JP2004154074A - マイコバクテリウム・ツベルクローシスの分析方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】被検試料中に存在するミコバクテリウム・ツベルキュロシスを正確及び迅速に検出及び／又は同定することができる分析方法、並びにそれに用いることのできる新規プライマー及びプライマーセットを提供する。
【解決手段】前記分析方法は、被検試料と前記の新規プライマーセットとを用いてＤＮＡ断片を増幅する工程、及び前記ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物を分析する工程を含む。
【選択図】 なし
【解決手段】前記分析方法は、被検試料と前記の新規プライマーセットとを用いてＤＮＡ断片を増幅する工程、及び前記ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物を分析する工程を含む。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ；Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓと略称することがある）の分析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒト型結核菌（マイコバクテリウム・ツベルクローシス）は、ヒト結核疾患の原因となる感染因子であり、結核菌の感染経路の殆どは排菌患者からの飛沫による経気道感染である。ヒトの結核症は、結核菌による慢性炎症の結果である。その病因には宿主側の免疫反応が大きく関与している。「再興感染症」として結核が途上国又は先進国のいずれにおいても注目を集めている。国内でも最近、学校や老人ホームで集団発生が見られ、結核菌の多量排菌患者が老人、若年者、及び外国人で特に増加しており、結核感染者は、約１０万人いる。また、非結核性の抗酸菌感染症は、ＨＩＶ感染者などの日和見感染や呼吸器系の基礎疾患を持つ高齢者の二次感染症として発症している。
【０００３】
結核症の診断は、被検試料、主として患者の喀痰に含まれる結核菌を検出することで確定するが、例えば、塗抹標本の抗酸菌染色法、遺伝子検査法（ＰＣＲ法又はハイブリダイゼーション）、血清検査法（血清中の結核菌に対する抗体の有無）、又は培養法が行なわれている。結核菌は増殖速度が遅く、３〜４週間の培養期間が必要である。結核菌に感染しているかどうかを迅速検査で判明することができれば、感染の防止及び治療のために重要である。現在、結核に対する有効な治療薬としてイソニアジド、リファンピシン、エタンブトール、及びストレプトマイシンなどがあり、結核患者の早期発見及び早期治療により患者の結核菌が駆除され、治癒することができる。
【０００４】
結核菌のゲノム塩基配列はすでに解明されており、４，４１１，５２９塩基よりなることがわかっている〔「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」，（英国），１９９８年，第３９３巻，ｐ．５３７−５４４（非特許文献１）〕。また、その遺伝子数は、３，９００種類あると言われている。
ヒトに結核菌（マイコバクテリウム・ツベルクローシス）の呼吸器感染があった場合、１０人の内１人は、免疫力がなく結核を発症すると言われている。結核菌は、細胞の分裂速度が遅く、小川培地で培養してコロニーが確認できるまで３〜４週間かかる。ヒトに感染する抗酸菌としては、ヒト型結核菌マイコバクテリウム・ツベルクローシス及びウシ型結核菌マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）以外の結核菌群に、トリ型結核菌マイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、及びマイコバクテリウム・カンサシイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ）がある。
【０００５】
その他の非定型抗酸菌として、マイコバクテリウム・マリナム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ）、マイコバクテリウム・ゼノピイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｅｎｏｐｉｉ）、マイコバクテリウム・ガストリ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｓｔｒｉ）、マイコバクテリウム・スクロフラセウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、マイコバクテリウム・セロネイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｈｅｌｏｎｅｉ）、又はマイコバクテリウム・フォーチュイタム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）などがある。迅速な検査を行ない、結核菌なのか、あるいは、その他の抗酸菌かどうかを確認することは、結核の治療を進める上で重要である。なお、マイコバクテリウム・ツベルクローシスは、ムコールの多糖体膜があり、抗酸菌染色で染まる桿菌である。
【０００６】
結核症の診断は、患者検査試料（例えば、喀痰、血液、胸腹水、髄液、便、尿、生検組織、又は結核菌の培養液など）から結核菌を検出することで確定するが、結核菌は増殖速度が遅く、培養して結果が判明するまでに３〜４週間の期間が必要である。
結核菌の排菌の有無を調べる検査として、例えば、患者喀痰を塗抹した標本の抗酸菌染色検査、培養検査、遺伝子検査（ＤＮＡプローブ法やＰＣＲ法）、又は患者血清中に存在する結核菌に対する抗体検査などが行なわれている。
【０００７】
抗酸菌染色検査は、喀痰の染色及び鏡検で迅速な検査ができるが、結核菌と非定型抗酸菌（例えば、マイコバクテリウム・アビウムなど）を区別することができない。また、血清検査でも、同様に結核菌なのか非定型抗酸菌（例えば、ミコバクテリウム・アビウムなど）を区別することができない。従って、結核の疑いのある患者を治療する場合、迅速な検査法として、抗酸菌検査患者の喀痰に排菌される結核菌を確認するため、結核菌か非結核性の非定型抗酸菌かどうかを遺伝子検査法による同定法が行なわれているが、簡易且つ迅速な同定検査法の開発が望まれている。
【０００８】
近年、結核患者検体の迅速性検査法として、患者検査材料から遺伝子を抽出し、結核菌に特異的な遺伝子の一部をＰＣＲ法で増幅し、その生成物を電気泳動した後、標識ＤＮＡプローブとハイブリダイズすることによりＥＬＩＳＡ法を用いた結核菌の同定検査が行なわれている。この場合、結果が出るまでに５〜６時間かかる。
患者の喀痰中に結核菌が存在しているかどうかを調べる目的で、結核菌の迅速診断法として遺伝子診断法が研究されているが、より簡便な診断法に対する関心は依然として高い。
【０００９】
【非特許文献１】
「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」，（英国），１９９８年，第３９３巻，ｐ．５３７−５４４
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、被検試料中に存在するミコバクテリウム・ツベルキュロシスを正確及び迅速に検出及び／又は同定することができる分析方法、並びにそれに用いることのできる新規プライマー及びプライマーセットを提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
前記課題は、本発明による、配列番号３〜６で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドにより解決することができる。
また、本発明は、配列番号３で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号４で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとからなるか、あるいは、配列番号５で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号６で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとからなる、プライマーセットに関する。
また、本発明は、配列番号７又は８で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドに関する。
【００１２】
また、本発明は、（１）（ａ）マイコバクテリウム・ツベルクローシスを含有する可能性のある被検試料、及び
（ｂ）配列番号３で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号４で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーとの組み合わせ、あるいは、配列番号５で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号６で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーとの組み合わせ
を用いて、ＤＮＡ断片を増幅する工程；並びに
（２）前記ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物を分析する工程
を含む、マイコバクテリウム・ツベルクローシスの分析方法に関する。
また、本発明は、（１）（ａ）マイコバクテリウム・ツベルクローシスを含有する可能性のある被検試料、及び
（ｂ）配列番号３で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドと、配列番号４で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドと同種又は異種の標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドとの組み合わせ、あるいは、配列番号５で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドと、配列番号６で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドと同種又は異種の標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドとの組み合わせ
を用いて、ＤＮＡ断片を増幅する工程；並びに
（２）前記ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物を、前記の各標識物質にそれぞれ特異的に結合可能なパートナーを用いて分析する工程
を含む、マイコバクテリウム・ツベルクローシスの分析方法に関する。
また、本発明は、（１）配列番号３で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドと、配列番号４で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドとは異なる標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドとの組み合わせ、あるいは、配列番号５で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドと、配列番号６で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドとは異なる標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドとの組み合わせ；及び
（２）前記標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能なパートナーが結合された着色粒子を保持し、しかも、もう一方の標識物質に特異的に結合可能なパートナーが固定化されているイムノクロマトグラフ用ストリップ
を含む、マイコバクテリウム・ツベルクローシスの分析用キットに関する。
また、本発明は、（１）配列番号３で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドと、配列番号４で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドとは異なる標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドとの組み合わせ、あるいは、配列番号５で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドと、配列番号６で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドとは異なる標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドとの組み合わせ；及び
（２）前記標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能なパートナーと、もう一方の標識物質に特異的に結合可能なパートナーとを担持したラテックス懸濁液
を含む、マイコバクテリウム・ツベルクローシスの分析用キットに関する。
また、本発明は、（１）配列番号３で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドと、配列番号４で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドと同種の標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドとの組み合わせ、あるいは、配列番号５で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドと、配列番号６で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドと同種の標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドとの組み合わせ；及び
（２）前記標識物質に特異的に結合可能なパートナーを担持したラテックス懸濁液
を含む、マイコバクテリウム・ツベルクローシスの分析用キットに関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
〔１〕本発明のオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド
本発明のオリゴヌクレオチドには、
配列番号３で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、
配列番号４で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、
配列番号５で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び
配列番号６で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
が含まれ、
配列番号３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又は
配列番号６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
が好ましい。
【００１４】
本発明のオリゴヌクレオチドである、配列番号３で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド）と配列番号４で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド）との組み合わせ、あるいは、配列番号５で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド）と配列番号６で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド）との組み合わせを、フォワードプライマー及びリバースプライマーとして用いてＰＣＲを実施することにより、マイコバクテリウム・ツベルクローシスの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子断片（例えば、配列番号７又は８で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド）を増幅することができる。配列番号７又は８で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド（好ましくは、配列番号７又は８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド）も、本発明の範囲に含まれる。なお、本明細書における用語「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方が含まれる。
【００１５】
マイコバクテリウム・ツベルクローシス菌のゲノム遺伝子は、４．１×１０６ｂｐである。また、リボゾームＲＮＡは、ウイルスを除く全生物種に存在し、細菌の分類に約１，５００ｂｐの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列が用いられている。なお、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域から全ての細菌に共通に使用できるユニバーサルプライマーを設計すれば、全ての細菌由来のＤＮＡを増幅することが可能となる。好気性菌については、既に、ユニバーサルプライマーを用いてＰＣＲ増幅した生成物を制限酵素で切断して同定する方法が報告されている（Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，３８，２０７６−２０８０，２０００）。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の約１，５００ｂｐの塩基配列の内、８００〜１，０００ｂｐの塩基配列を用いて細菌の系統分類ができることが報告されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８２，６９５５−６９５９，１９８５）。
マイコバクテリウム・ツベルクローシス菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、又は１６ＳリボゾームＲＮＡをターゲットにした遺伝子に関して、ユニバーサルプライマーとして配列番号１で表される塩基配列からなるプライマー及び配列番号２で表される塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ法で増幅し、１，５００ｂｐの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子断片を取得することができる。
【００１６】
本発明のオリゴヌクレオチドである、配列番号３で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号４で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとの組み合わせ、あるいは、配列番号５で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号６で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとの組み合わせを用いたＰＣＲ法で増幅するＤＮＡは、マイコバクテリウム・ツベルクローシス菌のみであり、その他の菌種は、増幅しない。
【００１７】
本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号３で表される塩基配列（塩基数＝１６）、配列番号４で表される塩基配列（塩基数＝１５）、配列番号５で表される塩基配列（塩基数＝１５）、又は配列番号６で表される塩基配列（塩基数＝１５）を含み、ＰＣＲにおけるプライマーと使用した場合にマイコバクテリウム・ツベルクローシスを特異的に増幅可能である限り、その塩基数は特に限定されるものではないが、例えば、１５塩基〜４０塩基であることが好ましく、１５塩基〜２０塩基であることがより好ましい。
【００１８】
本発明のオリゴヌクレオチドは、その５’末端が標識物質で標識化されていることが好ましい。前記標識物質は、ＰＣＲに影響を与えることがなく、しかも、その標識物質に特異的に結合可能なパートナーが存在する限り、特に限定されるものではなく、例えば、プライマーの標識化に一般的に用いられる公知の標識物質を使用することができる。このような標識物質としては、例えば、蛍光物質〔例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ジゴキシゲニン、ビオチン等を挙げることができる。これらの標識物質に特異的に結合可能なパートナーとしては、標識物質に対する抗体（ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含む）又はその抗体フラグメント〔例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ等〕を挙げることができる。また、ビオチンに特異的に結合可能なパートナーとしては、抗ビオチン抗体又はそのフラグメント以外にも、例えば、アビジン又はストレプトアビジンを挙げることができる。
【００１９】
〔２〕本発明の分析方法及び分析用キット
本発明の分析方法は、
（１）（ａ）マイコバクテリウム・ツベルクローシスを含有する可能性のある被検試料、及び
（ｂ）配列番号３で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号４で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーとの組み合わせ、あるいは、配列番号５で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号６で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーとの組み合わせ
を用いて、ＤＮＡ断片を増幅する工程（ＤＮＡ増幅工程）；並びに
（２）前記ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物を分析する工程（分析工程）
を含む。
【００２０】
本発明の分析方法で分析することのできる被検試料は、マイコバクテリウム・ツベルクローシスを含有する可能性のある試料である限り、特に限定されるものではないが、例えば、喀痰、血液、胸腹水、髄液、便、尿、生検組織、又は結核菌の培養液などを挙げることができる。これらの被検試料を、そのまま、本発明の分析方法で分析することもできるが、これらの試料から抗酸菌のみを検出するために、検査材料の均一化及び雑菌の死滅を目的に前処理を行なうことが好ましい。特に喀痰は、喀痰中の細菌の分布が不均一なために、まず均一化を行なう必要がある。この方法として、（１）Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、（２）ジチオスレイトール、（３）弱アルカリプロテアーゼ（スプーターザイム）、（４）強アルカリ若しくは弱アルカリ処理する方法、又は（５）界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ２０又はＮＰ４０）などを挙げることができる。
【００２１】
前記ＤＮＡ増幅工程は、プライマーセットとして、本発明のオリゴヌクレオチドである、配列番号３で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号４で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーとの組み合わせ、あるいは、配列番号５で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号６で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーとの組み合わせを用いること以外は、例えば、通常のＰＣＲ法に従って実施することができる。
【００２２】
本発明の分析方法で用いる各プライマーは、その５’末端が同種又は異種の標識物質で標識化されたオリゴヌクレオチドであることもできるし、あるいは、標識化されていないオリゴヌクレオチドであることもできる。
各プライマーの５’末端が同種又は異種の標識物質で標識化されたオリゴヌクレオチドを用いると、分析工程において、前記標識物質に特異的に結合可能なパートナーを用いる分析方法（例えば、イムノクロマトグラフ法、ラテックス凝集法、又はサンドイッチ法など）を用いることができるため、好ましい。電気泳動法を用いることなく、簡易且つ迅速に検出・同定することができるからである。
【００２３】
なお、標識物質として同種又は異種の標識物質を用いるかは、後述の分析工程の説明の際に詳述するように、分析工程において利用する分析手法により、適宜決定することができる。
例えば、分析工程における分析手法として、ラテックス凝集法又はサンドイッチ法を利用する場合には、同種の標識物質を用いることもできるし、あるいは、異種の標識物質を用いることもできる。一方、分析工程における分析手法として、イムノクロマトグラフ法を利用する場合には、その実施形態により、利用可能な標識物質の種類が制限されることがあり、異種の標識物質を用いることが必要な場合がある。
【００２４】
前記分析工程では、前記ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物を分析する。反応生成物の分析方法としては、ＰＣＲ産物の分析に用いられる通常の分析方法を用いることができ、例えば、分子生物学的手法、あるいは、標識物質に特異的に結合可能なパートナーを用いる分析方法（例えば、イムノクロマトグラフ法、ラテックス凝集法、又はサンドイッチ法など）等を挙げることができる。なお、前記ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物は、そのまま直接、あるいは、適当な処理を行なった処理物（例えば、適当に希釈又は濃縮した希釈物又は濃縮物）として、分析工程にかけることができる。
【００２５】
分子生物学的手法を用いる場合には、例えば、ゲル（例えば、アガロースゲル）電気泳動を実施した後、そのゲルをそのまま、あるいは、メンブレンに転写し、予想されるＤＮＡサイズを有するバンドの有無により、あるいは、プローブとのハイブリダイズの有無により、ＤＮＡ増幅工程においてマイコバクテリウム・ツベルクローシスの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子断片が生成したか否かを決定することができ、更には、被検試料中にマイコバクテリウム・ツベルクローシスが存在することを決定することができる。
なお、分析工程において分子生物学的手法を用いる場合には、ＤＮＡ増幅工程で用いる各プライマーは、その５’末端が各々異なる標識物質で標識化されたオリゴヌクレオチドであることもできるし、あるいは、標識化されていないオリゴヌクレオチドであることもできる。
【００２６】
一方、分析工程において、標識物質に特異的に結合可能なパートナーを用いる分析方法を用いる場合には、ＤＮＡ増幅工程で用いる各プライマーとして、その５’末端がが同種又は異種の標識物質で標識化されたオリゴヌクレオチドを用いる。以下、本発明の分析方法において、分析工程で、標識物質に特異的に結合可能なパートナーを用いる分析方法を用いる態様を、特に、本発明の結合パートナー型分析方法と称する。
本発明の結合パートナー型分析方法において、分析工程における分析手法として、イムノクロマトグラフ法、ラテックス凝集法、及びサンドイッチ法を利用する各態様について、以下、この順序に従って説明する。
【００２７】
本発明の結合パートナー型分析方法において、分析工程における分析手法として、イムノクロマトグラフ法を用いる場合には、例えば、イムノクロマトグラフ用ストリップとして、プライマーの標識化に用いた２種類の標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能なパートナーが結合された着色粒子（すなわち、着色粒子コンジュゲート）を、固相担体に保持し、しかも、もう一方の標識物質に特異的に結合可能なパートナーが、前記固相担体に固定化（すなわち、固相化）されているイムノクロマトグラフ用ストリップを使用することができる。
【００２８】
前記固相担体としては、例えば、ニトロセルロース、セルロースアセテート、又はガラス繊維フィルター等を用いることができる。
前記着色粒子としては、例えば、金属コロイド（例えば、金コロイド等）、非金属コロイド（例えば、ポリスチレンコロイド等）、又はリポゾーム等を用いることができる。
標識物質に特異的に結合可能なパートナーとしては、例えば、標識物質に対する抗体（ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含む）又はその抗体フラグメント〔例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ等〕を用いることができる。また、ビオチンに特異的に結合可能なパートナーとしては、抗ビオチン抗体又はそのフラグメント以外にも、例えば、アビジン又はストレプトアビジンを挙げることができる。以下、固相担体に固定化させる前記パートナーを「固定化用パートナー」と称し、着色粒子に結合させ、着色粒子コンジュゲートとして固相担体に保持させる前記パートナーを「保持用パートナー」と称する。
【００２９】
本発明の結合パートナー型分析方法で用いることのできる前記イムノクロマトグラフ用ストリップでは、被検試料の展開方向に関して、上流側に、着色粒子コンジュゲートの保持領域（例えば、塗布領域）を設け、下流側に、固定化用パートナーの固定領域を設ける。固定化用パートナー（例えば、抗体）の固相への結合は、例えば、約１μｇ／ｍＬの抗体溶液を固相担体に加え、室温放置することにより行なうことができる。タンパク質の非特異的吸着をブロックするために、例えば、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）でブロッキングすることが好ましい。
なお、陰性コントロールとして、例えば、マウスＩｇＧ又はウサギＩｇＧを固定する領域は、固定化用パートナーの固定領域の更に下流側に設けることもできるし、設けないでおくこともできるが、検査を正確にするためには設ける方が好ましい。
【００３０】
イムノクロマトグラフ法を用いる本発明の結合パートナー型分析方法では、固相担体に固定化された固定化用パートナーと、固相担体に保持された着色粒子コンジュゲートとを介して、ＤＮＡ増幅工程で増幅した二重標識ＤＮＡ生成物を検出する。担体の役割は、被検出物（二重標識ＤＮＡ生成物）と着色粒子コンジュゲートとを展開し、固定化された固定化用パートナーと反応させ、更に、未反応物を分離することにある。
【００３１】
より具体的には、クロマトグラフ用ストリップの着色粒子コンジュゲートを塗布した側の端に、ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物又はその処理物（例えば、希釈物又は濃縮物）が接触すると、この水溶液はクロマトグラフ用ストリップに吸収及び展開され、先端に向かって浸透する。前記接触方法としては、例えば、被検試料滴下部位に滴下する方法、あるいは、容器（例えば、ウェル）内の被検試料を吸着する方法などを挙げることができる。着色粒子コンジュゲートを塗布した領域に達すると、二重標識ＤＮＡ生成物は、保持用パートナーを介して着色粒子コンジュゲートと結合し、更にクロマトグラフ用ストリップ上を移動する。そして、この二重標識ＤＮＡ生成物と着色粒子コンジュゲートとの複合体が、固定化用パートナーを固定した領域に達すると、二重標識ＤＮＡ生成物は、この固定化用パートナーに結合し、トラップされる。その結果、二重標識ＤＮＡ生成物と着色粒子コンジュゲートとの複合体は、この領域で停止し、これ以上移動しない。イムノクロマトグラフ法を利用する本発明の結合パートナー型分析方法では、この着色粒子の担体上での集積を目視により観察することにより、ＤＮＡ増幅工程においてマイコバクテリウム・ツベルクローシスの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子断片が生成したか否かを決定することができ、更には、被検試料中にマイコバクテリウム・ツベルクローシスが存在すること（すなわち、被検試料の陽性又は陰性）を判定することができる。
【００３２】
なお、このように、着色粒子コンジュゲートを保持し、しかも、固定化用パートナーが固定化されているイムノクロマトグラフ用ストリップを用いる場合には、２個１組のプライマーセットを標識化する標識物質として、異種の標識物質を用いることが必要である。仮に、両プライマーが同種の標識物質で標識化されていると、二重標識ＤＮＡ生成物が着色粒子コンジュゲート保持領域を通過し、両者の複合体を形成した際に、二重標識ＤＮＡ生成物におけるパートナー結合部位が、全て、着色粒子コンジュゲートとの結合に使用されてしまい、二重標識ＤＮＡ生成物と着色粒子コンジュゲートとの複合体が、固定化用パートナーを固定した領域に達しても、固定化用パートナーとの結合部位が残っていないことがあるからである。
【００３３】
従って、イムノクロマトグラフ法を利用し、しかも、２個１組のプライマーセットを標識化する標識物質として同種の標識物質を用いた場合には、例えば、固定化用パートナーが固定化されているが、着色粒子コンジュゲートを保持しないイムノクロマトグラフ用ストリップを用いて、ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物又はその処理物を展開する第１工程を実施した後、着色粒子コンジュゲートを展開する第２工程を実施する必要がある。この場合、第１工程が終了した時点で、ストリップ上の固定化用パートナー固定化領域に、一方の標識物質が未反応の状態で二重標識ＤＮＡ生成物が結合し、第２工程において、その未反応の標識物質に、着色粒子コンジュゲートが結合することができる。
【００３４】
本発明の結合パートナー型分析方法において、分析工程における分析手法として、ラテックス凝集法を用いる場合には、ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物と接触させるラテックス懸濁液として、プライマーを標識化するのに用いた標識物質に特異的に結合可能なパートナーを担持したラテックス懸濁液を用いること以外は、通常のラテックス凝集法をそのまま適用して実施することができる。
ラテックス凝集法を用いる場合には、２個１組のプライマーセットに対して用いる標識物質の種類は、同種（すなわち、１種類）であることもできるし、あるいは、異種（すなわち、２種類）であることもできる。同種であると、競合が生じて凝集度に影響を与える可能性があるため、異種の標識物質を用いることが好ましい。
【００３５】
２個１組のプライマーセットを標識化する標識物質として、異種の標識物質を用いる場合には、それらの２種類の標識物質に、それぞれ、特異的に結合可能な２種類のパートナー（すなわち、一方の標識物質に特異的に結合可能なパートナーと、もう一方の標識物質に特異的に結合可能なパートナー）を担持したラテックス懸濁液を使用する。一方、２個１組のプライマーセットを標識化する標識物質として、同種の標識物質を用いる場合には、その１種類の標識物質に特異的に結合可能なパートナーを担持したラテックス懸濁液を使用する。
【００３６】
ラテックスとしては、通常の免疫分析用試薬に使用可能なラテックスである限り、特に限定されるものではなく、例えば、ポリスチレン、又はスチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体などを挙げることができる。ラテックスの平均粒径は、測定対象物の検出濃度又は測定機器によって適宜選択することができ、例えば、０．０５〜０．５μｍであることができる。
２種類のパートナーを用いる場合には、それらをラテックス上に担持させる形態としては、例えば、２種類のパートナーを混合した状態で、同一のラテックス上に担持させることもできるし、あるいは、２種類のパートナーを、それぞれ、別々のラテックス上に担持させることもできる。
パートナーを担持するラテックス懸濁液は、公知方法、例えば、物理的又は化学的結合により感作させることにより、調製することができる。
【００３７】
ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物又はその処理物（例えば、希釈物又は濃縮物）と、前記ラテックス懸濁液とを接触させると、前記反応生成物中に二重標識ＤＮＡ生成物が存在する場合には、特異的結合反応（例えば、抗原抗体反応）により凝集が生じる。
例えば、抗原抗体反応の条件は、通常の免疫学的ラテックス比濁分析方法の実施条件と同様であることができ、例えば、反応のｐＨは、６〜８．５で実施することができる。反応温度は０〜５０℃であることが好ましく、２０〜４０℃がより好ましい。反応時間は、適宜決定することができ、例えば、汎用自動分析機では１０〜１５分間で測定を完了することができる。
【００３８】
特異的結合反応（例えば、抗原抗体反応）により生じた凝集の程度は、公知の分析方法、例えば、光学的分析方法により分析することができる。前記光学的分析方法としては、例えば、反応液に光を照射して散乱光又は透過光を分析する方法を挙げることができ、より具体的には、散乱光強度、吸光度、又は透過光強度を測定する光学機器を用いて分析を行なうことができる。好ましい測定波長は３００〜８００ｎｍである。前記光学機器を用いた分析では、公知の方法に従って、用いるラテックス粒子の大きさ及び／又は濃度の選択、並びに反応時間の設定により、散乱光強度、吸光度、又は透過光強度の増加又は減少を測定することにより実施することができる。また、これらの方法を併用することも可能である。ラテックス凝集法を利用する本発明の結合パートナー型分析方法では、ラテックスの凝集の程度を観察することにより、ＤＮＡ増幅工程においてマイコバクテリウム・ツベルクローシスの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子断片が生成したか否かを決定することができ、更には、被検試料中にマイコバクテリウム・ツベルクローシスが存在すること（すなわち、被検試料の陽性又は陰性）を判定することができる。
【００３９】
本発明の結合パートナー型分析方法において、分析工程における分析手法として、サンドイッチ法を用いる場合には、分析対象化合物に対する抗体の代わりに、プライマーを標識化するのに用いた標識物質に特異的に結合可能なパートナーを用いること以外は、通常のサンドイッチ法をそのまま適用して実施することができる。
２個１組のプライマーセットを標識化する標識物質として、異種の標識物質を用いる場合には、それらの２種類の標識物質に、それぞれ、特異的に結合可能な２種類のパートナーを使用する。一方、２個１組のプライマーセットを標識化する標識物質として、同種の標識物質を用いる場合には、その１種類の標識物質に特異的に結合可能なパートナーを使用する。
【００４０】
具体的には、例えば、プライマーの標識化に用いた２種類の標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能な第１のパートナーを、適当な不溶性担体に固定化する。次に、不溶性担体と体液試料との非特異的結合を避けるために、適当なブロッキング剤〔例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）やゼラチン等〕で不溶性担体の表面を被覆する。続いて、ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物又はその処理物（例えば、希釈物又は濃縮物）を加えて一定時間（例えば、５分〜３時間）及び一定温度（例えば、４℃〜４０℃、好ましくは室温付近）で接触させ、反応させる（１次反応）。続いて、プライマーの標識化に用いた２種類の標識物質の残る一方に特異的に結合可能な第２のパートナーに標識物質を付した標識化第２パートナーを加えて一定時間（例えば、５分〜３時間）及び一定温度（例えば、４℃〜４０℃、好ましくは室温付近）で接触させ、反応させる（２次反応）。これを適当な洗浄液（例えば、界面活性剤を含む生理食塩水）で洗浄してから、不溶性担体上に存在する標識化第２パートナーの量を定量する。その値から、ＤＮＡ増幅工程においてマイコバクテリウム・ツベルクローシスの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子断片が生成したか否かを決定することができ、更には、被検試料中にマイコバクテリウム・ツベルクローシスが存在すること（すなわち、被検試料の陽性又は陰性）を判定することができる。
２個１組のプライマーセットを標識化する標識物質として、同種の標識物質を用いる場合には、前記第１及び第２パートナーに代えて、その１種類の標識物質に特異的に結合可能なパートナーを用いること以外は、同様にして実施することができる。また、１次反応と２次反応とを同時に行なうことも可能である。
【００４１】
前記不溶性担体としては、例えば、高分子（例えば、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、又はポリサッカライド等）、ニトロセルロース、紙、若しくはアガロース、又はこれらの組み合わせ等を例示することができる。
第２パートナーに付す標識物質としては、例えば、酵素、蛍光物質、又は発光物質を挙げることができる。酵素としては、例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、又はβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ等、また、蛍光物質としては、例えば、フルオレセインイソチオシアネート等、また、発光物質としては、例えば、アクリジニウムエステル又はルシフェリン等を使用することができる。
【００４２】
本発明の分析用キットには、分析工程における分析手法としてイムノクロマトグラフ法を利用する本発明の結合パートナー型分析方法に用いることのできる分析用キット（以下、イムノクロマトグラフ型分析用キットと称する）と、分析工程における分析手法としてラテックス凝集法を利用する本発明の結合パートナー型分析方法に用いることのできる分析用キット（以下、ラテックス凝集型分析用キットと称する）とが含まれる。
【００４３】
本発明のイムノクロマトグラフ型分析用キットは、
（１）配列番号３で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号３で表される塩基配列からなり、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド）と、配列番号４で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドとは異なる標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号４で表される塩基配列からなり、前記オリゴヌクレオチドとは異なる標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド）との組み合わせ、あるいは、配列番号５で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号５で表される塩基配列からなり、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド）と、配列番号６で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドとは異なる標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号６で表される塩基配列からなり、前記オリゴヌクレオチドとは異なる標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド）との組み合わせ；及び
（２）前記標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能なパートナーが結合された着色粒子を保持し、しかも、もう一方の標識物質に特異的に結合可能なパートナーが固定化されているイムノクロマトグラフ用ストリップ
を含む。
【００４４】
本発明のラテックス凝集型分析用キットは、
（１）配列番号３で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号３で表される塩基配列からなり、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド）と、配列番号４で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドとは異なる標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号４で表される塩基配列からなり、前記オリゴヌクレオチドとは異なる標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド）との組み合わせ、あるいは、配列番号５で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号５で表される塩基配列からなり、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド）と、配列番号６で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドとは異なる標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号６で表される塩基配列からなり、前記オリゴヌクレオチドとは異なる標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド）との組み合わせ；及び
（２）前記標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能なパートナーと、もう一方の標識物質に特異的に結合可能なパートナーとを担持したラテックス懸濁液を含むか、あるいは、
（１）配列番号３で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号３で表される塩基配列からなり、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド）と、配列番号４で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドと同種の標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号４で表される塩基配列からなり、前記オリゴヌクレオチドと同種の標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド）との組み合わせ、あるいは、配列番号５で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号５で表される塩基配列からなり、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド）と、配列番号６で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドと同種の標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号６で表される塩基配列からなり、前記オリゴヌクレオチドと同種の標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド）との組み合わせ；及び
（２）前記標識物質に特異的に結合可能なパートナーを担持したラテックス懸濁液
を含む。
【００４５】
以下、プライマーセットとして、配列番号３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組み合わせを用いる、本発明の具体的な実施手順の一例を示し、本発明をより具体的に説明する。
１）プローブの設計
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のクローニング用プライマーとして、配列表の配列番号１及び２で表される各塩基配列を設計する。その１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列をジデオキシ法で決定する。
標識化合物として５’−末端にＦＩＴＣ又はビオチンを付加する。具体的には、配列表の配列番号３及び４で表される各塩基配列を設計し、その遺伝子増幅生成物の塩基配列として配列表の配列番号７で表される塩基配列を決定する。
【００４６】
２）ＤＮＡの合成
３８１型ＤＮＡ自動合成装置（アプライドバイオシステムズ社）を用いて常法により、配列表に記載した配列で表されるオリゴＤＮＡを４種類合成する（以下、配列番号１〜４と称する）。ＤＮＡのプライマーとして、配列番号１〜４で表される塩基配列からなるＤＮＡは、マイコバクテリウム・ツベルクローシス菌の１６Ｓ ｒＲＮＡの鋳型特異的なプライマーである。
なお、配列番号３で表される塩基配列の５’末端にＦＩＴＣを含む塩基数１６個からなるオリゴＤＮＡ、及び配列番号４で表される塩基配列の５’末端にビオチンを含む塩基数１５個からなるオリゴＤＮＡを合成する。
【００４７】
３）ＰＣＲ法によるＤＮＡ生成物の確認
マイコバクテリウム・ツベルクローシス菌から調製したＤＮＡを用いて、ＰＣＲ装置で９５℃で熱変性し、前記のプライマー（配列番号１及び２）を添加すると、１６Ｓ ＤＮＡに特異的に結合する。
次に、ＤＮＡポリメラーゼ、特には耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ：Ｒｏｃｈｅ社、又はＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ）を添加し、以下のＰＣＲ法による増幅サイクルを行なう。
１サイクルは、（ａ）ＤＮＡの変性工程〔９４℃で２分間〕、（ｂ）１本鎖ＤＮＡとプライマーとのアニーリング工程〔５０℃で３０秒間〕、及び（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成工程〔７２℃で１分３０秒間〕からなり、１サイクル毎にＤＮＡ量は２倍に増幅されるが、このサイクルを３０回繰り返す。
【００４８】
４）プラスミドの作製
市販のプラスミドベクターｐＺＥｒＯ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を制限酵素ＥｃｏＲＶ（３７℃，２時間）で消化して、増幅したＰＣＲ産物がベクターに挿入できるようにする。この制限酵素で切断したベクター２．８ｋｂｐとＰＣＲにより合成した約１，５００ｂｐのＤＮＡをライゲーション・キット（宝酒造）を用いて、１６℃で３０分間反応させる。
【００４９】
５）大腸菌の形質転換
組み換えプラスミドと、市販の大腸菌ＤＨ５α株（宝酒造）を５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＣａＣｌ２で処理して作成したコンピテント細胞とを氷中で３０分間インキュベートし、４２℃で３０秒間熱処理した後、３７℃でＳＯＣ培地にて１時間培養する。この大腸菌を、５０μｇ／ｍＬゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）及び１ｍｍｏｌ／Ｌイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を含むＹＴ寒天平板上にまき、３７℃で一夜培養を行なう。
生じたゼオシン耐性で透明なコロニーを、各々新たな５０μｇ／ｍＬゼオシンを含むＹＴブロスで３７℃一夜培養をし、アルカリ溶菌法にてプラスミドＤＮＡを単離する（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
【００５０】
６）ＰＣＲ法による二重標識ＤＮＡ生成物の作製
前記で調製したＤＮＡを、ＰＣＲ装置において９５℃で熱変性し、前記プライマー（配列番号３及び４）を添加すると、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に特異的に結合する。
次に、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ製）又はＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡）を添加し、以下のＰＣＲ法による増幅サイクルを行なう。
１サイクルは、（ａ）ＤＮＡの変性工程〔９４℃で２分間〕、（ｂ）１本鎖ＤＮＡとプライマーとのアニーリング工程〔５０℃で３０秒間〕、及び（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成工程〔７２℃で３０秒間〕からなり、１サイクル毎にＤＮＡ量は２倍に増幅されるが、このサイクルを３０回繰り返す。
【００５１】
７）イムノクロマトグラフ用ストリップの作製
薄片状のクロマトグラフ基材（ニトロセルロース膜）の片方に金コロイド標識したストレプトアビジンを塗布し、他方に第２の抗ＦＩＴＣモノクローナル抗体を固定する。
抗ＦＩＴＣ抗体の固相への結合は、例えば、約１μｇ／ｍＬの抗体溶液をニトロセルロースに加え、室温放置することにより行なうことができる。タンパク質の非特異的吸着をブロックするために、１％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキングすることができる。
【００５２】
イムノクロマトグラフ法では、クロマトグラフ用ストリップの金コロイド標識ストレプトアビジンを塗布した側の端に、被検試料中のＰＣＲ法によるＤＮＡ生成物、又は希釈液が接すると、この水溶液はクロマトグラフ用ストリップに吸収及び展開され、先端に向かって浸透する。金コロイド標識ストレプトアビジンを塗布した領域に達すると、ＤＮＡ生成物は金コロイド標識ストレプトアビジンと結合し、更にクロマトグラフ用ストリップ上を移動する。そして、このＰＣＲ生成物と金コロイド標識結合物が、抗ＦＩＴＣ抗体を固定した領域に達すると、ＤＮＡ生成物はこの抗ＦＩＴＣ抗体に結合し、トラップされる。その結果、金コロイド標識結合物は、この領域で停止し、これ以上移動しない。イムノクロマトグラフ法では、この着色粒子の担体上での集積を目視により観察して、検体の陽性／陰性を判定する。
【００５３】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
《マイコバクテリウム・ツベルクローシス菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のクローニング》
本実施例では、市販のキット（Ｇｅｎとるくん；宝酒造製）を用いてマイコバクテリウム・ツベルクローシスの菌体からゲノムＤＮＡを単離した後、２種類のプライマーとして配列番号１及び配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡを用いてＰＣＲ法で１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅し、約１．５ｋｂｐのＤＮＡを得た。このＰＣＲ産物をプラスミドｐＺＥｒＯ−１のＥｃｏＲＶ サイトを利用して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合して組み換えプラスミドを作成した。各工程の手順は、以下に示す通りである。
【００５４】
（１）マイコバクテリウム・ツベルクローシスの培養
結核菌マイコバクテリウム・ツベルクローシスは、小川培地（極東製薬製）を用いて３〜４週間培養を行なった。
【００５５】
（２）合成ＤＮＡの作成
３８１型ＤＮＡ自動合成装置（アプライドバイオシステムズ社）を用いて常法により、６種類のプライマーＤＮＡ（配列番号１〜配列番号６）を合成した。配列番号３又は５で表される各塩基配列からなるプライマーＤＮＡの５’−末端は、各々ＦＩＴＣ標識ｄＧＴＰ又はＦＩＴＣ標識ｄＡＴＰを用い、配列番号４又は６で表される各塩基配列からなるプライマーＤＮＡの５’−末端は、ビオチン標識ｄＣＴＰを用いて合成した。
ユニバーサルプライマー１（配列番号１）及びユニバーサルプライマー２（配列番号２）の各塩基配列は、マイコバクテリウム・ツベルクローシス菌のゲノムＤＮＡの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅するものである。従って、プライマー１とプライマー２を用いてＰＣＲ法で増幅されるＤＮＡ生成物（Ｉ）は、１，５００塩基対である。
【００５６】
なお、前記ユニバーサルプライマー（配列番号１及び配列番号２）は、参考文献〔Ｌａｎｅ， Ｄ．Ｊ． （１９９１）． １６Ｓ／２３Ｓ ｒＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ． Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ． Ｅ． Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔ ａｎｄ Ｍ． Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ， ｅｄｓ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ： １１５−１７５〕のプライマー２７ｆ及びプライマー１４９２ｆを引用したものである。
また、マイコバクテリウム・ツベルクローシスの１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列としては、英国サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）研究所が公開している結核菌ゲノムの情報のＥＮＴＲＹ：ＭＴＵｒＲＮＡ０１で１６Ｓ ｒＲＮＡ（１４７１８４４−１４７３３８０）の１５３７塩基が掲載されているのを使用した。配列番号３で表される塩基配列は、その第７６番〜第９１番（１４７１９１９〜１４７１９３４）であり、配列番号４で表される塩基配列は、第２０５番〜第２１９番（１４７２０４８〜１４７２０６２）であり、配列番号５で表される塩基配列は、その第１２７１番〜第１２８５番（１４７３１１４〜１４７３１２８）であり、配列番号６で表される塩基配列は、第１４３７番〜第１４５１番（１４７３２８０〜１４７３２９４）である。また、配列番号１で表される塩基配列は、第１１番〜第３０番（１４７１８５４〜１４７１８７３）であり、配列番号２で表される塩基配列は、第１４８５番〜第１５０６番（１４７３３２８〜１４７３３４９）である。
【００５７】
（３）遺伝子の増幅
実施例１（１）で培養したマイコバクテリウム・ツベルクローシス菌から調製したゲノムＤＮＡと、実施例１（２）で合成したプライマー１及びプライマー２とを用いてＰＣＲを行なった。
１サイクルは、（ａ）ＤＮＡの変性工程〔９５℃で２分間〕、（ｂ）１本鎖ＤＮＡとプライマー（配列番号１及び２）とのアニーリング工程〔５０℃で３０秒間〕、及び（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成工程〔７２℃で１分３０秒間〕からなり、このサイクルを３０回繰り返した。
【００５８】
（４）組み換えプラスミドの作製
クローニングベクターとして、ｐＺＥｒＯ−１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いた。実施例１（３）で得られたＤＮＡ生成物（Ｉ）とｐＺＥｒＯ−１ベクターのＥｃｏＲＶサイトを利用して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合して組み換えプラスミドを作成した。
具体的には、ＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲル電気泳動で分離し、約１，５００ｂｐのバンドを切り取り、市販のカラム（ＧｅｎＥｌｕｔｅ ＡＧＡＲＯＳＥ ＳＰＩＮ ＣＯＬＵＭＮ；ＳＩＧＭＡ社）で精製した。ＤＮＡライゲーション・キット（宝酒造）を用いて、ＤＮＡ（Ｉ）３μＬとｐＺＥｒＯ−１ベクター（制限酵素ＥｃｏＲＶで処理したもの）１μＬとを加え、更にライゲーション溶液Ｉ（酵素液）４μＬを加えて１６℃で３０分間反応させ、ライゲーションを行ない、プラスミドＤＮＡ（ＩＩ）を作製した。
【００５９】
（５）形質転換
実施例１（４）で得られた組み換えＤＮＡを用いて、常法により形質転換を行なった。すなわち、５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＣａＣｌ２処理して作製したコンピテントセル（大腸菌ＤＨ５α株）にプラスミドＤＮＡを導入した。
【００６０】
（６）形質転換体に含まれる１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の単離
実施例１（５）で得られた形質転換体であるコロニーを、５０μｇ／ｍＬゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＹＴ−ブロスに接種し、３７℃で一夜培養を行なった。この培養液１．５ｍＬをエッペンドルフチューブに入れ、遠心分離で菌体を集め、アルカリ溶菌法にてプラスミドＤＮＡを単離した。
【００６１】
（７）塩基配列の決定
実施例１（６）で得られたＤＮＡと市販のキット（ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ；アプライドバイオシステムズ社）を用いてＰＣＲ反応を行ない、この反応溶液をＤＮＡシークエンサー装置（３７３Ａ−１８ ＤＮＡシークエンサー装置；アプライドバイオシステムズ製）にアプライし、ジデオキシ法で塩基配列を決定した。
【００６２】
【実施例２】
《１４４ｂｐ及び１８０ｂｐの各ＤＮＡ遺伝子の増幅》
本実施例では、実施例１で作製したマイコバクテリウム・ツベルクローシスのｒＲＮＡ遺伝子（１．５ｋｂｐ）を含むクローンからＤＮＡを単離し、２種類のプライマーセットとして、配列番号３及び配列番号４で表される各塩基配列からなるＤＮＡプライマーセット、並びに配列番号５及び配列番号６で表される各塩基配列からなるＤＮＡプライマーセットを用いて、ＰＣＲ法でＤＮＡ増幅を行ない、そのＰＣＲ生成物量及び塩基配列を確認した。
【００６３】
（１）遺伝子の増幅
実施例１で作製した１．５ｋｂｐのｒＲＮＡ遺伝子配列を含むプラスミドＤＮＡと、実施例１（２）で合成した２種類の標識プライマーセット、すなわち、プライマー３（配列番号３）及びプライマー４（配列番号４）との組み合わせ、又はプライマー５（配列番号５）及びプライマー６（配列番号６）との組み合わせをそれぞれ用いてＰＣＲを行なった。
１サイクルは、（ａ）ＤＮＡの変性工程〔９５℃で２分間〕、（ｂ）１本鎖ＤＮＡとプライマー（配列番号３及び４）とのアニーリング工程〔５０℃で３０秒間〕、及び（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成工程〔７２℃で３０秒間〕からなり、このサイクル数による二重標識ＰＣＲ生成物量を確認するため、１０回、１５回、２０回、及び３０回の反応を行なった。
【００６４】
（２）１４４ｂｐ及び１８０ｂｐの各ＤＮＡの精製
実施例２（１）で得られたマイコバクテリウム・ツベルクローシスのＰＣＲ生成物を１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にアプライし、ＤＮＡマーカー（φＸ１７４／ＨａｅＩＩＩ Ｄｉｇｅｓｔ；東洋紡）から判断し、１４４ｂｐバンド及び１８０ｂｐバンドに相応する各バンドを切り取り、市販のキット（ＤＮＡ Ｐｒｅｐ；ダイアヤトロン社）を用いてＤＮＡを精製した。
【００６５】
（３）塩基配列の決定
実施例２（２）で得られたマイコバクテリウム・ツベルクローシスのＤＮＡと市販のキット（ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ；アプライドバイオシステムズ社）を用いてＰＣＲ反応を行ない、この反応溶液をＤＮＡシークエンサー装置（３７３Ａ−１８ ＤＮＡシークエンサー装置；アプライドバイオシステムズ製）にアプライし、ジデオキシ法で塩基配列を決定した。
プライマー３（配列番号３）及びプライマー４（配列番号４）との組み合わせから得られた１４４ｂｐのＤＮＡバンドからは、配列番号７で表される塩基配列が得られ、プライマー５（配列番号５）及びプライマー６（配列番号６）との組み合わせから得られた１８０ｂｐのＤＮＡバンドからは、配列番号８で表される塩基配列が得られた。
【００６６】
【実施例３】
《各種菌体から単離したゲノムを用いたＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅》
本実施例では、実施例１で作製したマイコバクテリウム・ツベルクローシスのｒＲＮＡ遺伝子（１．５ｋｂｐ）を含むクローン、及び各種菌体（マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・アビウム、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、マイコバクテリウム・カンサシイ、及び大腸菌の培養菌株）からＤＮＡを単離し、２種類のプライマーセットとして、配列番号３及び配列番号４で表される各塩基配列からなるＤＮＡプライマーセット、並びに配列番号５及び配列番号６で表される各塩基配列からなるＤＮＡプライマーセットを用いてＰＣＲ法でＤＮＡ増幅を行なった。
【００６７】
（１）ＤＮＡの分離
小川培地上に生育した抗酸菌株（マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・アビウム、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、及びマイコバクテリウム・カンサシイ）のコロニーを坂口フラスコに取り、ガラスビーズで菌体をほぐした後、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した検体から、市販のＤＮＡ調製キット（Ｇｅｎとるくん；宝酒造製）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。
【００６８】
（２）遺伝子の増幅
実施例３（１）で得たＤＮＡと、実施例１（２）で合成した２種類の標識プライマーセット、すなわち、プライマー３（配列番号３）及びプライマー４（配列番号４）との組み合わせ、又はプライマー５（配列番号５）及びプライマー６（配列番号６）との組み合わせをそれぞれ用いてＰＣＲを行なった。
１サイクルは、（ａ）ＤＮＡの変性工程〔９５℃で２分間〕、（ｂ）１本鎖ＤＮＡとプライマー（配列番号３及び４）とのアニーリング工程〔５０℃で３０秒間〕、及び（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成工程〔７２℃で３０秒間〕からなり、このサイクルを３０回繰り返した。
【００６９】
（３）１４４ｂｐＤＮＡ及び１８０ｂｐＤＮＡの確認
実施例３（２）で得られたＰＣＲ生成物を１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にアプライし、ＤＮＡマーカー（φＸ１７４／ＨａｅＩＩＩ Ｄｉｇｅｓｔ；東洋紡）を指標として、１４４ｂｐのバンド及び１８０ｂｐのバンドの有無を確認した。
【００７０】
【実施例４】
《イムノクロマトグラフ用ストリップの作製》
本実施例では、ＰＣＲ生成物捕捉用抗体としてモノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体（ＺＹＭＥＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）又はポリクローナル抗ＦＩＴＣ抗体（ＺＹＭＥＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を、金コロイド標識物としてストレプトアビジン（ＴＲＩＮＡ Ｂｉｏｒｅａｃｔｉｖｅｓ製）を用いて、ＰＣＲ生成物測定用イムノクロマトグラフ用ストリップを作製した。
【００７１】
（１）イムノクロマトグラフ用メンブレンの作製
ポリアミド（ナイロン６６）製メンブレン（Ｉｍｍｕｎｏｄｙｎｅ ＡＢＣ，孔径＝３．０μｍ；Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を５ｍｍ×２０ｍｍのサイズに裁断した。
メンブレンの上流側の一端から８ｍｍの位置に、ＰＣＲ生成物の検出ゾーンとして、モノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体溶液又はポリクローナル抗ＦＩＴＣ抗体溶液〔各々濃度０．５ｍｇ／ｍＬ；５ｍｍｏｌ／Ｌホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）で希釈〕を幅１ｍｍの線状に塗布した。
また、メンブレンの上流側の一端から１３ｍｍの位置に、陰性コントロールゾーンとして、マウスＩｇＧ溶液〔濃度０．５ｍｇ／ｍＬ；５ｍｍｏｌ／Ｌホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）で希釈〕を、幅１ｍｍの線状に塗布した。
室温下で１時間、３７℃下で３０分間静置し、各々の抗体を固相化した。メンブレンを０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に浸し、室温及び相対湿度２０％以下の条件下で３０分間緩やかに振とうし、ブロッキングした。メンブレンの過剰のブロッキング液を除き、室温下で一夜静置し、乾燥させ、二重標識ＰＣＲ生成物のイムノクロマトグラフ法用抗体固相化メンブレンとした。
【００７２】
（２）金コロイド標識ストレプトアビジン懸濁液の作製
ストレプトアビジン（濃度１ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬを２ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｎａ２Ｂ４Ｏ７緩衝液（ｐＨ６．５）（以下、Ｂｏｒａｘ緩衝液と称する）３，０００ｍＬ中で４℃下で一夜透析した。ストレプトアビジン溶液は、４℃下、１００，０００×ｇで１時間遠心分離した後、その上清を、１００，０００×ｇで１時間遠心分離したＢｏｒａｘ緩衝液で１００μｇ／ｍＬとなるように希釈した。金コロイド液（ＧＯＬＤ ＣＯＬＬＯＩＤ ２０ｎｍ；Ｂｒｉｔｉｓｈ ＢｉｏＣｅｌｌＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ製）１００ｍＬを、０．２ｍｏｌ／Ｌ−Ｋ２ＣＯ３溶液及び０．２ｍｏｌ／Ｌ−Ｈ３ＰＯ４溶液でｐＨ６．５に調整した。金コロイド液２０ｍＬを撹拌しながら、希釈したストレプトアビジン溶液２ｍＬを徐々に滴下し、室温下で３０分間撹拌した。更に、撹拌しながら１０％ＢＳＡ溶液（ｐＨ９．０；４℃下、１００，０００×ｇで１時間遠心分離した上清）２．５ｍＬを滴下した後、室温下で３０分間撹拌した。１０℃下にて１６，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を除去した。沈殿した金コロイド標識ストレプトアビジンを、０．５％ショ糖を含むホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）（０．４５μｍフィルター濾過）２０ｍＬに再懸濁させ、１０℃下にて１６，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を除去した。更に、沈殿した金コロイド標識ストレプトアビジンを、０．５％ショ糖を含むホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）（０．４５μｍフィルター濾過）２０ｍＬに再懸濁させ、１０℃下にて１６，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を除去した。最後に、沈殿した金コロイド標識ストレプトアビジンを、０．５％ショ糖を含むホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８，０）（０．４５μｍフィルター濾過）に再懸濁させた後、波長５２０ｎｍにおける吸光度が約１０になるように濃度調整し、表面をシリコン処理したガラス試験管に移し、密栓し、４℃下に保存し、ＰＣＲ生成物のイムノクロマトグラフ法用金コロイド標識ストレプトアビジン懸濁液とした。
【００７３】
金コロイド標識ストレプトアビジン懸濁液は、波長５２０ｎｍにおける吸光度が３．０になるように、５．０％ショ糖を含む２ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．３）で希釈した後、その７μＬを、吸収パッドアキュウィックＡＷ１４−２０Ｔ４（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を５ｍｍ×５ｍｍのサイズに裁断したものに塗布し、シリカゲルデシケーター内で室温下、一夜減圧（≦５０ｍｍＨｇ）乾燥したものを、ＰＣＲ生成物のイムノクロマトグラフ法用金コロイド標識ストレプトアビジンパッドとした。
【００７４】
（３）イムノクロマトグラフ法用吸収パッドの作製
グラスファイバーパッド（タイプＡ／Ｂ；Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を５ｍｍ×１８ｍｍのサイズに裁断したものを、ＰＣＲ生成物のイムノクロマトグラフ法用試料添加パッドとした。グラスファイバーパッド（タイプＡ／Ｅ；Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を５ｍｍ×２５ｍｍのサイズに裁断したものを、ＰＣＲ生成物のイムノクロマトグラフ法用吸収パッドとした。
【００７５】
（４）イムノクロマトグラフ用ストリップ
５ｍｍ×６０ｍｍのサイズに裁断したプラスティック粘着シート（ＢｉｏＤｏｔ製）に、上流側より、試料添加パッド、金コロイド標識ストレプトアビジンパッド、抗体固相化メンブレン、及び吸収パッドの順に、各々その両端を隣接する部材と１ｍｍ重ね合わせて貼付し、ＰＣＲ生成物測定用イムノクロマトグラフ用ストリップとした。
【００７６】
【実施例５】
《イムノクロマトグラフ法によるＰＣＲ生成物の測定》
本実施例では、実施例４で作製したイムノクロマトグラフ用ストリップを用いて、ＰＣＲ生成物のイムノクロマトグラフ法を実施した。
【００７７】
（１）ＰＣＲ法のサイクル回数別によるＰＣＲ生成物の検出
実施例２（１）で使用した２種類の標識プライマー、すなわち、プライマー３（配列番号３）及びプライマー４（配列番号４）との組み合わせを用い、ＰＣＲ法のサイクル回数として、１０回、１５回、２０回、及び３０回の反応をそれぞれ行なった。これらのＰＣＲ反応液１０μＬと２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液９０μＬとを混合した溶液、及び２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ブランク試験）１００μＬを、水平に静置したイムノクロマトグラフ用ストリップの試料添加パッドに滴下し、室温下で１０分間展開した。
【００７８】
メンブレンのモノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体を固相化した部分、及び陰性コントロール抗体を固相化した部分の金コロイドの捕捉に基づく赤紫〜紫色の着色の有無を目視観察し、ＰＣＲ生成物の有無を判定した。モノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体固相化イムノクロマトグラフ用ストリップでのＰＣＲ生成物の測定結果を表１に示す。表１において、「−」は陰性、「＋」は弱陽性、「＋＋」は中陽性、「＋＋＋」は強陽性であることを示す。
今回行なったＰＣＲ法では、ＰＣＲのサイクル回数１０回では二重標識ＰＣＲ生成物が、まだ、あまり産生されておらず、イムノクロマトグラフ用ストリップで測定することができなかった。ＰＣＲのサイクル回数が１５回、２０回、及び３０回では、二重標識ＰＣＲ生成物をイムノクロマトグラフ用ストリップを用いて測定することができた。
【００７９】
【００８０】
（２）ＰＣＲ生成物の希釈溶液の測定
実施例５（１）においてＰＣＲ法のサイクル回数として３０回を行なった反応液を、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）で、１０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、及び１０００倍にそれぞれ希釈した溶液、並びに２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ブランク試験）の各１００μＬを水平に静置したイムノクロマトグラフ用ストリップの試料添加パッドに滴下し、室温下で１０分間展開した。
【００８１】
メンブレンのモノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体又はポリクローナル抗ＦＩＴＣ抗体を固相化した部分、及び陰性コントロール抗体を固相化した部分の金コロイドの捕捉に基づく赤紫〜紫色の着色の有無を目視観察し、ＰＣＲ生成物の有無を判定した。
表２に、モノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体を固相化したメンブレンを組み込んだＰＣＲ生成物測定用イムノクロマトグラフ用ストリップでの測定結果を示す。また、表３に、ポリクローナル抗ＦＩＴＣ抗体を固相化したメンブレンを組み込んだＰＣＲ生成物測定用イムノクロマトグラフ用ストリップでの測定結果を示す。表２及び表３において、「−」は陰性、「±」は擬陽性、「＋」は弱陽性、「＋＋」は中陽性、「＋＋＋」は強陽性であることを示す。
モノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体を固相化抗体に用いたＰＣＲ生成物測定用イムノクロマトグラフ用ストリップでは、元の被検液を５００倍希釈したものまで検出可能であり、ポリクローナル抗ＦＩＴＣ抗体を固相化したＰＣＲ生成物測定用イムノクロマトグラフ用ストリップでは、元の被検液を１，０００倍希釈したものまで検出可能であった。
【００８２】
【００８３】
【００８４】
（３）培養菌株を用いたＰＣＲ生成物の測定
実施例２（１）で使用した２種類の標識プライマー〔プライマー３（配列番号３）及びプライマー４（配列番号４）〕を用いて、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・アビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、マイコバクテリウム・カンサシイ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の培養菌株を用いて、同一のＰＣＲ反応を行なった。
これらのＰＣＲ反応液１０μＬと２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液９０μＬとを混合した溶液、及び２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ブランク試験）１００μＬを、水平に静置したイムノクロマトグラフ用ストリップの試料添加パッドに滴下し、同様に室温で１０分間展開した。
【００８５】
モノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体固相化イムノクロマトグラフ用ストリップでのＰＣＲ生成物の測定結果を表４に示す。表４において、「−」は陰性、「＋＋」は陽性であることを示す。このイムノクロマトグラフ用ストリップでマイコバクテリウム・ツベルクローシスのみに特異的に反応する結果が得られた。
【００８６】
【００８７】
（４）患者試料から得られたＰＣＲ生成物の測定
結核菌患者試料を用いて、実施例２（１）で使用した２種類の標識プライマー〔プライマー３（配列番号３）及びプライマー４（配列番号４）〕を用いて、ＰＣＲ反応を行なった。
これらのＰＣＲ反応液１０μＬと２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液９０μＬとを混合した溶液、及び２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ブランク試験）１００μＬを、水平に静置したイムノクロマトグラフ用ストリップの試料添加パッドに滴下し、同様に室温で１０分間展開した。
【００８８】
モノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体固相化イムノクロマトグラフ用ストリップでの患者検体を用いたＰＣＲ生成物の測定結果を表５に示す。表５において、「−」は陰性、「±」は擬陽性、「＋」は弱陽性、「＋＋」は中陽性であることを示す。
【００８９】
【００９０】
【発明の効果】
現在、国内で結核菌の迅速検査法として、患者検体から遺伝子を抽出し、結核菌に特異的な遺伝子をＰＣＲ法で増幅し、その生成物を電気泳動した後、ＤＮＡのサイズを確認する方法や標識ＤＮＡプローブとハイブリダイズすることにより結核菌の同定が行なわれている。また、結核菌が産生するナイアシンを測定する方法で、結核菌の感染の有無を調べる検査が行なわれている。従って、結核菌の同定を行うには、更に結核菌を培養して菌体を３〜４週間かけての培養が行なわれている。
【００９１】
本発明のオリゴヌクレオチド及び本発明の分析方法によれば、被検試料中に存在するマイコバクテリウム・ツベルクローシス菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子断片を、２種類の標識プライマーを用いてＰＣＲ法で増幅した後、その二重標識ＤＮＡ生成物を、例えば、分子生物学的手法又は免疫学的手法（特には、イムノクロマトグラフィー法）を用いて分析することにより、マイコバクテリウム・ツベルクローシス菌を特異的に検出することができる。また、前記二重標識ＤＮＡ生成物を免疫学的手法（特には、イムノクロマトグラフィー法）を用いて分析することにより、電気泳動法を用いることなく、簡易且つ迅速に検出・同定することができる。また、喀痰中に存在する菌数を半定量的に測定することができる。
【００９２】
【配列表】
【発明の属する技術分野】
本発明は、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ；Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓと略称することがある）の分析方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒト型結核菌（マイコバクテリウム・ツベルクローシス）は、ヒト結核疾患の原因となる感染因子であり、結核菌の感染経路の殆どは排菌患者からの飛沫による経気道感染である。ヒトの結核症は、結核菌による慢性炎症の結果である。その病因には宿主側の免疫反応が大きく関与している。「再興感染症」として結核が途上国又は先進国のいずれにおいても注目を集めている。国内でも最近、学校や老人ホームで集団発生が見られ、結核菌の多量排菌患者が老人、若年者、及び外国人で特に増加しており、結核感染者は、約１０万人いる。また、非結核性の抗酸菌感染症は、ＨＩＶ感染者などの日和見感染や呼吸器系の基礎疾患を持つ高齢者の二次感染症として発症している。
【０００３】
結核症の診断は、被検試料、主として患者の喀痰に含まれる結核菌を検出することで確定するが、例えば、塗抹標本の抗酸菌染色法、遺伝子検査法（ＰＣＲ法又はハイブリダイゼーション）、血清検査法（血清中の結核菌に対する抗体の有無）、又は培養法が行なわれている。結核菌は増殖速度が遅く、３〜４週間の培養期間が必要である。結核菌に感染しているかどうかを迅速検査で判明することができれば、感染の防止及び治療のために重要である。現在、結核に対する有効な治療薬としてイソニアジド、リファンピシン、エタンブトール、及びストレプトマイシンなどがあり、結核患者の早期発見及び早期治療により患者の結核菌が駆除され、治癒することができる。
【０００４】
結核菌のゲノム塩基配列はすでに解明されており、４，４１１，５２９塩基よりなることがわかっている〔「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」，（英国），１９９８年，第３９３巻，ｐ．５３７−５４４（非特許文献１）〕。また、その遺伝子数は、３，９００種類あると言われている。
ヒトに結核菌（マイコバクテリウム・ツベルクローシス）の呼吸器感染があった場合、１０人の内１人は、免疫力がなく結核を発症すると言われている。結核菌は、細胞の分裂速度が遅く、小川培地で培養してコロニーが確認できるまで３〜４週間かかる。ヒトに感染する抗酸菌としては、ヒト型結核菌マイコバクテリウム・ツベルクローシス及びウシ型結核菌マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）以外の結核菌群に、トリ型結核菌マイコバクテリウム・アビウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、及びマイコバクテリウム・カンサシイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ）がある。
【０００５】
その他の非定型抗酸菌として、マイコバクテリウム・マリナム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ）、マイコバクテリウム・ゼノピイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｅｎｏｐｉｉ）、マイコバクテリウム・ガストリ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇａｓｔｒｉ）、マイコバクテリウム・スクロフラセウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）、マイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、マイコバクテリウム・セロネイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｈｅｌｏｎｅｉ）、又はマイコバクテリウム・フォーチュイタム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）などがある。迅速な検査を行ない、結核菌なのか、あるいは、その他の抗酸菌かどうかを確認することは、結核の治療を進める上で重要である。なお、マイコバクテリウム・ツベルクローシスは、ムコールの多糖体膜があり、抗酸菌染色で染まる桿菌である。
【０００６】
結核症の診断は、患者検査試料（例えば、喀痰、血液、胸腹水、髄液、便、尿、生検組織、又は結核菌の培養液など）から結核菌を検出することで確定するが、結核菌は増殖速度が遅く、培養して結果が判明するまでに３〜４週間の期間が必要である。
結核菌の排菌の有無を調べる検査として、例えば、患者喀痰を塗抹した標本の抗酸菌染色検査、培養検査、遺伝子検査（ＤＮＡプローブ法やＰＣＲ法）、又は患者血清中に存在する結核菌に対する抗体検査などが行なわれている。
【０００７】
抗酸菌染色検査は、喀痰の染色及び鏡検で迅速な検査ができるが、結核菌と非定型抗酸菌（例えば、マイコバクテリウム・アビウムなど）を区別することができない。また、血清検査でも、同様に結核菌なのか非定型抗酸菌（例えば、ミコバクテリウム・アビウムなど）を区別することができない。従って、結核の疑いのある患者を治療する場合、迅速な検査法として、抗酸菌検査患者の喀痰に排菌される結核菌を確認するため、結核菌か非結核性の非定型抗酸菌かどうかを遺伝子検査法による同定法が行なわれているが、簡易且つ迅速な同定検査法の開発が望まれている。
【０００８】
近年、結核患者検体の迅速性検査法として、患者検査材料から遺伝子を抽出し、結核菌に特異的な遺伝子の一部をＰＣＲ法で増幅し、その生成物を電気泳動した後、標識ＤＮＡプローブとハイブリダイズすることによりＥＬＩＳＡ法を用いた結核菌の同定検査が行なわれている。この場合、結果が出るまでに５〜６時間かかる。
患者の喀痰中に結核菌が存在しているかどうかを調べる目的で、結核菌の迅速診断法として遺伝子診断法が研究されているが、より簡便な診断法に対する関心は依然として高い。
【０００９】
【非特許文献１】
「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」，（英国），１９９８年，第３９３巻，ｐ．５３７−５４４
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、被検試料中に存在するミコバクテリウム・ツベルキュロシスを正確及び迅速に検出及び／又は同定することができる分析方法、並びにそれに用いることのできる新規プライマー及びプライマーセットを提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
前記課題は、本発明による、配列番号３〜６で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドにより解決することができる。
また、本発明は、配列番号３で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号４で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとからなるか、あるいは、配列番号５で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号６で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとからなる、プライマーセットに関する。
また、本発明は、配列番号７又は８で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドに関する。
【００１２】
また、本発明は、（１）（ａ）マイコバクテリウム・ツベルクローシスを含有する可能性のある被検試料、及び
（ｂ）配列番号３で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号４で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーとの組み合わせ、あるいは、配列番号５で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号６で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーとの組み合わせ
を用いて、ＤＮＡ断片を増幅する工程；並びに
（２）前記ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物を分析する工程
を含む、マイコバクテリウム・ツベルクローシスの分析方法に関する。
また、本発明は、（１）（ａ）マイコバクテリウム・ツベルクローシスを含有する可能性のある被検試料、及び
（ｂ）配列番号３で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドと、配列番号４で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドと同種又は異種の標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドとの組み合わせ、あるいは、配列番号５で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドと、配列番号６で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドと同種又は異種の標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドとの組み合わせ
を用いて、ＤＮＡ断片を増幅する工程；並びに
（２）前記ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物を、前記の各標識物質にそれぞれ特異的に結合可能なパートナーを用いて分析する工程
を含む、マイコバクテリウム・ツベルクローシスの分析方法に関する。
また、本発明は、（１）配列番号３で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドと、配列番号４で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドとは異なる標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドとの組み合わせ、あるいは、配列番号５で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドと、配列番号６で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドとは異なる標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドとの組み合わせ；及び
（２）前記標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能なパートナーが結合された着色粒子を保持し、しかも、もう一方の標識物質に特異的に結合可能なパートナーが固定化されているイムノクロマトグラフ用ストリップ
を含む、マイコバクテリウム・ツベルクローシスの分析用キットに関する。
また、本発明は、（１）配列番号３で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドと、配列番号４で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドとは異なる標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドとの組み合わせ、あるいは、配列番号５で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドと、配列番号６で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドとは異なる標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドとの組み合わせ；及び
（２）前記標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能なパートナーと、もう一方の標識物質に特異的に結合可能なパートナーとを担持したラテックス懸濁液
を含む、マイコバクテリウム・ツベルクローシスの分析用キットに関する。
また、本発明は、（１）配列番号３で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドと、配列番号４で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドと同種の標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドとの組み合わせ、あるいは、配列番号５で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドと、配列番号６で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドと同種の標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドとの組み合わせ；及び
（２）前記標識物質に特異的に結合可能なパートナーを担持したラテックス懸濁液
を含む、マイコバクテリウム・ツベルクローシスの分析用キットに関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
〔１〕本発明のオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド
本発明のオリゴヌクレオチドには、
配列番号３で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、
配列番号４で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、
配列番号５で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド、及び
配列番号６で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド
が含まれ、
配列番号３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、
配列番号５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、又は
配列番号６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
が好ましい。
【００１４】
本発明のオリゴヌクレオチドである、配列番号３で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド）と配列番号４で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド）との組み合わせ、あるいは、配列番号５で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号５で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド）と配列番号６で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド）との組み合わせを、フォワードプライマー及びリバースプライマーとして用いてＰＣＲを実施することにより、マイコバクテリウム・ツベルクローシスの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子断片（例えば、配列番号７又は８で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド）を増幅することができる。配列番号７又は８で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド（好ましくは、配列番号７又は８で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド）も、本発明の範囲に含まれる。なお、本明細書における用語「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方が含まれる。
【００１５】
マイコバクテリウム・ツベルクローシス菌のゲノム遺伝子は、４．１×１０６ｂｐである。また、リボゾームＲＮＡは、ウイルスを除く全生物種に存在し、細菌の分類に約１，５００ｂｐの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列が用いられている。なお、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子領域から全ての細菌に共通に使用できるユニバーサルプライマーを設計すれば、全ての細菌由来のＤＮＡを増幅することが可能となる。好気性菌については、既に、ユニバーサルプライマーを用いてＰＣＲ増幅した生成物を制限酵素で切断して同定する方法が報告されている（Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，３８，２０７６−２０８０，２０００）。１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の約１，５００ｂｐの塩基配列の内、８００〜１，０００ｂｐの塩基配列を用いて細菌の系統分類ができることが報告されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８２，６９５５−６９５９，１９８５）。
マイコバクテリウム・ツベルクローシス菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子、又は１６ＳリボゾームＲＮＡをターゲットにした遺伝子に関して、ユニバーサルプライマーとして配列番号１で表される塩基配列からなるプライマー及び配列番号２で表される塩基配列からなるプライマーを用いてＰＣＲ法で増幅し、１，５００ｂｐの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子断片を取得することができる。
【００１６】
本発明のオリゴヌクレオチドである、配列番号３で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号４で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとの組み合わせ、あるいは、配列番号５で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと配列番号６で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとの組み合わせを用いたＰＣＲ法で増幅するＤＮＡは、マイコバクテリウム・ツベルクローシス菌のみであり、その他の菌種は、増幅しない。
【００１７】
本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号３で表される塩基配列（塩基数＝１６）、配列番号４で表される塩基配列（塩基数＝１５）、配列番号５で表される塩基配列（塩基数＝１５）、又は配列番号６で表される塩基配列（塩基数＝１５）を含み、ＰＣＲにおけるプライマーと使用した場合にマイコバクテリウム・ツベルクローシスを特異的に増幅可能である限り、その塩基数は特に限定されるものではないが、例えば、１５塩基〜４０塩基であることが好ましく、１５塩基〜２０塩基であることがより好ましい。
【００１８】
本発明のオリゴヌクレオチドは、その５’末端が標識物質で標識化されていることが好ましい。前記標識物質は、ＰＣＲに影響を与えることがなく、しかも、その標識物質に特異的に結合可能なパートナーが存在する限り、特に限定されるものではなく、例えば、プライマーの標識化に一般的に用いられる公知の標識物質を使用することができる。このような標識物質としては、例えば、蛍光物質〔例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ジゴキシゲニン、ビオチン等を挙げることができる。これらの標識物質に特異的に結合可能なパートナーとしては、標識物質に対する抗体（ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含む）又はその抗体フラグメント〔例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ等〕を挙げることができる。また、ビオチンに特異的に結合可能なパートナーとしては、抗ビオチン抗体又はそのフラグメント以外にも、例えば、アビジン又はストレプトアビジンを挙げることができる。
【００１９】
〔２〕本発明の分析方法及び分析用キット
本発明の分析方法は、
（１）（ａ）マイコバクテリウム・ツベルクローシスを含有する可能性のある被検試料、及び
（ｂ）配列番号３で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号４で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーとの組み合わせ、あるいは、配列番号５で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号６で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーとの組み合わせ
を用いて、ＤＮＡ断片を増幅する工程（ＤＮＡ増幅工程）；並びに
（２）前記ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物を分析する工程（分析工程）
を含む。
【００２０】
本発明の分析方法で分析することのできる被検試料は、マイコバクテリウム・ツベルクローシスを含有する可能性のある試料である限り、特に限定されるものではないが、例えば、喀痰、血液、胸腹水、髄液、便、尿、生検組織、又は結核菌の培養液などを挙げることができる。これらの被検試料を、そのまま、本発明の分析方法で分析することもできるが、これらの試料から抗酸菌のみを検出するために、検査材料の均一化及び雑菌の死滅を目的に前処理を行なうことが好ましい。特に喀痰は、喀痰中の細菌の分布が不均一なために、まず均一化を行なう必要がある。この方法として、（１）Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、（２）ジチオスレイトール、（３）弱アルカリプロテアーゼ（スプーターザイム）、（４）強アルカリ若しくは弱アルカリ処理する方法、又は（５）界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ２０又はＮＰ４０）などを挙げることができる。
【００２１】
前記ＤＮＡ増幅工程は、プライマーセットとして、本発明のオリゴヌクレオチドである、配列番号３で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号４で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーとの組み合わせ、あるいは、配列番号５で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号６で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーとの組み合わせを用いること以外は、例えば、通常のＰＣＲ法に従って実施することができる。
【００２２】
本発明の分析方法で用いる各プライマーは、その５’末端が同種又は異種の標識物質で標識化されたオリゴヌクレオチドであることもできるし、あるいは、標識化されていないオリゴヌクレオチドであることもできる。
各プライマーの５’末端が同種又は異種の標識物質で標識化されたオリゴヌクレオチドを用いると、分析工程において、前記標識物質に特異的に結合可能なパートナーを用いる分析方法（例えば、イムノクロマトグラフ法、ラテックス凝集法、又はサンドイッチ法など）を用いることができるため、好ましい。電気泳動法を用いることなく、簡易且つ迅速に検出・同定することができるからである。
【００２３】
なお、標識物質として同種又は異種の標識物質を用いるかは、後述の分析工程の説明の際に詳述するように、分析工程において利用する分析手法により、適宜決定することができる。
例えば、分析工程における分析手法として、ラテックス凝集法又はサンドイッチ法を利用する場合には、同種の標識物質を用いることもできるし、あるいは、異種の標識物質を用いることもできる。一方、分析工程における分析手法として、イムノクロマトグラフ法を利用する場合には、その実施形態により、利用可能な標識物質の種類が制限されることがあり、異種の標識物質を用いることが必要な場合がある。
【００２４】
前記分析工程では、前記ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物を分析する。反応生成物の分析方法としては、ＰＣＲ産物の分析に用いられる通常の分析方法を用いることができ、例えば、分子生物学的手法、あるいは、標識物質に特異的に結合可能なパートナーを用いる分析方法（例えば、イムノクロマトグラフ法、ラテックス凝集法、又はサンドイッチ法など）等を挙げることができる。なお、前記ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物は、そのまま直接、あるいは、適当な処理を行なった処理物（例えば、適当に希釈又は濃縮した希釈物又は濃縮物）として、分析工程にかけることができる。
【００２５】
分子生物学的手法を用いる場合には、例えば、ゲル（例えば、アガロースゲル）電気泳動を実施した後、そのゲルをそのまま、あるいは、メンブレンに転写し、予想されるＤＮＡサイズを有するバンドの有無により、あるいは、プローブとのハイブリダイズの有無により、ＤＮＡ増幅工程においてマイコバクテリウム・ツベルクローシスの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子断片が生成したか否かを決定することができ、更には、被検試料中にマイコバクテリウム・ツベルクローシスが存在することを決定することができる。
なお、分析工程において分子生物学的手法を用いる場合には、ＤＮＡ増幅工程で用いる各プライマーは、その５’末端が各々異なる標識物質で標識化されたオリゴヌクレオチドであることもできるし、あるいは、標識化されていないオリゴヌクレオチドであることもできる。
【００２６】
一方、分析工程において、標識物質に特異的に結合可能なパートナーを用いる分析方法を用いる場合には、ＤＮＡ増幅工程で用いる各プライマーとして、その５’末端がが同種又は異種の標識物質で標識化されたオリゴヌクレオチドを用いる。以下、本発明の分析方法において、分析工程で、標識物質に特異的に結合可能なパートナーを用いる分析方法を用いる態様を、特に、本発明の結合パートナー型分析方法と称する。
本発明の結合パートナー型分析方法において、分析工程における分析手法として、イムノクロマトグラフ法、ラテックス凝集法、及びサンドイッチ法を利用する各態様について、以下、この順序に従って説明する。
【００２７】
本発明の結合パートナー型分析方法において、分析工程における分析手法として、イムノクロマトグラフ法を用いる場合には、例えば、イムノクロマトグラフ用ストリップとして、プライマーの標識化に用いた２種類の標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能なパートナーが結合された着色粒子（すなわち、着色粒子コンジュゲート）を、固相担体に保持し、しかも、もう一方の標識物質に特異的に結合可能なパートナーが、前記固相担体に固定化（すなわち、固相化）されているイムノクロマトグラフ用ストリップを使用することができる。
【００２８】
前記固相担体としては、例えば、ニトロセルロース、セルロースアセテート、又はガラス繊維フィルター等を用いることができる。
前記着色粒子としては、例えば、金属コロイド（例えば、金コロイド等）、非金属コロイド（例えば、ポリスチレンコロイド等）、又はリポゾーム等を用いることができる。
標識物質に特異的に結合可能なパートナーとしては、例えば、標識物質に対する抗体（ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を含む）又はその抗体フラグメント〔例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ等〕を用いることができる。また、ビオチンに特異的に結合可能なパートナーとしては、抗ビオチン抗体又はそのフラグメント以外にも、例えば、アビジン又はストレプトアビジンを挙げることができる。以下、固相担体に固定化させる前記パートナーを「固定化用パートナー」と称し、着色粒子に結合させ、着色粒子コンジュゲートとして固相担体に保持させる前記パートナーを「保持用パートナー」と称する。
【００２９】
本発明の結合パートナー型分析方法で用いることのできる前記イムノクロマトグラフ用ストリップでは、被検試料の展開方向に関して、上流側に、着色粒子コンジュゲートの保持領域（例えば、塗布領域）を設け、下流側に、固定化用パートナーの固定領域を設ける。固定化用パートナー（例えば、抗体）の固相への結合は、例えば、約１μｇ／ｍＬの抗体溶液を固相担体に加え、室温放置することにより行なうことができる。タンパク質の非特異的吸着をブロックするために、例えば、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）でブロッキングすることが好ましい。
なお、陰性コントロールとして、例えば、マウスＩｇＧ又はウサギＩｇＧを固定する領域は、固定化用パートナーの固定領域の更に下流側に設けることもできるし、設けないでおくこともできるが、検査を正確にするためには設ける方が好ましい。
【００３０】
イムノクロマトグラフ法を用いる本発明の結合パートナー型分析方法では、固相担体に固定化された固定化用パートナーと、固相担体に保持された着色粒子コンジュゲートとを介して、ＤＮＡ増幅工程で増幅した二重標識ＤＮＡ生成物を検出する。担体の役割は、被検出物（二重標識ＤＮＡ生成物）と着色粒子コンジュゲートとを展開し、固定化された固定化用パートナーと反応させ、更に、未反応物を分離することにある。
【００３１】
より具体的には、クロマトグラフ用ストリップの着色粒子コンジュゲートを塗布した側の端に、ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物又はその処理物（例えば、希釈物又は濃縮物）が接触すると、この水溶液はクロマトグラフ用ストリップに吸収及び展開され、先端に向かって浸透する。前記接触方法としては、例えば、被検試料滴下部位に滴下する方法、あるいは、容器（例えば、ウェル）内の被検試料を吸着する方法などを挙げることができる。着色粒子コンジュゲートを塗布した領域に達すると、二重標識ＤＮＡ生成物は、保持用パートナーを介して着色粒子コンジュゲートと結合し、更にクロマトグラフ用ストリップ上を移動する。そして、この二重標識ＤＮＡ生成物と着色粒子コンジュゲートとの複合体が、固定化用パートナーを固定した領域に達すると、二重標識ＤＮＡ生成物は、この固定化用パートナーに結合し、トラップされる。その結果、二重標識ＤＮＡ生成物と着色粒子コンジュゲートとの複合体は、この領域で停止し、これ以上移動しない。イムノクロマトグラフ法を利用する本発明の結合パートナー型分析方法では、この着色粒子の担体上での集積を目視により観察することにより、ＤＮＡ増幅工程においてマイコバクテリウム・ツベルクローシスの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子断片が生成したか否かを決定することができ、更には、被検試料中にマイコバクテリウム・ツベルクローシスが存在すること（すなわち、被検試料の陽性又は陰性）を判定することができる。
【００３２】
なお、このように、着色粒子コンジュゲートを保持し、しかも、固定化用パートナーが固定化されているイムノクロマトグラフ用ストリップを用いる場合には、２個１組のプライマーセットを標識化する標識物質として、異種の標識物質を用いることが必要である。仮に、両プライマーが同種の標識物質で標識化されていると、二重標識ＤＮＡ生成物が着色粒子コンジュゲート保持領域を通過し、両者の複合体を形成した際に、二重標識ＤＮＡ生成物におけるパートナー結合部位が、全て、着色粒子コンジュゲートとの結合に使用されてしまい、二重標識ＤＮＡ生成物と着色粒子コンジュゲートとの複合体が、固定化用パートナーを固定した領域に達しても、固定化用パートナーとの結合部位が残っていないことがあるからである。
【００３３】
従って、イムノクロマトグラフ法を利用し、しかも、２個１組のプライマーセットを標識化する標識物質として同種の標識物質を用いた場合には、例えば、固定化用パートナーが固定化されているが、着色粒子コンジュゲートを保持しないイムノクロマトグラフ用ストリップを用いて、ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物又はその処理物を展開する第１工程を実施した後、着色粒子コンジュゲートを展開する第２工程を実施する必要がある。この場合、第１工程が終了した時点で、ストリップ上の固定化用パートナー固定化領域に、一方の標識物質が未反応の状態で二重標識ＤＮＡ生成物が結合し、第２工程において、その未反応の標識物質に、着色粒子コンジュゲートが結合することができる。
【００３４】
本発明の結合パートナー型分析方法において、分析工程における分析手法として、ラテックス凝集法を用いる場合には、ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物と接触させるラテックス懸濁液として、プライマーを標識化するのに用いた標識物質に特異的に結合可能なパートナーを担持したラテックス懸濁液を用いること以外は、通常のラテックス凝集法をそのまま適用して実施することができる。
ラテックス凝集法を用いる場合には、２個１組のプライマーセットに対して用いる標識物質の種類は、同種（すなわち、１種類）であることもできるし、あるいは、異種（すなわち、２種類）であることもできる。同種であると、競合が生じて凝集度に影響を与える可能性があるため、異種の標識物質を用いることが好ましい。
【００３５】
２個１組のプライマーセットを標識化する標識物質として、異種の標識物質を用いる場合には、それらの２種類の標識物質に、それぞれ、特異的に結合可能な２種類のパートナー（すなわち、一方の標識物質に特異的に結合可能なパートナーと、もう一方の標識物質に特異的に結合可能なパートナー）を担持したラテックス懸濁液を使用する。一方、２個１組のプライマーセットを標識化する標識物質として、同種の標識物質を用いる場合には、その１種類の標識物質に特異的に結合可能なパートナーを担持したラテックス懸濁液を使用する。
【００３６】
ラテックスとしては、通常の免疫分析用試薬に使用可能なラテックスである限り、特に限定されるものではなく、例えば、ポリスチレン、又はスチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体などを挙げることができる。ラテックスの平均粒径は、測定対象物の検出濃度又は測定機器によって適宜選択することができ、例えば、０．０５〜０．５μｍであることができる。
２種類のパートナーを用いる場合には、それらをラテックス上に担持させる形態としては、例えば、２種類のパートナーを混合した状態で、同一のラテックス上に担持させることもできるし、あるいは、２種類のパートナーを、それぞれ、別々のラテックス上に担持させることもできる。
パートナーを担持するラテックス懸濁液は、公知方法、例えば、物理的又は化学的結合により感作させることにより、調製することができる。
【００３７】
ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物又はその処理物（例えば、希釈物又は濃縮物）と、前記ラテックス懸濁液とを接触させると、前記反応生成物中に二重標識ＤＮＡ生成物が存在する場合には、特異的結合反応（例えば、抗原抗体反応）により凝集が生じる。
例えば、抗原抗体反応の条件は、通常の免疫学的ラテックス比濁分析方法の実施条件と同様であることができ、例えば、反応のｐＨは、６〜８．５で実施することができる。反応温度は０〜５０℃であることが好ましく、２０〜４０℃がより好ましい。反応時間は、適宜決定することができ、例えば、汎用自動分析機では１０〜１５分間で測定を完了することができる。
【００３８】
特異的結合反応（例えば、抗原抗体反応）により生じた凝集の程度は、公知の分析方法、例えば、光学的分析方法により分析することができる。前記光学的分析方法としては、例えば、反応液に光を照射して散乱光又は透過光を分析する方法を挙げることができ、より具体的には、散乱光強度、吸光度、又は透過光強度を測定する光学機器を用いて分析を行なうことができる。好ましい測定波長は３００〜８００ｎｍである。前記光学機器を用いた分析では、公知の方法に従って、用いるラテックス粒子の大きさ及び／又は濃度の選択、並びに反応時間の設定により、散乱光強度、吸光度、又は透過光強度の増加又は減少を測定することにより実施することができる。また、これらの方法を併用することも可能である。ラテックス凝集法を利用する本発明の結合パートナー型分析方法では、ラテックスの凝集の程度を観察することにより、ＤＮＡ増幅工程においてマイコバクテリウム・ツベルクローシスの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子断片が生成したか否かを決定することができ、更には、被検試料中にマイコバクテリウム・ツベルクローシスが存在すること（すなわち、被検試料の陽性又は陰性）を判定することができる。
【００３９】
本発明の結合パートナー型分析方法において、分析工程における分析手法として、サンドイッチ法を用いる場合には、分析対象化合物に対する抗体の代わりに、プライマーを標識化するのに用いた標識物質に特異的に結合可能なパートナーを用いること以外は、通常のサンドイッチ法をそのまま適用して実施することができる。
２個１組のプライマーセットを標識化する標識物質として、異種の標識物質を用いる場合には、それらの２種類の標識物質に、それぞれ、特異的に結合可能な２種類のパートナーを使用する。一方、２個１組のプライマーセットを標識化する標識物質として、同種の標識物質を用いる場合には、その１種類の標識物質に特異的に結合可能なパートナーを使用する。
【００４０】
具体的には、例えば、プライマーの標識化に用いた２種類の標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能な第１のパートナーを、適当な不溶性担体に固定化する。次に、不溶性担体と体液試料との非特異的結合を避けるために、適当なブロッキング剤〔例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）やゼラチン等〕で不溶性担体の表面を被覆する。続いて、ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物又はその処理物（例えば、希釈物又は濃縮物）を加えて一定時間（例えば、５分〜３時間）及び一定温度（例えば、４℃〜４０℃、好ましくは室温付近）で接触させ、反応させる（１次反応）。続いて、プライマーの標識化に用いた２種類の標識物質の残る一方に特異的に結合可能な第２のパートナーに標識物質を付した標識化第２パートナーを加えて一定時間（例えば、５分〜３時間）及び一定温度（例えば、４℃〜４０℃、好ましくは室温付近）で接触させ、反応させる（２次反応）。これを適当な洗浄液（例えば、界面活性剤を含む生理食塩水）で洗浄してから、不溶性担体上に存在する標識化第２パートナーの量を定量する。その値から、ＤＮＡ増幅工程においてマイコバクテリウム・ツベルクローシスの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子断片が生成したか否かを決定することができ、更には、被検試料中にマイコバクテリウム・ツベルクローシスが存在すること（すなわち、被検試料の陽性又は陰性）を判定することができる。
２個１組のプライマーセットを標識化する標識物質として、同種の標識物質を用いる場合には、前記第１及び第２パートナーに代えて、その１種類の標識物質に特異的に結合可能なパートナーを用いること以外は、同様にして実施することができる。また、１次反応と２次反応とを同時に行なうことも可能である。
【００４１】
前記不溶性担体としては、例えば、高分子（例えば、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、又はポリサッカライド等）、ニトロセルロース、紙、若しくはアガロース、又はこれらの組み合わせ等を例示することができる。
第２パートナーに付す標識物質としては、例えば、酵素、蛍光物質、又は発光物質を挙げることができる。酵素としては、例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、又はβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ等、また、蛍光物質としては、例えば、フルオレセインイソチオシアネート等、また、発光物質としては、例えば、アクリジニウムエステル又はルシフェリン等を使用することができる。
【００４２】
本発明の分析用キットには、分析工程における分析手法としてイムノクロマトグラフ法を利用する本発明の結合パートナー型分析方法に用いることのできる分析用キット（以下、イムノクロマトグラフ型分析用キットと称する）と、分析工程における分析手法としてラテックス凝集法を利用する本発明の結合パートナー型分析方法に用いることのできる分析用キット（以下、ラテックス凝集型分析用キットと称する）とが含まれる。
【００４３】
本発明のイムノクロマトグラフ型分析用キットは、
（１）配列番号３で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号３で表される塩基配列からなり、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド）と、配列番号４で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドとは異なる標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号４で表される塩基配列からなり、前記オリゴヌクレオチドとは異なる標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド）との組み合わせ、あるいは、配列番号５で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号５で表される塩基配列からなり、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド）と、配列番号６で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドとは異なる標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号６で表される塩基配列からなり、前記オリゴヌクレオチドとは異なる標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド）との組み合わせ；及び
（２）前記標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能なパートナーが結合された着色粒子を保持し、しかも、もう一方の標識物質に特異的に結合可能なパートナーが固定化されているイムノクロマトグラフ用ストリップ
を含む。
【００４４】
本発明のラテックス凝集型分析用キットは、
（１）配列番号３で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号３で表される塩基配列からなり、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド）と、配列番号４で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドとは異なる標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号４で表される塩基配列からなり、前記オリゴヌクレオチドとは異なる標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド）との組み合わせ、あるいは、配列番号５で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号５で表される塩基配列からなり、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド）と、配列番号６で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドとは異なる標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号６で表される塩基配列からなり、前記オリゴヌクレオチドとは異なる標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド）との組み合わせ；及び
（２）前記標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能なパートナーと、もう一方の標識物質に特異的に結合可能なパートナーとを担持したラテックス懸濁液を含むか、あるいは、
（１）配列番号３で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号３で表される塩基配列からなり、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド）と、配列番号４で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドと同種の標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号４で表される塩基配列からなり、前記オリゴヌクレオチドと同種の標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド）との組み合わせ、あるいは、配列番号５で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号５で表される塩基配列からなり、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド）と、配列番号６で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドと同種の標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド（好ましくは、配列番号６で表される塩基配列からなり、前記オリゴヌクレオチドと同種の標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチド）との組み合わせ；及び
（２）前記標識物質に特異的に結合可能なパートナーを担持したラテックス懸濁液
を含む。
【００４５】
以下、プライマーセットとして、配列番号３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組み合わせを用いる、本発明の具体的な実施手順の一例を示し、本発明をより具体的に説明する。
１）プローブの設計
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のクローニング用プライマーとして、配列表の配列番号１及び２で表される各塩基配列を設計する。その１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列をジデオキシ法で決定する。
標識化合物として５’−末端にＦＩＴＣ又はビオチンを付加する。具体的には、配列表の配列番号３及び４で表される各塩基配列を設計し、その遺伝子増幅生成物の塩基配列として配列表の配列番号７で表される塩基配列を決定する。
【００４６】
２）ＤＮＡの合成
３８１型ＤＮＡ自動合成装置（アプライドバイオシステムズ社）を用いて常法により、配列表に記載した配列で表されるオリゴＤＮＡを４種類合成する（以下、配列番号１〜４と称する）。ＤＮＡのプライマーとして、配列番号１〜４で表される塩基配列からなるＤＮＡは、マイコバクテリウム・ツベルクローシス菌の１６Ｓ ｒＲＮＡの鋳型特異的なプライマーである。
なお、配列番号３で表される塩基配列の５’末端にＦＩＴＣを含む塩基数１６個からなるオリゴＤＮＡ、及び配列番号４で表される塩基配列の５’末端にビオチンを含む塩基数１５個からなるオリゴＤＮＡを合成する。
【００４７】
３）ＰＣＲ法によるＤＮＡ生成物の確認
マイコバクテリウム・ツベルクローシス菌から調製したＤＮＡを用いて、ＰＣＲ装置で９５℃で熱変性し、前記のプライマー（配列番号１及び２）を添加すると、１６Ｓ ＤＮＡに特異的に結合する。
次に、ＤＮＡポリメラーゼ、特には耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ：Ｒｏｃｈｅ社、又はＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ）を添加し、以下のＰＣＲ法による増幅サイクルを行なう。
１サイクルは、（ａ）ＤＮＡの変性工程〔９４℃で２分間〕、（ｂ）１本鎖ＤＮＡとプライマーとのアニーリング工程〔５０℃で３０秒間〕、及び（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成工程〔７２℃で１分３０秒間〕からなり、１サイクル毎にＤＮＡ量は２倍に増幅されるが、このサイクルを３０回繰り返す。
【００４８】
４）プラスミドの作製
市販のプラスミドベクターｐＺＥｒＯ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を制限酵素ＥｃｏＲＶ（３７℃，２時間）で消化して、増幅したＰＣＲ産物がベクターに挿入できるようにする。この制限酵素で切断したベクター２．８ｋｂｐとＰＣＲにより合成した約１，５００ｂｐのＤＮＡをライゲーション・キット（宝酒造）を用いて、１６℃で３０分間反応させる。
【００４９】
５）大腸菌の形質転換
組み換えプラスミドと、市販の大腸菌ＤＨ５α株（宝酒造）を５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＣａＣｌ２で処理して作成したコンピテント細胞とを氷中で３０分間インキュベートし、４２℃で３０秒間熱処理した後、３７℃でＳＯＣ培地にて１時間培養する。この大腸菌を、５０μｇ／ｍＬゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）及び１ｍｍｏｌ／Ｌイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を含むＹＴ寒天平板上にまき、３７℃で一夜培養を行なう。
生じたゼオシン耐性で透明なコロニーを、各々新たな５０μｇ／ｍＬゼオシンを含むＹＴブロスで３７℃一夜培養をし、アルカリ溶菌法にてプラスミドＤＮＡを単離する（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
【００５０】
６）ＰＣＲ法による二重標識ＤＮＡ生成物の作製
前記で調製したＤＮＡを、ＰＣＲ装置において９５℃で熱変性し、前記プライマー（配列番号３及び４）を添加すると、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に特異的に結合する。
次に、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ製）又はＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡）を添加し、以下のＰＣＲ法による増幅サイクルを行なう。
１サイクルは、（ａ）ＤＮＡの変性工程〔９４℃で２分間〕、（ｂ）１本鎖ＤＮＡとプライマーとのアニーリング工程〔５０℃で３０秒間〕、及び（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成工程〔７２℃で３０秒間〕からなり、１サイクル毎にＤＮＡ量は２倍に増幅されるが、このサイクルを３０回繰り返す。
【００５１】
７）イムノクロマトグラフ用ストリップの作製
薄片状のクロマトグラフ基材（ニトロセルロース膜）の片方に金コロイド標識したストレプトアビジンを塗布し、他方に第２の抗ＦＩＴＣモノクローナル抗体を固定する。
抗ＦＩＴＣ抗体の固相への結合は、例えば、約１μｇ／ｍＬの抗体溶液をニトロセルロースに加え、室温放置することにより行なうことができる。タンパク質の非特異的吸着をブロックするために、１％ＢＳＡ／ＰＢＳでブロッキングすることができる。
【００５２】
イムノクロマトグラフ法では、クロマトグラフ用ストリップの金コロイド標識ストレプトアビジンを塗布した側の端に、被検試料中のＰＣＲ法によるＤＮＡ生成物、又は希釈液が接すると、この水溶液はクロマトグラフ用ストリップに吸収及び展開され、先端に向かって浸透する。金コロイド標識ストレプトアビジンを塗布した領域に達すると、ＤＮＡ生成物は金コロイド標識ストレプトアビジンと結合し、更にクロマトグラフ用ストリップ上を移動する。そして、このＰＣＲ生成物と金コロイド標識結合物が、抗ＦＩＴＣ抗体を固定した領域に達すると、ＤＮＡ生成物はこの抗ＦＩＴＣ抗体に結合し、トラップされる。その結果、金コロイド標識結合物は、この領域で停止し、これ以上移動しない。イムノクロマトグラフ法では、この着色粒子の担体上での集積を目視により観察して、検体の陽性／陰性を判定する。
【００５３】
【実施例】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
《マイコバクテリウム・ツベルクローシス菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のクローニング》
本実施例では、市販のキット（Ｇｅｎとるくん；宝酒造製）を用いてマイコバクテリウム・ツベルクローシスの菌体からゲノムＤＮＡを単離した後、２種類のプライマーとして配列番号１及び配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡを用いてＰＣＲ法で１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅し、約１．５ｋｂｐのＤＮＡを得た。このＰＣＲ産物をプラスミドｐＺＥｒＯ−１のＥｃｏＲＶ サイトを利用して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合して組み換えプラスミドを作成した。各工程の手順は、以下に示す通りである。
【００５４】
（１）マイコバクテリウム・ツベルクローシスの培養
結核菌マイコバクテリウム・ツベルクローシスは、小川培地（極東製薬製）を用いて３〜４週間培養を行なった。
【００５５】
（２）合成ＤＮＡの作成
３８１型ＤＮＡ自動合成装置（アプライドバイオシステムズ社）を用いて常法により、６種類のプライマーＤＮＡ（配列番号１〜配列番号６）を合成した。配列番号３又は５で表される各塩基配列からなるプライマーＤＮＡの５’−末端は、各々ＦＩＴＣ標識ｄＧＴＰ又はＦＩＴＣ標識ｄＡＴＰを用い、配列番号４又は６で表される各塩基配列からなるプライマーＤＮＡの５’−末端は、ビオチン標識ｄＣＴＰを用いて合成した。
ユニバーサルプライマー１（配列番号１）及びユニバーサルプライマー２（配列番号２）の各塩基配列は、マイコバクテリウム・ツベルクローシス菌のゲノムＤＮＡの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅するものである。従って、プライマー１とプライマー２を用いてＰＣＲ法で増幅されるＤＮＡ生成物（Ｉ）は、１，５００塩基対である。
【００５６】
なお、前記ユニバーサルプライマー（配列番号１及び配列番号２）は、参考文献〔Ｌａｎｅ， Ｄ．Ｊ． （１９９１）． １６Ｓ／２３Ｓ ｒＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ． Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ． Ｅ． Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔ ａｎｄ Ｍ． Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ， ｅｄｓ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ： １１５−１７５〕のプライマー２７ｆ及びプライマー１４９２ｆを引用したものである。
また、マイコバクテリウム・ツベルクローシスの１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列としては、英国サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）研究所が公開している結核菌ゲノムの情報のＥＮＴＲＹ：ＭＴＵｒＲＮＡ０１で１６Ｓ ｒＲＮＡ（１４７１８４４−１４７３３８０）の１５３７塩基が掲載されているのを使用した。配列番号３で表される塩基配列は、その第７６番〜第９１番（１４７１９１９〜１４７１９３４）であり、配列番号４で表される塩基配列は、第２０５番〜第２１９番（１４７２０４８〜１４７２０６２）であり、配列番号５で表される塩基配列は、その第１２７１番〜第１２８５番（１４７３１１４〜１４７３１２８）であり、配列番号６で表される塩基配列は、第１４３７番〜第１４５１番（１４７３２８０〜１４７３２９４）である。また、配列番号１で表される塩基配列は、第１１番〜第３０番（１４７１８５４〜１４７１８７３）であり、配列番号２で表される塩基配列は、第１４８５番〜第１５０６番（１４７３３２８〜１４７３３４９）である。
【００５７】
（３）遺伝子の増幅
実施例１（１）で培養したマイコバクテリウム・ツベルクローシス菌から調製したゲノムＤＮＡと、実施例１（２）で合成したプライマー１及びプライマー２とを用いてＰＣＲを行なった。
１サイクルは、（ａ）ＤＮＡの変性工程〔９５℃で２分間〕、（ｂ）１本鎖ＤＮＡとプライマー（配列番号１及び２）とのアニーリング工程〔５０℃で３０秒間〕、及び（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成工程〔７２℃で１分３０秒間〕からなり、このサイクルを３０回繰り返した。
【００５８】
（４）組み換えプラスミドの作製
クローニングベクターとして、ｐＺＥｒＯ−１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いた。実施例１（３）で得られたＤＮＡ生成物（Ｉ）とｐＺＥｒＯ−１ベクターのＥｃｏＲＶサイトを利用して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合して組み換えプラスミドを作成した。
具体的には、ＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲル電気泳動で分離し、約１，５００ｂｐのバンドを切り取り、市販のカラム（ＧｅｎＥｌｕｔｅ ＡＧＡＲＯＳＥ ＳＰＩＮ ＣＯＬＵＭＮ；ＳＩＧＭＡ社）で精製した。ＤＮＡライゲーション・キット（宝酒造）を用いて、ＤＮＡ（Ｉ）３μＬとｐＺＥｒＯ−１ベクター（制限酵素ＥｃｏＲＶで処理したもの）１μＬとを加え、更にライゲーション溶液Ｉ（酵素液）４μＬを加えて１６℃で３０分間反応させ、ライゲーションを行ない、プラスミドＤＮＡ（ＩＩ）を作製した。
【００５９】
（５）形質転換
実施例１（４）で得られた組み換えＤＮＡを用いて、常法により形質転換を行なった。すなわち、５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＣａＣｌ２処理して作製したコンピテントセル（大腸菌ＤＨ５α株）にプラスミドＤＮＡを導入した。
【００６０】
（６）形質転換体に含まれる１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の単離
実施例１（５）で得られた形質転換体であるコロニーを、５０μｇ／ｍＬゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＹＴ−ブロスに接種し、３７℃で一夜培養を行なった。この培養液１．５ｍＬをエッペンドルフチューブに入れ、遠心分離で菌体を集め、アルカリ溶菌法にてプラスミドＤＮＡを単離した。
【００６１】
（７）塩基配列の決定
実施例１（６）で得られたＤＮＡと市販のキット（ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ；アプライドバイオシステムズ社）を用いてＰＣＲ反応を行ない、この反応溶液をＤＮＡシークエンサー装置（３７３Ａ−１８ ＤＮＡシークエンサー装置；アプライドバイオシステムズ製）にアプライし、ジデオキシ法で塩基配列を決定した。
【００６２】
【実施例２】
《１４４ｂｐ及び１８０ｂｐの各ＤＮＡ遺伝子の増幅》
本実施例では、実施例１で作製したマイコバクテリウム・ツベルクローシスのｒＲＮＡ遺伝子（１．５ｋｂｐ）を含むクローンからＤＮＡを単離し、２種類のプライマーセットとして、配列番号３及び配列番号４で表される各塩基配列からなるＤＮＡプライマーセット、並びに配列番号５及び配列番号６で表される各塩基配列からなるＤＮＡプライマーセットを用いて、ＰＣＲ法でＤＮＡ増幅を行ない、そのＰＣＲ生成物量及び塩基配列を確認した。
【００６３】
（１）遺伝子の増幅
実施例１で作製した１．５ｋｂｐのｒＲＮＡ遺伝子配列を含むプラスミドＤＮＡと、実施例１（２）で合成した２種類の標識プライマーセット、すなわち、プライマー３（配列番号３）及びプライマー４（配列番号４）との組み合わせ、又はプライマー５（配列番号５）及びプライマー６（配列番号６）との組み合わせをそれぞれ用いてＰＣＲを行なった。
１サイクルは、（ａ）ＤＮＡの変性工程〔９５℃で２分間〕、（ｂ）１本鎖ＤＮＡとプライマー（配列番号３及び４）とのアニーリング工程〔５０℃で３０秒間〕、及び（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成工程〔７２℃で３０秒間〕からなり、このサイクル数による二重標識ＰＣＲ生成物量を確認するため、１０回、１５回、２０回、及び３０回の反応を行なった。
【００６４】
（２）１４４ｂｐ及び１８０ｂｐの各ＤＮＡの精製
実施例２（１）で得られたマイコバクテリウム・ツベルクローシスのＰＣＲ生成物を１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にアプライし、ＤＮＡマーカー（φＸ１７４／ＨａｅＩＩＩ Ｄｉｇｅｓｔ；東洋紡）から判断し、１４４ｂｐバンド及び１８０ｂｐバンドに相応する各バンドを切り取り、市販のキット（ＤＮＡ Ｐｒｅｐ；ダイアヤトロン社）を用いてＤＮＡを精製した。
【００６５】
（３）塩基配列の決定
実施例２（２）で得られたマイコバクテリウム・ツベルクローシスのＤＮＡと市販のキット（ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ；アプライドバイオシステムズ社）を用いてＰＣＲ反応を行ない、この反応溶液をＤＮＡシークエンサー装置（３７３Ａ−１８ ＤＮＡシークエンサー装置；アプライドバイオシステムズ製）にアプライし、ジデオキシ法で塩基配列を決定した。
プライマー３（配列番号３）及びプライマー４（配列番号４）との組み合わせから得られた１４４ｂｐのＤＮＡバンドからは、配列番号７で表される塩基配列が得られ、プライマー５（配列番号５）及びプライマー６（配列番号６）との組み合わせから得られた１８０ｂｐのＤＮＡバンドからは、配列番号８で表される塩基配列が得られた。
【００６６】
【実施例３】
《各種菌体から単離したゲノムを用いたＰＣＲ法によるＤＮＡ増幅》
本実施例では、実施例１で作製したマイコバクテリウム・ツベルクローシスのｒＲＮＡ遺伝子（１．５ｋｂｐ）を含むクローン、及び各種菌体（マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・アビウム、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、マイコバクテリウム・カンサシイ、及び大腸菌の培養菌株）からＤＮＡを単離し、２種類のプライマーセットとして、配列番号３及び配列番号４で表される各塩基配列からなるＤＮＡプライマーセット、並びに配列番号５及び配列番号６で表される各塩基配列からなるＤＮＡプライマーセットを用いてＰＣＲ法でＤＮＡ増幅を行なった。
【００６７】
（１）ＤＮＡの分離
小川培地上に生育した抗酸菌株（マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・アビウム、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、及びマイコバクテリウム・カンサシイ）のコロニーを坂口フラスコに取り、ガラスビーズで菌体をほぐした後、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌した検体から、市販のＤＮＡ調製キット（Ｇｅｎとるくん；宝酒造製）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。
【００６８】
（２）遺伝子の増幅
実施例３（１）で得たＤＮＡと、実施例１（２）で合成した２種類の標識プライマーセット、すなわち、プライマー３（配列番号３）及びプライマー４（配列番号４）との組み合わせ、又はプライマー５（配列番号５）及びプライマー６（配列番号６）との組み合わせをそれぞれ用いてＰＣＲを行なった。
１サイクルは、（ａ）ＤＮＡの変性工程〔９５℃で２分間〕、（ｂ）１本鎖ＤＮＡとプライマー（配列番号３及び４）とのアニーリング工程〔５０℃で３０秒間〕、及び（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成工程〔７２℃で３０秒間〕からなり、このサイクルを３０回繰り返した。
【００６９】
（３）１４４ｂｐＤＮＡ及び１８０ｂｐＤＮＡの確認
実施例３（２）で得られたＰＣＲ生成物を１２％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にアプライし、ＤＮＡマーカー（φＸ１７４／ＨａｅＩＩＩ Ｄｉｇｅｓｔ；東洋紡）を指標として、１４４ｂｐのバンド及び１８０ｂｐのバンドの有無を確認した。
【００７０】
【実施例４】
《イムノクロマトグラフ用ストリップの作製》
本実施例では、ＰＣＲ生成物捕捉用抗体としてモノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体（ＺＹＭＥＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）又はポリクローナル抗ＦＩＴＣ抗体（ＺＹＭＥＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を、金コロイド標識物としてストレプトアビジン（ＴＲＩＮＡ Ｂｉｏｒｅａｃｔｉｖｅｓ製）を用いて、ＰＣＲ生成物測定用イムノクロマトグラフ用ストリップを作製した。
【００７１】
（１）イムノクロマトグラフ用メンブレンの作製
ポリアミド（ナイロン６６）製メンブレン（Ｉｍｍｕｎｏｄｙｎｅ ＡＢＣ，孔径＝３．０μｍ；Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を５ｍｍ×２０ｍｍのサイズに裁断した。
メンブレンの上流側の一端から８ｍｍの位置に、ＰＣＲ生成物の検出ゾーンとして、モノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体溶液又はポリクローナル抗ＦＩＴＣ抗体溶液〔各々濃度０．５ｍｇ／ｍＬ；５ｍｍｏｌ／Ｌホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）で希釈〕を幅１ｍｍの線状に塗布した。
また、メンブレンの上流側の一端から１３ｍｍの位置に、陰性コントロールゾーンとして、マウスＩｇＧ溶液〔濃度０．５ｍｇ／ｍＬ；５ｍｍｏｌ／Ｌホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）で希釈〕を、幅１ｍｍの線状に塗布した。
室温下で１時間、３７℃下で３０分間静置し、各々の抗体を固相化した。メンブレンを０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に浸し、室温及び相対湿度２０％以下の条件下で３０分間緩やかに振とうし、ブロッキングした。メンブレンの過剰のブロッキング液を除き、室温下で一夜静置し、乾燥させ、二重標識ＰＣＲ生成物のイムノクロマトグラフ法用抗体固相化メンブレンとした。
【００７２】
（２）金コロイド標識ストレプトアビジン懸濁液の作製
ストレプトアビジン（濃度１ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬを２ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｎａ２Ｂ４Ｏ７緩衝液（ｐＨ６．５）（以下、Ｂｏｒａｘ緩衝液と称する）３，０００ｍＬ中で４℃下で一夜透析した。ストレプトアビジン溶液は、４℃下、１００，０００×ｇで１時間遠心分離した後、その上清を、１００，０００×ｇで１時間遠心分離したＢｏｒａｘ緩衝液で１００μｇ／ｍＬとなるように希釈した。金コロイド液（ＧＯＬＤ ＣＯＬＬＯＩＤ ２０ｎｍ；Ｂｒｉｔｉｓｈ ＢｉｏＣｅｌｌＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ製）１００ｍＬを、０．２ｍｏｌ／Ｌ−Ｋ２ＣＯ３溶液及び０．２ｍｏｌ／Ｌ−Ｈ３ＰＯ４溶液でｐＨ６．５に調整した。金コロイド液２０ｍＬを撹拌しながら、希釈したストレプトアビジン溶液２ｍＬを徐々に滴下し、室温下で３０分間撹拌した。更に、撹拌しながら１０％ＢＳＡ溶液（ｐＨ９．０；４℃下、１００，０００×ｇで１時間遠心分離した上清）２．５ｍＬを滴下した後、室温下で３０分間撹拌した。１０℃下にて１６，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を除去した。沈殿した金コロイド標識ストレプトアビジンを、０．５％ショ糖を含むホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）（０．４５μｍフィルター濾過）２０ｍＬに再懸濁させ、１０℃下にて１６，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を除去した。更に、沈殿した金コロイド標識ストレプトアビジンを、０．５％ショ糖を含むホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）（０．４５μｍフィルター濾過）２０ｍＬに再懸濁させ、１０℃下にて１６，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清を除去した。最後に、沈殿した金コロイド標識ストレプトアビジンを、０．５％ショ糖を含むホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８，０）（０．４５μｍフィルター濾過）に再懸濁させた後、波長５２０ｎｍにおける吸光度が約１０になるように濃度調整し、表面をシリコン処理したガラス試験管に移し、密栓し、４℃下に保存し、ＰＣＲ生成物のイムノクロマトグラフ法用金コロイド標識ストレプトアビジン懸濁液とした。
【００７３】
金コロイド標識ストレプトアビジン懸濁液は、波長５２０ｎｍにおける吸光度が３．０になるように、５．０％ショ糖を含む２ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．３）で希釈した後、その７μＬを、吸収パッドアキュウィックＡＷ１４−２０Ｔ４（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を５ｍｍ×５ｍｍのサイズに裁断したものに塗布し、シリカゲルデシケーター内で室温下、一夜減圧（≦５０ｍｍＨｇ）乾燥したものを、ＰＣＲ生成物のイムノクロマトグラフ法用金コロイド標識ストレプトアビジンパッドとした。
【００７４】
（３）イムノクロマトグラフ法用吸収パッドの作製
グラスファイバーパッド（タイプＡ／Ｂ；Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を５ｍｍ×１８ｍｍのサイズに裁断したものを、ＰＣＲ生成物のイムノクロマトグラフ法用試料添加パッドとした。グラスファイバーパッド（タイプＡ／Ｅ；Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）を５ｍｍ×２５ｍｍのサイズに裁断したものを、ＰＣＲ生成物のイムノクロマトグラフ法用吸収パッドとした。
【００７５】
（４）イムノクロマトグラフ用ストリップ
５ｍｍ×６０ｍｍのサイズに裁断したプラスティック粘着シート（ＢｉｏＤｏｔ製）に、上流側より、試料添加パッド、金コロイド標識ストレプトアビジンパッド、抗体固相化メンブレン、及び吸収パッドの順に、各々その両端を隣接する部材と１ｍｍ重ね合わせて貼付し、ＰＣＲ生成物測定用イムノクロマトグラフ用ストリップとした。
【００７６】
【実施例５】
《イムノクロマトグラフ法によるＰＣＲ生成物の測定》
本実施例では、実施例４で作製したイムノクロマトグラフ用ストリップを用いて、ＰＣＲ生成物のイムノクロマトグラフ法を実施した。
【００７７】
（１）ＰＣＲ法のサイクル回数別によるＰＣＲ生成物の検出
実施例２（１）で使用した２種類の標識プライマー、すなわち、プライマー３（配列番号３）及びプライマー４（配列番号４）との組み合わせを用い、ＰＣＲ法のサイクル回数として、１０回、１５回、２０回、及び３０回の反応をそれぞれ行なった。これらのＰＣＲ反応液１０μＬと２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液９０μＬとを混合した溶液、及び２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ブランク試験）１００μＬを、水平に静置したイムノクロマトグラフ用ストリップの試料添加パッドに滴下し、室温下で１０分間展開した。
【００７８】
メンブレンのモノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体を固相化した部分、及び陰性コントロール抗体を固相化した部分の金コロイドの捕捉に基づく赤紫〜紫色の着色の有無を目視観察し、ＰＣＲ生成物の有無を判定した。モノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体固相化イムノクロマトグラフ用ストリップでのＰＣＲ生成物の測定結果を表１に示す。表１において、「−」は陰性、「＋」は弱陽性、「＋＋」は中陽性、「＋＋＋」は強陽性であることを示す。
今回行なったＰＣＲ法では、ＰＣＲのサイクル回数１０回では二重標識ＰＣＲ生成物が、まだ、あまり産生されておらず、イムノクロマトグラフ用ストリップで測定することができなかった。ＰＣＲのサイクル回数が１５回、２０回、及び３０回では、二重標識ＰＣＲ生成物をイムノクロマトグラフ用ストリップを用いて測定することができた。
【００７９】
（２）ＰＣＲ生成物の希釈溶液の測定
実施例５（１）においてＰＣＲ法のサイクル回数として３０回を行なった反応液を、２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）で、１０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、及び１０００倍にそれぞれ希釈した溶液、並びに２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ブランク試験）の各１００μＬを水平に静置したイムノクロマトグラフ用ストリップの試料添加パッドに滴下し、室温下で１０分間展開した。
【００８１】
メンブレンのモノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体又はポリクローナル抗ＦＩＴＣ抗体を固相化した部分、及び陰性コントロール抗体を固相化した部分の金コロイドの捕捉に基づく赤紫〜紫色の着色の有無を目視観察し、ＰＣＲ生成物の有無を判定した。
表２に、モノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体を固相化したメンブレンを組み込んだＰＣＲ生成物測定用イムノクロマトグラフ用ストリップでの測定結果を示す。また、表３に、ポリクローナル抗ＦＩＴＣ抗体を固相化したメンブレンを組み込んだＰＣＲ生成物測定用イムノクロマトグラフ用ストリップでの測定結果を示す。表２及び表３において、「−」は陰性、「±」は擬陽性、「＋」は弱陽性、「＋＋」は中陽性、「＋＋＋」は強陽性であることを示す。
モノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体を固相化抗体に用いたＰＣＲ生成物測定用イムノクロマトグラフ用ストリップでは、元の被検液を５００倍希釈したものまで検出可能であり、ポリクローナル抗ＦＩＴＣ抗体を固相化したＰＣＲ生成物測定用イムノクロマトグラフ用ストリップでは、元の被検液を１，０００倍希釈したものまで検出可能であった。
【００８２】
（３）培養菌株を用いたＰＣＲ生成物の測定
実施例２（１）で使用した２種類の標識プライマー〔プライマー３（配列番号３）及びプライマー４（配列番号４）〕を用いて、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・アビウム（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、マイコバクテリウム・カンサシイ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ）、及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の培養菌株を用いて、同一のＰＣＲ反応を行なった。
これらのＰＣＲ反応液１０μＬと２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液９０μＬとを混合した溶液、及び２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ブランク試験）１００μＬを、水平に静置したイムノクロマトグラフ用ストリップの試料添加パッドに滴下し、同様に室温で１０分間展開した。
【００８５】
モノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体固相化イムノクロマトグラフ用ストリップでのＰＣＲ生成物の測定結果を表４に示す。表４において、「−」は陰性、「＋＋」は陽性であることを示す。このイムノクロマトグラフ用ストリップでマイコバクテリウム・ツベルクローシスのみに特異的に反応する結果が得られた。
【００８６】
（４）患者試料から得られたＰＣＲ生成物の測定
結核菌患者試料を用いて、実施例２（１）で使用した２種類の標識プライマー〔プライマー３（配列番号３）及びプライマー４（配列番号４）〕を用いて、ＰＣＲ反応を行なった。
これらのＰＣＲ反応液１０μＬと２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液９０μＬとを混合した溶液、及び２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩緩衝液（ブランク試験）１００μＬを、水平に静置したイムノクロマトグラフ用ストリップの試料添加パッドに滴下し、同様に室温で１０分間展開した。
【００８８】
モノクローナル抗ＦＩＴＣ抗体固相化イムノクロマトグラフ用ストリップでの患者検体を用いたＰＣＲ生成物の測定結果を表５に示す。表５において、「−」は陰性、「±」は擬陽性、「＋」は弱陽性、「＋＋」は中陽性であることを示す。
【００８９】
【発明の効果】
現在、国内で結核菌の迅速検査法として、患者検体から遺伝子を抽出し、結核菌に特異的な遺伝子をＰＣＲ法で増幅し、その生成物を電気泳動した後、ＤＮＡのサイズを確認する方法や標識ＤＮＡプローブとハイブリダイズすることにより結核菌の同定が行なわれている。また、結核菌が産生するナイアシンを測定する方法で、結核菌の感染の有無を調べる検査が行なわれている。従って、結核菌の同定を行うには、更に結核菌を培養して菌体を３〜４週間かけての培養が行なわれている。
【００９１】
本発明のオリゴヌクレオチド及び本発明の分析方法によれば、被検試料中に存在するマイコバクテリウム・ツベルクローシス菌の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子断片を、２種類の標識プライマーを用いてＰＣＲ法で増幅した後、その二重標識ＤＮＡ生成物を、例えば、分子生物学的手法又は免疫学的手法（特には、イムノクロマトグラフィー法）を用いて分析することにより、マイコバクテリウム・ツベルクローシス菌を特異的に検出することができる。また、前記二重標識ＤＮＡ生成物を免疫学的手法（特には、イムノクロマトグラフィー法）を用いて分析することにより、電気泳動法を用いることなく、簡易且つ迅速に検出・同定することができる。また、喀痰中に存在する菌数を半定量的に測定することができる。
【００９２】
【配列表】
Claims (11)
- 配列番号３〜６で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
- ５’末端が標識化されている、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
- 配列番号３で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号４で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとからなるか、あるいは、配列番号５で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドと、配列番号６で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドとからなる、プライマーセット。
- 各オリゴヌクレオチドの５’末端が標識化されている、請求項３に記載のプライマーセット。
- 配列番号７又は８で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド。
- （１）（ａ）マイコバクテリウム・ツベルクローシスを含有する可能性のある被検試料、及び
（ｂ）配列番号３で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号４で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーとの組み合わせ、あるいは、配列番号５で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーと配列番号６で表される塩基配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーとの組み合わせ
を用いて、ＤＮＡ断片を増幅する工程；並びに
（２）前記ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物を分析する工程
を含む、マイコバクテリウム・ツベルクローシスの分析方法。 - （１）（ａ）マイコバクテリウム・ツベルクローシスを含有する可能性のある被検試料、及び
（ｂ）配列番号３で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドと、配列番号４で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドと同種又は異種の標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドとの組み合わせ、あるいは、配列番号５で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドと、配列番号６で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドと同種又は異種の標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドとの組み合わせ
を用いて、ＤＮＡ断片を増幅する工程；並びに
（２）前記ＤＮＡ増幅工程で得られた反応生成物を、前記の各標識物質にそれぞれ特異的に結合可能なパートナーを用いて分析する工程
を含む、マイコバクテリウム・ツベルクローシスの分析方法。 - 前記分析工程における分析方法が、イムノクロマトグラフ法、ラテックス凝集法、又はサンドイッチ法である、請求項７に記載の分析方法。
- （１）配列番号３で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドと、配列番号４で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドとは異なる標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドとの組み合わせ、あるいは、配列番号５で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドと、配列番号６で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドとは異なる標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドとの組み合わせ；及び
（２）前記標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能なパートナーが結合された着色粒子を保持し、しかも、もう一方の標識物質に特異的に結合可能なパートナーが固定化されているイムノクロマトグラフ用ストリップ
を含む、マイコバクテリウム・ツベルクローシスの分析用キット。 - （１）配列番号３で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドと、配列番号４で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドとは異なる標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドとの組み合わせ、あるいは、配列番号５で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドと、配列番号６で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドとは異なる標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドとの組み合わせ；及び（２）前記標識物質のいずれか一方に特異的に結合可能なパートナーと、もう一方の標識物質に特異的に結合可能なパートナーとを担持したラテックス懸濁液
を含む、マイコバクテリウム・ツベルクローシスの分析用キット。 - （１）配列番号３で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドと、配列番号４で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドと同種の標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドとの組み合わせ、あるいは、配列番号５で表される塩基配列を含み、標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドと、配列番号６で表される塩基配列を含み、前記オリゴヌクレオチドと同種の標識物質で５’末端が標識化されているオリゴヌクレオチドとの組み合わせ；及び
（２）前記標識物質に特異的に結合可能なパートナーを担持したラテックス懸濁液
を含む、マイコバクテリウム・ツベルクローシスの分析用キット。
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| WO2007148733A1 (ja) * | 2006-06-22 | 2007-12-27 | Olympus Corporation | 標的核酸の検出方法及び該検出方法に用いる容器 |
| JP2009165371A (ja) * | 2008-01-11 | 2009-07-30 | Univ Of Tokushima | 二重標識融合ｐｃｒイムノクロマトグラフィー |
| WO2015152312A1 (ja) * | 2014-04-04 | 2015-10-08 | 田中貴金属工業株式会社 | 免疫クロマト分析方法 |
-
2002
- 2002-11-07 JP JP2002324276A patent/JP2004154074A/ja active Pending
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