CN109402229A

CN109402229A - 基于分子信标的实时定量pcr检测布鲁氏菌感染的体系

Info

Publication number: CN109402229A
Application number: CN201811191942.7A
Authority: CN
Inventors: 吴国球; 舒建洪; 吕正兵; 何玉龙; 童夏霞; 杨芳
Original assignee: Hangzhou Hongqiao Zhongke Gene Technology Co Ltd; Hangzhou Hong Sheng Biotechnology Ltd By Share Ltd
Current assignee: Hangzhou Hongqiao Zhongke Gene Technology Co Ltd; Hangzhou Hong Sheng Biotechnology Ltd By Share Ltd
Priority date: 2018-10-12
Filing date: 2018-10-12
Publication date: 2019-03-01

Abstract

本发明涉及生化检测领域，尤其是涉及一种基于分子信标的实时定量PCR检测布鲁氏菌感染的体系、试剂盒及检测方法。该检测体系、试剂盒和检测方法包括扩增引物系统和分子信标探针系统，所述扩增引物系统包括序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对，所述分子信标探针系统包括如SEQ ID NO.3所示的基因序列。与细菌培养、SAT和RBPT等血清学试验相比，能够提高检测效率，并且特异性好、灵敏度高，具有很好的应用前景。

Description

基于分子信标的实时定量PCR检测布鲁氏菌感染的体系

技术领域

本发明涉及生化检测领域，尤其是涉及一种基于分子信标的实时定量PCR检测布鲁氏菌感染的体系、试剂盒及检测方法。

背景技术

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的人畜共患传染病，导致动物的繁殖障碍和人类的发热性疾病，并且在中东、西亚、非洲和南美等地区流行。在过去的几十年中，中国特别是新疆和内蒙古的人类布鲁氏菌病患病率显着增加。基于使用一系列细菌学和生物化学测试的单一表型特征，布鲁氏菌通常分为六种。近年来，由于从海洋哺乳动物、啮齿动物和感染的人类乳房植入物中分离出几种新的布鲁氏菌菌株，物种数量已增加到10。

人体中的布鲁氏菌病具有多种临床症状，其中最重要的是断续不稳定的发热和动脉痛。大部分患者伴有脾肿大和/或肝肿大。当疾病变为慢性时，它会影响几乎所有器官并导致复杂的综合征，包括脊椎炎、心内膜炎和脑膜脑炎等。

一般来说，布鲁氏菌病的诊断方法包括直接微生物分析和间接检测，如血清学检测。细菌培养是疾病决定性诊断的重要标准，但需要较长时间，灵敏度较低。血清学检测方法如标准凝集试验（SAT）和板式孟加拉红平板凝集实验（RBPT）均为用于检测抗布鲁氏菌抗体，但血清学方法可能被疫苗，反复暴露于抗原刺激，或与布鲁氏菌以外的抗原交叉反应等问题混淆，影响检测的准确性。

与细菌培养方法相比，分子测定法是度敏度高的，并且与血清学方法相比更具特异性。PCR方法具有可信度高，成本效益高，灵敏度高，特异高并且检测快速，越来越多地被用作鉴定布鲁氏菌属、种和生物型的特定序列，以及利用它作为减少布鲁氏菌病爆发的监测工具。

分子信标（MB）是标记的单链寡核苷酸，具有茎 - 环结构。环是与其靶序列互补的单菌株，而茎是由5至7bp的两个抗互补臂形成的双菌株以稳定环。一条臂的末端用荧光团标记，另一条臂的末端用淬灭基团连接。环与其靶序列的结合打开了茎并从荧光团中除去了淬灭基团，产生了荧光。MB生成信号仅在目标存在的情况下产生。为了克服检测时产生的误导，需要一种诊断布鲁氏菌感染的新方法。在本研究中，建立并评估了基于分子信标的实时定量PCR方法。通过与细菌培养和血清学试验比较来评估了其诊断价值。

发明内容

基于此，本发明提供一种基于分子信标的实时定量PCR检测布鲁氏菌感染的体系、试剂盒及检测方法，能够提高检测效率，并且特异性好、灵敏度高。

一种基于分子信标的实时定量PCR检测布鲁氏菌感染的体系，其特征在于，包括扩增引物系统和分子信标探针系统，其中，所述扩增引物系统包括序列如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示的引物对。

在一些实施例中，所述分子信标探针系统包括如SEQ ID NO.3所示的基因序列。

在一些实施例中，所述分子信标探针的两端标记有荧光团和淬灭基团。现在已知的任何荧光团-淬灭基团对可用于本发明的实践中。（参见例如 S.A.Marras,“Selectionof fluorophore and quencher pairs for fluorescent nucleic acid hybridizationprobes,”Methods Mol.Biol.2006；335:3-16.）。在一些实施方案中，荧光团的激发波长分别为495nm、538nm或646nm，发射波长分别为520nm、554nm或 669nm。在一些实施方案中，淬灭基团是吸收峰为430nm至672nm的染料。在一些实施方案中，所述荧光团选自荧光素亚酰胺（FAM）、6-羧基荧光素、六氯- 6-甲基荧光素、VIC荧光染料、四氯-6-羧基荧光素、羧基-X-罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、磺酰罗丹明、6-羧基-4’,5-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、花菁3、花菁5和花菁5.5中的一种；所述淬灭基团选自DDQ-I、DABCYL、Eclipse、Iowa Black FQ、BHQ-1、QSY-7、BHQ-2、DDQ-II、Iowa Black RQ、QSY-21和DHQ-3。在一些实施例中，荧光团选自荧光素亚酰胺（fluorescein amidite，FAM），淬灭基团选自DABCYL。通常而不总是，淬灭团通过醚键连接到寡核苷酸的3'羟基基团，而荧光团通过酯键连接到寡核苷酸的5'磷酸基团。

在一些实施例中，所述分子信标探针系统还包括用FAM（荧光团）和DABCYL（淬灭基团）分别标记SEQ ID NO.3所示的基因序列的5'和3'末端。

一种基于分子信标的实时定量PCR检测布鲁氏菌感染的试剂盒，包括上述任一实施例所述的体系。

在一些实施例中，所述基于分子信标的实时定量PCR检测布鲁氏菌感染的试剂盒还包括PCR常用试剂，例如DNA提取试剂、PCR反应缓冲液、Mg²⁺试剂、dNTPs以及DNA Taq聚合酶、尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)、无菌水(ddH₂O)中的至少一种。由于此类PCR常用试剂均可经市场途径单独购得或者自行配置，因此具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据客户实际需要配置，为方便起见，也可全部装配入试剂盒。

在一些实施例中，所述PCR常用试剂DNA提取试剂、PCR反应缓冲液、Mg²⁺试剂、dNTPs以及DNA Taq聚合酶、尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)、无菌水(ddH₂O)均为常见组分，其含量亦为常规。

在一些实施例中，所述引物对的使用浓度为10~100 pmol/L；优选50 pmol/L。

在一些实施例中，所述分子信标探针的使用浓度为20~100 pmol/L；优选50 pmol/L。

在一些实施例中，PCR反应缓冲液的成分包括KCl、Tris-HCl、1％TritonX-100，10×的PCR反应缓冲液的使用浓度为0.1~4.5 mmol/L；优选1.2 mmol/L。

在一些实施例中，Mg²⁺试剂如MgCl₂试剂等，Mg²⁺的使用浓度为0.2~5 mmol/L；优选2.0 mmol/L。

在一些实施例中，dNTPs中各dNTP的使用浓度为0.1~5 mmol/L；优选1.0 mmol/L。

在一些实施例中，DNA Taq聚合酶的使用浓度为0.5单位。

在一些实施例中，所述试剂盒中还可含有阳性对照。所述阳性对照为含有布鲁氏菌阳性对照质粒的溶液。可单独市购或根据现有技术自行构建。

在一些实施例中，所述试剂盒中还可含有阴性对照。阴性对照可为各种不含有布鲁氏菌的溶液，如PCR反应缓冲液、无菌水(ddH₂O)、生理盐水等；阴性对照亦可为含有非相关病原体对照质粒的溶液，例如大肠杆菌（ATCC25922）、肺炎克雷伯菌（ATCC700603）、铜绿假单胞菌（ATCC15442）、阴沟肠杆菌（ATCC13047）、产气肠杆菌（ATCC49701）、金黄色葡萄球菌（ATCC29213）、表皮葡萄球菌（ATCC12228）、屎肠球菌（ ATCC29212）等一种或多种的对照质粒溶液。

本发明的试剂盒采用分子信标实时定量PCR进行布鲁氏菌的检测，根据扩增及检测情况可分析判断布鲁氏菌感染情况。因此，引物及探针的设计是本发明试剂盒的关键。

一种基于分子信标的实时定量PCR检测布鲁氏菌感染的检测方法，包括如下步骤：

提取待测样本的DNA；

以提取的DNA作为模板，以所述扩增引物系统作为扩增引物，并加入分子信标探针系统进行实时荧光PCR扩增；

在实时荧光PCR扩增过程中检测荧光信号，得到检测结果。

在一些实施例中，所述检测方法中PCR扩增条件设置为：在95℃变性5分钟，在95℃条件下变性30秒，在55~65℃条件下退火30秒，在72℃下扩增30秒，PCR循环20~50次。

在一些实施例中，所述检测方法中检测荧光信号的温度在30~50℃，优选在45℃下检测荧光信号。

本发明还提供了上述检测体系、检测试剂盒和检测方法在制备布鲁氏菌检测产品中的用途。

在这项研究中，发明人成功开发了基于分子信标（MB-qPCR）的实时定量PCR检测布鲁氏菌感染的体系、试剂盒及检测方法，以检测编码5种流行布鲁氏菌中外膜蛋白OMP-2a的第一个58-aa基因的保守序列。与细菌培养相比，它具有较高的诊断灵敏度，与SAT和RBPT等血清学试验相比具有较高的特异性，为临床布鲁氏菌病的分子诊断提供了一种高效率的方法，具有很好的应用前景。

附图说明

图1是MB探针的示意图及其与靶序列的结合。 A. MB探针的构成和结构; B.编码外膜蛋白OMP-2a的第一个58-aa的寡核苷酸序列，其共有五种流行布鲁氏菌物种。正向引物（JPF）序列和反向引物（JPR）已表示出；与探针匹配的互补序列用下划线示出。

图2是PCR产物的凝胶电泳测定。泳道1-7，预期的PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶中约100bp；第8道，阴性对照；M，DNA标记。

图3是基于分子（MB-qPCR）的实时定量PCR测定。A，10倍连续稀释的pUC-OPM2a DNA的扩增曲线（108至102个拷贝）；B，10倍系列稀释系列质粒DNA的标准曲线绘制为Y轴上的阈值循环，相对于目标浓度（X轴）（y = -3.1372x + 38.201，R2 = 0.998）。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。并且：使用SPSS软件版本22，通过Pearson的卡方检验和Fisher精确检验分析数据。对于所有分析，p <0.05被认为是显著的。

实施例1 探针和引物的设计

布鲁氏菌、鲍氏梭菌、枯草芽孢杆菌、猪链球菌和犬埃里希氏体的外膜蛋白OMP-2基因的核苷酸序列来自于国家生物技术中心的GenBank数据库（No: CP007763.1）。使用Mfold（版本3.0）进行查找国家医学图书馆的信息并比对。使用Primer 5和Beacon 7软件设计最保守区域的引物和MB探针，并由GenScript BioTech Company（中国南京）合成。

我们已经发现了一个完全保守的基因序列，该基因编码外膜蛋白OMP-2a的第一个58-aa，设计一对引物（JPF和JPR，图1B）以从OMP-2a编码序列扩增104bp-DNA片段。

据报道，与线性寡核苷酸探针或双菌株核酸染料相比，茎环探针在基因检测中表现出更好的特异性，因此比TaqMan探针具有更高的灵敏度和信号背景比。还发现共有茎分子信标比TaqMan探针或SYBR Green I产生更好的性能。

为了特异性检测PCR扩增产物，还根据本研究中的设计指南设计了分子信标（MB）探针。该探针具有与靶DNA完全匹配的序列，并且侧翼具有5个寡核苷酸的自配对序列以形成茎。用FAM（荧光团）和DABCYL（淬灭基团）分别标记构成序列的5'和3'末端（图1A）。结合靶序列的MB探针的示意图显示在图1中。

正向引物（JPF）序列是5'-atcaagagccttctccttgg-3'（SEQ ID No.1），反向引物（JPR）序列是5'-gacatattcaacggcttcgg-3'(SEQ ID No.2)，MB探针序列是5'-FAM-cgcgtaagctgcaaccagagctacgcg-DABCYL-3'(SEQ ID No.3)。

实施例2 质粒的构建

编码外膜蛋白OMP-2a的前58个氨基酸残基的寡核苷酸由GenScript BioTech Company（中国南京）化学合成。使用Wizard DNA纯化试剂盒（Promega，Madison，USA）纯化DNA片段，然后使用TOPO TA克隆试剂盒（Invitrogen，USA）将其克隆到pUC57-简单载体中。在4℃温育过夜后，将连接混合物转化到感受态大肠杆菌（DH5α）中，并在含有氨苄青霉素和X-gal的琼脂平板上生长过夜。使用蓝白色筛选鉴定阳性克隆。挑取单菌落于5毫升LB液体培养基，在37℃、200rpm的条件下摇床培养过夜，随后使用QIA prep Spin Miniprep Kit（Qiagen，Dusseldorf，Germany）纯化。将质粒DNA溶解于50μL TE缓冲液中，用于在GenScriptBioTech Company（中国南京）中测序。阳性质粒命名为pUC-OMP2a。

为了获得标准DNA，通过EcoRV位点将编码OMP-2a蛋白的前58个氨基酸残基的化学合成的DNA片段克隆到pUC57-简单载体中。重组质粒的测序结果与预测的序列一致，表明成功构建了携带阳性DNA的质粒。

实施例3 PCR体系

在该研究中使用CCX96 TM实时系统（Bio-Rad，USA）。在95℃变性5分钟，然后在95℃条件下变性30秒，在55~65℃条件下退火30秒，在72℃下扩增30秒，开始PCR循环。在45℃下收集荧光信号。PCR体系为：0.5单位的DNA Taq聚合酶（Takara，Tokyo，Japan），每种引物1μL，1μL模板，2μL dNTP，2.5μL 10×PCR缓冲液，4μL MgCl₂，1μL MB探针和加入ddH₂O至总体积为25μL。通过1.5％琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物。通过测序验证序列。

如所预测的，引物JPF和JPR允许在pUC-OPM2a质粒的最佳退火温度（59℃）下扩增104-bp片段。通过1.5％琼脂糖电泳观察到约100bp的条带（图2），其与理论大小一致。从阴性对照中看不到条带。MB探针和Mg²⁺的最佳浓度分别为50 pmol/L和2 mmol/L。

实施例4 方法评估

1、灵敏度测定

来自不同稀释度的质粒DNA用作标准曲线的模板，使用该测定法估计灵敏度。为此，将pU57-OMP2a质粒DNA以10倍的稀释度的通过降序从108拷贝至102拷贝连续稀释。通过绝对定量绘制标准曲线。对每种已知DNA稀释液设置重复反应，同时不设置模板对照和阴性对照。

通过10倍的连续稀释法从108至102个拷贝稀释pUC-OPM2a来研究该检测的灵敏度。将释放的荧光团作为扩增循环数的函数作图。放大的曲线显示为典型的S型曲线（图3A）。绘制标准曲线，其中Y轴上的循环阈值（Ct）对X轴上的对数起始拷贝数（y = -3.1372x+ 38.201，R2 = 0.998）。发现标准曲线是线性的，范围从102到108个拷贝（图3B）。线性回归曲线的斜率（S）与根据下式的PCR反应的效率（E）相关：E = [10-1 /斜率-1]。基于-3.4的斜率值，该检测的PCR效率为98％。发现该方法可以检测低至50拷贝的布鲁氏菌DNA。

2、特异性测定

通过掺入临床分离的布鲁氏菌的DNA作为阳性标准来设计特异性测定。非相关病原体如大肠杆菌（ATCC25922），肺炎克雷伯菌（ATCC700603），铜绿假单胞菌（ATCC15442），阴沟肠杆菌（ATCC13047），产气肠杆菌（ATCC49701），金黄色葡萄球菌（ATCC29213），表皮葡萄球菌（ATCC12228），屎肠球菌（ ATCC29212）等用作阴性对照。抽取所有细菌的DNA并用作模板以评估特异性。

为了评估该方法的特异性，并观察与临床常见细菌的交叉反应，从革兰氏阴性菌如大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌和产气肠杆菌中提取的DNA，或革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、屎肠球菌用作PCR测定的模板，而布鲁氏菌DNA用作阳性对照。除布鲁氏菌DNA外未检测到扩增信号（图未显示）。这些证据表明基于MB的qPCR对布鲁氏菌具有特异性。

3、精度评估

测定内和测定间变异系数用于评估每个实验的精确度。在同一测定的所有运行中，从重复值确定测定内变异系数（CV）。根据在10天内的不同时间进行的重复测定的平均值计算测定间变异系数。

通常使用测定内和测定间变异系数（CV）来评估精确度。结果显示，Ct值具有低于1％的平均测定内CV和低于10％的平均测定间CV。计算的DNA拷贝数具有低于15％的平均测定内和测定间CV，揭示了该方法的良好再现性和稳定性。

实施例5 样品采集

2016年7月至2017年8月期间，在新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市传染病医院的门诊收集疑似布鲁氏菌病的患者（n = 312）的样本，患者也是新疆地区的居民。这些人包括具有布鲁氏菌病的临床症状的患者，例如发烧、出汗、关节痛、肌痛和虚弱，以及与感染布鲁氏菌病的人亲密接触或其家庭成员有感染布鲁氏菌病的人。此外，还将10份健康供体的血液样品作为阴性对照并入该研究中。血液样本由护士或实验室技术人员采集。分离血清并在两小时内测试。布鲁氏菌病根据中华人民共和国卫生部发布的标准（WS 269-2007）确诊。

实施例6 培养鉴定、与细菌学检测的比较

通过静脉穿刺取出至少8 mL血液（对于1-3 mL儿童）并注射到培养瓶中（Peds plus TM/ F用于儿童，Plus Aerobic / F用于成人，BD BACTECTM，BD公司，美国）。然后，将培养瓶装入BD BACTECTM / FX培养系统（BD公司，美国）并监测7天，然后根据临床和实验室标准研究所概述的程序除去具有阴性结果的小瓶。如果小瓶显示阳性结果，则将100-μL血液样品划线到绵羊血琼脂平板或布鲁氏菌培养基平板（Mast Diagnostics，UK）上。将板在有氧条件下和在5-10％的CO ₂存在下于37℃温育。每3天检查一次培养基。典型且分离良好的布鲁氏菌菌落小、透明、凸起，沿着条纹线具有整个边缘以及光滑明亮的表面，通过Gram染色肉眼观察。此外，还制备细菌悬浮液并用4.5％盐水调节至0.5麦克伯尼单位（约108 cfu/mL），用于VITEK 2革兰氏阴性识别卡（VITEK 2 GN测试试剂盒）。通过VITEK 2微生物鉴定系统进行鉴定（bioMerieux，Inc.，France）根据卡中的生化反应，结果由软件自动生产报告。

尽管细菌学分离和鉴定是一个耗时的过程，但是细菌学检测仍然被认为是布鲁氏菌病诊断的“黄金标准”方法。细菌的初始分离是诊断的一个难题。幸运的是，专业的血培养瓶和培养系统已普遍应用于临床实验室，血培养的阳性百分比在近几年显著增加。在这项研究中，312个样本中的108个样本进行了细菌学检测。将血培养的阳性样品接种到绵羊血琼脂和布鲁氏菌琼脂选择性培养基的平板上。接种3-4天后，具有针尖，闪亮，光滑和半透明外观的菌落进行革兰氏染色，并且仅将革兰氏阴性球菌进行进一步的确认试验。结果表明，血培养的总阳性率为42.6％（46/108），并且通过VITEK 2鉴定系统将从血液中分离的物质鉴定为布鲁氏菌（Brucella melitensis）生物型3。MB-qPCR在细菌培养的阳性样品中显示出97.8％的阳性率（45/46）。此外，在62个样品中的13个中检测到布鲁氏菌DNA，其中培养物为阴性（表1）。总阳性率为53.7％，高于细菌培养。诊断灵敏度和特异性分别为97.8％和79.0％。阳性预测值，阴性预测值和诊断效率分别为77.6％，98.0％和87.0％。

表1. MB-qPCR和血培养的测试结果（n = 108）

实施例7 与血清学试验的比较

使用DNeasy血液试剂盒（Qiagen，USA）从疑似患者和健康供体的血液样品中提取DNA，并进行MB-qPCR测定。进行标准凝集试验（SAT）和琥红平板试验（RBPT）以检测抗Brucella抗体。使用来自中国北京疾病预防控制中心（CDC）的传染病研究所的抗原进行RBPT。凝集作用显示为弱阳性，阳性，强阳性或非常强阳性。根据制造商的说明，所有样品同时进行SAT。使用凝集镜检测阳性反应，并且给出的滴度表示最高稀释度，其中在管中发生50％或更多的凝集。

为了进一步评估诊断价值，应将MB-qPCR与商业血清学试验如SAT和RBT进行比较，这些试验是间接诊断或筛查布鲁氏菌病的有用方法。使用MB-qPCR，RBPT和SAT分别平行测定所有312个样品。数据总结在表2和表3中。阳性百分比分别为47.4％（MB-qPCR），63.5％（SAT）和60.7％（RBPT）。三种方法的阳性率差异无统计学意义（P> 0.05）。SAT和RBPT阳性结果的符合率分别为91.9％和89.2％。然而，阴性结果的符合率分别为62.2％和59.1％。血清学测试可能反映出抗体谱没有特定的临床相关性，并且抗体滴度通常在长时间内保持较高水平。通常，针对布鲁氏菌的IgM早在感染后第一周就出现，然后在第二周进行IgG扩增。两类免疫球蛋白在第四周达到高峰并持续近一年。抗生素的应用伴随着抗体滴度的下降。因此，SAT或RBT的阳性结果并不意味着目前感染，并且假阳性/阴性结果明显存在。在具有SAT阳性结果的198个样品中的62个中，布鲁氏菌DNA是阴性的，并且具有RBPT阳性结果的199个样品中的67个通过MB-qPCR得到。在具有SAT阴性结果的114个样品中的12个中检测到布鲁氏菌DNA，并且在173个具有RBPT阴性结果的样品中检测到16个（表2和表3）。暗示着MB-qPCR比SAT或RBPT具有更高的特异性和更少的假阳性率。

表2. MB-qPCR和SAT的测试结果（n = 312）

表3. MB-qPCR和RBPT的测试结果（n = 312）

序列表

<110> 杭州洪晟生物技术股份有限公司

杭州洪桥中科基因技术有限公司

<120> 基于分子信标的实时定量PCR检测布鲁氏菌感染的体系

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atcaagagcc ttctccttgg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gacatattca acggcttcgg 20

Claims

1.一种基于分子信标的实时定量PCR检测布鲁氏菌感染的体系，其特征在于，包括扩增引物系统和分子信标探针系统，其中，所述扩增引物系统包括序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示的引物对。

2.如权利要求1所述的体系，其特征在于，所述分子信标探针系统包括如SEQ ID NO.3所示的基因序列。

3.如权利要求2所述的体系，其特征在于，所述分子信标探针系统还包括用荧光团和淬灭基团标记SEQ ID NO.3所示的基因序列的5'和3'末端；

优选的，所述荧光团选自荧光素亚酰胺（FAM）、6-羧基荧光素、六氯- 6-甲基荧光素、VIC荧光染料、四氯-6-羧基荧光素、羧基-X-罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、磺酰罗丹明、6-羧基-4’,5-二氯-2’,7’-二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、花菁3、花菁5和花菁5.5中的一种；

优选的，所述淬灭基团选自DDQ-I、DABCYL、Eclipse、Iowa Black FQ、BHQ-1、QSY-7、BHQ-2、DDQ-II、Iowa Black RQ、QSY-21和DHQ-3中的一种；

优选的，所述荧光团选自荧光素亚酰胺（FAM），所述淬灭基团选自DABCYL，分别标记SEQID NO.3所示的基因序列的5'和3'末端。

4.一种基于分子信标的实时定量PCR检测布鲁氏菌感染的试剂盒，包括上述任一权利要求所述的体系。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述基于分子信标的实时定量PCR检测布鲁氏菌感染的试剂盒还包括DNA提取试剂、PCR反应缓冲液、Mg²⁺试剂、dNTPs、DNA Taq聚合酶、尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)、无菌水(ddH₂O)中的至少一种。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述引物对的使用浓度为10~100 pmol/L；优选50 pmol/L；

所述分子信标探针的使用浓度为20~100 pmol/L；优选50 pmol/L；

所述PCR反应缓冲液的成分包括KCl、Tris-HCl、1％TritonX-100，10×的PCR反应缓冲液的使用浓度为0.1~4.5 mmol/L；优选1.2 mmol/L，所述Mg²⁺试剂如MgCl₂试剂等，Mg²⁺的使用浓度为0.2~5 mmol/L；优选2.0 mmol/L；所述dNTPs中各dNTP的使用浓度为0.1~5 mmol/L；优选1.0 mmol/L；所述DNA Taq聚合酶的使用浓度为0.5单位。

7.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还可含有阳性对照；优选，所述阳性对照为含有布鲁氏菌阳性对照质粒的溶液；

所述试剂盒中还可含有阴性对照；优选，阴性对照为各种不含有布鲁氏菌的溶液；再优选，阴性对照为PCR反应缓冲液、无菌水(ddH₂O)、生理盐水或含有非相关病原体对照质粒的溶液。

8.一种基于分子信标的实时定量PCR检测布鲁氏菌感染的检测方法，包括如下步骤：

提取待测样本的DNA；

在实时荧光PCR扩增过程中检测荧光信号，得到检测结果。

9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述PCR扩增条件设置为：在95℃变性5分钟，在95℃条件下变性30秒，在55~65℃条件下退火30秒，在72℃下扩增30秒，PCR循环20~50次；

所述检测荧光信号的温度在30~50℃，优选在45℃下检测荧光信号。

10.如权利要求1-3任一所述的体系、权利要求4-7任一所述的试剂盒和权利要求8-9任一所述的检测方法在制备布鲁氏菌检测产品中的用途。