暂离心8～15s后，于64～66℃下恒温孵育30～70min，待反应结束后直接检测结果，或者将反应管于75～85℃下灭活20～30min，扩增产物于4℃以下保存3day以上用于后续检测。

作为本发明再进一步的方案：所述S4中的可视化HNB染料检测法的具体方法为：

在白色背景下观察扩增产物的颜色：若扩增产物颜色不变，依旧为紫色，则表明DNA未扩增，结果为阴性；若扩增产物颜色变为蓝色，则表明DNA扩增，结果为阳性。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本研究主要针对布鲁氏菌的保守基因Omp2a设计3对LAMP引物，对布鲁氏菌进行检测，优化LAMP反应条件与反应体系，建立了一种特异、灵敏和可视化的LAMP检测布鲁氏菌的方法。本检测方法可以准确区分布鲁氏菌与非布鲁氏菌。同灵敏度检验结果表示，该检测方法的检测限为2.56×10^-4ng/μL，灵敏度是传统PCR的10倍。

由于采用可视化检测，HNB的显色效果更明显，染料在扩增前就加入到反应体系中，这样可以避免气溶胶污染，不需要使用实时浊度仪，所以该检测方法可以准确、快速的检验布鲁氏菌，且因为设备简化，更适用于进行基层检验和现场检验。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为Mg²⁺浓度优化结果；

图2为反应温度优化结果；

图3为该方法特异性检测结果；

图4为该方法灵敏度检测结果；

图5为PCR检测方法灵敏度检测结果。

具体实施方式

为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例，实施例中这些特定的特征、结构或特性可以任意适合的方式结合在一个或多个实施例中。在下面的描述中，提供诸如具体的配置和组件的特定细节仅仅是为了帮助全面理解本申请的实施例。因此，本领域技术人员应该清楚，可以对这里描述的实施例进行各种改变和修改而不脱离本申请的范围和精神。

本发明一种布鲁氏菌环介导等温扩增技术检测方法，该检测方法所采用的LAMP引物包括两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP，以及两条环引物LF和LB；所述检测方法具体按照以下步骤实施：

S1，提取细菌基因组DNA，具体方法为：

取布鲁氏菌活疫苗株(代号S2)接种于增菌培养基中，在35～37℃、180～220r/min摇床内培养36～48h后，在80～85℃的水浴锅内灭活30～40min，按照细菌基因组提取试剂盒使用说明进行布鲁氏菌基因组的提取，测定DNA模板浓度及纯度，存放于-20～-40℃冰箱备用。所述的增菌培养基可采用胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)液体培养基，在其它一些实施例中也可以采用基础肉汤培养基(LB)或血清葡萄糖培养基等。

S2，LAMP检测的反应体系的建立，具体步骤为：

依次将2.3～2.7μL的10×ThermoPol Buffer、1.32～1.48mM dNTP Mix、0.36～0.44M甜菜碱、6.5～7.5mM Mg²⁺溶液、LAMP引物、117.6～122.4M HNB、4～12U Bst DNAPolymerase Large Fragment酶、步骤S1制备的1～5μL DNA模板于冰浴条件下加入到反应管中，然后用双蒸水补足至25μL，振荡形成均匀混合液。

所述的LAMP引物的具体加入量为：FIP和BIP各1.44～1.76μM、F3和B3各0.16～0.24μM、LF和LB各0.64～0.96μM；

所述的Mg²⁺溶液可采用MgSO₄溶液，在其它一些实施例中也可以采用MgCl₂或选择不影响反应正常进行的其它Mg²⁺溶液均可。

S3，设置反应条件，完成反应，具体方法为：将S2中最终得到的所述均匀混合液短暂离心8～15s后，于64～66℃下恒温孵育30～70min，待反应结束后得到被测试样或于一定条件下保存作为待测试样。具体为：

将S2中最终得到的所述均匀混合液短暂离心8～15s后，于64～66℃下恒温孵育30～70min，待反应结束后直接得到被测试样，或者待反应结束后将反应管于75～85℃下灭活20～30min，扩增产物于4℃以下保存3day以上用于后续检测。

S4，采用可视化HNB染料检测法对步骤S3得到的所述被测试样或待测试样进行布鲁氏菌的检测。

所述的可视化HNB染料检测法的具体实施步骤为：

在白色背景下观察扩增产物的颜色：若扩增产物颜色不变(依旧为紫色)，则表明DNA未扩增，结果为阴性；若扩增产物颜色变为蓝色，则表明DNA扩增，结果为阳性。

该方法的检测原理为：LAMP反应过程中会消耗混合溶液中的Mg²⁺。而羟基萘酚蓝(HNB)是一种常见的金属指示剂，含有不同浓度Mg²⁺的混合液体颜色不同，当发生LAMP扩增，则反应溶液中的Mg²⁺消耗之后呈现蓝色，如果不发生扩增，则Mg²⁺没有被消耗，反应溶液颜色依旧为紫色。

同时，采用琼脂糖凝胶电泳检测法对相同的试样进行检测，作为对照样，以证明本方法中检测结果的正确性。

琼脂糖凝胶电泳检测法具体的步骤为：使用浓度为2％的琼脂糖凝胶进行电泳。电泳时，点样量为2～5μL，电压为115～125±5V，电泳时间为30～40min。电泳后的凝胶置于凝胶成像系统中紫外成像。成像后的电泳条带为特殊的梯状结构，则扩增结果为阳性；若无条带，则扩增结果为阴性。

这一方法的检测原理是：LAMP反应扩增后的产物是若干个不同长度的茎环DNA混合物，其在琼脂糖凝胶电泳的中的条带呈现特殊的梯状结构，而如果不发生扩增，则电泳后的成像结果中不存在条带。

所述的用于布鲁氏菌环介导等温扩增技术检测的引物，序列如表1所示，其中：

外引物F3的序列为：GGCCTGAAATATGCTGGCG；

外引物B3的序列为：TCGGGGGCAATGAACTTTG；

内引物FIP的序列为：GCCACGAACCTTTGTAGCCCATGGTTCGATCGCTGGTGTT；

内引物BIP的序列为：GCAGGGCGCATATTCGTCCGACCCCAGACAGCCCAATC；

环引物LF的序列为：CGATGACCGAGTCATAGGCA；

环引物LB的序列为：ACCAGAACTACGGTCAGTGG；

表1 LAMP引物序列表

序列标识符	引物	引物序列(5'-3')
				Primer	Primer sequence(5'-3')
1	F3	GGCCTGAAATATGCTGGCG
			2	B3	TCGGGGGCAATGAACTTTG
3	FIP	GCCACGAACCTTTGTAGCCCATGGTTCGATCGCTGGTGTT
			4	BIP	GCAGGGCGCATATTCGTCCGACCCCAGACAGCCCAATC
5	LF	CGATGACCGAGTCATAGGCA
			6	LB	ACCAGAACTACGGTCAGTGG

所述的引物的设计和制备过程为：在GenBank数据库中检索布鲁氏菌Omp2a基因序列，选取不同种属的Omp2a基因序列，这些基因序列的GenBank登记号分别为：AY008719.1、MF966952.1、MF966953.1、AY008721.1、AY008720.1，

通过Clustal软件比对分析，选取特异性好的保守片段。通过在线软件PrimerExplorer V5(http://primerexplorer.jp/e/)设计出如表1所示的一套LAMP引物，包括两条外引物(F3、B3)、两条内引物(FIP、BIP)和两条环引物(LF、LB)。引物合成后，用ddH₂O溶解后分装，-20℃冰箱保存备用。

本发明检测方法中，发明的重点是根据布鲁氏菌设计的新引物、优化后的反应体系，从而使本测试方法能准确的检测出布鲁氏菌。

首先，根据菌种的不同，需要选择其保守序列进行引物设计，而设计出的引物要求灵敏度好，特异性强(即只能检测出布鲁氏菌)，因此引物设计是本发明的关键技术。

另外，需要针对新引物的反应体系的优化过程，这是本发明方法的另一个重点，具体包括：

(1)LAMP反应体系优化

LAMP体系较为固定，因此仅对较为重要的Mg²⁺浓度进行优化。设置Mg²⁺浓度为4mmol/L、5mmol/L、6mmol/L和7mmol/L，选择无假阳性、无非特异性扩增、颜色差异明显和反应时间较短的Mg²⁺浓度为最适Mg²⁺浓度。如图1所示，其中Ⅰ～Ⅳ号试样，Mg²⁺浓度依次为4mmol/L、5mmol/L、6mmol/L和7mmol/L；

ⅠA～ⅣA为电泳结果图，ⅠB～ⅣB为可视化结果；在上述电泳结果图和可视化结果图中，1为阳性对照，2、3、4为空白对照；M为2000bp Marker。

设置Mg²⁺浓度为4mmol/L、5mmol/L、6mmol/L和7mmol/L，通过观察反应结果确定最佳Mg²⁺浓度。如图所示，反应进行60min后不同浓度Mg²⁺反应液的阳性均发生不同程度的变色：

对于Ⅰ号试样,Mg²⁺浓度为4mmol/L，如图中ⅠB所示，2、3、4的空白对照为蓝色，结合ⅠA中2和3显示有条带，可以说明2、3为假阳性，且4虽然不是假阳性但是与阳性对照样的色差并不大，无法起到检测要求的区分作用。

对于Ⅱ号试样和Ⅲ号试样,Mg²⁺浓度为5mmol/L和6mmol/L时，如图中ⅡB和ⅢB所示，试样基本上为蓝色，虽然结合ⅡA和ⅢA中的条带判断并非全部都为假阳性，但是可以看出阳性对照与空白对照的颜色差异并不明显，不能满足检测需求。

对于Ⅳ号试样，Mg²⁺浓度为7mmol/L时，如图ⅣB，2～4的空白对照为紫色，可以看出阳性对照1与2～4的空白对照颜色差异明显、反应时间较短且无假阳性现象。因此，选择7mmol/L为最适Mg²⁺浓度。另外，在进一步的实验研究中，申请人还取了6.5mmol/L、7.5mmol/L同样进行了上述试验，其阳性对照与空白对照的颜色差异略差于7mmol/L(7mM)，但高于Mg²⁺浓度为5mmol/L和6mmol/L时的情况。

(2)LAMP反应温度优化

设置反应温度为63℃、64℃和65℃，确定适宜的反应温度。选择无假阳性、无非特异性扩增和反应时间较短的温度为最适反应温度。如图2所示，对于Ⅰ～Ⅲ号试样，温度依次为63℃、64℃、65℃；ⅠA～ⅢA为电泳结果图，ⅠB～ⅢB为可视化结果；在所述电泳结果图和可视化结果中，1为阳性对照，2、3、4为空白对照；M为2000bp Marker。设置反应温度为63℃、64℃和65℃，检测适宜的反应温度。

如图所示，对于Ⅰ号试样和Ⅱ号试样，反应温度为63℃和64℃时，图ⅠB和图中ⅡB所示，2号空白样为蓝色，结合图ⅠA和图ⅡA中出现的条带现象，说明这两个温度下的试样出现假阳性现象，而且反应时间较65℃时长。

对于Ⅲ号试样，反应温度为65℃，如图中的ⅢB所示，此时2～4空白样均显示为紫色，结合图中ⅢA中，2～4的空白样也未出现条带，因此完全没有出现假阳性的状况。因此，选择无假阳性、无非特异性扩增和反应时间较短的65℃温度为最适反应温度，即优选恒温孵育温度为65℃。

另外，在进一步的实验研究中，申请人还研究了反应温度更细化的选择，同样进行了上述试验，发现其中设置反应温度分别为64.5℃、65.5℃、66℃时，试验也并未出现假阳性且无非特异性扩增，但其综合效果上略差于65℃的最佳反应温度。

实施例1

本发明一种布鲁氏菌环介导等温扩增技术检测方法，该检测方法所采用的LAMP引物包括两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP，以及两条环引物LF和LB；所述检测方法具体按照以下步骤实施：

S1，提取细菌基因组DNA，具体方法为：

取布鲁氏菌活疫苗株S2接种于增菌培养基中，在35℃、180r/min摇床内培养36h后，在80℃的水浴锅内灭活30min，按照细菌基因组提取试剂盒使用说明进行布鲁氏菌基因组的提取，测定DNA模板浓度及纯度，存放于-20℃冰箱备用。所述的增菌培养基可采用胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)液体培养基。

S2，LAMP检测的反应体系的建立，具体步骤为：

依次将2.3μL的10×ThermoPol Buffer、1.32mM dNTP Mix、0.36M甜菜碱、6.5mMMg²⁺溶液、引物、117.6M HNB、4U Bst DNA Polymerase Large Fragment酶、1μL DNA模板于冰浴条件下加入到反应管中，然后用双蒸水补足至25μL，振荡形成均匀混合液。

所述的引物的具体加入量为：FIP和BIP各1.44μM、F3和B3各0.16μM、LF和LB各0.64μM；

所述的Mg²⁺溶液可采用MgSO₄溶液。

S3，设置反应条件，完成反应，具体方法为：

将S2中最终得到的所述均匀混合液短暂离心8s后，于64℃下恒温孵育30min，待反应结束后直接检测结果，或者将反应管于75℃下灭活20min，扩增产物于4℃以下保存3day以上用于后续检测。

S4，确定检测结果，检测结果时采用的方法为可视化HNB染料检测法。

所述的可视化HNB染料检测法的具体实施步骤为：

在白色背景下观察扩增产物的颜色：若扩增产物颜色不变(依旧为紫色)，则表明DNA未扩增，结果为阴性；若扩增产物颜色变为蓝色，则表明DNA扩增，结果为阳性。

同时，采用琼脂糖凝胶电泳检测法进行测试作为对照，具体实施步骤为：

使用浓度为2％的琼脂糖凝胶进行电泳。电泳时，点样量为2μL，电压为115V，电泳时间为30min。电泳后的凝胶置于凝胶成像系统中紫外成像。成像后的电泳条带为特殊的梯状结构，则扩增结果为阳性；若无条带，则扩增结果为阴性。

实施例2

本发明一种布鲁氏菌环介导等温扩增技术检测方法，该检测方法所采用的LAMP引物包括两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP，以及两条环引物LF和LB；所述检测方法具体按照以下步骤实施：

S1，提取细菌基因组DNA，具体方法为：

取布鲁氏菌活疫苗株S2接种于增菌培养基中，在36℃、200r/min摇床内培养40h后，在82℃的水浴锅内灭活35min，按照细菌基因组提取试剂盒使用说明进行布鲁氏菌基因组的提取，测定DNA模板浓度及纯度，存放于-30℃冰箱备用。所述的增菌培养基可采用胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)液体培养基。

S2，LAMP检测的反应体系的建立，具体步骤为：

依次将2.5μL的10×ThermoPol Buffer、1.4mM dNTP Mix、0.4M甜菜碱、7mM Mg²⁺溶液、引物、120M HNB、8U Bst DNA Polymerase Large Fragment酶、3μL DNA模板于冰浴条件下加入到反应管中，然后用双蒸水补足至25μL，振荡形成均匀混合液。

所述的引物的具体加入量为：FIP和BIP各1.6μM、F3和B3各0.2μM、LF和LB各0.8μM；

所述的Mg²⁺溶液可采用MgSO₄溶液。

S3，设置反应条件，完成反应，具体方法为：

将S2中最终得到的所述均匀混合液短暂离心11s后，于65℃下恒温孵育60min，待反应结束后直接检测结果，或者将反应管于80℃下灭活25min，扩增产物于4℃以下保存3day以上用于后续检测。

S4，确定检测结果，检测结果时可以采用的方法包括琼脂糖凝胶电泳检测法或可视化HNB染料检测法，

所述的可视化HNB染料检测法的具体实施步骤为：

在白色背景下观察扩增产物的颜色：若扩增产物颜色不变，依旧为紫色，则表明DNA未扩增，结果为阴性；若扩增产物颜色变为蓝色，则表明DNA扩增，结果为阳性。

同时，采用琼脂糖凝胶电泳检测法进行测试作为对照，具体实施步骤为：

使用浓度为2％的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳时，点样量为3μL，电压为120V，电泳时间为35min，电泳后的凝胶置于凝胶成像系统中紫外成像，成像后的电泳条带为特殊的梯状结构，则扩增结果为阳性；若无条带，则扩增结果为阴性。

实施例3

本发明一种布鲁氏菌环介导等温扩增技术检测方法，该检测方法所采用的LAMP引物包括两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP，以及两条环引物LF和LB；所述检测方法具体按照以下步骤实施：

S1，提取细菌基因组DNA，具体方法为：

取布鲁氏菌活疫苗株S2接种于增菌培养基中，在37℃、220r/min摇床内培养48h后，在85℃的水浴锅内灭活40min，按照细菌基因组提取试剂盒使用说明进行布鲁氏菌基因组的提取，测定DNA模板浓度及纯度，存放于-40℃冰箱备用。所述的增菌培养基可采用胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)液体培养基，

S2，LAMP检测的反应体系的建立，具体步骤为：

依次将2.7μL的10×ThermoPol Buffer、1.48mM dNTP Mix、0.44M甜菜碱、7.5mMMg²⁺溶液、引物、122.4M HNB、12U Bst DNA Polymerase Large Fragment酶、5μL DNA模板于冰浴条件下加入到反应管中，然后用双蒸水补足至25μL，振荡形成均匀混合液。

所述的引物的具体加入量为：FIP和BIP各1.76μM、F3和B3各0.24μM、LF和LB各0.96μM；

所述的Mg²⁺溶液可采用MgSO₄溶液。

S3，确定反应条件，完成反应，具体方法包括两种：

方法A，将S2中最终得到的所述均匀混合液短暂离心15s后，于66℃下恒温孵育70min，待反应结束后直接检测结果，

方法B，或者将反应管于85℃下灭活30min，扩增产物于4℃以下保存3day以上用于后续检测。

S4，确定检测结果，检测结果时可以采用的方法包括琼脂糖凝胶电泳检测法或可视化HNB染料检测法两种方法。

所述的可视化HNB染料检测法的具体实施步骤为：

在白色背景下观察扩增产物的颜色：若扩增产物颜色不变，依旧为紫色，则表明DNA未扩增，结果为阴性；若扩增产物颜色变为蓝色，则表明DNA扩增，结果为阳性。

同时，采用琼脂糖凝胶电泳检测法进行测试作为对照，具体实施步骤为：

使用浓度为2％的琼脂糖凝胶进行电泳。电泳时，点样量为5μL，电压为125±5V，电泳时间为40min。电泳后的凝胶置于凝胶成像系统中紫外成像。成像后的电泳条带为特殊的梯状结构，则扩增结果为阳性；若无条带，则扩增结果为阴性。

本发明上述实施例中，采用的增菌培养基为胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)液体培养基，在其它一些实施例中也可以采用基础肉汤培养基(LB)或血清葡萄糖培养基等，同样可以达到增菌和培养的目的。

本发明上述实施例中，采用的Mg²⁺溶液为MgSO₄溶液，在其它一些实施例中也可以采用MgCl₂或选择不影响反应正常进行的其它Mg²⁺溶液均可。

本发明优点或者积极有益的效果主要表现在以下几个方面：

1.该检测方法可以准确区分布鲁氏菌与非布鲁氏菌。即进行LAMP特异性检测后，表明设计引物的特异性良好，能准确区分布鲁氏菌与非布鲁氏菌。

LAMP特异性检测的具体方法如下：

为确保建立方法的特异性，用优化好的反应体系及反应条件检测3种布鲁氏菌及7种非布鲁氏菌，每种细菌的DNA模板添加量为1μL。如图3所示，A为电泳结果图，B为可视化结果；1～10分别为羊种布鲁氏菌16M、猪种布鲁氏菌S2、牛种布鲁氏菌2308、大肠杆菌ATCC25922、沙门氏菌H9812、金黄色葡萄球菌ATCC29213、单核细胞增生李斯特菌CMCC54004、蜡样芽孢杆菌ATCC14579、小肠耶尔森菌、志贺杆菌；M为2000bp Marker。用优化好的反应体系及反应条件检测3种布鲁氏菌及7种非布鲁氏菌，每种细菌的DNA模板添加量为1μL。如图3所示，加入布鲁氏菌模板的反应管颜色均由紫色变为蓝色，即图3B中1～3号反应管，与琼脂糖凝胶电泳检测结果一致，即图3A图中1～3号试样有特殊的梯形条带，表明设计引物的特异性良好，能准确区分布鲁氏菌与非布鲁氏菌。

2.同灵敏度检验结果表示，该检测方法的检测限为2.56×10^-4ng/μL，灵敏度是传统PCR的10倍，即，将本发明方法对布鲁氏菌检测的灵敏度进行测试，与现有技术聚合酶链式反应(PCR)进行对比后，布鲁氏菌检测的灵敏度明显优于聚合酶链式反应(PCR)的灵敏度，具体的测试对比实验如下：

(1)本发明方法灵敏度检测：

采用10倍梯度稀释法检测建立方法的检测限。每个梯度的DNA模板取1μL加于优化好的反应体系中，在最适反应条件下扩增并判断结果。如图4所示，其中，B为可视化结果，图中显示，1～6号样本的颜色为蓝色，7～8号样本的颜色为紫色。图A为琼脂糖凝胶电泳结果图，结果显示1～6号样本出现梯形条带。

1～8的DNA模板浓度依次为2.56×10ng/μL、2.56ng/μL、2.56×10^-1ng/μL、2.56×10^-2ng/μL、2.56×10^-3ng/μL、2.56×10^-4ng/μL、2.56×10^-5ng/μL和2.56×10^-6ng/μL；M为2000bp Marker。将浓度为256ng/μL的DNA模板10倍梯度稀释，并取1μL加到LAMP反应体系中。65±5℃恒温孵育60±5min后，灵敏度检测结果如图5。结果表明，建立的LAMP方法检测限为2.56×10^-4ng/μL，且可视化结果与凝胶电泳结果一致。

(2)聚合酶链式反应(PCR)的灵敏度检测：

常规PCR的引物使用文献引物，其具体序列如表2所示。

表2PCR引物序列

序列标识符	引物	引物序列(5'-3')
				Primer	Primer sequence(5'-3')
7	正向引物	GCGCATTCTTCGGTTATGAA
			8	反向引物	CGCAGGCGAAAACAGCTATAA

依次将2.5μL的10×Buffer、5μL dNTP Mix(2.5mM)、3μL MgSO4(25mM)、0.5μL F3(12.5μM)、0.5μL B3(12.5μM)、0.3μL Taq酶(5U/μL)、1μL DNA模板和12.2μL双蒸水在冰浴条件下加入0.2mL的反应管中，混合均匀，于PCR仪中反应。

PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环；72℃继续延伸1min后在4℃下保存。

如图5所示，为PCR检测方法灵敏度检测结果，在检测中1～7的DNA模板浓度依次为2.56×10ng/μL、2.56ng/μL、2.56×10^-1ng/μL、2.56×10^-2ng/μL、2.56×10^-3ng/μL、2.56×10^-4ng/μL和2.56×10^-5ng/μL；N为空白对照；M为2000bp Marker。将浓度为256ng/μL的DNA模板10倍梯度稀释，并取1μL加到PCR反应体系中。如图所示，PCR反应的检测限为2.56×10^{- 3}ng/μL，高于建立好的LAMP检测方法。

3.本发明的布鲁氏菌环介导等温扩增技术检测方法，采用可视化HNB染料检测法，显色效果更明显，染料在扩增前就加入到反应体系中，这样可以避免气溶胶污染，可以准确、快速的检验布鲁氏菌，另外，因为不需要使用实时浊度仪，因为设备简化，更适用于进行基层检验和现场检验。

以上所述的，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种布鲁氏菌环介导等温扩增技术可视化检测方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggcctgaaat atgctggcg 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcgggggcaa tgaactttg 19

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gccacgaacc tttgtagccc atggttcgat cgctggtgtt 40

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcagggcgca tattcgtccg accccagaca gcccaatc 38

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cgatgaccga gtcataggca 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

accagaacta cggtcagtgg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gcgcattctt cggttatgaa 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cgcaggcgaa aacagctata a 21

Claims (10)

1.一种用于布鲁氏菌环介导等温扩增技术检测的引物，其特征在于，包括两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP，以及两条环引物LF和LB；所述的引物序列如下：

外引物F3的序列为：GGCCTGAAATATGCTGGCG；

外引物B3的序列为：TCGGGGGCAATGAACTTTG；

内引物FIP的序列为：GCCACGAACCTTTGTAGCCCAT-GGTTCGATCGCTGGTGTT；

内引物BIP的序列为：GCAGGGCGCATATTCGTCCG-ACCCCAGACAGCCCAATC；

环引物LF的序列为：CGATGACCGAGTCATAGGCA；

环引物LB的序列为：ACCAGAACTACGGTCAGTGG。

2.一种布鲁氏菌环介导等温扩增技术可视化检测方法，采用了所述权利要求1中的LAMP引物，其特征在于，具体按照以下步骤实施：

S1，提取细菌基因组DNA，取布鲁氏菌活疫苗株S2接种于增菌培养基中，在35～37℃、180～220r/min摇床内培养36～48h后，在80～85℃的水浴锅内灭活30～40min，按照细菌基因组提取试剂盒使用说明进行布鲁氏菌基因组的提取，测定DNA模板浓度及纯度，存放于-20～-40℃冰箱备用；

S2，LAMP检测的反应体系的建立，依次将2.3～2.7μL的10×ThermoPol Buffer、1.30～1.48mM dNTP Mix、0.36～0.44M甜菜碱、6.5～7.5mM Mg²⁺溶液、所述LAMP引物、117.6～122.4M HNB、4～12U Bst DNA Polymerase Large Fragment酶、步骤S1制备的1～5μL DNA模板于冰浴条件下加入到反应管中，然后用双蒸水补足至25μL，振荡形成均匀混合液；

S3，设置反应条件，完成反应，将步骤S2最终得到的所述均匀混合液短暂离心，恒温孵育，待反应结束后直接得到被测试样或于一定条件下保存作为待测试样；

S4，确定检测结果，采用可视化HNB染料检测法对步骤S3得到的所述被测试样或待测试样进行布鲁氏菌的检测。

3.根据权利要求2所述的布鲁氏菌环介导等温扩增技术可视化检测方法，其特征在于，所述步骤S1中的增菌培养基采用胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)液体培养基、基础肉汤培养基(LB)或血清葡萄糖培养基。

4.根据权利要求2所述的布鲁氏菌环介导等温扩增技术可视化检测方法，其特征在于，所述步骤S1中的水浴锅的温度为80℃。

5.根据权利要求2所述的布鲁氏菌环介导等温扩增技术可视化检测方法，其特征在于，所述步骤S2中的引物的具体加入量为：FIP和BIP各1.44～1.76μM、F3和B3各0.16～0.24μM、LF和LB各0.64～0.96μM。

6.根据权利要求2所述的布鲁氏菌环介导等温扩增技术可视化检测方法，其特征在于，所述步骤S2中的Mg²⁺溶液采用MgSO₄溶液、MgCl₂溶液。

7.根据权利要求2-6任一项所述的布鲁氏菌环介导等温扩增技术可视化检测方法，其特征在于，所述S2中Mg²⁺溶液的浓度为7mM。

8.根据权利要求2-6任一项所述的布鲁氏菌环介导等温扩增技术可视化检测方法，其特征在于，所述步骤S3的反应具体方法为：

将S2中最终得到的所述均匀混合液短暂离心8～15s后，于64～66℃下恒温孵育30～70min，待反应结束后直接得到被测试样，或者待反应结束后将反应管于75～85℃下灭活20～30min，扩增产物于4℃以下保存3day以上用于后续检测。

9.根据权利要求8所述的布鲁氏菌环介导等温扩增技术可视化检测方法，其特征在于，所述恒温孵育温度为65℃。

10.根据权利要求2-6任一项所述的布鲁氏菌环介导等温扩增技术可视化检测方法，其特征在于，所述S4中的可视化HNB染料检测法的具体方法为：

在白色背景下观察扩增产物的颜色：若扩增产物颜色不变，依旧为紫色，则表明DNA未扩增，结果为阴性；若扩增产物颜色变为蓝色，则表明DNA扩增，结果为阳性。

Images