WO2012070963A1 - Способ быстрой лабораторной диагностики заболеваний, основанный на выявлении специфических белков и устройство для его осуществления - Google Patents

Способ быстрой лабораторной диагностики заболеваний, основанный на выявлении специфических белков и устройство для его осуществления Download PDF

Info

Publication number
WO2012070963A1
WO2012070963A1 PCT/RU2010/000689 RU2010000689W WO2012070963A1 WO 2012070963 A1 WO2012070963 A1 WO 2012070963A1 RU 2010000689 W RU2010000689 W RU 2010000689W WO 2012070963 A1 WO2012070963 A1 WO 2012070963A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
charge
specific
oligopeptides
protein
enzyme
Prior art date
Application number
PCT/RU2010/000689
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Борис Славинович ФАРБЕР
Софья Борисовна ФАРБЕР
Артур Викторович МАРТЫНОВ
Original Assignee
Farber Boris Slavinovich
Farber Sof Ya Borisovna
Martynov Artur Viktorovich
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Farber Boris Slavinovich, Farber Sof Ya Borisovna, Martynov Artur Viktorovich filed Critical Farber Boris Slavinovich
Priority to PCT/RU2010/000689 priority Critical patent/WO2012070963A1/ru
Priority to EA201300486A priority patent/EA024771B1/ru
Priority to US12/931,459 priority patent/US20120129195A1/en
Publication of WO2012070963A1 publication Critical patent/WO2012070963A1/ru
Priority to US13/849,883 priority patent/US20130288230A1/en

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6842—Proteomic analysis of subsets of protein mixtures with reduced complexity, e.g. membrane proteins, phosphoproteins, organelle proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures

Definitions

  • the invention relates to medicine, namely, to methods of laboratory diagnostics and is intended to replace existing methods of immunodiagnostics with the use of immunoglobulins by the patented significantly less expensive method.
  • Enzyme-linked immunosorbent assay or ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA) is a laboratory immunological method for the qualitative determination and quantitative measurement of antigens, as well as immunoglobulins and hormones.
  • the ELISA method has high sensitivity and specificity, which currently amounts to more than 90%.
  • Test systems for enzyme immunoassay detect a wide range of various infections: HIV infection, viral hepatitis, cytomegalovirus, herpes, toxoplasma, etc.
  • Enzyme-linked immunosorbent assay allows the determination of antibodies
  • IgG, IgA, IgM infectious agents in the blood.
  • These antibodies are produced by the body in response to infection.
  • Antibodies are detected by interaction with special preparations containing the corresponding antigens, which form a strong complex with antibodies that can be detected in various ways.
  • the method is based on the principle of interaction of the immunosorbent — the antigen of the pathogen of infection with detectable antibodies.
  • the test system will detect specific antibodies in the test sample, regardless of their class, or antibodies of only a certain class.
  • the material for the study is serum or plasma of venous blood taken on an empty stomach.
  • immunoglobulins For the diagnosis of sexually transmitted diseases, three classes of immunoglobulins are used: M, A, G.
  • immunoglobulins of different classes are produced in a certain sequence, using ELISA can diagnose infection at different stages, and monitor the dynamics of the process.
  • the sequence of production of immunoglobulins of different classes is as follows: IgM antibodies appear first. how as a rule, this happens after 1-3 weeks from the moment of infection. The time of detection of antibodies depends both on the infection itself and on the characteristics of the immune system of a particular person. Symptoms of an acute infection appear. Detection of IgM antibodies in the analysis indicates the presence of an acute phase of the disease or an exacerbation of chronic infectious diseases.
  • IgA antibodies After a month, IgA antibodies begin to develop, the main part of which is concentrated on the mucous membranes, where their protective function is realized. The last to appear are IgG antibodies, usually 4 weeks after infection. After treatment of chlamydia, mycoplasmosis, trichomoniasis, their level is significantly reduced, since immunity against these diseases does not develop. It should be noted that the detection of immunoglobulins (IgM, IgG, IgA) indicates only the presence of antibodies, and not the presence of a pathogen. Therefore, in some cases, an enzyme-linked immunosorbent assay can give false results — both false positive and false negative. However, the specificity of the best recombinant-type ELISA test systems is currently approaching 100%.
  • Immunofluorescence analysis is also used to detect both antigens and antibodies. This method is based on the use of reagents labeled with a fluorescent dye. Antibodies are most often labeled with fluorescein isothiocyanate. Labeled antibodies bind to the antigen, forming complexes that can be detected by fluorescence microscopy. There are three modifications of immunofluorescence assay. 1. The direct immunofluorescence method is used to detect antigens. It is based on the direct binding of antigen adsorbed on a solid support to labeled antibodies. The reaction is evaluated using a fluorescence microscope. 2. The indirect immunofluorescence method allows the detection of antibodies to a known antigen.
  • An antigen sorbed on a solid support binds to unlabeled antibodies.
  • Antigen – antibody complexes are detected using labeled antibodies to immunoglobulins. 3.
  • the method of competitive immunofluorescence os- It was revealed by binding of the standard labeled and unlabeled antigens present in the test sample with antibodies adsorbed on a solid support. Since labeled and unlabeled antigens compete for binding to antibodies, the concentration of antigen in the test sample can be determined by the amount of labeled antigen bound.
  • components are patented that are capable of specifically binding to active sites of influenza virus neuraminidase and new components for use in this method.
  • Synthetic derivatives of neuraminic acid analogues are patented as substances specifically interacting with influenza neuraminidase.
  • the use of synthetic derivatives of neuraminidase in antibody test systems in place of immunoglobulins is contemplated.
  • the disadvantage of the method is the completely synthetic nature of the neuraminidase derivatives and, accordingly, the complexity of the synthesis and production of the test system, which significantly increases its price, the need to synthesize a derivative for each strain of influenza virus with its own neuraminidase, the inability to use the method to detect other infections and identify proteins other than influenza.
  • An immunodiagnostic method and a kit for detecting viral antigens such as herpes simplex are also known [ 2 ].
  • the viral antigen is immunoconjugated with a specific IgG immunoglobulin against the viral antigen and adsorbed onto an insoluble matrix.
  • the matrix interacts upon contact with monoclonal IgM immunoglobulins labeled with biotin.
  • the presence of the herpes virus antigen is detected by the reaction of avidin with biotin.
  • the method is an analogue of enzyme immunoassay.
  • the disadvantage of this method is the need to obtain specific immunoglobulins against viral antigens using animals or using hybridomas to obtain monoclonal antibodies, which significantly increases the cost of the final product.
  • the method also uses multiple covalent conjugation of immunoglobulins with biotin and specific immunoglobulins with an insoluble matrix, which significantly reduces the specificity and sensitivity of immunoglobulins, which significantly reduces the accuracy of the studies.
  • the method is intended only for detection of viral antigens and cannot be used to detect bacterial, fungal, and other low-immunogenic proteins, to which it is difficult to induce the synthesis of specific immunoglobulins in immunized animals.
  • a biosensor for detecting the presence of a well-defined protein in a biological material, which contains a plate, a conductive layer deposited on it, forming electrodes, a protective dielectric coating, contact leads, an immunochemical biomatrix on the surface of one of the electrodes containing sorbed immunoglobulins specific for the protein being detected.
  • the basis of the invention is the task of developing a method for rapid laboratory diagnosis of diseases and an apparatus for its implementation, based on the detection of specific proteins, capable of detecting any protein specific for a particular disease, including a low immunogenic protein, to which it is impossible or difficult to obtain specific immunoglobulins.
  • immunoglobulins and animals are not used to obtain them, the procedures for obtaining the protein reagent are reduced to a few simple procedures and allow developing test systems for detecting new and poorly studied infectious diseases as soon as possible.
  • the problem is solved by developing a method for rapid laboratory diagnosis of diseases, based on the identification of specific target proteins characteristic of the disease in the reaction of their specific interaction with other reagent proteins, characterized in that they take the target protein specific for the disease (injected from a microorganism, virus or microscopic fungus), hydrolyzed with proteolytic enzymes, modify the chemical structure of the resulting macromolecular ensemble from ol gopeptidov by atsi- lation succinic anhydride or alkylation of monochloroacetic acid.
  • the reaction is carried out in such a way that their charge changes to the opposite, and is then used as reagent proteins in immunofluorescence and enzyme-linked immunosorbent assays or using an impedance biosensor instead of specific and anti-species immunoglobulins.
  • proteolytic enzymes can be used: pepsin, trypsin, papanin, chymotrypsin.
  • pepsin can be used: pepsin, trypsin, papanin, chymotrypsin.
  • fluorescent conjugates can be obtained for further use in the method of fluorescent antibodies (direct or indirect immunofluorescence).
  • the problem is also solved by developing a device for rapid laboratory diagnosis of diseases by determining the presence of a clearly defined protein in biological material that contains a plate, a conductive layer deposited on it, forming electrodes, a protective dielectric coating, contact leads, immunochemical biomatrix on the surface of one of the electrodes containing sorbed immunoglobulins specific for the protein to be determined, characterized in that they use biomatrix as sewn to the metal surface hydrolyzed by proteolytic enzymes and modified by replacing the charge of molecules with the opposite detectable antigen.
  • An ensemble is a term from supramolecular chemistry.
  • the objects of supramolecular chemistry are supramolecular ensembles built spontaneously from complementary, that is, having geometrical and chemical correspondence of fragments, similar to spontaneous assembly of complex spatial structures in a living cell [4,5]
  • the specific interaction is due to the effect of conjugation and hybridization of homogeneous peptides, but having the opposite charge — self-assembly on the target of the supramolecular ensemble.
  • the method allows to exclude the stage of obtaining specific immunoglobulins and accordingly to abandon the use of animals, speed up the development of test systems for new and poorly studied infectious diseases to several days, significantly reduce the cost of production of test systems with the same sensitivity of the method, but with significantly more specificity.
  • FIG. 1. Photograph of smear epithelial cells not infected with herpes virus in a patented method
  • FIG. 2. - Infected with the herpes virus type 1 cells of the buccal epithelium detected by the patented method
  • Fig.Z. The structure (diagram) of the proposed device — an impedance biosensor (top view): 1 — electrodes (gold, platinum, iridium, etc.), 2 — silicon substrate, 3 — immunochemical cell with sorbed peptidhydrolyzate, 4 — insulating substrate (glass, silicon, plastic, rubber or others), electrodes are connected to the immunochemical cell on both sides.
  • Figure 4 - Structure (diagram) of the proposed device is an impedance biosensor (side view): 1 - electrodes (gold, platinum, iridium or others ..), 2 - silicon substrate, 3 - immunochemical cell with sorbed peptidhydrolyzate, 4- insulating substrate (glass, silicon, plastic, rubber or others), electrodes are connected to the immunochemical cell from both sides.
  • 1 - electrodes gold, platinum, iridium or others ..
  • 2 - silicon substrate 3 - immunochemical cell with sorbed peptidhydrolyzate
  • 4- insulating substrate glass, silicon, plastic, rubber or others
  • Figure 5. The principle of operation of the proposed device is an impedance multielectrode immunochemical biosensor on a gold substrate: a - there is no reaction between antibodies and antigens in the solution, b - between antibodies and antigens and the solution is precipitated (complex formation and precipitate), which is reflected on the nature of the impedance curve.
  • the device operates as follows. When biological material is introduced into the immunochemical cell 3 in the presence of an immunochemical reaction (between acylated peptides from the cell surface and a specific antigen), the impedance curve changes over time. In the absence of an immunochemical reaction, the impedance curve remains unchanged. This allows the detection of the presence of a clearly defined protein in biological material.
  • an immunochemical reaction between acylated peptides from the cell surface and a specific antigen
  • biosensors The fastest and most accurate methods for the selective detection of DNA, RNA, and proteins are biosensors, the principle of operation of which is based on the impedance, admittance, and electronic conductivity of DNA [1-3].
  • the hardware of the detectors has been studied and worked out for a long time: the signals are recorded by electrochemical methods: chronoamperometry, cyclic voltammetry, and electrochemical impedance spectroscopy (EIS) [4 - 6].
  • EIS electrochemical impedance spectroscopy
  • the main bottleneck of biosensors is the electrode: it either has a limited service time or is so highly sensitive that it gives false negative responses.
  • immunobiosensors are increasingly being used, the principle of which is based on the detection of the reaction of the formation of antigen-antibody complexes by the electrochemical method.
  • Immunoglobulins are the most expensive component of a biosensor due to the fact that polyclonal immunoglobulins of a vaccinated animal (most often rabbits) are needed to obtain an effective immunobiosensor. Accordingly, to obtain industrial quantities of immunoglobulins, a vivarium and a system for purifying blood proteins and chromatographic isolation of immunoglobulins are needed. Our method allows replacing immunoglobulins with a defined antigen, but with reversed molecular charges. Prior to application to the electrode, such antigens are fragmented with proteolytic enzymes and modified with antihydrides of dicarboxylic acids or chlorine derivatives of acids. In this case, the adsorbed antigen fragments acquire the properties of affinity and complementarity to their unmodified derivatives.
  • FIG. 5 shows the impedance for a multi-electrode gold biosensor chip.
  • Example 1 Obtaining a test system for the diagnosis of influenza containing neuraminidase N1 and hemagglutinin HI.
  • Amniotic fluid is taken after infection of the chicken embryo with the H1N1 influenza virus and incubation until the maximum amount of virus has accumulated under known standardized conditions, the influenza virus contained therein is purified by known methods, and concentrated by dialysis. Trypsin solution was added to the resulting concentrate, so that the enzyme: protein ratio was 1: 100, left in an thermostat at 37 ° C for 12 hours. The concentration of soluble oligopeptides - hydrolysis products were determined spectrophotometrically at 280 nm and 260 nm.
  • the spectrophotometric method for determining protein is based on the ability of aromatic amino acids (tryptophan, tyrosine, and to a lesser extent phenylalanine) to absorb ultraviolet light with a maximum absorption at 280 nm. It is conventionally assumed that when the protein concentration in the solution is 1 mg / ml, the optical density at 280 nm is 1 when using a cuvette with a layer thickness of 10 mm. As a comparison solution, a preparation solvent was used. The concentration of the test protein in the solution should be from 0.05 to 2 mg / L. The presence of nucleic acids and nucleotides (more than 20%) interferes with protein determination by this method. In this case, the optical density of the same solution is measured at two wavelengths — 260 and 280 nm; Protein X content (mg / ml) is calculated using the Kalkar formula:
  • the resulting mixture of oligopeptides and RNA is boiled for 10 minutes, then the resulting precipitate of non-hydrolyzed biopolymers is separated by centrifugation at 5g for 20 minutes.
  • Fluorescein isothiocyanate is added to the supernatant in relation to 1/10000 protein, the solution is left at + 5 ° C for 5 hours, then solid succinic anhydride is added in the ratio to the protein concentration of 2: 1.
  • the resulting reagent mixture is then used in the method of fluorescent antibodies.
  • the kit also uses standardized bovine serum albumin conjugated with rhodamine.
  • Example 2 Detection of infection with the H1N1 influenza virus.
  • bronchial secretions In patients who suspect the flu, they take bronchial secretions, a smear of the nasal mucosa, and blood. Each sample is resuspended in a 0.9% buffered sodium chloride solution, centrifuged. The resuspension and centrifugation procedure is repeated three times to clean the cells of the associated soluble components. The cell pellet is taken off with a micropipette and applied to a glass slide; with another glass, the cell suspension is evenly distributed over the glass. Let the smear dry, lower it to fix it in acetone solution or fix it with a Nikiforov mixture until the smear dries.
  • the peptide composition obtained in Example 1 is applied to the dried smear and left in a thermostat at 37 ° C for 40 minutes in a humid chamber to prevent the smear from drying out. Then the smear is washed with a buffered 0.9% sodium chloride solution and a 0.1% rhodamine-labeled bovine serum albumin solution is applied, also left for 20 minutes in a thermostat in a humid chamber. Albumin treatment is necessary to block extra epitopes of cells that did not bind to specific fluorescent peptides. Then the smear is removed from the thermostat, washed with distilled water and dried. Green fluorescent cells are detected in a fluorescence microscope.
  • Virus-infected cells fluoresce a green flower; healthy cells fluoresce red. If instead of a glass slide, a Goryaev’s camera or a fluorometric nozzle is used, the percentage of cells infected with the virus can be calculated.
  • the developed test system was checked in a comparative test with the standardized and registered RNIF test system, PCR test system, and the culture method.
  • tissue samples of patients in hospitals during the influenza epidemic from 12 to 75 years of both sexes were taken.
  • Table 1 Comparative results of examination of patients of two groups - with clinical signs of influenza, who are in the hospital during the period of the flu epidemic and the control group undergoing a routine examination without clinical signs of influenza
  • Control experienced Control experienced Control experienced Control group (with (without a clinical group (with (without a clinical group (with (without clinical, clinical, clinical, clinical signs)) signs of flu, flu, flu, flu, flu, flu, flu, flu
  • Patentable 180/107/59 (40/4/10) (180/102/57) (40/2/5) (180/1 10/61) (40/4/10)
  • Example 3 Obtaining a test system for the diagnosis of herpes type 1
  • Amniotic fluid is taken after infection of the chicken embryo with herpes virus (strain L-2) and incubation until the maximum amount of virus has accumulated under known standardized conditions, the herpes virus contained therein is purified by known methods, and concentrated by dialysis. Trypsin solution was added to the resulting concentrate so that the ratio of enzyme: protein was 1: 100, left in an incubator at 37 ° C for 12 hours. The concentration of soluble oligopeptides, hydrolysis products, was determined spectrophotometrically at 280 nm and 260 nm as described in Example 1.
  • the resulting mixture of oligopeptides and DNA is boiled for 10 minutes, then the resulting precipitate of non-hydrolyzed biopolymers is separated by centrifugation at 5g for 20 minutes.
  • Fluorescein isothiocyanate is added to the supernatant in relation to a protein of 1/10000, the solution is left at + 5 ° ⁇ for 5 hours, then solid succinic anhydride is added in the ratio to the protein concentration of 2: 1.
  • the resulting reagent mixture is then used in the method of fluorescent antibodies.
  • the kit also uses standardized bovine serum albumin conjugated with rhodamine.
  • smears are taken from the lesion, smears of white blood cells. Each sample is resuspended in a 0.9% buffered sodium chloride solution, centrifuged. Resuspension procedure and centrifugation is repeated three times to clean the cells of the associated soluble components. Leukocytes are further isolated by a standardized method on the ficcol / ferrographin gradient. The cell pellet was taken with a micropipette and applied to a glass slide; with another glass, the cell suspension was uniformly distributed over the glass. Let the smear dry, lower it to fix it in acetone solution or fix it with a Nikiforov mixture until the smear dries.
  • the peptide composition obtained in Example 3 is applied to the dried smear and left in an incubator at 37 ° C for 40 minutes in a humid chamber to prevent the smear from drying out. Then the smear is washed with a buffered 0.9% solution of sodium chloride and a 0.1% solution of rhodamine-labeled bovine serum albumin is applied; it is also left for 20 minutes in a thermostat in a humid chamber. Labeled albumin treatment is necessary to block excess epitopes of cells that did not bind to specific fluorescent peptides. Then the smear is removed from the thermostat, washed with distilled water and dried. Detect the green fluorescent cells in a fluorescence microscope.
  • Virus-infected cells fluoresce green ( Figure 2), healthy cells fluoresce red ( Figure 1). If instead of a glass slide a Goryaev’s camera or a fluorometric nozzle is used, the percentage of cells infected with the virus can be calculated.
  • the developed test system was checked in a comparative test with the standardized and registered RNIF test system, PCR test system, and the culture method.
  • samples were taken from patients undergoing an outpatient study complaining of labial herpes between the ages of 22 and 60 years of both sexes.
  • Table 2 Comparative results of the examination of patients of two groups - with clinically and signs of labial herpes virus infection and a control group undergoing examination without clinical signs of labial herpes Method Identified viral antigen in Identified antigen in white blood cells
  • Patentable (43/43/100) (18/4/10) (43/43/100) (18/6/33)
  • the analysis results obtained using the developed method most closely correlate with the RNIF method and the culture method of virus isolation, both in the group of patients with clinical signs of labial herpes and in healthy people.
  • the proposed method is highly sensitive and specific, correlates in accuracy with the RNIF method.
  • a method for rapid laboratory diagnosis of diseases based on the detection of specific proteins and a device for its implementation can be implemented at pharmaceutical and biotechnological enterprises without changing the technological cycle and do not require new unique equipment or reagents.
  • the method allows to exclude the stage of production of specific immunoglobulins and accordingly to abandon the use of animals, speed up the development of test systems for new and poorly studied infectious diseases up to several days, significantly reduce the cost of production of test systems with the same sensitivity of the method with its significantly more specificity , the method correlates in specificity and sensitivity with the cultural method of virus isolation and polymerase chain reaction, does not require complicated and expensive of equipment.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к медицине. Способ быстрой лабораторной диагностики заболеваний основан на выявлении характерных для заболевания специфических белков-мишеней в реакции их специфического взаимодействия с белками-реагентами. Белок-мишень специфический для данного заболевания гидролизуют протеолитическими ферментами, модифицируют химическую структуру образовавшейся смеси олигопептидов таким образом, чтобы их заряд изменился на противоположный, и используют в качестве белков-реагентов вместо специфических иммуноглобулинов в методах иммунофлюоресцентного анализа и иммуноферментного анализа. Устройство для осуществления способа для быстрой лабораторной диагностики заболеваний содержит пластинку, нанесенный на нее проводящий слой, образующий электроды, защитное диэлектрическое покрытие, контактные выводы, иммунохимическую биоматрицу на поверхности одного из электродов, содержащую сорбированные специфические к определенному белку иммуноглобулины. В качестве биоматрицы используют пришитый к металлической поверхности гидролизованный протеолитическими ферментами и модифицированный с заменой заряда молекул на противоположный детектируемый антиген.

Description

Способ быстрой лабораторной диагностики заболеваний, основанный на выявлении специфических белков и устройство для его осуществления
Область техники
Изобретение относится к медицине, а именно, к методам лабораторной диагности- ке и предназначено для замены существующих методов иммунодиагностики с примене- нием иммуноглобулинов на патентуемый значительно менее затратный метод.
Предшествующий уровень техники
Среди существующих лабораторных методов диагностики заболеваний, где ис- пользуются специфические иммуноглобулины, наиболее распространены иммунофер- ментный метод и метод иммунофлюоресценции.
Иммуноферментный анализ, или ИФА (англ. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)— это лабораторный иммунологический метод качественного определения и ко- личественного измерения антигенов, а также иммуноглобулинов и гормонов. Метод ИФА обладает высокой чувствительностью и специфичностью, которая в настоящее время со- ставляет более 90%. Тест-системы для иммуноферментной диагностики выявляют широ- кий круг различных инфекций: ВИЧ-инфекция, вирусные гепатиты, цитомегаловирусная, герпесная, токсоплазменная и др.
Метод иммуноферментного анализа (ИФА) дает возможность определения антител
(IgG, IgA, IgM) к возбудителям инфекции в крови. Эти антитела вырабатываются орга- низмом в ответ на инфицирование. Антитела выявляются при взаимодействии со специ- альными препаратами, содержащими соответствующие антигены, образующие с антите- лами прочный комплекс, который можно обнаружить разными способами. В основе мето- да лежит принцип взаимодействия иммуносорбента— антигена возбудителя инфекции с выявляемыми антителами. В зависимости от того, какие антитела использованы, тест- система будет выявлять в исследуемом образце или специфические антитела независимо от их класса, или антитела лишь определённого класса. Материалом для исследования служит сыворотка или плазма венозной крови, взятой натощак.
Для диагностики венерических заболеваний используются три класса иммуноглобулинов: М, A, G.
Благодаря тому, что иммуноглобулины разных классов вырабатываются в опреде- ленной последовательности, с помощью ИФА можно диагностировать инфекцию на раз- ных стадиях, и отслеживать динамику развития процесса. Последовательность выработки иммуноглобулинов разных классов следующая: Первыми появляются IgM-антитела. Как правило, это происходит через 1-3 недели с момента заражения. Время обнаружения ан- тител зависит как от самой инфекции, так и от особенностей иммунной системы конкрет- ного человека. Появляются симптомы острой инфекции. Обнаружение IgM-антител в ана- лизе указывает на наличие острой фазы заболевания или на обострение хронических ин- фекционных заболеваний.
Через месяц начинают вырабатываться IgA-антитела, основная часть которых кон- центрируется на слизистых оболочках, где реализуется их защитная функция.Последними появляются IgG-антитела, как правило, на 4 неделю с момента заражения. После лечения хламидиоза, микоплазмоза, трихомониаза их уровень значительно снижается, так как им- мунитет против этих заболеваний не развивается. Следует обратить внимание на то, что обнаружение иммуноглобулинов (IgM, IgG, IgA) указывает только на наличие антител, а не на наличие возбудителя. Поэтому в некоторых случаях иммуноферментный анализ мо- жет давать и ложные результаты— как ложноположительные, так и ложноотрацательные. Однако, специфичность лучших тест-систем ИФА рекомбинантного типа в настоящее время приближается к 100%.
Таким образом, за счет несомненных преимуществ иммуноферментного анализа: удобства в работе, быстроты, объективности за счет автоматизации учета результатов, возможности исследования иммуноглобулинов различных классов (что важно для ранней диагностики заболеваний и их прогноза) в настоящее время является одним из основных методов лабораторной диагностики. Достоинства ИФА— возможность ранней диагно- стики инфекции, возможность прослеживать динамику развития процесса, быстрота и удобство в работе. Недостаток ИФА— относясь к непрямым методам диагностики, он позволяет определить иммунный ответ организма на возбудителя, а не сам возбудитель.
Иммунофлюоресцентный анализ также применяют для выявления, как антигенов, так и антител. Этот метод основан на использовании реагентов, меченных флюоресцент- ным красителем. Антитела чаще всего метят флюоресцеина изотиоцианатом. Меченые антитела связываются с антигеном, образуя комплексы, которые можно выявить с помо- щью флюоресцентной микроскопии. Существуют три модификации иммунофлюорес- центного анализа. 1. Метод прямой иммунофлюоресценции применяют для выявления антигенов. Он основан на непосредственном связывании антигена, сорбированного на твердой подложке, с мечеными антителами. Реакцию оценивают с помощью флюорес- центного микроскопа. 2. Метод непрямой иммунофлюоресценции позволяет выявить ан- титела к известному антигену. Антиген, сорбированный на твердой подложке, связывает- ся с немечеными антителами. Комплексы антиген— антитело выявляются с помощью ме- ченых антител к иммуноглобулинам. 3. Метод конкурентной иммунофлюоресценции ос- нован на связывании стандартного меченого и присутствующего в исследуемой пробе немеченого антигенов с антителами, сорбированными на твердой подложке. Поскольку меченый и немеченый антигены конкурируют за связывание с антителами, по количеству связанного меченого антигена можно определить концентрацию антигена в исследуемой пробе.
Известен способ детекции вируса гриппа и компоненты для его использования ['], где не используются антитела. В этом методе патентуются компоненты, способные спе- цифически связываться с активными участками нейраминидазы вируса гриппа и новые компоненты для использования в этом методе. В качестве веществ, специфически взаимо- действующих с гриппозной нейраминидазой патентуются синтетические производные аналоги нейраминовой кислоты. Предполагается использование синтетических производ- ных нейраминидазы в антительных тест-системах вместо иммуноглобулинов. Недостат- ком метода является полностью синтетический характер производных нейраминидазы и соответственно сложность синтеза и производство тест-системы, что значительно увели- чивает ее цену, необходимость синтеза производного к каждому штамму вируса гриппа со своей нейраминидазой, невозможность использования метода для детекции других ин- фекций и выявления других белков, кроме гриппозных.
Также известен иммунодиагностический способ и набор к нему для детектирова- ния вирусных антигенов, таких как простой герпес [2]. Вирусный антиген иммуноконъю- гирован со специфическим иммуноглобулином IgG против вирусного антигена и сорби- рован на нерастворимой матрице. Матрица взаимодействует при контакте с моноклональ- ными иммуноглобулинами IgM, мечеными биотином. Наличие антигена вируса герпеса выявляется реакцией авидина с биотином. Метод является аналогом иммуноферментного анализа. Недостатком метода является необходимость получения специфических имму- ноглобулинов против вирусных антигенов с применением животных либо использования гибридом для получения моноклональных антител, что значительно удорожает конечный продукт. Также в методе используют многократную ковалентную конюгацию иммуногло- булинов с биотином и специфических иммуноглобулинов с нерастворимым матриксом, что значительно уменьшает специфичность и чувствительность иммуноглобулинов от че- го значительно падает точность проведенных исследований. Кроме того, метод предна- значен только для детекции вирусных антигенов и не может быть использован для выяв- ления бактериальных, грибковых и других низкоиммуногенных белков, к которым у им- мунизированных животных трудно индуцировать синтез специфических иммуноглобули- нов. Известен биосенсор для детекции наличия в биологическом материале четко определенного белка, который содержит пластинку, нанесенный на нее проводящий слой, образующий электроды, защитное диэлектрическое покрытие, контактные выводы, имму- нохимическую биоматрицу на поверхности одного из электродов содержащую сорбиро- ванные специфические к определяемому белку иммуноглобулины [ ].
Раскрытие изобретения
В основу изобретения поставлена задача разработать способ быстрой лабораторной диагностики заболеваний и прибор для его осуществления, основанный на выявлении специфических белков, способный выявлять любой белок, специфический для конкретной болезни, в том числе низкоиммуногенный белок, к которому невозможно или трудно по- лучить специфический иммуноглобулины. В предлагаемом способе не используются им- муноглобулины и животные для их получения, процедуры получения белка - реагента сводится к нескольким простым процедурам и позволяет разрабатывать тест-системы для выявления новых и малоизученных инфекционных заболеваний к кратчайшие сроки.
Поставленная задача решается путем разработки способа быстрой лабораторной диагностики заболеваний, основанного на выявлении характерных для заболевания спе- цифических белков-мишеней в реакции их специфического взаимодействия с другими белками-реагентами, отличающегося тем, что берут специфический для данного заболе- вания белок-мишень (вьщеленный из микроорганизма, вируса или микроскопического грибка), гидролизуют протеолитическими ферментами, модифицируют химическую структуру образовавшегося макромолекулярного ансамбля из олигопептидов путем аци- лирования янтарным ангидридом или алкилированием монохлоруксусной кислотой. Реак- цию ведут таким образом, чтобы их заряд изменился на противоположный, и используют далее уже в качестве белков-реагентов в методах иммунофлюоресцентного и иммунофер- ментного анализов или с применением импедансного биосенсора вместо специфических и антивидовых иммуноглобулинов. В качестве протеолитчиеских ферментов могут быть использованы: пепсин, трипсин, папанин, химотрипсин. Между полученным макромоле- кулярным ансамблем кислых олигопептидов и флюоресциирующим веществом флюорес- цеинизотиоцианатом или другим флюоресцентным зондом могут быть получены флюо- ресцирующие конюгаты для дальнейшего применения в методе флюоресцирующих анти- тел (прямой или непрямой иммунофлюоресценции). Аналогично могут быть получены конюгаты между супрамолекулярным ансамблем кислых пептидов и ферментом пероксидазой для дальнейшего использования этого конъюгата в иммуноферментном анализе.
Поставленная задача решается также путем разработки устройства для быстрой ла- бораторной диагностики заболеваний путем определения наличия в биологическом мате- риале четко определенного белка, которое содержит пластинку, нанесенный на нее прово- дящий слой, образующий электроды, защитное диэлектрическое покрытие, контактные выводы, иммунохимическую биоматрицу на поверхности одного из электродов содержа- щую сорбированные специфические к определяемому белку иммуноглобулины, отли- чающегося тем, что в качестве биоматрицы используют пришитый к металлической по- верхности гидролизованный протеолитическими ферментами и модифицированный с за- меной заряда молекул на противоположный детектируемый антиген.
Вместо иммуноглобулинов авторами использован ансамбль из олигопептидов - продуктов гидролиза детектируемых впоследствии специфических антигенов, но с изме- ненными на противоположные зарядами молекул. Ансамбль - термин из супрамолекуляр- ной химии. Объекты супрамолекулярной химии— супрамолекулярные ансамбли, строя- щиеся самопроизвольно из комплементарных, т. е. имеющих геометрическое и химиче- ское соответствие фрагментов, подобно самопроизвольной сборке сложнейших простран- ственных структур в живой клетке [4,5]
Специфическое взаимодействие обусловлено эффектом конъюгации и гибридиза- ции гомогенных пептидов, но имеющих противоположный заряд - самосборка на мишени супрамолекулярного ансамбля. Метод позволяет исключить этап получения специфиче- ских иммуноглобулинов и соответственно отказаться от использования животных, уско- рить до нескольких дней разработку тест-систем для новых и малоизученных инфекцион- ных заболеваний, значительно снизить стоимость производства тест-систем при той же чувствительности метода, но при значительно большей его специфичности.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1.- Фотография эпителиальных клеток мазка, не инфицированных вирусом герпеса в патентуемом методе Фиг. 2. - Инфицированные вирусом герпеса 1 типа клетки букального эпителия, выявленные патентуемым методом
Фиг.З.- Структура (схема) предлагаемого устройства -импедансного биосенсора (вид сверху) : 1 - электроды (золотые, платиновые, иридиевые или др..), 2- кремниевая подложка, 3- иммунохимическая ячейка с сорбированным пептидогидролизатом, 4- изолирующая подложка (стеклянная, кремниевая, пластмассовая, резиновая или др.), к иммунохимической ячейке с двух сторон подведены электроды.
Фиг.4 - Структура (схема) предлагаемого устройства - импедансного биосенсора (вид сбо- ку): 1 - электроды (золотые, платиновые, иридиевые или др..), 2- кремниевая под- ложка, 3- иммунохимическая ячейка с сорбированным пептидогидролизатом, 4- изо- лирующая подложка (стеклянная, кремниевая, пластмассовая, резиновая или др.), к иммунохимической ячейке с двух сторон подведены электроды.
Фиг.5.- Принцип работы предлагаемого устройства - импедансного многоэлектродного иммунохимического биосенсора на золотой подложке: а - между антителами и ан- тигенами в растворе нет реакции, б- между антителами и антигенами а растворе идет преципитация (образование комплекса и осадка), что отражается на характере импе- дансной кривой.
Устройство работает следующим образом. При внесении в иммунохимическую ячейку 3 биологического материала при наличии иммунохимической реакции (между ацилированными пептидами с поверхности ячейки и специфическим антигеном) с течени- ем времени импедансная кривая меняется. При отсутствии иммунохимической реакции импедансная кривая остается неизменной. Это позволяет производить детекцию наличия в биологическом материале четко определенного белка.
Наиболее быстрыми и точными методами селективной детекции ДНК, РНК и бел- ков являются биосенсоры, принцип работы которых основан на импедансе, адмитансе и электронной проводимости ДНК [1 - 3]. Аппаратная часть детекторов давно изучена и хорошо проработана: регистрацию сигналов осуществляют электрохимическими метода- ми: хроноамперометрией, циклической вольтамперометрией и электрохимической импе- дансной спектроскопией (ЭИС) [4 - 6]. Основным узким местом биосенсоров является электрод: он либо имеет ограниченное время службы либо настолько высокочувствите- лен, что дает ложноотрицательные срабатывания. В настоящее время все чаще применяе- ются иммунобиосенсоры, принцип работы которых основан на выявлении реакции обра- зования комплексов антиген-антитело электрохимическим путем. На один из электродов наносят антитела (пришивают малеимидом или имидами кремниевых кислот) и регистрируют импеданс в контрольном растворе. Затем вносят опытный раствор с опре- деляемым антигеном. В случае образования иммунных комплексов между нанесенными на электрод антителами и антигенами меняется картина вольтамперометрической кривой. При этом легко определяется корреляция между количеством антигена в пробе и характе- ром кривой. Аналогично можно выявлять и специфические антитела в растворе, если на электрод сорбировать специфический антиген. Недостатком метода является необходи- мость применения иммуноглобулинов (антител) для выявления антигенов. Иммуноглобу- лины являются наиболее дорогостоящим компонентом биосенсора в связи с тем, что для получения эффективного иммунобиосенсора нужны поликлональные иммуноглобулины вакцинированного животного (чаще всего кролей). Соответственно, для получения про- мышленных количеств иммуноглобулинов нужен виварий и система для очистки белков крови, хроматографического выделения иммуноглобулинов. Предлагаемый нами метод позволяет заменить иммуноглобулины на определяемый антиген, но с измененными на противоположный зарядами молекул. Перед нанесением на электрод такие антигены фрагментируют протеолетическими ферментами и модифицируют антигдридами дикар- боновых кислот либо хлорпроизводными кислот. В этом случае сорбированные фрагмен- ты антигена приобретают свойства афинности и комплементарности к своим немодифи- цированным производным. Кроме того, в отличие от водороных связей между иммуног- лобулинами и антигенами, между ацилированными фрагментами и нативным антигеном образуется ионная связь. Реакция идет очень быстро, буквально за несколько секунд. Это позволяет создавать биосенсоры для мгновенного определения опасных микробных и ви- русных возбудителей в биологических средах, если речь идет о жизни и смерти пациента. На фиг.5 приведен импеданс для многоэлектродного золотого чипа-биосенсора.
Примеры осуществления изобретения
Пример 1. Получение тест-системы для диагностики гриппа, содержащего нейраминидазу N1 и геммаглютинин HI .
Берут амниотическую жидкость после инфицирования куриного эмбриона вирусом гриппа H1N1 и инкубирования до накопления максимального количества вируса в извест- ных стандартизованных условиях, очищают известными методами содержащийся там ви- рус гриппа, концентрируют его путем диализа. К полученному концентрату добавляют раствор трипсина с расчетом, чтобы соотношение фермент: белок составляло 1 :100, ос- тавляют в термостате при 37° С на 12 часов. Концентрацию растворимых олигопептидов - продуктов гидролиза определяли спектрофотометрически при 280 нм и 260 нм. Спектрофотометрический метод определения белка основан на способности аромати- ческих аминокислот (триптофан, тирозин и в меньшей степени фенилаланин) поглощать ультрафиолетовый свет с максимумом поглощения при 280 нм. Условно принято считать, что при концентрации белка в растворе, равной 1 мг/мл, величина оптической плотности при 280 нм равна 1 при использовании кюветы с толщиной слоя 10 мм. В качестве раство- ра сравнения использовали растворитель препарата. Концентрация испытуемого белка в растворе должна быть от 0,05 до 2 мг/л. Определению белка данным методом мешают присутствие нуклеиновых кислот и нуклеотидов (более 20 %). В этом случае оптическую плотность одного и того же раствора измеряют при двух длинах волн— 260 и 280 нм; со- держание белка X (мг/мл) рассчитывают по формуле Калькара:
Figure imgf000009_0001
Полученную смесь олигопептидов и РНК кипятят 10 минут, затем образовавшийся осадок негидролизованных биополимеров отделяют центрифугированием при 5g в тече- ние 20 минут. К надосадочной жидкости добавляют флюоресцеина изотиоцианата в соот- ношении к белку 1/10000, оставляют раствор при +5°С на 5 часов, затем добавляют твер- дый янтарный ангидрид в соотношении к концентрации белка 2:1. Полученную смесь реа- гента далее используют в методе флюоресцирующих антител. Также в наборе используют конъюгированный с родамином стандартизованный бычий сывороточный альбумин.
Пример 2. Детекция инфицирования вирусом гриппа H1N1.
У пациентов, у которых подозревают грипп, берут бронхиальное отделяемое, мазок слизистой носа, кровь. Каждую пробу ресуспензируют в 0,9 % забуференном растворе на- трия хлорида, центрифугируют. Процедуру ресуспендирования и центрифугирования по- вторяют трижды для очистки клеток от сопутствующих растворимых компонентов. Оса- док клеток отбирают микропипеткой и наносят на предметное стекло, другим стеклом суспензию клеток равномерно распределяют по стеклу. Дают мазку высохнуть, опускают для фиксации в раствор ацетона либо фиксируют смесью Никифорова до высыхания маз- ка. На высушенный мазок наносят полученную в примере 1 композицию пептидов и ос- тавляют в термостате при 37° С на 40 минут во влажной камере для предотвращения вы- сыхания мазка. Затем мазок промывают забуференным 0,9% раствором натрия хлорида и наносят 0,1 % раствор меченного родамином бычьего сывороточного альбумина, также оставляют на 20 минут в термостате во влажной камере. Обработка альбумином необхо- дима для блокирования лишних эпитопов клеток, не связавшихся со специфическими флюоресцирующими пептидами. Затем мазок вынимают из термостата, промывают дистиллированной водой и высушивают. Детектируют флюоресцирующие зеленым цве- том клетки в флюоресцентном микроскопе. Инфицированные вирусом клетки флюорес- цируют зеленым цветок, здоровые клетки флюоресцируют красным цветом. Если вместо предметного стекла использовать камеру Горяева или флюорометрическую насадку, то можно сосчитать процентное соотношение инфицированных вирусом клеток.
Для проверки работоспособности метода разработанную тест-систему проверяли в сравнительном тесте со стандартизованными и зарегистрированными РНИФ-тест- системой, ПЦР-тест-системой и клуьтуральным методом. Для детекции брали образцы тканей больных, находящихся в стационарах в период эпидемии гриппа возрастом от 12 до 75 лет обоего пола.
В качестве контролей использовали стандартизованную тест-систему для реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) выявления антигенов вируса гриппа H1N1 производства НИИ Гриппа РАМН (г. Санкт-Петербург, Российская Федерация), ревертаз- ный ПЦР-диагностикум TaqMan (США) и выделение вируса in ovo с его детекцией стан- дартизованным методом гемагглютинации. На рисунке 1 представлены результаты срав- нения стандартного метода РНИФ и патентуемого способа.
Таблица 1.- Сравнительные результаты обследования пациентов двух групп - с кли- ническими признаками гриппа, находящиеся в стационаре в период эпидемии гриппа и контрольная группа, проходящая плановое обследование без клиниче- ских признаков гриппа
Способ Выявлено вирусный анти- Выявлено антиген в мазке Выявлено антиген в леко- ген в бронхиальном отде- из слизистой носа цитах крови
ляемом (Всего пациен- (Всего пациен-
(Всего пациен- тов/выявлено/%) тов/выявлено/%) тов/выявлено/%)
Опытная Контроль Опытная Контроль Опытная Контроль группа (с (без клини- группа (с (без клини- группа (с (без клини- клинически- ческих при- клинически- ческих при- клинически- ческих при- ми призна- знаков ми призна- знаков ми призна- знаков ками гриппа) гриппа) ками гриппа) гриппа) ками гриппа) гриппа)
Патентуемый (180/107/59) (40/4/10) (180/102/57) (40/2/5) (180/1 10/61) (40/4/10)
Контрольный (180/62/34) (40/1/2,5) (180/69/38) (40/0/0) (180/68/38) (40/2/5)
РНИФ
Контрольный (180/102/57) (40/6/15) (180/100/55) (40/5/12) (180/100/55) (40/4/10)
ПЦР -
Figure imgf000011_0001
Как видно из таблицы 1 , результаты анализа, полученные с помощью разработанного ме- тода наиболее близко коррелируют с золотым стандартом вирусологии - культуральным методом выделения вирусом и методом ПЦР как в группе пациентов с клиническими при- знаками гриппа, так и у практически здоровых людей. Таким образом, предлагаемый ме- тод обладает высокой чувствительностью и специфичностью, по точности приближается к культуральному методу детекции вирусов, который является стандартом вирусологиче- ской диагностики. Пример 3. Получение тест-системы для диагностики герпеса 1 типа
Берут амниотическую жидкость после инфицирования куриного эмбриона вирусом герпеса (штамм Л-2) и инкубирования до накопления максимального количества вируса в известных стандартизованных условиях, очищают известными методами содержащийся там вирус герпеса, концентрируют его путем диализа. К полученному концентрату добав- ляют раствор трипсина с расчетом, чтобы соотношение фермент: белок составляло 1 : 100, оставляют в термостате при 37° С на 12 часов. Концентрацию растворимых олигопепти- дов - продуктов гидролиза определяли спектрофотометрически при 280 нм и 260 нм как описано в примере 1.
Полученную смесь олигопептидов и ДНК кипятят 10 минут, затем образовавшийся осадок негидролизованных биополимеров отделяют центрифугированием при 5g в тече- ние 20 минут. К надосадочной жидкости добавляют флюоресцеина изотиоцианата в соот- ношении к белку 1/10000, оставляют раствор при +5°С на 5 часов, затем добавляют твер- дый янтарный ангидрид в соотношении к концентрации белка 2: 1. Полученную смесь реа- гента далее используют в методе флюоресцирующих антител. Также в наборе используют конъюгированный с родамином стандартизованный бычий сывороточный альбумин.
Пример 4. Детекция инфицирования вирусом герпеса 1 типа
У пациентов, с признаками лабиальной герпесвирусной инфекции берут мазки из очага поражения, мазки лейкоцитов крови. Каждую пробу ресуспензируют в 0,9 % забу- ференном растворе натрия хлорида, центрифугируют. Процедуру ресуспендирования и ю центрифугирования повторяют трижды для очистки клеток от сопутствующих растворимых компонентов. Лейкоциты дополнительно выделяют стандартизованным ме- тодом на градиенте фиккол/ферографин. Осадок клеток отбирают микропипеткой и нано- сят на предметное стекло, другим стеклом суспензию клеток равномерно распределяют по стеклу. Дают мазку высохнуть, опускают для фиксации в раствор ацетона либо фиксиру- ют смесью Никифорова до высыхания мазка. На высушенный мазок наносят полученную в примере 3 композицию пептидов и оставляют в термостате при 37° С на 40 минут во влажной камере для предотвращения высыхания мазка. Затем мазок промывают забуфе- ренным 0,9% раствором натрия хлорида и наносят 0,1 % раствор меченного родамином бычьего сывороточного альбумина, также оставляют на 20 минут в термостате во влажной камере. Обработка меченным альбумином необходима для блокирования лишних эпито- пов клеток, не связавшихся со специфическими флюоресцирующими пептидами. Затем мазок вынимают из термостата, промывают дистиллированной водой и высушивают. Де- тектируют флюоресцирующие зеленым цветом клетки в флюоресцентном микроскопе. Инфицированные вирусом клетки флюоресцируют зеленым цветом (Фиг.2), здоровые клетки флюоресцируют красным цветом (Фиг.1). Если вместо предметного стекла исполь- зовать камеру Горяева или флюорометрическую насадку, то можно сосчитать процентное соотношение инфицированных вирусом клеток.
Для проверки работоспособности метода разработанную тест-систему проверяли в сравнительном тесте со стандартизованными и зарегистрированными РНИФ-тест- системой, ПЦР-тест-системой и клуьтуральным методом. Для детекции брали образцы у больных, находящихся на амбулаторном исследовании с жалобами на лабиальный герпес возрастом от 22 до 60 лет обоего пола.
В качестве контролей использовали стандартизованную тест-систему для реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) выявления антигенов вируса герпеса 1 типа производства «Лабдиагностика» (г. Москва, Российская Федерация), ПЦР-диагностикум ЗАО «НПФ ДНК-Технология» (Российская Федерация) и выделение вируса in ovo с его детекцией стандартизованным методом иммунофлюоресценции фирмы «Лабдиагности- ка». На рисунке 1 представлены результаты сравнения стандартного метода РНИФ и па- тентуемого способа.
Таблица 2.- Сравнительные результаты обследования пациентов двух групп - с кли- нически и признаками лабиальной герпесвирусной инфекцией и контрольная группа, проходящая обследование без клинических признаков лабиального гер- песа Способ Выявлено вирусный антиген в Выявлено антиген в лейкоцитах
мазке с очага поражения (Всего пациентов/выявлено/%) (Всего пациентов/выявлено/%)
Опытная Контроль (без Опытная группа (с Контроль (без клиниче- группа (с клинических клиническими призна- ских признаков лаби- клиническими признаков ла- ками лабиального гер- ального герпеса) признаками биального песа)
лабиального герпеса)
герпеса)
Патентуемый (43/43/100) (18/4/10) (43/43/100) (18/6/33)
Контрольный (43/34/34) (18/1/2,5) (43/40/93) (18/6/33)
РНИФ
Контрольный (43/102/57) (18/6/15) (43/36/84) (18/0/0)
ПЦР
Культивирование (43/43/100) (18/3/7) (43/12/28) (18/4/22)
in ovo, детекция
РНИФ
Как видно из таблицы 2, результаты анализа, полученные с помощью разработанного ме- тода наиболее близко коррелируют с методом РНИФ и культуральным методом выделе- ния вирусов, как в группе пациентов с клиническими признаками лабиального герпеса, так и у здоровых людей. Таким образом, предлагаемый метод обладает высокой чувстви- тельностью и специфичностью, по точности коррелируется с методом РНИФ.
Промышленная применимость способа и устройства.
Способ быстрой лабораторной диагностики заболеваний, основанный на выявлении спе- цифических белков и устройство для его осуществления могут быть внедрены на фарма- цевтических и биотехнологических предприятиях без изменения технологического цикла и не требуют нового уникального оборудования или реактивов. Способ позволяет исклю- чить этап получения специфических иммуноглобулинов и соответственно отказаться от использования животных, ускорить до нескольких дней разработку тест-систем для новых и малоизученных инфекционных заболеваний, значительно удешевить стоимость произ- водства тест-систем при той же чувствительности метода при значительно большей его специфичности, метод коррелируется по специфичности и чувствительности с культу- ральным методом выделения вируса и полимеразной цепной реакцией, не требует слож- ного и дорогостоящего оборудования. Использованные источники информации
1 US Patent N 6242582 Method of detection of influenza virus and compounds for use therein // Phillip Reece, Wen- Yang Wu, Betty Jin, Guy Kripper, Keith Watson
2 US Patent N 4535057 Immunoassay employing monoclonal herpes simplex antibody and bio- tin-avidin detection system// Gordon Dressman, Cynthia Kendall
3 Патент США 5567301
4 http://dic.academic.ru/dic.nsf/ruwiki/79240
5 Jean-Marie Lehn. Supramolecular Chemistry. Concepts and Perspectives.- Weinheim; New York; Basel; Cambridge; Tokyo: VCH Verlagsgesellschaft mbH, 1995.-P. 103 (Chapter 7)

Claims

Формула изобретения
1. Способ быстрой лабораторной диагностики заболеваний, основанный на выявлении ха- рактерных для заболевания специфических белков-мишеней в реакции их специфического взаимодействия с другими белками-реагентами, отличающийся тем, что берут специфи- ческий для данного заболевания белок-мишень, гидролизуют протеолитическими фермен- тами, модифицируют химическую структуру образовавшейся смеси (ансамбля) олигопеп- тидов таким образом, чтобы их заряд изменился на противоположный, и используют да- лее уже в качестве белков-реагентов.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что перед изменением заряда молекул композиции олигопептидов их ковалентно модифицируют флюоресцирующим агентом, а затем кова- лентно модифицируют химическую структуру образовавшейся смеси (ансамбля) олиго- пептидов с изменением их заряда на противоположный и используют в методе иммуноф- люоресцентного анализа.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что перед изменением заряда молекул композиции олигопептидов их ковалентно модифицируют бивалентным сшивающим агентом, а затем ковалентно модифицируют химическую структуру образовавшейся смеси (ансамбля) оли- гопептидов с изменением их заряда на противоположный, затем добавляют маркерный фермент, образовавшийся конъюгат фермента и композиции пептидов используют в ме- тоде иммуноферментного анализа.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве протеолитического фермента ис- пользуют трипсин.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве протеолитического фермента ис- пользуют папаин.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве протеолитического фермента ис- пользуют химотрипсин.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве протеолитического фермента ис- пользуют пепсин.
8. Способ по п.4-7, отличающийся тем, что продукт реакции между композицией моди- фицированных пептидов и специфическим белком-мишенью выявляют методом гель- электрофореза по увеличению массы белка-мишени.
9. Способ по п.2, отличающийся тем, что в качестве флюоресцирующего агента исполь- зуют флюоресциинизотиоцианат.
10. Способ по п.2, отличающийся тем, что где в качестве флюоресцирующего агента ис- пользуют родамин.
1 1. Способ по п.З, отличающийся тем, что в качестве маркерного фермента использу- ют пероксидазу.
12. Способ по п. 3, отличающийся тем, что в качестве бивалентного сшивающего агента используют глутаровый диальдегид.
13. Способ по п. 3, отличающийся тем, что в качестве бивалентного сшивающего агента используют малеимид
14. Способ по п. 3, отличающийся тем, что в качестве бивалентного сшивающего агента используют малоновый диальдегид.
15. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ковалентную модификацию структуры ком- позиции олигопептидов с заменой заряда проводят янтарным ангидридом.
16. Способ по п. 1, где ковалентную модификацию структуры композиции олигопептидов с заменой заряда проводят монохлоруксусной кислотой.
17. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве белка-мишени используют инак- тивированный температурой или радиацией микроорганизм.
18. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве белка-мишени используют инди- видуальный белок инактивированного температурой или радиацией микроорганизма.
19. Способ по п.п.17 -18, отличающийся тем, что в качестве микроорганизма использу- ют вирусы.
20. Способ по п.п.17 -18, отличающийся тем, что в качестве микроорганизма использу- ют бактерии.
21. Способ по п.п.17 - 18, отличающийся тем, что в качестве микроорганизма использу- ют микроскопические грибы.
22. Устройство для осуществления способа для быстрой лабораторной диагностики забо- леваний детекции путем определения наличия в биологическом материале четко опреде- ленного белка, который содержит пластинку, нанесенный на нее проводящий слой, обра- зующий электроды, защитное диэлектрическое покрытие, контактные выводы, иммуно- химическую биоматрицу на поверхности одного из электродов содержащую сорбирован- ные специфические к определяемому белку иммуноглобулины, отличающееся тем, что в качестве биоматрицы используют пришитый к металлической поверхности гидролизован- ный протеолитическими ферментами и модифицированный с заменой заряда молекул на противоположный детектируемый антиген.
PCT/RU2010/000689 2010-11-22 2010-11-22 Способ быстрой лабораторной диагностики заболеваний, основанный на выявлении специфических белков и устройство для его осуществления WO2012070963A1 (ru)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2010/000689 WO2012070963A1 (ru) 2010-11-22 2010-11-22 Способ быстрой лабораторной диагностики заболеваний, основанный на выявлении специфических белков и устройство для его осуществления
EA201300486A EA024771B1 (ru) 2010-11-22 2010-11-22 Способ быстрой лабораторной диагностики заболеваний, основанный на выявлении специфических белков
US12/931,459 US20120129195A1 (en) 2010-11-22 2011-02-01 Method of quick laboratory diagnosis if illnesses based on the discovery of specific proteins and equipment for its implementation
US13/849,883 US20130288230A1 (en) 2010-11-22 2013-03-25 Method for identification of a natural biopolymer

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2010/000689 WO2012070963A1 (ru) 2010-11-22 2010-11-22 Способ быстрой лабораторной диагностики заболеваний, основанный на выявлении специфических белков и устройство для его осуществления

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US12/931,459 Continuation US20120129195A1 (en) 2010-11-22 2011-02-01 Method of quick laboratory diagnosis if illnesses based on the discovery of specific proteins and equipment for its implementation

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012070963A1 true WO2012070963A1 (ru) 2012-05-31

Family

ID=46064699

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2010/000689 WO2012070963A1 (ru) 2010-11-22 2010-11-22 Способ быстрой лабораторной диагностики заболеваний, основанный на выявлении специфических белков и устройство для его осуществления

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20120129195A1 (ru)
EA (1) EA024771B1 (ru)
WO (1) WO2012070963A1 (ru)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111480079A (zh) * 2017-10-16 2020-07-31 伊纳诺生物股份有限公司 疾病蛋白质组蛋白质阵列及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5567301A (en) * 1995-03-01 1996-10-22 Illinois Institute Of Technology Antibody covalently bound film immunobiosensor
WO2010096331A1 (en) * 2009-02-11 2010-08-26 Duke University Sensors incorporating antibodies and methods of making and using the same

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20070094668A (ko) * 2003-12-23 2007-09-20 칼리퍼 라이프 사이언시즈, 인크. 분석물 주입 시스템

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5567301A (en) * 1995-03-01 1996-10-22 Illinois Institute Of Technology Antibody covalently bound film immunobiosensor
WO2010096331A1 (en) * 2009-02-11 2010-08-26 Duke University Sensors incorporating antibodies and methods of making and using the same

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KEPENG ET AL.: "Identification of protein - protein interactions of the occlusion - derived virus-associated proteins of Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus", JOURNAL OF GENERAL VIROLOGY, vol. 91, 2010, pages 659 - 670 *
MAHMOUD SHORMAN ET AL.: "Clinical Manifestations and Diagnosis of Influenza", SOUTHERN MEDICAL JOURNAL, vol. 96, no. (8):73, August 2003 (2003-08-01), pages 337 - 738 *
MARTYNOV A.V. ET AL.: "New approach to design and synthesis of therapeutic and preventive drugs, taking into account interspecies polymorphism of receptors (Method of precisionpartial modification)", ANNALS OF MECHNIKOV INSTITUTE, vol. 5-15, no. 4, 2007, pages 8 - 9 *
PIERCE BIOTECHNOLOGY, ANTIBODY LABELING, 2004, U.S.A., pages 40 - 43 *
SARAH L. NOTON ET AL.: "Identification of the domains of the influenza A virus M1 matrix protein required for NP binding, oligomerization and incorporation into virions", JOURNAL OF GENERAL VIROLOGY, vol. 88, 2007, pages 2280 - 2290 *
SMIRNOVA YU. A. ET AL.: "Flu Virion as a Substrate for Proteolytic Enzymes", RUSSIAN JOURNAL OF BIOORGANIC CHEMISTRY, vol. 34, no. 3, 2008, pages 369 - 374 *

Also Published As

Publication number Publication date
EA024771B1 (ru) 2016-10-31
US20120129195A1 (en) 2012-05-24
EA201300486A1 (ru) 2013-11-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2901296B2 (ja) カンピロバクター・ピロリの高分子型細胞関連蛋白の調製法とカンピロバクター・ピロリ感染の血清学的検出のための用法
CN102759631A (zh) 一种定量检测降钙素原pct的胶乳增强免疫比浊试剂盒
JP2015007651A (ja) 補体固定抗体の検出のための方法および組成物
CN113447659B (zh) 一种检测抗蛋白酶体亚基α1-IgG抗体的试剂盒
CN113447658B (zh) 一种检测抗过氧化物还原酶-1-IgG抗体的试剂盒
WO2022151596A1 (zh) 中和抗体高敏检测方法及产品
US20120064543A1 (en) Method for detecting substance in biological sample
JP2001512691A (ja) イムノアッセイ分析および分子生物学的な過程を調べるための電気化学的レポーターシステム
EP2161576B1 (en) Method of predicting risk of acquiring influenza
CN110178031A (zh) 寨卡病毒感染的血清学测定
JP4920173B2 (ja) 較正マイクロアレイ
WO2000060354A1 (en) Lipopolysaccharide immunoassay and test device
US8535951B2 (en) Reagent for detection of analyte and process thereof
WO2012070963A1 (ru) Способ быстрой лабораторной диагностики заболеваний, основанный на выявлении специфических белков и устройство для его осуществления
TW202307432A (zh) SARS-CoV-2之免疫測定方法及免疫測定套組、以及單株抗體或其之抗體片段
KR20200015276A (ko) 쯔쯔가무시균 유래 엑소좀을 이용한 쯔쯔가무시병의 진단방법
US20130288230A1 (en) Method for identification of a natural biopolymer
KR101311736B1 (ko) 샌드위치 면역분석 바이오칩 및 이를 사용한 면역분석법
US20110300529A1 (en) Detection of ifi16 in body fluids
TW201943727A (zh) 單域結合蛋白及其組合及多種標記單域結合蛋白之應用及用於特異性過敏原ＩｇＥ的檢測方法
CN113447657B (zh) 一种检测抗乌头酸水合酶-IgG抗体的检测试剂盒
CN114660283B (zh) 一种基于电学加速的免疫检测板式芯片及其制备方法
JP5137880B2 (ja) 結合性物質を固定化した乾燥粒子の製造方法
KR20080049827A (ko) 칸디다 진단용 칩
Shlyapnikov et al. Rapid detection of femtogram amounts of protein by gel-free immunoblot

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 10859913

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

DPE2 Request for preliminary examination filed before expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 201300486

Country of ref document: EA

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 10859913

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1