JP2004154073A - ポルフィロモナス・ジンジバリスの分析方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】被検試料中に存在するポルフィロモナス・ジンジバリス菌を正確及び迅速に検出及び／又は同定することができる分析方法、並びにそれに用いることのできる新規プライマー及びプライマーセットを提供する。
【解決手段】前記分析方法は、被検試料と前記の新規プライマーセットとを用いてＤＮＡ断片を増幅する工程、及び前記ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物を分析する工程を含む。
【選択図】 なし
【解決手段】前記分析方法は、被検試料と前記の新規プライマーセットとを用いてＤＮＡ断片を増幅する工程、及び前記ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物を分析する工程を含む。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ；Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓと略称することがある）の分析方法に関する。より詳細には、本発明は、歯周病の起因菌を検出及び／又は同定するための診断用検査試薬として、ＰＣＲ法で合成した二重標識遺伝子増幅生成物に対するイムノクロマトグラフ用ストリップに結合した２種類の標識化合物に特異的なタンパク質又は抗体（モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体）を用いた免疫学的な遺伝子検出系に関する。更に詳細には、本検出系が、特定の遺伝子を２種類の標識プライマーを用いて増幅した二重標識ＤＮＡ生成物のみに反応し、その他の遺伝子と反応しない、診断に有用な免疫学的遺伝子検出系に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ポルフィロモナス・ジンジバリスは、ヒト歯周病疾患の原因となる感染因子の１つである。歯周病菌は、嫌気性菌のため、培養して歯周病菌を検体試料中から分離及び同定するには、約１週間かかる。歯周病起因菌としては、ポルフィロモナス・ジンジバリス以外に、アクチノバチルス・アクチノマイセテコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｃｏｍｉｔａｎｓ）、プレボテーラ・インテルメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、バクテロイデス・フォルシタス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｏｒｓｙｔｈｕｓ）、トレポネーマ・デンチコーラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、キャンピロバクター・レクタス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｒｅｃｔｕｓ）、又はフソバクテリウム・ヌクレータム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）などが関与している。歯周ポケット内の細菌の菌種及び菌数を調べる検査は重要である。なお、ポルフィロモナス・ジンジバリスは、へミン要求性培地で生育する黒色色素性のグラム陰性桿菌である。
【０００３】
歯周病は、嫌気性細菌が関与する歯の支持組織の炎症疾患であり、比較的軽症の歯周炎から、歯の支持組織の破壊に特徴がある劇症の歯周病までの広範囲に及ぶ。歯周炎の進行においては、活動期に歯肉縁下プラーク中の細菌が増加することが報告されている。この細菌の１つは、ポルフィロモナス・ジンジバリスであり、歯肉下プラークのポルフィロモナス・ジンジバリス菌の増加は、歯周炎の悪化に関係しており、５ｘ１０５個以上では歯周病の起因菌となることが報告されている〔「ペリオドントロジー２０００（Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌｏｇｙ ２０００）」，（デンマーク），ムンクスガード・インターナショナル出版社（Ｍｕｎｋｓｇａａｒｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ），１９９４年，第５巻，ｐ．７８−１１１（非特許文献１）］。しかし、これらの細菌は、健康な部位でもしばしば検出され、病的レベルよりも少ない細菌数に制御することが重要である。
【０００４】
歯周病の治療を行なう上で、細菌検査及び診断を行なうことが重要となってきており、例えば、歯周病菌の培養、血清検査（例えば、特異抗体によるＥＬＩＳＡ法や蛍光抗体法）、遺伝子検査（例えば、ＤＮＡプローブ法やＰＣＲ法）、又は酵素活性測定法などが行なわれている。歯周病菌のどの菌種に感染しているか、あるいは、その菌数が発症の閾値を越えるかどうかが必要となってきている。従って、歯周病菌の疑いのある患者を治療する場合、特定の歯周ポケットに存在する歯周病菌を除菌するため、起因菌の迅速な同定法の開発が望まれている。
【０００５】
最近、歯周病患者検体で歯周病菌の迅速性のある検査法として、患者検体から遺伝子を抽出し、歯周病菌に特異的な遺伝子の一部をＰＣＲ法で増幅し、その生成物を電気泳動した後、ＤＮＡのサイズを確認する方法や、標識ＤＮＡプローブとハイブリダイズすることにより歯周病菌の同定が行なわれている。この場合、結果が出るまでに５〜６時間かかる。
特定の部位に歯周病菌が存在しているかどうかを調べる目的で、歯周病菌の迅速診断法として遺伝子診断法が研究されているが、より簡便な診断法に対する関心は依然として高い。
【０００６】
【非特許文献１】
「ペリオドントロジー２０００（Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌｏｇｙ ２０００）」，（デンマーク），ムンクスガード・インターナショナル出版社（Ｍｕｎｋｓｇａａｒｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ），１９９４年，第５巻，ｐ．７８−１１１
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
歯周病菌感染の診断は、検体（歯周ポケット等の生検組織）から歯周病菌を検出することで確定する。しかし、歯周病菌は嫌気性菌であるため、嫌気性の培養が必要であり、また増殖に時間がかかり、菌種を同定するには１〜２週間の必要である。
本発明の課題は、被検試料（例えば、歯周ポケット内のプラーク、又は培養液）中に存在する歯周病菌の内、歯周病患者の歯周ポケットの歯肉縁下プラーク等に存在する歯周病菌であるポルフィロモナス・ジンジバリス菌を正確及び迅速に検出及び／又は同定することができる分析方法、並びにそれに用いることのできる新規プライマー及びプライマーセットを提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
前記課題は、本発明による、配列番号３又は４で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドにより解決することができる。
また、本発明は、配列番号３で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号４で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとからなる、プライマーセットに関する。
また、本発明は、配列番号５で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドに関する。
【０００９】
また、本発明は、（１）（ａ）ポルフィロモナス・ジンジバリスを含有する可能性のある被検試料と、（ｂ）配列番号３で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと、（ｃ）配列番号４で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーとを用いて、ＤＮＡ断片を増幅する工程；及び
（２）前記ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物を分析する工程
を含む、ポルフィロモナス・ジンジバリスの分析方法に関する。
また、本発明は、（１）（ａ）ポルフィロモナス・ジンジバリスを含有する可能性のある被検試料と、（ｂ）配列番号３で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドと、（ｃ）配列番号４で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドと同種又は異種の標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドとを用いて、ＤＮＡ断片を増幅する工程；及び
（２）前記ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物を、前記の各標識物質にそれぞれ特異的に結合可能なパートナーを用いて分析する工程
を含む、ポルフィロモナス・ジンジバリスの分析方法に関する。
また、本発明は、（１）配列番号３で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド；
（２）配列番号４で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドとは異なる標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド；及び
（３）前記標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能なパートナーが結合された着色粒子を保持し、しかも、もう一方の標識物質に特異的に結合可能なパートナーが固定化されているイムノクロマトグラフ用ストリップを含む、ポルフィロモナス・ジンジバリスの分析用キットに関する。
また、本発明は、（１）配列番号３で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド；
（２）配列番号４で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドとは異なる標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド；及び
（３）前記標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能なパートナーと、もう一方の標識物質に特異的に結合可能なパートナーとを担持したラテックス懸濁液
を含む、ポルフィロモナス・ジンジバリスの分析用キットに関する。
また、本発明は、（１）配列番号３で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド；
（２）配列番号４で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドと同種の標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド；及び
（３）前記標識物質に特異的に結合可能なパートナーを担持したラテックス懸濁液
を含む、ポルフィロモナス・ジンジバリスの分析用キットに関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
〔１〕本発明のオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド
本発明のオリゴヌクレオチドには、配列番号３で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び配列番号４で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが含まれ、配列番号３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが好ましい。
本発明のオリゴヌクレオチドである、配列番号３で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド）、及び配列番号４で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド）を、それぞれ、フォワードプライマー及びリバースプライマーとして用いてＰＣＲを実施することにより、ポルフィロモナス・ジンジバリスの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子断片（例えば、配列番号５で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド）を増幅することができる。配列番号５で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド（好ましくは、配列番号５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド）も、本発明の範囲に含まれる。なお、本明細書における用語「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方が含まれる。
【００１１】
ポルフィロモナス・ジンジバリス菌のゲノム遺伝子は、ポルフィロモナス・ジンジバリス・ゲノムプロジェクト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ．ｏｒｇ）で２．２×１０６ｂｐの塩基配列の解析が行なわれている。また、リボゾームＲＮＡは、ウイルスを除く全生物種に存在し、細菌の分類に約１，５００ｂｐの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列が用いられている。
なお、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域から全ての細菌に共通に使用できるユニバーサルプライマーを設計すれば、全ての細菌由来のＤＮＡを増幅することが可能となる。好気性菌については、既に、ユニバーサルプライマーを用いてＰＣＲ増幅した生成物を制限酵素で切断して同定する方法が報告されている（Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，３８，２０７６−２０８０，２０００）。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の約１，５００ｂｐの塩基配列の内、８００〜１，０００ｂｐの塩基配列を用いて細菌の系統分類ができることが報告されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８２，６９５５−６９５９，１９８５）。
ポルフィロモナス・ジンジバリス菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、又は１６ＳリボゾームＲＮＡをターゲットにした遺伝子に関して、ユニバーサルプライマーとして配列番号１で表される塩基配列からなるプライマー及び配列番号２で表される塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ法で増幅し、１，５００ｂｐの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子断片を取得することができる。
【００１２】
本発明のオリゴヌクレオチドである、配列番号３で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド及び配列番号４で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドにおける、配列番号３で表される塩基配列及び配列番号４で表される塩基配列は、歯周菌として関与している、アクチノバチルス・アクチノミセテコミタンス、プレボテラ・インテルメディア、バクテロイデス・フォルシタス、トレポネマ・デンチコラ、カンピロバクター・レクタス、及びフソバクテリウム・ヌクレアツムの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の各塩基配列と異なる、ポルフィロモナス・ジンジバリスに特異的な塩基配列である。これらの２種類のプライマーを用いたＰＣＲ法で増幅するＤＮＡは、ポルフィロモナス・ジンジバリス菌のみであり、その他の菌種は、増幅しない。
【００１３】
本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号３で表される塩基配列又は配列番号４で表される塩基配列（塩基数＝１８）を含み、ＰＣＲにおけるプライマーと使用した場合にポルフィロモナス・ジンジバリスを特異的に増幅可能である限り、その塩基数は特に限定されるものではないが、例えば、１８塩基〜４０塩基であることが好ましく、１８塩基〜２５塩基であることがより好ましい。
【００１４】
本発明のオリゴヌクレオチドは、その５’末端が標識物質で標識化されていることが好ましい。前記標識物質は、ＰＣＲに影響を与えることがなく、しかも、その標識物質に特異的に結合可能なパートナーが存在する限り、特に限定されるものではなく、例えば、プライマーの標識化に一般的に用いられる公知の標識物質を使用することができる。このような標識物質としては、例えば、蛍光物質〔例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ジゴキシゲニン、ビオチン等を挙げることができる。これらの標識物質に特異的に結合可能なパートナーとしては、標識物質に対する抗体（ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含む）又はその抗体フラグメント〔例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ等〕を挙げることができる。また、ビオチンに特異的に結合可能なパートナーとしては、抗ビオチン抗体又はそのフラグメント以外にも、例えば、アビジン又はストレプトアビジンを挙げることができる。
【００１５】
〔２〕本発明の分析方法及び分析用キット
本発明の分析方法は、
（１）（ａ）ポルフィロモナス・ジンジバリスを含有する可能性のある被検試料と、（ｂ）配列番号３で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、（ｃ）配列番号４で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとを用いて、ＤＮＡ断片を増幅する工程（ＤＮＡ増幅工程）；及び
（２）前記ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物を分析する工程（分析工程）
を含む。
【００１６】
本発明の分析方法で分析することのできる被検試料は、ポルフィロモナス・ジンジバリスを含有する可能性のある試料である限り、特に限定されるものではないが、例えば、歯周病ポケットのプラーク若しくは生検組織、それらの処理液、又は培養した菌体などを挙げることができる。
【００１７】
前記ＤＮＡ増幅工程は、プライマーセットとして、本発明のオリゴヌクレオチドである、配列番号３で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号４で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとの組み合わせを用いること以外は、例えば、通常のＰＣＲ法に従って実施することができる。
【００１８】
本発明の分析方法で用いる各プライマーは、その５’末端が同種又は異種の標識物質で標識化されたオリゴヌクレオチドであることもできるし、あるいは、標識化されていないオリゴヌクレオチドであることもできる。
各プライマーの５’末端が同種又は異種の標識物質で標識化されたオリゴヌクレオチドを用いると、分析工程において、前記標識物質に特異的に結合可能なパートナーを用いる分析方法（例えば、イムノクロマトグラフ法、ラテックス凝集法、又はサンドイッチ法など）を用いることができるため、好ましい。電気泳動法を用いることなく、簡易且つ迅速に検出・同定することができるからである。
【００１９】
なお、標識物質として同種又は異種の標識物質を用いるかは、後述の分析工程の説明の際に詳述するように、分析工程において利用する分析手法により、適宜決定することができる。
例えば、分析工程における分析手法として、ラテックス凝集法又はサンドイッチ法を利用する場合には、同種の標識物質を用いることもできるし、あるいは、異種の標識物質を用いることもできる。一方、分析工程における分析手法として、イムノクロマトグラフ法を利用する場合には、その実施形態により、利用可能な標識物質の種類が制限されることがあり、異種の標識物質を用いることが必要な場合がある。
【００２０】
前記分析工程では、前記ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物を分析する。反応生成物の分析方法としては、ＰＣＲ産物の分析に用いられる通常の分析方法を用いることができ、例えば、分子生物学的手法、あるいは、標識物質に特異的に結合可能なパートナーを用いる分析方法（例えば、イムノクロマトグラフ法、ラテックス凝集法、又はサンドイッチ法など）等を挙げることができる。なお、前記ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物は、そのまま直接、あるいは、適当な処理を行なった処理物（例えば、適当に希釈又は濃縮した希釈物又は濃縮物）として、分析工程にかけることができる。
【００２１】
分子生物学的手法を用いる場合には、例えば、ゲル（例えば、アガロースゲル）電気泳動を実施した後、そのゲルをそのまま、あるいは、メンブレンに転写し、予想されるＤＮＡサイズを有するバンドの有無により、あるいは、プローブとのハイブリダイズの有無により、ＤＮＡ増幅工程においてポルフィロモナス・ジンジバリスの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子断片が生成したか否かを決定することができ、更には、被検試料中にポルフィロモナス・ジンジバリスが存在することを決定することができる。
なお、分析工程において分子生物学的手法を用いる場合には、ＤＮＡ増幅工程で用いる各プライマーは、その５’末端が各々異なる標識物質で標識化されたオリゴヌクレオチドであることもできるし、あるいは、標識化されていないオリゴヌクレオチドであることもできる。
【００２２】
一方、分析工程において、標識物質に特異的に結合可能なパートナーを用いる分析方法を用いる場合には、ＤＮＡ増幅工程で用いる各プライマーとして、その５’末端が同種又は異種の標識物質で標識化されたオリゴヌクレオチドを用いる。以下、本発明の分析方法において、分析工程で、標識物質に特異的に結合可能なパートナーを用いる分析方法を用いる態様を、特に、本発明の結合パートナー型分析方法と称する。
本発明の結合パートナー型分析方法において、分析工程における分析手法として、イムノクロマトグラフ法、ラテックス凝集法、及びサンドイッチ法を利用する各態様について、以下、この順序に従って説明する。
【００２３】
本発明の結合パートナー型分析方法において、分析工程における分析手法として、イムノクロマトグラフ法を用いる場合には、例えば、イムノクロマトグラフ用ストリップとして、プライマーの標識化に用いた２種類の標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能なパートナーが結合された着色粒子（すなわち、着色粒子コンジュゲート）を、固相担体に保持し、しかも、もう一方の標識物質に特異的に結合可能なパートナーが、前記固相担体に固定化（すなわち、固相化）されているイムノクロマトグラフ用ストリップを使用することができる。
【００２４】
前記固相担体としては、例えば、ニトロセルロース、セルロースアセテート、又はガラス繊維フィルター等を用いることができる。
前記着色粒子としては、例えば、金属コロイド（例えば、金コロイド等）、非金属コロイド（例えば、ポリスチレンコロイド等）、又はリポゾーム等を用いることができる。
標識物質に特異的に結合可能なパートナーとしては、例えば、標識物質に対する抗体（ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含む）又はその抗体フラグメント〔例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ等〕を用いることができる。また、ビオチンに特異的に結合可能なパートナーとしては、抗ビオチン抗体又はそのフラグメント以外にも、例えば、アビジン又はストレプトアビジンを挙げることができる。以下、固相担体に固定化させる前記パートナーを「固定化用パートナー」と称し、着色粒子に結合させ、着色粒子コンジュゲートとして固相担体に保持させる前記パートナーを「保持用パートナー」と称する。
【００２５】
本発明の結合パートナー型分析方法で用いることのできる前記イムノクロマトグラフ用ストリップでは、被検試料の展開方向に関して、上流側に、着色粒子コンジュゲートの保持領域（例えば、塗布領域）を設け、下流側に、固定化用パートナーの固定領域を設ける。固定化用パートナー（例えば、抗体）の固相への結合は、例えば、約１μｇ／ｍＬの抗体溶液を固相担体に加え、室温放置することにより行なうことができる。タンパク質の非特異的吸着をブロックするために、例えば、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）でブロッキングすることが好ましい。
なお、陰性コントロールとして、例えば、マウスＩｇＧ又はウサギＩｇＧを固定する領域は、固定化用パートナーの固定領域の更に下流側に設けることもできるし、設けないでおくこともできるが、検査を正確にするためには設ける方が好ましい。
【００２６】
イムノクロマトグラフ法を用いる本発明の結合パートナー型分析方法では、固相担体に固定化された固定化用パートナーと、固相担体に保持された着色粒子コンジュゲートとを介して、ＤＮＡ増幅工程で増幅した二重標識ＤＮＡ生成物を検出する。担体の役割は、被検出物（二重標識ＤＮＡ生成物）と着色粒子コンジュゲートとを展開し、固定化された固定化用パートナーと反応させ、更に、未反応物を分離することにある。
【００２７】
より具体的には、クロマトグラフ用ストリップの着色粒子コンジュゲートを塗布した側の端に、ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物又はその処理物（例えば、希釈物又は濃縮物）が接触すると、この水溶液はクロマトグラフ用ストリップに吸収及び展開され、先端に向かって浸透する。前記接触方法としては、例えば、被検試料滴下部位に滴下する方法、あるいは、容器（例えば、ウェル）内の被検試料を吸着する方法などを挙げることができる。着色粒子コンジュゲートを塗布した領域に達すると、二重標識ＤＮＡ生成物は、保持用パートナーを介して着色粒子コンジュゲートと結合し、更にクロマトグラフ用ストリップ上を移動する。そして、この二重標識ＤＮＡ生成物と着色粒子コンジュゲートとの複合体が、固定化用パートナーを固定した領域に達すると、二重標識ＤＮＡ生成物は、この固定化用パートナーに結合し、トラップされる。その結果、二重標識ＤＮＡ生成物と着色粒子コンジュゲートとの複合体は、この領域で停止し、これ以上移動しない。イムノクロマトグラフ法を利用する本発明の結合パートナー型分析方法では、この着色粒子の担体上での集積を目視により観察することにより、ＤＮＡ増幅工程においてポルフィロモナス・ジンジバリスの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子断片が生成したか否かを決定することができ、更には、被検試料中にポルフィロモナス・ジンジバリスが存在すること（すなわち、被検試料の陽性又は陰性）を判定することができる。
【００２８】
本発明の結合パートナー型分析方法において、分析工程における分析手法として、ラテックス凝集法を用いる場合には、ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物と接触させるラテックス懸濁液として、プライマーを標識化するのに用いた標識物質に特異的に結合可能なパートナーを担持したラテックス懸濁液を用いること以外は、通常のラテックス凝集法をそのまま適用して実施することができる。
ラテックス凝集法を用いる場合には、２個１組のプライマーセットに対して用いる標識物質の種類は、同種（すなわち、１種類）であることもできるし、あるいは、異種（すなわち、２種類）であることもできる。同種であると、競合が生じて凝集度に影響を与える可能性があるため、異種の標識物質を用いることが好ましい。
【００２９】
２個１組のプライマーセットを標識化する標識物質として、異種の標識物質を用いる場合には、それらの２種類の標識物質に、それぞれ、特異的に結合可能な２種類のパートナー（すなわち、一方の標識物質に特異的に結合可能なパートナーと、もう一方の標識物質に特異的に結合可能なパートナー）を担持したラテックス懸濁液を使用する。一方、２個１組のプライマーセットを標識化する標識物質として、同種の標識物質を用いる場合には、その１種類の標識物質に特異的に結合可能なパートナーを担持したラテックス懸濁液を使用する。
【００３０】
ラテックスとしては、通常の免疫分析用試薬に使用可能なラテックスである限り、特に限定されるものではなく、例えば、ポリスチレン、又はスチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体などを挙げることができる。ラテックスの平均粒径は、測定対象物の検出濃度又は測定機器によって適宜選択することができ、例えば、０．０５〜０．５μｍであることができる。
２種類のパートナーを用いる場合には、それらをラテックス上に担持させる形態としては、例えば、２種類のパートナーを混合した状態で、同一のラテックス上に担持させることもできるし、あるいは、２種類のパートナーを、それぞれ、別々のラテックス上に担持させることもできる。
パートナーを担持するラテックス懸濁液は、公知方法、例えば、物理的又は化学的結合により感作させることにより、調製することができる。
【００３１】
ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物又はその処理物（例えば、希釈物又は濃縮物）と、前記ラテックス懸濁液とを接触させると、前記反応生成物中に二重標識ＤＮＡ生成物が存在する場合には、特異的結合反応（例えば、抗原抗体反応）により凝集が生じる。
例えば、抗原抗体反応の条件は、通常の免疫学的ラテックス比濁分析方法の実施条件と同様であることができ、例えば、反応のｐＨは、６〜８．５で実施することができる。反応温度は０〜５０℃であることが好ましく、２０〜４０℃がより好ましい。反応時間は、適宜決定することができ、例えば、汎用自動分析機では１０〜１５分間で測定を完了することができる。
【００３２】
特異的結合反応（例えば、抗原抗体反応）により生じた凝集の程度は、公知の分析方法、例えば、光学的分析方法により分析することができる。前記光学的分析方法としては、例えば、反応液に光を照射して散乱光又は透過光を分析する方法を挙げることができ、より具体的には、散乱光強度、吸光度、又は透過光強度を測定する光学機器を用いて分析を行なうことができる。好ましい測定波長は３００〜８００ｎｍである。前記光学機器を用いた分析では、公知の方法に従って、用いるラテックス粒子の大きさ及び／又は濃度の選択、並びに反応時間の設定により、散乱光強度、吸光度、又は透過光強度の増加又は減少を測定することにより実施することができる。また、これらの方法を併用することも可能である。ラテックス凝集法を利用する本発明の結合パートナー型分析方法では、ラテックスの凝集の程度を観察することにより、ＤＮＡ増幅工程においてポルフィロモナス・ジンジバリスの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子断片が生成したか否かを決定することができ、更には、被検試料中にポルフィロモナス・ジンジバリスが存在すること（すなわち、被検試料の陽性又は陰性）を判定することができる。
【００３３】
本発明の結合パートナー型分析方法において、分析工程における分析手法として、サンドイッチ法を用いる場合には、分析対象化合物に対する抗体の代わりに、プライマーを標識化するのに用いた標識物質に特異的に結合可能なパートナーを用いること以外は、通常のサンドイッチ法をそのまま適用して実施することができる。
２個１組のプライマーセットを標識化する標識物質として、異種の標識物質を用いる場合には、それらの２種類の標識物質に、それぞれ、特異的に結合可能な２種類のパートナーを使用する。一方、２個１組のプライマーセットを標識化する標識物質として、同種の標識物質を用いる場合には、その１種類の標識物質に特異的に結合可能なパートナーを使用する。
【００３４】
具体的には、例えば、プライマーの標識化に用いた２種類の標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能な第１のパートナーを、適当な不溶性担体に固定化する。次に、不溶性担体と体液試料との非特異的結合を避けるために、適当なブロッキング剤〔例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）やゼラチン等〕で不溶性担体の表面を被覆する。続いて、ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物又はその処理物（例えば、希釈物又は濃縮物）を加えて一定時間（例えば、５分〜３時間）及び一定温度（例えば、４℃〜４０℃、好ましくは室温付近）で接触させ、反応させる（１次反応）。続いて、プライマーの標識化に用いた２種類の標識物質の残る一方に特異的に結合可能な第２のパートナーに標識物質を付した標識化第２パートナーを加えて一定時間（例えば、５分〜３時間）及び一定温度（例えば、４℃〜４０℃、好ましくは室温付近）で接触させ、反応させる（２次反応）。これを適当な洗浄液（例えば、界面活性剤を含む生理食塩水）で洗浄してから、不溶性担体上に存在する標識化第２パートナーの量を定量する。その値から、ＤＮＡ増幅工程においてポルフィロモナス・ジンジバリスの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子断片が生成したか否かを決定することができ、更には、被検試料中にポルフィロモナス・ジンジバリスが存在すること（すなわち、被検試料の陽性又は陰性）を判定することができる。
２個１組のプライマーセットを標識化する標識物質として、同種の標識物質を用いる場合には、前記第１及び第２パートナーに代えて、その１種類の標識物質に特異的に結合可能なパートナーを用いること以外は、同様にして実施することができる。また、１次反応と２次反応とを同時に行なうことも可能である。
【００３５】
前記不溶性担体としては、例えば、高分子（例えば、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、又はポリサッカライド等）、ニトロセルロース、紙、若しくはアガロース、又はこれらの組み合わせ等を例示することができる。
第２パートナーに付す標識物質としては、例えば、酵素、蛍光物質、又は発光物質を挙げることができる。酵素としては、例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、又はβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ等、また、蛍光物質としては、例えば、フルオレセインイソチオシアネート等、また、発光物質としては、例えば、アクリジニウムエステル又はルシフェリン等を使用することができる。
【００３６】
本発明の分析用キットには、分析工程における分析手法としてイムノクロマトグラフ法を利用する本発明の結合パートナー型分析方法に用いることのできる分析用キット（以下、イムノクロマトグラフ型分析用キットと称する）と、分析工程における分析手法としてラテックス凝集法を利用する本発明の結合パートナー型分析方法に用いることのできる分析用キット（以下、ラテックス凝集型分析用キットと称する）とが含まれる。
【００３７】
本発明のイムノクロマトグラフ型分析用キットは、
（１）配列番号３で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号３で表される塩基配列からなり、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド）；
（２）配列番号４で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドとは異なる標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号４で表される塩基配列からなり、前記オリゴヌクレオチドとは異なる標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド）；及び
（３）前記標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能なパートナーが結合された着色粒子を保持し、しかも、もう一方の標識物質に特異的に結合可能なパートナーが固定化されているイムノクロマトグラフ用ストリップ
を含む。
【００３８】
本発明のラテックス凝集型分析用キットは、
（１）配列番号３で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号３で表される塩基配列からなり、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド）；
（２）配列番号４で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドとは異なる標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号４で表される塩基配列からなり、前記オリゴヌクレオチドとは異なる標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド）；及び
（３）前記標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能なパートナーと、もう一方の標識物質に特異的に結合可能なパートナーとを担持したラテックス懸濁液
を含む。
【００３９】
以下、本発明の具体的な実施手順の一例を示し、本発明をより具体的に説明する。
１）プローブの設計
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のクローニング用プライマーとして、配列表の配列番号１及び２で表される各塩基配列を設計する。その１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列をジデオキシ法で決定する。
標識化合物として５’−末端にＦＩＴＣ又はビオチンを付加する。具体的には、配列表の配列番号３及び４で表される各塩基配列を設計し、その遺伝子増幅生成物の塩基配列として配列表の配列番号５及び６で表される各塩基配列を決定する。
【００４０】
２）ＤＮＡの合成
３８１型ＤＮＡ自動合成装置（アプライドバイオシステムズ社）を用いて常法により、配列表に記載した配列で表されるオリゴＤＮＡを４種類合成する（以下、配列番号１〜４と称する）。ＤＮＡのプライマーとして、配列番号１〜４で表される塩基配列からなるＤＮＡは、ポルフィロモナス・ジンジバリス菌の１６Ｓ
ｒＲＮＡの鋳型特異的なプライマーである。
なお、配列番号３で表される塩基配列の５’末端にＦＩＴＣを含む塩基数１８個からなるオリゴＤＮＡ、及び配列番号４で表される塩基配列の５’末端にビオチンを含む塩基数１８個からなるオリゴＤＮＡを合成する。
【００４１】
３）ＰＣＲ法によるＤＮＡ生成物の確認
ポルフィロモナス・ジンジバリス菌から調製したＤＮＡを用いて、ＰＣＲ装置で９５℃で熱変性し、前記のプライマー（配列番号１及び２）を添加すると、１６Ｓ ＤＮＡに特異的に結合する。
次に、ＤＮＡポリメラーゼ、特には耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ：Ｒｏｃｈｅ社）を添加し、以下のＰＣＲ法による増幅サイクルを行なう。
１サイクルは、（ａ）ＤＮＡの変性工程〔９４℃で２分間〕、（ｂ）１本鎖ＤＮＡとプライマーとのアニーリング工程〔５０℃で３０秒間〕、及び（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成工程〔７２℃で１分３０秒間〕からなり、１サイクル毎にＤＮＡ量は２倍に増幅されるが、このサイクルを３０回繰り返す。
【００４２】
４）プラスミドの作製
市販のプラスミドベクターｐＺＥｒＯ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を制限酵素ＥｃｏＲＶ（３７℃，２時間）で消化して、増幅したＰＣＲ産物がベクターに挿入できるようにする。この制限酵素で切断したベクター２．８ｋｂｐとＰＣＲにより合成した約１，５００ｂｐのＤＮＡをライゲーション・キット（宝酒造）を用いて、１６℃で３０分間反応させる。
【００４３】
５）大腸菌の形質転換
組み換えプラスミドと、市販の大腸菌ＤＨ５α株（宝酒造）を５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＣａＣｌ２で処理して作成したコンピテント細胞とを氷中で３０分間インキュベートし、４２℃で３０秒間熱処理した後、３７℃でＳＯＣ培地にて１時間培養する。この大腸菌を、５０μｇ／ｍＬゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）及び１ｍｍｏｌ／Ｌイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を含むＹＴ寒天平板上にまき、３７℃で一夜培養を行なう。
生じたゼオシン耐性で透明なコロニーを、各々新たな５０μｇ／ｍＬゼオシンを含むＹＴブロスで３７℃一夜培養をし、アルカリ溶菌法にてプラスミドＤＮＡを単離する（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
【００４４】
６）ＰＣＲ法による二重標識ＤＮＡ生成物の作製
前記で調製したＤＮＡを、ＰＣＲ装置において９５℃で熱変性し、前記プライマー（配列番号３及び４）を添加すると、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に特異的に結合する。
次に、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ製）を添加し、以下のＰＣＲ法による増幅サイクルを行なう。
１サイクルは、（ａ）ＤＮＡの変性工程〔９４℃で２分間〕、（ｂ）１本鎖ＤＮＡとプライマーとのアニーリング工程〔５０℃で３０秒間〕、及び（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成工程〔７２℃で３０秒間〕からなり、１サイクル毎にＤＮＡ量は２倍に増幅されるが、このサイクルを３０回繰り返す。
【００４５】
７）イムノクロマトグラフ用ストリップの作製
薄片状のクロマトグラフ基材（ニトロセルロース膜）の片方に金コロイド標識したストレプトアビジンを塗布し、他方に第２の抗ＦＩＴＣモノクローナル抗体を固定する。
抗ＦＩＴＣ抗体の固相への結合は、例えば、約１μｇ／ｍＬの抗体溶液をニトロセルロースに加え、室温放置することにより行なうことができる。タンパク質の非特異的吸着をブロックするために、１％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキングすることができる。
【００４６】
イムノクロマトグラフ法では、クロマトグラフ用ストリップの金コロイド標識ストレプトアビジンを塗布した側の端に、被検試料中のＰＣＲ法によるＤＮＡ生成物、又は希釈液が接すると、この水溶液はクロマトグラフ用ストリップに吸収及び展開され、先端に向かって浸透する。金コロイド標識ストレプトアビジンを塗布した領域に達すると、ＤＮＡ生成物は金コロイド標識ストレプトアビジンと結合し、更にクロマトグラフ用ストリップ上を移動する。そして、このＰＣＲ生成物と金コロイド標識結合物が、抗ＦＩＴＣ抗体を固定した領域に達すると、ＤＮＡ生成物はこの抗ＦＩＴＣ抗体に結合し、トラップされる。その結果、金コロイド標識結合物は、この領域で停止し、これ以上移動しない。イムノクロマトグラフ法では、この着色粒子の担体上での集積を目視により観察して、検体の陽性／陰性を判定する。
【００４７】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
《ポルフィロモナス・ジンジバリス菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のクローニング》
本実施例では、市販のキット（Ｇｅｎとるくん；宝酒造製）を用いてポルフィロモナス・ジンジバリスの菌体からゲノムＤＮＡを単離した後、２種類のプライマーとして配列番号１及び配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡを用いてＰＣＲ法で１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅し、約１．５ｋｂｐのＤＮＡを得た。このＰＣＲ産物をプラスミドｐＺＥｒＯ−１のＥｃｏＲＶ サイトを利用して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合して組み換えプラスミドを作成した。各工程の手順は、以下に示す通りである。
【００４８】
（１）ポルフィロモナス・ジンジバリスの培養
ＧＡＭ寒天培地（日水製薬製）にビタミンＫ及びヘミンを添加し、嫌気バッグ（ダイアヤトロン社）を用いて、ポルフィロモナス・ジンジバリスＡＴＣＣ ３３２７７株の培養を４８時間行なった。
【００４９】
（２）合成ＤＮＡの作成
３８１型ＤＮＡ自動合成装置（アプライドバイオシステムズ社）を用いて常法により、４種類のプライマーＤＮＡ（配列番号１〜配列番号４）を合成した。配列番号３で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡの５’−末端は、ＦＩＴＣ標識ｄＡＴＰを用い、配列番号４で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡの５’−末端は、ビオチン標識ｄＧＴＰを用いて合成した。
ユニバーサルプライマー１（配列番号１）及びユニバーサルプライマー２（配列番号２）の各塩基配列は、ポルフィロモナス・ジンジバリス菌のゲノムＤＮＡの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅するものである。従って、プライマー１とプライマー２を用いてＰＣＲ法で増幅されるＤＮＡ生成物（Ｉ）は、１，５００塩基対である。
【００５０】
なお、前記ユニバーサルプライマー（配列番号１及び配列番号２）は、参考文献〔Ｌａｎｅ， Ｄ．Ｊ． （１９９１）． １６Ｓ／２３Ｓ ｒＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ． Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ． Ｅ． Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔ ａｎｄ Ｍ． Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ， ｅｄｓ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ： １１５−１７５〕のプライマー２７ｆ及びプライマー１４９２ｆを引用したものである。
また、ポルフィロモナス・ジンジバリス（ＡＴＣＣ ３３２７７）の１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋのＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｌ１６４９２（１４７４ｂｐ）から引用した。配列番号３で表される塩基配列は、その第８４１番〜第８５８番であり、配列番号４で表される塩基配列は、第１００２番〜第１０１９番である。また、配列番号１で表される塩基配列は、第８番〜第２７番であるが、配列番号２で表される塩基配列は、この中には含まれていない。
【００５１】
（３）遺伝子の増幅
実施例１（１）で培養したポルフィロモナス・ジンジバリス菌から調製したゲノムＤＮＡと、実施例１（２）で合成したプライマー１及びプライマー２とを用いてＰＣＲを行なった。
１サイクルは、（ａ）ＤＮＡの変性工程〔９５℃で２分間〕、（ｂ）１本鎖ＤＮＡとプライマー（配列番号１及び２）とのアニーリング工程〔５０℃で３０秒間〕、及び（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成工程〔７２℃で１分３０秒間〕からなり、このサイクルを３０回繰り返した。
【００５２】
（４）組み換えプラスミドの作製
クローニングベクターとして、ｐＺＥｒＯ−１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いた。実施例１（３）で得られたＤＮＡ生成物（Ｉ）とｐＺＥｒＯ−１ベクターのＥｃｏＲＶサイトを利用して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合して組み換えプラスミドを作成した。
具体的には、ＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲル電気泳動で分離し、約１，５００ｂｐのバンドを切り取り、市販のカラム（ＧｅｎＥｌｕｔｅ ＡＧＡＲＯＳＥ ＳＰＩＮ ＣＯＬＵＭＮ；ＳＩＧＭＡ社）で精製した。ＤＮＡライゲーション・キット（宝酒造）を用いて、ＤＮＡ（Ｉ）３μＬとｐＺＥｒＯ−１ベクター（制限酵素ＥｃｏＲＶで処理したもの）１μＬとを加え、更にライゲーション溶液Ｉ（酵素液）４μＬを加えて１６℃で３０分間反応させ、ライゲーションを行ない、プラスミドＤＮＡ（ＩＩ）を作製した。
【００５３】
（５）形質転換
実施例１（４）で得られた組み換えＤＮＡを用いて、常法により形質転換を行なった。すなわち、５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＣａＣｌ２処理して作製したコンピテントセル（大腸菌ＤＨ５α株）にプラスミドＤＮＡを導入した。
【００５４】
（６）形質転換体に含まれる１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の単離
実施例１（５）で得られた形質転換体であるコロニーを、５０μｇ／ｍＬゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＹＴ−ブロスに接種し、３７℃で一夜培養を行なった。この培養液１．５ｍＬをエッペンドルフチューブに入れ、遠心分離で菌体を集め、アルカリ溶菌法にてプラスミドＤＮＡを単離した。
【００５５】
（７）塩基配列の決定
実施例１（６）で得られたＤＮＡと市販のキット（ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ；アプライドバイオシステムズ社）を用いてＰＣＲ反応を行ない、この反応溶液をＤＮＡシークエンサー装置（３７３Ａ−１８ ＤＮＡシークエンサー装置；アプライドバイオシステムズ製）にアプライし、ジデオキシ法で塩基配列を決定した。
【００５６】
【実施例２】
《１７９ｂｐ ＤＮＡ遺伝子の増幅》
本実施例では、実施例１で作製したポルフィロモナス・ジンジバリスのｒＲＮＡ遺伝子（１．５ｋｂｐ）を含むクローンからＤＮＡを単離し、２種類のプライマーとして配列番号３及び配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡを用いてＰＣＲ法でＤＮＡ増幅を行ない、そのＰＣＲ生成物量及び塩基配列を確認した。
【００５７】
（１）遺伝子の増幅
実施例１で作製した１．５ｋｂｐのｒＲＮＡ遺伝子配列を含むプラスミドＤＮＡと、実施例１（２）で合成した２種類の標識プライマー、すなわち、プライマー３（配列番号３）及びプライマー４（配列番号４）を用いてＰＣＲを行なった。
１サイクルは、（ａ）ＤＮＡの変性工程〔９５℃で２分間〕、（ｂ）１本鎖ＤＮＡとプライマー（配列番号３及び４）とのアニーリング工程〔５０℃で３０秒間〕、及び（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成工程〔７２℃で３０秒間〕からなり、このサイクル数による二重標識ＰＣＲ生成物量を確認するため、１０回、１５回、２０回、及び３０回の反応を行なった。
【００５８】
結果を図１に示す。図１は、ＰＣＲ生成物の０．８％アガロースゲル電気泳動の結果を示す、図面に代わる写真である。各レーンは、下記のとおりである：
レーン１：ＤＮＡマーカー（１２３ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ；ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ製）；
レーン２：ＤＮＡマーカー（ＤＮＡ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｒｋｅｒ ＶＩＩＩ；ベーリンガー・マンハイム製）；
レーン３：ＰＣＲのサイクル数１０回の生成物；
レーン４：ＰＣＲのサイクル数１５回の生成物；
レーン５：ＰＣＲのサイクル数２０回の生成物；
レーン６：ＰＣＲのサイクル数３０回の生成物；
レーン７：ＰＣＲのサイクル数３０回の生成物を１０倍希釈し、その５μＬをアプライしたもの；
レーン８：ＰＣＲのサイクル数３０回の生成物を５０倍希釈し、その５μＬをアプライしたもの；
レーン９：ＰＣＲのサイクル数３０回の生成物を１００倍希釈し、その５μＬをアプライしたもの；
レーン１０：ＰＣＲのサイクル数３０回の生成物を２００倍希釈し、その５μＬをアプライしたもの；及び
レーン１１：ＰＣＲのサイクル数３０回の生成物を５００倍希釈し、その５μＬをアプライしたもの。
【００５９】
（２）１７９ｂｐＤＮＡの精製
実施例２（１）で得られたポルフィロモナス・ジンジバリスのＰＣＲ生成物を１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にアプライし、ＤＮＡマーカー（１２３ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ；ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ製）から判断し、１７９ｂｐバンドに相応するバンドを切り取り、市販のキット（ＤＮＡ Ｐｒｅｐ；ダイアヤトロン社）を用いてＤＮＡを精製した。
【００６０】
（３）塩基配列の決定
実施例２（２）で得られたポルフィロモナス・ジンジバリスのＤＮＡと市販のキット（ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ；アプライドバイオシステムズ社）を用いてＰＣＲ反応を行ない、この反応溶液をＤＮＡシークエンサー装置（３７３Ａ−１８ ＤＮＡシークエンサー装置；アプライドバイオシステムズ製）にアプライし、ジデオキシ法で塩基配列を決定した。
【００６１】
【実施例３】
《各種菌体から単離したゲノムを用いたＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅》
本実施例では、実施例１で作製したポルフィロモナス・ジンジバリスのｒＲＮＡ遺伝子（１．５ｋｂｐ）を含むクローン、及び各種菌体（ポルフィロモナス・ジンジバリス、アクチノバチルス・アクチノミセテコミタンス、プレボテラ・インテルメディア、及び大腸菌の培養菌株）からＤＮＡを単離し、２種類の標識プライマーとして配列番号３及び配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡを用いてＰＣＲ法でＤＮＡ増幅を行なった。
【００６２】
（１）ＤＮＡの分離
寒天平板上の各種培養菌株のコロニーから少量つま楊枝で採取し、市販のＤＮＡ調製キット（Ｇｅｎとるくん；宝酒造製）により調製した。
【００６３】
（２）遺伝子の増幅
実施例３（１）で得たＤＮＡと、実施例１（２）で合成した２種類の標識プライマー、すなわち、プライマー３（配列番号３）及びプライマー４（配列番号４）を用いてＰＣＲを行なった。
１サイクルは、（ａ）ＤＮＡの変性工程〔９５℃で２分間〕、（ｂ）１本鎖ＤＮＡとプライマー（配列番号３及び４）とのアニーリング工程〔５０℃で３０秒間〕、及び（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成工程〔７２℃で３０秒間〕からなり、このサイクルを３０回繰り返した。
【００６４】
（３）１７９ｂｐＤＮＡの確認
実施例３（２）で得られたＰＣＲ生成物を１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にアプライし、ＤＮＡマーカー（１２３ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ；ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ製）を指標として、１７９ｂｐバンドの有無を確認した。
【００６５】
【実施例４】
《イムノクロマトグラフ用ストリップの作製》
本実施例では、ＰＣＲ生成物捕捉用抗体としてモノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体（ＺＹＭＥＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）又はポリクローナル抗ＦＩＴＣ抗体（ＺＹＭＥＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を、金コロイド標識物としてストレプトアビジン（ＴＲＩＮＡ Ｂｉｏｒｅａｃｔｉｖｅｓ製）を用いて、ＰＣＲ生成物測定用イムノクロマトグラフ用ストリップを作製した。
【００６６】
（１）イムノクロマトグラフ用メンブレンの作製
ポリアミド（ナイロン６６）製メンブレン（Ｉｍｍｕｎｏｄｙｎｅ ＡＢＣ，孔径＝３．０μｍ；Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を５ｍｍ×２０ｍｍのサイズに裁断した。
メンブレンの上流側の一端から８ｍｍの位置に、ＰＣＲ生成物の検出ゾーンとして、モノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体溶液又はポリクローナル抗ＦＩＴＣ抗体溶液〔各々濃度０．５ｍｇ／ｍＬ；５ｍｍｏｌ／Ｌホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）で希釈〕を幅１ｍｍの線状に塗布した。
また、メンブレンの上流側の一端から１３ｍｍの位置に、陰性コントロールゾーンとして、マウスＩｇＧ溶液〔濃度０．５ｍｇ／ｍＬ；５ｍｍｏｌ／Ｌホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）で希釈〕を、幅１ｍｍの線状に塗布した。
室温下で１時間、３７℃下で３０分間静置し、各々の抗体を固相化した。メンブレンを０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に浸し、室温及び相対湿度２０％以下の条件下で３０分間緩やかに振とうし、ブロッキングした。メンブレンの過剰のブロッキング液を除き、室温下で一夜静置し、乾燥させ、二重標識ＰＣＲ生成物のイムノクロマトグラフ法用抗体固相化メンブレンとした。
【００６７】
（２）金コロイド標識ストレプトアビジン懸濁液の作製
ストレプトアビジン（濃度１ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬを２ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｎａ２Ｂ４Ｏ７緩衝液（ｐＨ６．５）（以下、Ｂｏｒａｘ緩衝液と称する）３，０００ｍＬ中で４℃下で一夜透析した。ストレプトアビジン溶液は、４℃下、１００，０００×ｇで１時間遠心分離した後、その上清を、１００，０００×ｇで１時間遠心分離したＢｏｒａｘ緩衝液で１００μｇ／ｍＬとなるように希釈した。金コロイド液（ＧＯＬＤ ＣＯＬＬＯＩＤ ２０ｎｍ；Ｂｒｉｔｉｓｈ ＢｉｏＣｅｌｌＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ製）１００ｍＬを、０．２ｍｏｌ／Ｌ−Ｋ２ＣＯ３溶液及び０．２ｍｏｌ／Ｌ−Ｈ３ＰＯ４溶液でｐＨ６．５に調整した。金コロイド液２０ｍＬを撹拌しながら、希釈したストレプトアビジン溶液２ｍＬを徐々に滴下し、室温下で３０分間撹拌した。更に、撹拌しながら１０％ＢＳＡ溶液（ｐＨ９．０；４℃下、１００，０００×ｇで１時間遠心分離した上清）２．５ｍＬを滴下した後、室温下で３０分間撹拌した。１０℃下にて１６，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を除去した。沈殿した金コロイド標識ストレプトアビジンを、０．５％ショ糖を含むホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）（０．４５μｍフィルター濾過）２０ｍＬに再懸濁させ、１０℃下にて１６，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を除去した。更に、沈殿した金コロイド標識ストレプトアビジンを、０．５％ショ糖を含むホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）（０．４５μｍフィルター濾過）２０ｍＬに再懸濁させ、１０℃下にて１６，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を除去した。最後に、沈殿した金コロイド標識ストレプトアビジンを、０．５％ショ糖を含むホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８，０）（０．４５μｍフィルター濾過）に再懸濁させた後、波長５２０ｎｍにおける吸光度が約１０になるように濃度調整し、表面をシリコン処理したガラス試験管に移し、密栓し、４℃下に保存し、ＰＣＲ生成物のイムノクロマトグラフ法用金コロイド標識ストレプトアビジン懸濁液とした。
【００６８】
金コロイド標識ストレプトアビジン懸濁液は、波長５２０ｎｍにおける吸光度が３．０になるように、５．０％ショ糖を含む２ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．３）で希釈した後、その７μＬを、吸収パッドアキュウィックＡＷ１４−２０Ｔ４（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を５ｍｍ×５ｍｍのサイズに裁断したものに塗布し、シリカゲルデシケーター内で室温下、一夜減圧（≦５０ｍｍＨｇ）乾燥したものを、ＰＣＲ生成物のイムノクロマトグラフ法用金コロイド標識ストレプトアビジンパッドとした。
【００６９】
（３）イムノクロマトグラフ法用吸収パッドの作製
グラスファイバーパッド（タイプＡ／Ｂ；Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を５ｍｍ×１８ｍｍのサイズに裁断したものを、ＰＣＲ生成物のイムノクロマトグラフ法用試料添加パッドとした。グラスファイバーパッド（タイプＡ／Ｅ；Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を５ｍｍ×２５ｍｍのサイズに裁断したものを、ＰＣＲ生成物のイムノクロマトグラフ法用吸収パッドとした。
【００７０】
（４）イムノクロマトグラフ用ストリップ
５ｍｍ×６０ｍｍのサイズに裁断したプラスティック粘着シート（ＢｉｏＤｏｔ製）に、上流側より、試料添加パッド、金コロイド標識ストレプトアビジンパッド、抗体固相化メンブレン、及び吸収パッドの順に、各々その両端を隣接する部材と１ｍｍ重ね合わせて貼付し、ＰＣＲ生成物測定用イムノクロマトグラフ用ストリップとした。
【００７１】
【実施例５】
《イムノクロマトグラフ法によるＰＣＲ生成物の測定》
本実施例では、実施例４で作製したイムノクロマトグラフ用ストリップを用いて、ＰＣＲ生成物のイムノクロマトグラフ法を実施した。
【００７２】
（１）ＰＣＲ法のサイクル回数別によるＰＣＲ生成物の検出
実施例２（１）で使用した２種類の標識プライマーを用い、ＰＣＲ法のサイクル回数として、１０回、１５回、２０回、及び３０回の反応をそれぞれ行なった。これらのＰＣＲ反応液１０μＬと２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液９０μＬとを混合した溶液、及び２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ブランク試験）１００μＬを、水平に静置したイムノクロマトグラフ用ストリップの試料添加パッドに滴下し、室温下で１０分間展開した。
【００７３】
メンブレンのモノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体を固相化した部分、及び陰性コントロール抗体を固相化した部分の金コロイドの捕捉に基づく赤紫〜紫色の着色の有無を目視観察し、ＰＣＲ生成物の有無を判定した。モノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体固相化イムノクロマトグラフ用ストリップでのＰＣＲ生成物の測定結果を表１に示す。表１において、「−」は陰性、「＋」は弱陽性、「＋＋」は中陽性、「＋＋＋」は強陽性であることを示す。
今回行なったＰＣＲ法では、ＰＣＲのサイクル回数１０回では二重標識ＰＣＲ生成物が、まだ、あまり産生されておらず、イムノクロマトグラフ用ストリップで測定することができなかった。ＰＣＲのサイクル回数が１５回、２０回、及び３０回では、二重標識ＰＣＲ生成物をイムノクロマトグラフ用ストリップを用いて測定することができた。
【００７４】
【００７５】
（２）ＰＣＲ生成物の希釈溶液の測定
実施例５（１）においてＰＣＲ法のサイクル回数として３０回を行なった反応液を、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）で、１０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、及び１０００倍にそれぞれ希釈した溶液、並びに２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ブランク試験）の各１００μＬを水平に静置したイムノクロマトグラフ用ストリップの試料添加パッドに滴下し、室温下で１０分間展開した。
【００７６】
メンブレンのモノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体又はポリクローナル抗ＦＩＴＣ抗体を固相化した部分、及び陰性コントロール抗体を固相化した部分の金コロイドの捕捉に基づく赤紫〜紫色の着色の有無を目視観察し、ＰＣＲ生成物の有無を判定した。
図２に、モノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体を固相化したメンブレンを組み込んだＰＣＲ生成物測定用イムノクロマトグラフ用ストリップでの結果を示す。
また、表２に、モノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体を固相化したメンブレンを組み込んだＰＣＲ生成物測定用イムノクロマトグラフ用ストリップでの測定結果を示す。また、表３に、ポリクローナル抗ＦＩＴＣ抗体を固相化したメンブレンを組み込んだＰＣＲ生成物測定用イムノクロマトグラフ用ストリップでの測定結果を示す。表２及び表３において、「−」は陰性、「±」は擬陽性、「＋」は弱陽性、「＋＋」は中陽性、「＋＋＋」は強陽性であることを示す。
【００７７】
図２において、レーン１は、５０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１００μＬをアプライした結果であり、レーン２は、ビオチン結合抗ＩｇＧ抗体溶液１００μＬをアプライした結果であり、レーン３〜レーン８は、ＰＣＲ生成物を１０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、及び１０００倍にそれぞれ希釈した溶液１００μＬをアプライした結果であり、レーン９は、希釈用緩衝液（すなわち、リン酸塩緩衝液）１００μＬをアプライした結果である。図２において、展開方向は、下から上へ向かう方向（すなわち、下方が試料添加パッド側であり、上方が吸収パッド側である）である。また、レーン１及び２に共通して観察される上方のバンドは、陰性コントロールとしてのマウスＩｇＧを塗布したゾーンであり、レーン２のバンドはマウスＩｇＧの検出ゾーンであり、レーン１のバンドは非特異反応で生じたものである。
【００７８】
モノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体を固相化抗体に用いたＰＣＲ生成物測定用イムノクロマトグラフ用ストリップでは、元の被検液を５００倍希釈したものまで検出可能であり、ポリクローナル抗ＦＩＴＣ抗体を固相化したＰＣＲ生成物測定用イムノクロマトグラフ用ストリップでは、元の被検液を１，０００倍希釈したものまで検出可能であった。
【００７９】
【００８０】
【００８１】
（３）培養菌株を用いたＰＣＲ生成物の測定
実施例２（１）で使用した２種類の標識プライマー〔プライマー３（配列番号３）及びプライマー４（配列番号４）〕を用いて、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、アクチノバチルス・アクチノマイセテコミタンス（Ａ．ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｃｏｍｉｔａｎｓ）、プレボテーラ・インテルメディア（Ｐ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の培養菌株を用いて、同一のＰＣＲ反応を行なった。
これらのＰＣＲ反応液１０μＬと２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液９０μＬとを混合した溶液、及び２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ブランク試験）１００μＬを、水平に静置したイムノクロマトグラフ用ストリップの試料添加パッドに滴下し、同様に室温で１０分間展開した。
【００８２】
モノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体固相化イムノクロマトグラフ用ストリップでのＰＣＲ生成物の測定結果を表４に示す。表４において、「−」は陰性、「＋＋」は中陽性であることを示す。このイムノクロマトグラフ用ストリップでポルフィロモナス・ジンジバリスのみに特異的に反応する結果が得られた。
【００８３】
【００８４】
（４）患者試料から得られたＰＣＲ生成物の測定
歯周病患者試料を用いて、実施例２（１）で使用した２種類の標識プライマー〔プライマー３（配列番号３）及びプライマー４（配列番号４）〕を用いて、ＰＣＲ反応を行なった。
これらのＰＣＲ反応液１０μＬと２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液９０μＬとを混合した溶液、及び２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ブランク試験）１００μＬを、水平に静置したイムノクロマトグラフ用ストリップの試料添加パッドに滴下し、同様に室温で１０分間展開した。
【００８５】
モノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体固相化イムノクロマトグラフ用ストリップでの患者検体を用いたＰＣＲ生成物の測定結果を表５に示す。表５において、「−」は陰性、「±」は擬陽性、「＋」は弱陽性、「＋＋」は中陽性であることを示す。
【００８６】
【００８７】
【発明の効果】
現在、国内で歯周病菌の迅速検査法として、患者検体から遺伝子を抽出し、歯周病菌に特異的な遺伝子をＰＣＲ法で増幅し、その生成物を電気泳動した後、ＤＮＡのサイズを確認する方法や標識ＤＮＡプローブとハイブリダイズすることにより歯周病菌の同定する研究が行われている。また、歯周病菌が産生するプロテアーゼ活性を測定する酵素法で、歯周病菌の感染の有無を調べる検査が行なわれている。しかし、歯周病菌の菌種や定量ができない欠点がある。従って、歯周病菌の同定を行なうには、更に歯周病菌を培養して菌体を増やした後、生化学性状試験により、１〜２週間かけて菌種の同定が行なわれている。
【００８８】
本発明のオリゴヌクレオチド及び本発明の分析方法によれば、被検試料中に存在する歯周病菌の１つ、ポルフィロモナス・ジンジバリス菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子断片を、２種類の標識プライマーを用いてＰＣＲ法で増幅した後、その二重標識ＤＮＡ生成物を、例えば、分子生物学的手法又は免疫学的手法（特には、イムノクロマトグラフィー法）を用いて分析することにより、ポルフィロモナス・ジンジバリス菌を特異的に検出することができる。また、前記二重標識ＤＮＡ生成物を免疫学的手法（特には、イムノクロマトグラフィー法）を用いて分析することにより、電気泳動法を用いることなく、簡易且つ迅速に検出・同定することができる。また、常在菌として口腔内に存在する菌数と歯周病に進展する菌数を半定量的に測定することができる。
【００８９】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＰＣＲ生成物の電気泳動の結果を示す、図面に代わる写真である。
【図２】ＰＣＲ生成物のイムノクロマト法の結果を示す、図面に代わる写真である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ；Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓと略称することがある）の分析方法に関する。より詳細には、本発明は、歯周病の起因菌を検出及び／又は同定するための診断用検査試薬として、ＰＣＲ法で合成した二重標識遺伝子増幅生成物に対するイムノクロマトグラフ用ストリップに結合した２種類の標識化合物に特異的なタンパク質又は抗体（モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体）を用いた免疫学的な遺伝子検出系に関する。更に詳細には、本検出系が、特定の遺伝子を２種類の標識プライマーを用いて増幅した二重標識ＤＮＡ生成物のみに反応し、その他の遺伝子と反応しない、診断に有用な免疫学的遺伝子検出系に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ポルフィロモナス・ジンジバリスは、ヒト歯周病疾患の原因となる感染因子の１つである。歯周病菌は、嫌気性菌のため、培養して歯周病菌を検体試料中から分離及び同定するには、約１週間かかる。歯周病起因菌としては、ポルフィロモナス・ジンジバリス以外に、アクチノバチルス・アクチノマイセテコミタンス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｃｏｍｉｔａｎｓ）、プレボテーラ・インテルメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、バクテロイデス・フォルシタス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｏｒｓｙｔｈｕｓ）、トレポネーマ・デンチコーラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、キャンピロバクター・レクタス（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｒｅｃｔｕｓ）、又はフソバクテリウム・ヌクレータム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）などが関与している。歯周ポケット内の細菌の菌種及び菌数を調べる検査は重要である。なお、ポルフィロモナス・ジンジバリスは、へミン要求性培地で生育する黒色色素性のグラム陰性桿菌である。
【０００３】
歯周病は、嫌気性細菌が関与する歯の支持組織の炎症疾患であり、比較的軽症の歯周炎から、歯の支持組織の破壊に特徴がある劇症の歯周病までの広範囲に及ぶ。歯周炎の進行においては、活動期に歯肉縁下プラーク中の細菌が増加することが報告されている。この細菌の１つは、ポルフィロモナス・ジンジバリスであり、歯肉下プラークのポルフィロモナス・ジンジバリス菌の増加は、歯周炎の悪化に関係しており、５ｘ１０５個以上では歯周病の起因菌となることが報告されている〔「ペリオドントロジー２０００（Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌｏｇｙ ２０００）」，（デンマーク），ムンクスガード・インターナショナル出版社（Ｍｕｎｋｓｇａａｒｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ），１９９４年，第５巻，ｐ．７８−１１１（非特許文献１）］。しかし、これらの細菌は、健康な部位でもしばしば検出され、病的レベルよりも少ない細菌数に制御することが重要である。
【０００４】
歯周病の治療を行なう上で、細菌検査及び診断を行なうことが重要となってきており、例えば、歯周病菌の培養、血清検査（例えば、特異抗体によるＥＬＩＳＡ法や蛍光抗体法）、遺伝子検査（例えば、ＤＮＡプローブ法やＰＣＲ法）、又は酵素活性測定法などが行なわれている。歯周病菌のどの菌種に感染しているか、あるいは、その菌数が発症の閾値を越えるかどうかが必要となってきている。従って、歯周病菌の疑いのある患者を治療する場合、特定の歯周ポケットに存在する歯周病菌を除菌するため、起因菌の迅速な同定法の開発が望まれている。
【０００５】
最近、歯周病患者検体で歯周病菌の迅速性のある検査法として、患者検体から遺伝子を抽出し、歯周病菌に特異的な遺伝子の一部をＰＣＲ法で増幅し、その生成物を電気泳動した後、ＤＮＡのサイズを確認する方法や、標識ＤＮＡプローブとハイブリダイズすることにより歯周病菌の同定が行なわれている。この場合、結果が出るまでに５〜６時間かかる。
特定の部位に歯周病菌が存在しているかどうかを調べる目的で、歯周病菌の迅速診断法として遺伝子診断法が研究されているが、より簡便な診断法に対する関心は依然として高い。
【０００６】
【非特許文献１】
「ペリオドントロジー２０００（Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌｏｇｙ ２０００）」，（デンマーク），ムンクスガード・インターナショナル出版社（Ｍｕｎｋｓｇａａｒｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ），１９９４年，第５巻，ｐ．７８−１１１
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
歯周病菌感染の診断は、検体（歯周ポケット等の生検組織）から歯周病菌を検出することで確定する。しかし、歯周病菌は嫌気性菌であるため、嫌気性の培養が必要であり、また増殖に時間がかかり、菌種を同定するには１〜２週間の必要である。
本発明の課題は、被検試料（例えば、歯周ポケット内のプラーク、又は培養液）中に存在する歯周病菌の内、歯周病患者の歯周ポケットの歯肉縁下プラーク等に存在する歯周病菌であるポルフィロモナス・ジンジバリス菌を正確及び迅速に検出及び／又は同定することができる分析方法、並びにそれに用いることのできる新規プライマー及びプライマーセットを提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
前記課題は、本発明による、配列番号３又は４で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドにより解決することができる。
また、本発明は、配列番号３で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号４で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとからなる、プライマーセットに関する。
また、本発明は、配列番号５で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドに関する。
【０００９】
また、本発明は、（１）（ａ）ポルフィロモナス・ジンジバリスを含有する可能性のある被検試料と、（ｂ）配列番号３で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと、（ｃ）配列番号４で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーとを用いて、ＤＮＡ断片を増幅する工程；及び
（２）前記ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物を分析する工程
を含む、ポルフィロモナス・ジンジバリスの分析方法に関する。
また、本発明は、（１）（ａ）ポルフィロモナス・ジンジバリスを含有する可能性のある被検試料と、（ｂ）配列番号３で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドと、（ｃ）配列番号４で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドと同種又は異種の標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドとを用いて、ＤＮＡ断片を増幅する工程；及び
（２）前記ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物を、前記の各標識物質にそれぞれ特異的に結合可能なパートナーを用いて分析する工程
を含む、ポルフィロモナス・ジンジバリスの分析方法に関する。
また、本発明は、（１）配列番号３で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド；
（２）配列番号４で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドとは異なる標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド；及び
（３）前記標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能なパートナーが結合された着色粒子を保持し、しかも、もう一方の標識物質に特異的に結合可能なパートナーが固定化されているイムノクロマトグラフ用ストリップを含む、ポルフィロモナス・ジンジバリスの分析用キットに関する。
また、本発明は、（１）配列番号３で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド；
（２）配列番号４で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドとは異なる標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド；及び
（３）前記標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能なパートナーと、もう一方の標識物質に特異的に結合可能なパートナーとを担持したラテックス懸濁液
を含む、ポルフィロモナス・ジンジバリスの分析用キットに関する。
また、本発明は、（１）配列番号３で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド；
（２）配列番号４で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドと同種の標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド；及び
（３）前記標識物質に特異的に結合可能なパートナーを担持したラテックス懸濁液
を含む、ポルフィロモナス・ジンジバリスの分析用キットに関する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
〔１〕本発明のオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド
本発明のオリゴヌクレオチドには、配列番号３で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び配列番号４で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドが含まれ、配列番号３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又は配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが好ましい。
本発明のオリゴヌクレオチドである、配列番号３で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド）、及び配列番号４で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド）を、それぞれ、フォワードプライマー及びリバースプライマーとして用いてＰＣＲを実施することにより、ポルフィロモナス・ジンジバリスの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子断片（例えば、配列番号５で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド）を増幅することができる。配列番号５で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド（好ましくは、配列番号５で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド）も、本発明の範囲に含まれる。なお、本明細書における用語「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方が含まれる。
【００１１】
ポルフィロモナス・ジンジバリス菌のゲノム遺伝子は、ポルフィロモナス・ジンジバリス・ゲノムプロジェクト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ．ｏｒｇ）で２．２×１０６ｂｐの塩基配列の解析が行なわれている。また、リボゾームＲＮＡは、ウイルスを除く全生物種に存在し、細菌の分類に約１，５００ｂｐの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列が用いられている。
なお、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域から全ての細菌に共通に使用できるユニバーサルプライマーを設計すれば、全ての細菌由来のＤＮＡを増幅することが可能となる。好気性菌については、既に、ユニバーサルプライマーを用いてＰＣＲ増幅した生成物を制限酵素で切断して同定する方法が報告されている（Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，３８，２０７６−２０８０，２０００）。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の約１，５００ｂｐの塩基配列の内、８００〜１，０００ｂｐの塩基配列を用いて細菌の系統分類ができることが報告されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８２，６９５５−６９５９，１９８５）。
ポルフィロモナス・ジンジバリス菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、又は１６ＳリボゾームＲＮＡをターゲットにした遺伝子に関して、ユニバーサルプライマーとして配列番号１で表される塩基配列からなるプライマー及び配列番号２で表される塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ法で増幅し、１，５００ｂｐの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子断片を取得することができる。
【００１２】
本発明のオリゴヌクレオチドである、配列番号３で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド及び配列番号４で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドにおける、配列番号３で表される塩基配列及び配列番号４で表される塩基配列は、歯周菌として関与している、アクチノバチルス・アクチノミセテコミタンス、プレボテラ・インテルメディア、バクテロイデス・フォルシタス、トレポネマ・デンチコラ、カンピロバクター・レクタス、及びフソバクテリウム・ヌクレアツムの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の各塩基配列と異なる、ポルフィロモナス・ジンジバリスに特異的な塩基配列である。これらの２種類のプライマーを用いたＰＣＲ法で増幅するＤＮＡは、ポルフィロモナス・ジンジバリス菌のみであり、その他の菌種は、増幅しない。
【００１３】
本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号３で表される塩基配列又は配列番号４で表される塩基配列（塩基数＝１８）を含み、ＰＣＲにおけるプライマーと使用した場合にポルフィロモナス・ジンジバリスを特異的に増幅可能である限り、その塩基数は特に限定されるものではないが、例えば、１８塩基〜４０塩基であることが好ましく、１８塩基〜２５塩基であることがより好ましい。
【００１４】
本発明のオリゴヌクレオチドは、その５’末端が標識物質で標識化されていることが好ましい。前記標識物質は、ＰＣＲに影響を与えることがなく、しかも、その標識物質に特異的に結合可能なパートナーが存在する限り、特に限定されるものではなく、例えば、プライマーの標識化に一般的に用いられる公知の標識物質を使用することができる。このような標識物質としては、例えば、蛍光物質〔例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ジゴキシゲニン、ビオチン等を挙げることができる。これらの標識物質に特異的に結合可能なパートナーとしては、標識物質に対する抗体（ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含む）又はその抗体フラグメント〔例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ等〕を挙げることができる。また、ビオチンに特異的に結合可能なパートナーとしては、抗ビオチン抗体又はそのフラグメント以外にも、例えば、アビジン又はストレプトアビジンを挙げることができる。
【００１５】
〔２〕本発明の分析方法及び分析用キット
本発明の分析方法は、
（１）（ａ）ポルフィロモナス・ジンジバリスを含有する可能性のある被検試料と、（ｂ）配列番号３で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、（ｃ）配列番号４で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとを用いて、ＤＮＡ断片を増幅する工程（ＤＮＡ増幅工程）；及び
（２）前記ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物を分析する工程（分析工程）
を含む。
【００１６】
本発明の分析方法で分析することのできる被検試料は、ポルフィロモナス・ジンジバリスを含有する可能性のある試料である限り、特に限定されるものではないが、例えば、歯周病ポケットのプラーク若しくは生検組織、それらの処理液、又は培養した菌体などを挙げることができる。
【００１７】
前記ＤＮＡ増幅工程は、プライマーセットとして、本発明のオリゴヌクレオチドである、配列番号３で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号４で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとの組み合わせを用いること以外は、例えば、通常のＰＣＲ法に従って実施することができる。
【００１８】
本発明の分析方法で用いる各プライマーは、その５’末端が同種又は異種の標識物質で標識化されたオリゴヌクレオチドであることもできるし、あるいは、標識化されていないオリゴヌクレオチドであることもできる。
各プライマーの５’末端が同種又は異種の標識物質で標識化されたオリゴヌクレオチドを用いると、分析工程において、前記標識物質に特異的に結合可能なパートナーを用いる分析方法（例えば、イムノクロマトグラフ法、ラテックス凝集法、又はサンドイッチ法など）を用いることができるため、好ましい。電気泳動法を用いることなく、簡易且つ迅速に検出・同定することができるからである。
【００１９】
なお、標識物質として同種又は異種の標識物質を用いるかは、後述の分析工程の説明の際に詳述するように、分析工程において利用する分析手法により、適宜決定することができる。
例えば、分析工程における分析手法として、ラテックス凝集法又はサンドイッチ法を利用する場合には、同種の標識物質を用いることもできるし、あるいは、異種の標識物質を用いることもできる。一方、分析工程における分析手法として、イムノクロマトグラフ法を利用する場合には、その実施形態により、利用可能な標識物質の種類が制限されることがあり、異種の標識物質を用いることが必要な場合がある。
【００２０】
前記分析工程では、前記ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物を分析する。反応生成物の分析方法としては、ＰＣＲ産物の分析に用いられる通常の分析方法を用いることができ、例えば、分子生物学的手法、あるいは、標識物質に特異的に結合可能なパートナーを用いる分析方法（例えば、イムノクロマトグラフ法、ラテックス凝集法、又はサンドイッチ法など）等を挙げることができる。なお、前記ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物は、そのまま直接、あるいは、適当な処理を行なった処理物（例えば、適当に希釈又は濃縮した希釈物又は濃縮物）として、分析工程にかけることができる。
【００２１】
分子生物学的手法を用いる場合には、例えば、ゲル（例えば、アガロースゲル）電気泳動を実施した後、そのゲルをそのまま、あるいは、メンブレンに転写し、予想されるＤＮＡサイズを有するバンドの有無により、あるいは、プローブとのハイブリダイズの有無により、ＤＮＡ増幅工程においてポルフィロモナス・ジンジバリスの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子断片が生成したか否かを決定することができ、更には、被検試料中にポルフィロモナス・ジンジバリスが存在することを決定することができる。
なお、分析工程において分子生物学的手法を用いる場合には、ＤＮＡ増幅工程で用いる各プライマーは、その５’末端が各々異なる標識物質で標識化されたオリゴヌクレオチドであることもできるし、あるいは、標識化されていないオリゴヌクレオチドであることもできる。
【００２２】
一方、分析工程において、標識物質に特異的に結合可能なパートナーを用いる分析方法を用いる場合には、ＤＮＡ増幅工程で用いる各プライマーとして、その５’末端が同種又は異種の標識物質で標識化されたオリゴヌクレオチドを用いる。以下、本発明の分析方法において、分析工程で、標識物質に特異的に結合可能なパートナーを用いる分析方法を用いる態様を、特に、本発明の結合パートナー型分析方法と称する。
本発明の結合パートナー型分析方法において、分析工程における分析手法として、イムノクロマトグラフ法、ラテックス凝集法、及びサンドイッチ法を利用する各態様について、以下、この順序に従って説明する。
【００２３】
本発明の結合パートナー型分析方法において、分析工程における分析手法として、イムノクロマトグラフ法を用いる場合には、例えば、イムノクロマトグラフ用ストリップとして、プライマーの標識化に用いた２種類の標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能なパートナーが結合された着色粒子（すなわち、着色粒子コンジュゲート）を、固相担体に保持し、しかも、もう一方の標識物質に特異的に結合可能なパートナーが、前記固相担体に固定化（すなわち、固相化）されているイムノクロマトグラフ用ストリップを使用することができる。
【００２４】
前記固相担体としては、例えば、ニトロセルロース、セルロースアセテート、又はガラス繊維フィルター等を用いることができる。
前記着色粒子としては、例えば、金属コロイド（例えば、金コロイド等）、非金属コロイド（例えば、ポリスチレンコロイド等）、又はリポゾーム等を用いることができる。
標識物質に特異的に結合可能なパートナーとしては、例えば、標識物質に対する抗体（ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含む）又はその抗体フラグメント〔例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ等〕を用いることができる。また、ビオチンに特異的に結合可能なパートナーとしては、抗ビオチン抗体又はそのフラグメント以外にも、例えば、アビジン又はストレプトアビジンを挙げることができる。以下、固相担体に固定化させる前記パートナーを「固定化用パートナー」と称し、着色粒子に結合させ、着色粒子コンジュゲートとして固相担体に保持させる前記パートナーを「保持用パートナー」と称する。
【００２５】
本発明の結合パートナー型分析方法で用いることのできる前記イムノクロマトグラフ用ストリップでは、被検試料の展開方向に関して、上流側に、着色粒子コンジュゲートの保持領域（例えば、塗布領域）を設け、下流側に、固定化用パートナーの固定領域を設ける。固定化用パートナー（例えば、抗体）の固相への結合は、例えば、約１μｇ／ｍＬの抗体溶液を固相担体に加え、室温放置することにより行なうことができる。タンパク質の非特異的吸着をブロックするために、例えば、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）でブロッキングすることが好ましい。
なお、陰性コントロールとして、例えば、マウスＩｇＧ又はウサギＩｇＧを固定する領域は、固定化用パートナーの固定領域の更に下流側に設けることもできるし、設けないでおくこともできるが、検査を正確にするためには設ける方が好ましい。
【００２６】
イムノクロマトグラフ法を用いる本発明の結合パートナー型分析方法では、固相担体に固定化された固定化用パートナーと、固相担体に保持された着色粒子コンジュゲートとを介して、ＤＮＡ増幅工程で増幅した二重標識ＤＮＡ生成物を検出する。担体の役割は、被検出物（二重標識ＤＮＡ生成物）と着色粒子コンジュゲートとを展開し、固定化された固定化用パートナーと反応させ、更に、未反応物を分離することにある。
【００２７】
より具体的には、クロマトグラフ用ストリップの着色粒子コンジュゲートを塗布した側の端に、ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物又はその処理物（例えば、希釈物又は濃縮物）が接触すると、この水溶液はクロマトグラフ用ストリップに吸収及び展開され、先端に向かって浸透する。前記接触方法としては、例えば、被検試料滴下部位に滴下する方法、あるいは、容器（例えば、ウェル）内の被検試料を吸着する方法などを挙げることができる。着色粒子コンジュゲートを塗布した領域に達すると、二重標識ＤＮＡ生成物は、保持用パートナーを介して着色粒子コンジュゲートと結合し、更にクロマトグラフ用ストリップ上を移動する。そして、この二重標識ＤＮＡ生成物と着色粒子コンジュゲートとの複合体が、固定化用パートナーを固定した領域に達すると、二重標識ＤＮＡ生成物は、この固定化用パートナーに結合し、トラップされる。その結果、二重標識ＤＮＡ生成物と着色粒子コンジュゲートとの複合体は、この領域で停止し、これ以上移動しない。イムノクロマトグラフ法を利用する本発明の結合パートナー型分析方法では、この着色粒子の担体上での集積を目視により観察することにより、ＤＮＡ増幅工程においてポルフィロモナス・ジンジバリスの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子断片が生成したか否かを決定することができ、更には、被検試料中にポルフィロモナス・ジンジバリスが存在すること（すなわち、被検試料の陽性又は陰性）を判定することができる。
【００２８】
本発明の結合パートナー型分析方法において、分析工程における分析手法として、ラテックス凝集法を用いる場合には、ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物と接触させるラテックス懸濁液として、プライマーを標識化するのに用いた標識物質に特異的に結合可能なパートナーを担持したラテックス懸濁液を用いること以外は、通常のラテックス凝集法をそのまま適用して実施することができる。
ラテックス凝集法を用いる場合には、２個１組のプライマーセットに対して用いる標識物質の種類は、同種（すなわち、１種類）であることもできるし、あるいは、異種（すなわち、２種類）であることもできる。同種であると、競合が生じて凝集度に影響を与える可能性があるため、異種の標識物質を用いることが好ましい。
【００２９】
２個１組のプライマーセットを標識化する標識物質として、異種の標識物質を用いる場合には、それらの２種類の標識物質に、それぞれ、特異的に結合可能な２種類のパートナー（すなわち、一方の標識物質に特異的に結合可能なパートナーと、もう一方の標識物質に特異的に結合可能なパートナー）を担持したラテックス懸濁液を使用する。一方、２個１組のプライマーセットを標識化する標識物質として、同種の標識物質を用いる場合には、その１種類の標識物質に特異的に結合可能なパートナーを担持したラテックス懸濁液を使用する。
【００３０】
ラテックスとしては、通常の免疫分析用試薬に使用可能なラテックスである限り、特に限定されるものではなく、例えば、ポリスチレン、又はスチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体などを挙げることができる。ラテックスの平均粒径は、測定対象物の検出濃度又は測定機器によって適宜選択することができ、例えば、０．０５〜０．５μｍであることができる。
２種類のパートナーを用いる場合には、それらをラテックス上に担持させる形態としては、例えば、２種類のパートナーを混合した状態で、同一のラテックス上に担持させることもできるし、あるいは、２種類のパートナーを、それぞれ、別々のラテックス上に担持させることもできる。
パートナーを担持するラテックス懸濁液は、公知方法、例えば、物理的又は化学的結合により感作させることにより、調製することができる。
【００３１】
ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物又はその処理物（例えば、希釈物又は濃縮物）と、前記ラテックス懸濁液とを接触させると、前記反応生成物中に二重標識ＤＮＡ生成物が存在する場合には、特異的結合反応（例えば、抗原抗体反応）により凝集が生じる。
例えば、抗原抗体反応の条件は、通常の免疫学的ラテックス比濁分析方法の実施条件と同様であることができ、例えば、反応のｐＨは、６〜８．５で実施することができる。反応温度は０〜５０℃であることが好ましく、２０〜４０℃がより好ましい。反応時間は、適宜決定することができ、例えば、汎用自動分析機では１０〜１５分間で測定を完了することができる。
【００３２】
特異的結合反応（例えば、抗原抗体反応）により生じた凝集の程度は、公知の分析方法、例えば、光学的分析方法により分析することができる。前記光学的分析方法としては、例えば、反応液に光を照射して散乱光又は透過光を分析する方法を挙げることができ、より具体的には、散乱光強度、吸光度、又は透過光強度を測定する光学機器を用いて分析を行なうことができる。好ましい測定波長は３００〜８００ｎｍである。前記光学機器を用いた分析では、公知の方法に従って、用いるラテックス粒子の大きさ及び／又は濃度の選択、並びに反応時間の設定により、散乱光強度、吸光度、又は透過光強度の増加又は減少を測定することにより実施することができる。また、これらの方法を併用することも可能である。ラテックス凝集法を利用する本発明の結合パートナー型分析方法では、ラテックスの凝集の程度を観察することにより、ＤＮＡ増幅工程においてポルフィロモナス・ジンジバリスの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子断片が生成したか否かを決定することができ、更には、被検試料中にポルフィロモナス・ジンジバリスが存在すること（すなわち、被検試料の陽性又は陰性）を判定することができる。
【００３３】
本発明の結合パートナー型分析方法において、分析工程における分析手法として、サンドイッチ法を用いる場合には、分析対象化合物に対する抗体の代わりに、プライマーを標識化するのに用いた標識物質に特異的に結合可能なパートナーを用いること以外は、通常のサンドイッチ法をそのまま適用して実施することができる。
２個１組のプライマーセットを標識化する標識物質として、異種の標識物質を用いる場合には、それらの２種類の標識物質に、それぞれ、特異的に結合可能な２種類のパートナーを使用する。一方、２個１組のプライマーセットを標識化する標識物質として、同種の標識物質を用いる場合には、その１種類の標識物質に特異的に結合可能なパートナーを使用する。
【００３４】
具体的には、例えば、プライマーの標識化に用いた２種類の標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能な第１のパートナーを、適当な不溶性担体に固定化する。次に、不溶性担体と体液試料との非特異的結合を避けるために、適当なブロッキング剤〔例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）やゼラチン等〕で不溶性担体の表面を被覆する。続いて、ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物又はその処理物（例えば、希釈物又は濃縮物）を加えて一定時間（例えば、５分〜３時間）及び一定温度（例えば、４℃〜４０℃、好ましくは室温付近）で接触させ、反応させる（１次反応）。続いて、プライマーの標識化に用いた２種類の標識物質の残る一方に特異的に結合可能な第２のパートナーに標識物質を付した標識化第２パートナーを加えて一定時間（例えば、５分〜３時間）及び一定温度（例えば、４℃〜４０℃、好ましくは室温付近）で接触させ、反応させる（２次反応）。これを適当な洗浄液（例えば、界面活性剤を含む生理食塩水）で洗浄してから、不溶性担体上に存在する標識化第２パートナーの量を定量する。その値から、ＤＮＡ増幅工程においてポルフィロモナス・ジンジバリスの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子断片が生成したか否かを決定することができ、更には、被検試料中にポルフィロモナス・ジンジバリスが存在すること（すなわち、被検試料の陽性又は陰性）を判定することができる。
２個１組のプライマーセットを標識化する標識物質として、同種の標識物質を用いる場合には、前記第１及び第２パートナーに代えて、その１種類の標識物質に特異的に結合可能なパートナーを用いること以外は、同様にして実施することができる。また、１次反応と２次反応とを同時に行なうことも可能である。
【００３５】
前記不溶性担体としては、例えば、高分子（例えば、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、又はポリサッカライド等）、ニトロセルロース、紙、若しくはアガロース、又はこれらの組み合わせ等を例示することができる。
第２パートナーに付す標識物質としては、例えば、酵素、蛍光物質、又は発光物質を挙げることができる。酵素としては、例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、又はβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ等、また、蛍光物質としては、例えば、フルオレセインイソチオシアネート等、また、発光物質としては、例えば、アクリジニウムエステル又はルシフェリン等を使用することができる。
【００３６】
本発明の分析用キットには、分析工程における分析手法としてイムノクロマトグラフ法を利用する本発明の結合パートナー型分析方法に用いることのできる分析用キット（以下、イムノクロマトグラフ型分析用キットと称する）と、分析工程における分析手法としてラテックス凝集法を利用する本発明の結合パートナー型分析方法に用いることのできる分析用キット（以下、ラテックス凝集型分析用キットと称する）とが含まれる。
【００３７】
本発明のイムノクロマトグラフ型分析用キットは、
（１）配列番号３で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号３で表される塩基配列からなり、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド）；
（２）配列番号４で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドとは異なる標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号４で表される塩基配列からなり、前記オリゴヌクレオチドとは異なる標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド）；及び
（３）前記標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能なパートナーが結合された着色粒子を保持し、しかも、もう一方の標識物質に特異的に結合可能なパートナーが固定化されているイムノクロマトグラフ用ストリップ
を含む。
【００３８】
本発明のラテックス凝集型分析用キットは、
（１）配列番号３で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号３で表される塩基配列からなり、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド）；
（２）配列番号４で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドとは異なる標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号４で表される塩基配列からなり、前記オリゴヌクレオチドとは異なる標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド）；及び
（３）前記標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能なパートナーと、もう一方の標識物質に特異的に結合可能なパートナーとを担持したラテックス懸濁液
を含む。
【００３９】
以下、本発明の具体的な実施手順の一例を示し、本発明をより具体的に説明する。
１）プローブの設計
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のクローニング用プライマーとして、配列表の配列番号１及び２で表される各塩基配列を設計する。その１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列をジデオキシ法で決定する。
標識化合物として５’−末端にＦＩＴＣ又はビオチンを付加する。具体的には、配列表の配列番号３及び４で表される各塩基配列を設計し、その遺伝子増幅生成物の塩基配列として配列表の配列番号５及び６で表される各塩基配列を決定する。
【００４０】
２）ＤＮＡの合成
３８１型ＤＮＡ自動合成装置（アプライドバイオシステムズ社）を用いて常法により、配列表に記載した配列で表されるオリゴＤＮＡを４種類合成する（以下、配列番号１〜４と称する）。ＤＮＡのプライマーとして、配列番号１〜４で表される塩基配列からなるＤＮＡは、ポルフィロモナス・ジンジバリス菌の１６Ｓ
ｒＲＮＡの鋳型特異的なプライマーである。
なお、配列番号３で表される塩基配列の５’末端にＦＩＴＣを含む塩基数１８個からなるオリゴＤＮＡ、及び配列番号４で表される塩基配列の５’末端にビオチンを含む塩基数１８個からなるオリゴＤＮＡを合成する。
【００４１】
３）ＰＣＲ法によるＤＮＡ生成物の確認
ポルフィロモナス・ジンジバリス菌から調製したＤＮＡを用いて、ＰＣＲ装置で９５℃で熱変性し、前記のプライマー（配列番号１及び２）を添加すると、１６Ｓ ＤＮＡに特異的に結合する。
次に、ＤＮＡポリメラーゼ、特には耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ：Ｒｏｃｈｅ社）を添加し、以下のＰＣＲ法による増幅サイクルを行なう。
１サイクルは、（ａ）ＤＮＡの変性工程〔９４℃で２分間〕、（ｂ）１本鎖ＤＮＡとプライマーとのアニーリング工程〔５０℃で３０秒間〕、及び（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成工程〔７２℃で１分３０秒間〕からなり、１サイクル毎にＤＮＡ量は２倍に増幅されるが、このサイクルを３０回繰り返す。
【００４２】
４）プラスミドの作製
市販のプラスミドベクターｐＺＥｒＯ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を制限酵素ＥｃｏＲＶ（３７℃，２時間）で消化して、増幅したＰＣＲ産物がベクターに挿入できるようにする。この制限酵素で切断したベクター２．８ｋｂｐとＰＣＲにより合成した約１，５００ｂｐのＤＮＡをライゲーション・キット（宝酒造）を用いて、１６℃で３０分間反応させる。
【００４３】
５）大腸菌の形質転換
組み換えプラスミドと、市販の大腸菌ＤＨ５α株（宝酒造）を５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＣａＣｌ２で処理して作成したコンピテント細胞とを氷中で３０分間インキュベートし、４２℃で３０秒間熱処理した後、３７℃でＳＯＣ培地にて１時間培養する。この大腸菌を、５０μｇ／ｍＬゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）及び１ｍｍｏｌ／Ｌイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を含むＹＴ寒天平板上にまき、３７℃で一夜培養を行なう。
生じたゼオシン耐性で透明なコロニーを、各々新たな５０μｇ／ｍＬゼオシンを含むＹＴブロスで３７℃一夜培養をし、アルカリ溶菌法にてプラスミドＤＮＡを単離する（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
【００４４】
６）ＰＣＲ法による二重標識ＤＮＡ生成物の作製
前記で調製したＤＮＡを、ＰＣＲ装置において９５℃で熱変性し、前記プライマー（配列番号３及び４）を添加すると、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に特異的に結合する。
次に、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ製）を添加し、以下のＰＣＲ法による増幅サイクルを行なう。
１サイクルは、（ａ）ＤＮＡの変性工程〔９４℃で２分間〕、（ｂ）１本鎖ＤＮＡとプライマーとのアニーリング工程〔５０℃で３０秒間〕、及び（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成工程〔７２℃で３０秒間〕からなり、１サイクル毎にＤＮＡ量は２倍に増幅されるが、このサイクルを３０回繰り返す。
【００４５】
７）イムノクロマトグラフ用ストリップの作製
薄片状のクロマトグラフ基材（ニトロセルロース膜）の片方に金コロイド標識したストレプトアビジンを塗布し、他方に第２の抗ＦＩＴＣモノクローナル抗体を固定する。
抗ＦＩＴＣ抗体の固相への結合は、例えば、約１μｇ／ｍＬの抗体溶液をニトロセルロースに加え、室温放置することにより行なうことができる。タンパク質の非特異的吸着をブロックするために、１％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキングすることができる。
【００４６】
イムノクロマトグラフ法では、クロマトグラフ用ストリップの金コロイド標識ストレプトアビジンを塗布した側の端に、被検試料中のＰＣＲ法によるＤＮＡ生成物、又は希釈液が接すると、この水溶液はクロマトグラフ用ストリップに吸収及び展開され、先端に向かって浸透する。金コロイド標識ストレプトアビジンを塗布した領域に達すると、ＤＮＡ生成物は金コロイド標識ストレプトアビジンと結合し、更にクロマトグラフ用ストリップ上を移動する。そして、このＰＣＲ生成物と金コロイド標識結合物が、抗ＦＩＴＣ抗体を固定した領域に達すると、ＤＮＡ生成物はこの抗ＦＩＴＣ抗体に結合し、トラップされる。その結果、金コロイド標識結合物は、この領域で停止し、これ以上移動しない。イムノクロマトグラフ法では、この着色粒子の担体上での集積を目視により観察して、検体の陽性／陰性を判定する。
【００４７】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
《ポルフィロモナス・ジンジバリス菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のクローニング》
本実施例では、市販のキット（Ｇｅｎとるくん；宝酒造製）を用いてポルフィロモナス・ジンジバリスの菌体からゲノムＤＮＡを単離した後、２種類のプライマーとして配列番号１及び配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡを用いてＰＣＲ法で１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅し、約１．５ｋｂｐのＤＮＡを得た。このＰＣＲ産物をプラスミドｐＺＥｒＯ−１のＥｃｏＲＶ サイトを利用して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合して組み換えプラスミドを作成した。各工程の手順は、以下に示す通りである。
【００４８】
（１）ポルフィロモナス・ジンジバリスの培養
ＧＡＭ寒天培地（日水製薬製）にビタミンＫ及びヘミンを添加し、嫌気バッグ（ダイアヤトロン社）を用いて、ポルフィロモナス・ジンジバリスＡＴＣＣ ３３２７７株の培養を４８時間行なった。
【００４９】
（２）合成ＤＮＡの作成
３８１型ＤＮＡ自動合成装置（アプライドバイオシステムズ社）を用いて常法により、４種類のプライマーＤＮＡ（配列番号１〜配列番号４）を合成した。配列番号３で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡの５’−末端は、ＦＩＴＣ標識ｄＡＴＰを用い、配列番号４で表される塩基配列からなるプライマーＤＮＡの５’−末端は、ビオチン標識ｄＧＴＰを用いて合成した。
ユニバーサルプライマー１（配列番号１）及びユニバーサルプライマー２（配列番号２）の各塩基配列は、ポルフィロモナス・ジンジバリス菌のゲノムＤＮＡの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅するものである。従って、プライマー１とプライマー２を用いてＰＣＲ法で増幅されるＤＮＡ生成物（Ｉ）は、１，５００塩基対である。
【００５０】
なお、前記ユニバーサルプライマー（配列番号１及び配列番号２）は、参考文献〔Ｌａｎｅ， Ｄ．Ｊ． （１９９１）． １６Ｓ／２３Ｓ ｒＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ． Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ． Ｅ． Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔ ａｎｄ Ｍ． Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ， ｅｄｓ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ： １１５−１７５〕のプライマー２７ｆ及びプライマー１４９２ｆを引用したものである。
また、ポルフィロモナス・ジンジバリス（ＡＴＣＣ ３３２７７）の１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋのＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｌ１６４９２（１４７４ｂｐ）から引用した。配列番号３で表される塩基配列は、その第８４１番〜第８５８番であり、配列番号４で表される塩基配列は、第１００２番〜第１０１９番である。また、配列番号１で表される塩基配列は、第８番〜第２７番であるが、配列番号２で表される塩基配列は、この中には含まれていない。
【００５１】
（３）遺伝子の増幅
実施例１（１）で培養したポルフィロモナス・ジンジバリス菌から調製したゲノムＤＮＡと、実施例１（２）で合成したプライマー１及びプライマー２とを用いてＰＣＲを行なった。
１サイクルは、（ａ）ＤＮＡの変性工程〔９５℃で２分間〕、（ｂ）１本鎖ＤＮＡとプライマー（配列番号１及び２）とのアニーリング工程〔５０℃で３０秒間〕、及び（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成工程〔７２℃で１分３０秒間〕からなり、このサイクルを３０回繰り返した。
【００５２】
（４）組み換えプラスミドの作製
クローニングベクターとして、ｐＺＥｒＯ−１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いた。実施例１（３）で得られたＤＮＡ生成物（Ｉ）とｐＺＥｒＯ−１ベクターのＥｃｏＲＶサイトを利用して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合して組み換えプラスミドを作成した。
具体的には、ＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲル電気泳動で分離し、約１，５００ｂｐのバンドを切り取り、市販のカラム（ＧｅｎＥｌｕｔｅ ＡＧＡＲＯＳＥ ＳＰＩＮ ＣＯＬＵＭＮ；ＳＩＧＭＡ社）で精製した。ＤＮＡライゲーション・キット（宝酒造）を用いて、ＤＮＡ（Ｉ）３μＬとｐＺＥｒＯ−１ベクター（制限酵素ＥｃｏＲＶで処理したもの）１μＬとを加え、更にライゲーション溶液Ｉ（酵素液）４μＬを加えて１６℃で３０分間反応させ、ライゲーションを行ない、プラスミドＤＮＡ（ＩＩ）を作製した。
【００５３】
（５）形質転換
実施例１（４）で得られた組み換えＤＮＡを用いて、常法により形質転換を行なった。すなわち、５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＣａＣｌ２処理して作製したコンピテントセル（大腸菌ＤＨ５α株）にプラスミドＤＮＡを導入した。
【００５４】
（６）形質転換体に含まれる１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の単離
実施例１（５）で得られた形質転換体であるコロニーを、５０μｇ／ｍＬゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＹＴ−ブロスに接種し、３７℃で一夜培養を行なった。この培養液１．５ｍＬをエッペンドルフチューブに入れ、遠心分離で菌体を集め、アルカリ溶菌法にてプラスミドＤＮＡを単離した。
【００５５】
（７）塩基配列の決定
実施例１（６）で得られたＤＮＡと市販のキット（ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ；アプライドバイオシステムズ社）を用いてＰＣＲ反応を行ない、この反応溶液をＤＮＡシークエンサー装置（３７３Ａ−１８ ＤＮＡシークエンサー装置；アプライドバイオシステムズ製）にアプライし、ジデオキシ法で塩基配列を決定した。
【００５６】
【実施例２】
《１７９ｂｐ ＤＮＡ遺伝子の増幅》
本実施例では、実施例１で作製したポルフィロモナス・ジンジバリスのｒＲＮＡ遺伝子（１．５ｋｂｐ）を含むクローンからＤＮＡを単離し、２種類のプライマーとして配列番号３及び配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡを用いてＰＣＲ法でＤＮＡ増幅を行ない、そのＰＣＲ生成物量及び塩基配列を確認した。
【００５７】
（１）遺伝子の増幅
実施例１で作製した１．５ｋｂｐのｒＲＮＡ遺伝子配列を含むプラスミドＤＮＡと、実施例１（２）で合成した２種類の標識プライマー、すなわち、プライマー３（配列番号３）及びプライマー４（配列番号４）を用いてＰＣＲを行なった。
１サイクルは、（ａ）ＤＮＡの変性工程〔９５℃で２分間〕、（ｂ）１本鎖ＤＮＡとプライマー（配列番号３及び４）とのアニーリング工程〔５０℃で３０秒間〕、及び（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成工程〔７２℃で３０秒間〕からなり、このサイクル数による二重標識ＰＣＲ生成物量を確認するため、１０回、１５回、２０回、及び３０回の反応を行なった。
【００５８】
結果を図１に示す。図１は、ＰＣＲ生成物の０．８％アガロースゲル電気泳動の結果を示す、図面に代わる写真である。各レーンは、下記のとおりである：
レーン１：ＤＮＡマーカー（１２３ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ；ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ製）；
レーン２：ＤＮＡマーカー（ＤＮＡ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｒｋｅｒ ＶＩＩＩ；ベーリンガー・マンハイム製）；
レーン３：ＰＣＲのサイクル数１０回の生成物；
レーン４：ＰＣＲのサイクル数１５回の生成物；
レーン５：ＰＣＲのサイクル数２０回の生成物；
レーン６：ＰＣＲのサイクル数３０回の生成物；
レーン７：ＰＣＲのサイクル数３０回の生成物を１０倍希釈し、その５μＬをアプライしたもの；
レーン８：ＰＣＲのサイクル数３０回の生成物を５０倍希釈し、その５μＬをアプライしたもの；
レーン９：ＰＣＲのサイクル数３０回の生成物を１００倍希釈し、その５μＬをアプライしたもの；
レーン１０：ＰＣＲのサイクル数３０回の生成物を２００倍希釈し、その５μＬをアプライしたもの；及び
レーン１１：ＰＣＲのサイクル数３０回の生成物を５００倍希釈し、その５μＬをアプライしたもの。
【００５９】
（２）１７９ｂｐＤＮＡの精製
実施例２（１）で得られたポルフィロモナス・ジンジバリスのＰＣＲ生成物を１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にアプライし、ＤＮＡマーカー（１２３ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ；ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ製）から判断し、１７９ｂｐバンドに相応するバンドを切り取り、市販のキット（ＤＮＡ Ｐｒｅｐ；ダイアヤトロン社）を用いてＤＮＡを精製した。
【００６０】
（３）塩基配列の決定
実施例２（２）で得られたポルフィロモナス・ジンジバリスのＤＮＡと市販のキット（ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ；アプライドバイオシステムズ社）を用いてＰＣＲ反応を行ない、この反応溶液をＤＮＡシークエンサー装置（３７３Ａ−１８ ＤＮＡシークエンサー装置；アプライドバイオシステムズ製）にアプライし、ジデオキシ法で塩基配列を決定した。
【００６１】
【実施例３】
《各種菌体から単離したゲノムを用いたＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅》
本実施例では、実施例１で作製したポルフィロモナス・ジンジバリスのｒＲＮＡ遺伝子（１．５ｋｂｐ）を含むクローン、及び各種菌体（ポルフィロモナス・ジンジバリス、アクチノバチルス・アクチノミセテコミタンス、プレボテラ・インテルメディア、及び大腸菌の培養菌株）からＤＮＡを単離し、２種類の標識プライマーとして配列番号３及び配列番号４で表される塩基配列からなるＤＮＡを用いてＰＣＲ法でＤＮＡ増幅を行なった。
【００６２】
（１）ＤＮＡの分離
寒天平板上の各種培養菌株のコロニーから少量つま楊枝で採取し、市販のＤＮＡ調製キット（Ｇｅｎとるくん；宝酒造製）により調製した。
【００６３】
（２）遺伝子の増幅
実施例３（１）で得たＤＮＡと、実施例１（２）で合成した２種類の標識プライマー、すなわち、プライマー３（配列番号３）及びプライマー４（配列番号４）を用いてＰＣＲを行なった。
１サイクルは、（ａ）ＤＮＡの変性工程〔９５℃で２分間〕、（ｂ）１本鎖ＤＮＡとプライマー（配列番号３及び４）とのアニーリング工程〔５０℃で３０秒間〕、及び（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成工程〔７２℃で３０秒間〕からなり、このサイクルを３０回繰り返した。
【００６４】
（３）１７９ｂｐＤＮＡの確認
実施例３（２）で得られたＰＣＲ生成物を１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にアプライし、ＤＮＡマーカー（１２３ｂｐ ＤＮＡ Ｌａｄｄｅｒ；ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ製）を指標として、１７９ｂｐバンドの有無を確認した。
【００６５】
【実施例４】
《イムノクロマトグラフ用ストリップの作製》
本実施例では、ＰＣＲ生成物捕捉用抗体としてモノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体（ＺＹＭＥＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）又はポリクローナル抗ＦＩＴＣ抗体（ＺＹＭＥＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を、金コロイド標識物としてストレプトアビジン（ＴＲＩＮＡ Ｂｉｏｒｅａｃｔｉｖｅｓ製）を用いて、ＰＣＲ生成物測定用イムノクロマトグラフ用ストリップを作製した。
【００６６】
（１）イムノクロマトグラフ用メンブレンの作製
ポリアミド（ナイロン６６）製メンブレン（Ｉｍｍｕｎｏｄｙｎｅ ＡＢＣ，孔径＝３．０μｍ；Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を５ｍｍ×２０ｍｍのサイズに裁断した。
メンブレンの上流側の一端から８ｍｍの位置に、ＰＣＲ生成物の検出ゾーンとして、モノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体溶液又はポリクローナル抗ＦＩＴＣ抗体溶液〔各々濃度０．５ｍｇ／ｍＬ；５ｍｍｏｌ／Ｌホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）で希釈〕を幅１ｍｍの線状に塗布した。
また、メンブレンの上流側の一端から１３ｍｍの位置に、陰性コントロールゾーンとして、マウスＩｇＧ溶液〔濃度０．５ｍｇ／ｍＬ；５ｍｍｏｌ／Ｌホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）で希釈〕を、幅１ｍｍの線状に塗布した。
室温下で１時間、３７℃下で３０分間静置し、各々の抗体を固相化した。メンブレンを０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に浸し、室温及び相対湿度２０％以下の条件下で３０分間緩やかに振とうし、ブロッキングした。メンブレンの過剰のブロッキング液を除き、室温下で一夜静置し、乾燥させ、二重標識ＰＣＲ生成物のイムノクロマトグラフ法用抗体固相化メンブレンとした。
【００６７】
（２）金コロイド標識ストレプトアビジン懸濁液の作製
ストレプトアビジン（濃度１ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬを２ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｎａ２Ｂ４Ｏ７緩衝液（ｐＨ６．５）（以下、Ｂｏｒａｘ緩衝液と称する）３，０００ｍＬ中で４℃下で一夜透析した。ストレプトアビジン溶液は、４℃下、１００，０００×ｇで１時間遠心分離した後、その上清を、１００，０００×ｇで１時間遠心分離したＢｏｒａｘ緩衝液で１００μｇ／ｍＬとなるように希釈した。金コロイド液（ＧＯＬＤ ＣＯＬＬＯＩＤ ２０ｎｍ；Ｂｒｉｔｉｓｈ ＢｉｏＣｅｌｌＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ製）１００ｍＬを、０．２ｍｏｌ／Ｌ−Ｋ２ＣＯ３溶液及び０．２ｍｏｌ／Ｌ−Ｈ３ＰＯ４溶液でｐＨ６．５に調整した。金コロイド液２０ｍＬを撹拌しながら、希釈したストレプトアビジン溶液２ｍＬを徐々に滴下し、室温下で３０分間撹拌した。更に、撹拌しながら１０％ＢＳＡ溶液（ｐＨ９．０；４℃下、１００，０００×ｇで１時間遠心分離した上清）２．５ｍＬを滴下した後、室温下で３０分間撹拌した。１０℃下にて１６，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を除去した。沈殿した金コロイド標識ストレプトアビジンを、０．５％ショ糖を含むホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）（０．４５μｍフィルター濾過）２０ｍＬに再懸濁させ、１０℃下にて１６，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を除去した。更に、沈殿した金コロイド標識ストレプトアビジンを、０．５％ショ糖を含むホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）（０．４５μｍフィルター濾過）２０ｍＬに再懸濁させ、１０℃下にて１６，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を除去した。最後に、沈殿した金コロイド標識ストレプトアビジンを、０．５％ショ糖を含むホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８，０）（０．４５μｍフィルター濾過）に再懸濁させた後、波長５２０ｎｍにおける吸光度が約１０になるように濃度調整し、表面をシリコン処理したガラス試験管に移し、密栓し、４℃下に保存し、ＰＣＲ生成物のイムノクロマトグラフ法用金コロイド標識ストレプトアビジン懸濁液とした。
【００６８】
金コロイド標識ストレプトアビジン懸濁液は、波長５２０ｎｍにおける吸光度が３．０になるように、５．０％ショ糖を含む２ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．３）で希釈した後、その７μＬを、吸収パッドアキュウィックＡＷ１４−２０Ｔ４（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を５ｍｍ×５ｍｍのサイズに裁断したものに塗布し、シリカゲルデシケーター内で室温下、一夜減圧（≦５０ｍｍＨｇ）乾燥したものを、ＰＣＲ生成物のイムノクロマトグラフ法用金コロイド標識ストレプトアビジンパッドとした。
【００６９】
（３）イムノクロマトグラフ法用吸収パッドの作製
グラスファイバーパッド（タイプＡ／Ｂ；Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を５ｍｍ×１８ｍｍのサイズに裁断したものを、ＰＣＲ生成物のイムノクロマトグラフ法用試料添加パッドとした。グラスファイバーパッド（タイプＡ／Ｅ；Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を５ｍｍ×２５ｍｍのサイズに裁断したものを、ＰＣＲ生成物のイムノクロマトグラフ法用吸収パッドとした。
【００７０】
（４）イムノクロマトグラフ用ストリップ
５ｍｍ×６０ｍｍのサイズに裁断したプラスティック粘着シート（ＢｉｏＤｏｔ製）に、上流側より、試料添加パッド、金コロイド標識ストレプトアビジンパッド、抗体固相化メンブレン、及び吸収パッドの順に、各々その両端を隣接する部材と１ｍｍ重ね合わせて貼付し、ＰＣＲ生成物測定用イムノクロマトグラフ用ストリップとした。
【００７１】
【実施例５】
《イムノクロマトグラフ法によるＰＣＲ生成物の測定》
本実施例では、実施例４で作製したイムノクロマトグラフ用ストリップを用いて、ＰＣＲ生成物のイムノクロマトグラフ法を実施した。
【００７２】
（１）ＰＣＲ法のサイクル回数別によるＰＣＲ生成物の検出
実施例２（１）で使用した２種類の標識プライマーを用い、ＰＣＲ法のサイクル回数として、１０回、１５回、２０回、及び３０回の反応をそれぞれ行なった。これらのＰＣＲ反応液１０μＬと２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液９０μＬとを混合した溶液、及び２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ブランク試験）１００μＬを、水平に静置したイムノクロマトグラフ用ストリップの試料添加パッドに滴下し、室温下で１０分間展開した。
【００７３】
メンブレンのモノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体を固相化した部分、及び陰性コントロール抗体を固相化した部分の金コロイドの捕捉に基づく赤紫〜紫色の着色の有無を目視観察し、ＰＣＲ生成物の有無を判定した。モノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体固相化イムノクロマトグラフ用ストリップでのＰＣＲ生成物の測定結果を表１に示す。表１において、「−」は陰性、「＋」は弱陽性、「＋＋」は中陽性、「＋＋＋」は強陽性であることを示す。
今回行なったＰＣＲ法では、ＰＣＲのサイクル回数１０回では二重標識ＰＣＲ生成物が、まだ、あまり産生されておらず、イムノクロマトグラフ用ストリップで測定することができなかった。ＰＣＲのサイクル回数が１５回、２０回、及び３０回では、二重標識ＰＣＲ生成物をイムノクロマトグラフ用ストリップを用いて測定することができた。
【００７４】
（２）ＰＣＲ生成物の希釈溶液の測定
実施例５（１）においてＰＣＲ法のサイクル回数として３０回を行なった反応液を、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）で、１０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、及び１０００倍にそれぞれ希釈した溶液、並びに２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ブランク試験）の各１００μＬを水平に静置したイムノクロマトグラフ用ストリップの試料添加パッドに滴下し、室温下で１０分間展開した。
【００７６】
メンブレンのモノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体又はポリクローナル抗ＦＩＴＣ抗体を固相化した部分、及び陰性コントロール抗体を固相化した部分の金コロイドの捕捉に基づく赤紫〜紫色の着色の有無を目視観察し、ＰＣＲ生成物の有無を判定した。
図２に、モノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体を固相化したメンブレンを組み込んだＰＣＲ生成物測定用イムノクロマトグラフ用ストリップでの結果を示す。
また、表２に、モノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体を固相化したメンブレンを組み込んだＰＣＲ生成物測定用イムノクロマトグラフ用ストリップでの測定結果を示す。また、表３に、ポリクローナル抗ＦＩＴＣ抗体を固相化したメンブレンを組み込んだＰＣＲ生成物測定用イムノクロマトグラフ用ストリップでの測定結果を示す。表２及び表３において、「−」は陰性、「±」は擬陽性、「＋」は弱陽性、「＋＋」は中陽性、「＋＋＋」は強陽性であることを示す。
【００７７】
図２において、レーン１は、５０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１００μＬをアプライした結果であり、レーン２は、ビオチン結合抗ＩｇＧ抗体溶液１００μＬをアプライした結果であり、レーン３〜レーン８は、ＰＣＲ生成物を１０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、及び１０００倍にそれぞれ希釈した溶液１００μＬをアプライした結果であり、レーン９は、希釈用緩衝液（すなわち、リン酸塩緩衝液）１００μＬをアプライした結果である。図２において、展開方向は、下から上へ向かう方向（すなわち、下方が試料添加パッド側であり、上方が吸収パッド側である）である。また、レーン１及び２に共通して観察される上方のバンドは、陰性コントロールとしてのマウスＩｇＧを塗布したゾーンであり、レーン２のバンドはマウスＩｇＧの検出ゾーンであり、レーン１のバンドは非特異反応で生じたものである。
【００７８】
モノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体を固相化抗体に用いたＰＣＲ生成物測定用イムノクロマトグラフ用ストリップでは、元の被検液を５００倍希釈したものまで検出可能であり、ポリクローナル抗ＦＩＴＣ抗体を固相化したＰＣＲ生成物測定用イムノクロマトグラフ用ストリップでは、元の被検液を１，０００倍希釈したものまで検出可能であった。
【００７９】
（３）培養菌株を用いたＰＣＲ生成物の測定
実施例２（１）で使用した２種類の標識プライマー〔プライマー３（配列番号３）及びプライマー４（配列番号４）〕を用いて、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、アクチノバチルス・アクチノマイセテコミタンス（Ａ．ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｃｏｍｉｔａｎｓ）、プレボテーラ・インテルメディア（Ｐ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の培養菌株を用いて、同一のＰＣＲ反応を行なった。
これらのＰＣＲ反応液１０μＬと２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液９０μＬとを混合した溶液、及び２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ブランク試験）１００μＬを、水平に静置したイムノクロマトグラフ用ストリップの試料添加パッドに滴下し、同様に室温で１０分間展開した。
【００８２】
モノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体固相化イムノクロマトグラフ用ストリップでのＰＣＲ生成物の測定結果を表４に示す。表４において、「−」は陰性、「＋＋」は中陽性であることを示す。このイムノクロマトグラフ用ストリップでポルフィロモナス・ジンジバリスのみに特異的に反応する結果が得られた。
【００８３】
（４）患者試料から得られたＰＣＲ生成物の測定
歯周病患者試料を用いて、実施例２（１）で使用した２種類の標識プライマー〔プライマー３（配列番号３）及びプライマー４（配列番号４）〕を用いて、ＰＣＲ反応を行なった。
これらのＰＣＲ反応液１０μＬと２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液９０μＬとを混合した溶液、及び２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ブランク試験）１００μＬを、水平に静置したイムノクロマトグラフ用ストリップの試料添加パッドに滴下し、同様に室温で１０分間展開した。
【００８５】
モノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体固相化イムノクロマトグラフ用ストリップでの患者検体を用いたＰＣＲ生成物の測定結果を表５に示す。表５において、「−」は陰性、「±」は擬陽性、「＋」は弱陽性、「＋＋」は中陽性であることを示す。
【００８６】
【発明の効果】
現在、国内で歯周病菌の迅速検査法として、患者検体から遺伝子を抽出し、歯周病菌に特異的な遺伝子をＰＣＲ法で増幅し、その生成物を電気泳動した後、ＤＮＡのサイズを確認する方法や標識ＤＮＡプローブとハイブリダイズすることにより歯周病菌の同定する研究が行われている。また、歯周病菌が産生するプロテアーゼ活性を測定する酵素法で、歯周病菌の感染の有無を調べる検査が行なわれている。しかし、歯周病菌の菌種や定量ができない欠点がある。従って、歯周病菌の同定を行なうには、更に歯周病菌を培養して菌体を増やした後、生化学性状試験により、１〜２週間かけて菌種の同定が行なわれている。
【００８８】
本発明のオリゴヌクレオチド及び本発明の分析方法によれば、被検試料中に存在する歯周病菌の１つ、ポルフィロモナス・ジンジバリス菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子断片を、２種類の標識プライマーを用いてＰＣＲ法で増幅した後、その二重標識ＤＮＡ生成物を、例えば、分子生物学的手法又は免疫学的手法（特には、イムノクロマトグラフィー法）を用いて分析することにより、ポルフィロモナス・ジンジバリス菌を特異的に検出することができる。また、前記二重標識ＤＮＡ生成物を免疫学的手法（特には、イムノクロマトグラフィー法）を用いて分析することにより、電気泳動法を用いることなく、簡易且つ迅速に検出・同定することができる。また、常在菌として口腔内に存在する菌数と歯周病に進展する菌数を半定量的に測定することができる。
【００８９】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＰＣＲ生成物の電気泳動の結果を示す、図面に代わる写真である。
【図２】ＰＣＲ生成物のイムノクロマト法の結果を示す、図面に代わる写真である。
Claims (11)
- 配列番号３又は４で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
- ５’末端が標識化されている、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
- 配列番号３で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号４で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとからなる、プライマーセット。
- 各オリゴヌクレオチドの５’末端が標識化されている、請求項１に記載のプライマーセット。
- 配列番号５で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド。
- （１）（ａ）ポルフィロモナス・ジンジバリスを含有する可能性のある被検試料と、（ｂ）配列番号３で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと、（ｃ）配列番号４で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーとを用いて、ＤＮＡ断片を増幅する工程；及び
（２）前記ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物を分析する工程
を含む、ポルフィロモナス・ジンジバリスの分析方法。 - （１）（ａ）ポルフィロモナス・ジンジバリスを含有する可能性のある被検試料と、（ｂ）配列番号３で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドと、（ｃ）配列番号４で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドと同種又は異種の標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドとを用いて、ＤＮＡ断片を増幅する工程；及び
（２）前記ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物を、前記の各標識物質にそれぞれ特異的に結合可能なパートナーを用いて分析する工程
を含む、ポルフィロモナス・ジンジバリスの分析方法。 - 前記分析工程における分析方法が、イムノクロマトグラフ法、ラテックス凝集法、又はサンドイッチ法である、請求項７に記載の分析方法。
- （１）配列番号３で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド；
（２）配列番号４で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドとは異なる標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド；及び
（３）前記標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能なパートナーが結合された着色粒子を保持し、しかも、もう一方の標識物質に特異的に結合可能なパートナーが固定化されているイムノクロマトグラフ用ストリップを含む、ポルフィロモナス・ジンジバリスの分析用キット。 - （１）配列番号３で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド；
（２）配列番号４で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドとは異なる標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド；及び
（３）前記標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能なパートナーと、もう一方の標識物質に特異的に結合可能なパートナーとを担持したラテックス懸濁液
を含む、ポルフィロモナス・ジンジバリスの分析用キット。 - （１）配列番号３で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド；
（２）配列番号４で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドと同種の標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド；及び
（３）前記標識物質に特異的に結合可能なパートナーを担持したラテックス懸濁液
を含む、ポルフィロモナス・ジンジバリスの分析用キット。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009165371A (ja) * | 2008-01-11 | 2009-07-30 | Univ Of Tokushima | 二重標識融合ｐｃｒイムノクロマトグラフィー |
| CN114174528A (zh) * | 2019-08-07 | 2022-03-11 | 学校法人东京齿科大学 | 判别方法、荧光测定装置和检查剂 |
-
2002
- 2002-11-07 JP JP2002324275A patent/JP2004154073A/ja active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JP2009165371A (ja) * | 2008-01-11 | 2009-07-30 | Univ Of Tokushima | 二重標識融合ｐｃｒイムノクロマトグラフィー |
| CN114174528A (zh) * | 2019-08-07 | 2022-03-11 | 学校法人东京齿科大学 | 判别方法、荧光测定装置和检查剂 |
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