JP2001512691A - イムノアッセイ分析および分子生物学的な過程を調べるための電気化学的レポーターシステム - Google Patents

イムノアッセイ分析および分子生物学的な過程を調べるための電気化学的レポーターシステム

Info

Publication number
JP2001512691A
JP2001512691A JP2000506361A JP2000506361A JP2001512691A JP 2001512691 A JP2001512691 A JP 2001512691A JP 2000506361 A JP2000506361 A JP 2000506361A JP 2000506361 A JP2000506361 A JP 2000506361A JP 2001512691 A JP2001512691 A JP 2001512691A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
electrochemical
enzyme
reporter system
substrate
nucleic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2000506361A
Other languages
English (en)
Inventor
ロバート・ディ・マクフィー
クライブ・アール・テイラー
ライナー・ヒンチェ
レネ・ザイツ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Southern California USC
Original Assignee
University of Southern California USC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US09/105,538 external-priority patent/US6682648B1/en
Application filed by University of Southern California USC filed Critical University of Southern California USC
Publication of JP2001512691A publication Critical patent/JP2001512691A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/005—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/28—Electrolytic cell components
    • G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
    • G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
    • G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
    • G01N27/3277—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction being a redox reaction, e.g. detection by cyclic voltammetry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54373—Apparatus specially adapted for solid-phase testing involving physiochemical end-point determination, e.g. wave-guides, FETS, gratings
    • G01N33/5438—Electrodes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Electrochemistry (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

(57)【要約】 免疫化学的および分子生物学的な終了点レポータ−システムにおいて、レドックス・リサイクルし得る電気化学的に活性な分子に結合、または該電気化学的に活性な分子の比率的生成を起こし得る酵素に結合した反応産物を、貴金属電極の密接な間隙のデジタル間配置を有するシリコン・マイクロチップでもって電流測定することにより、検出および／または定量する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本出願は、米国仮特許出願６０／０５５，４６６（１９９７年８月１２日出願
）、米国仮特許出願６０／０５５，７５９（１９９７年８月１４日出願）および
米国特許出願０９／１０５，５３８および０９／１０５，５３９（１９９８年６
月２６日出願）に基づく。
【０００２】 （発明の分野） 本発明は、電気化学的方法および関連マイクロチップ装置に関する。この装置
の用途は、免疫化学的および／または分子生物学的進行を監視するための電圧測
定または電流測定による検定である。
【０００３】 （発明の背景） 何らかの化学反応の有用性を評価するのに、無機、有機または生化学反応であ
ろうとも、反応物および産物の組成および相対量は、反応の進行中または平衡終
了点にて測定されなければならない。このような監視を行う一つの具体的な手段
は、構造的に制限された方法で反応物または産物のいずれかの分子に結合できる
生物的または非生物的分子を利用する。これらの分析技法は、抗体以外の物質が
認識分子として機能するとしても、免疫グロブリンの選択的認識および結合能力
に関して、一般的に免疫化学的であると言われている。用語レセプターおよびリ
ガンドは、分析技術に関するこの分野をより一般的に表すために使用されてきた
。これらの技法は、基礎有機化学および生化学に様々に適用されるが、臨床医学
の分野において多くの発展を遂げてきた。免疫化学的に反応の進行を測定するた
めの適切な一般的原則は、多くの他の科学的探求に適用可能であるが、臨床医学
の分野からの例を用いて説明され得る。現在、多くの免疫化学的に様式された試
験は、臨床的に重要ないかなる生物分子をも実質的に測定するために開発されて
きた。このような分析方法は、２、３例をあげると、毒物学、内分泌学、免疫学
、血清学、微生物学および酵素学の実験研究の礎となっている。
【０００４】 現在最も多く利用されている方法は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ
）である。この方法は非常に広範な分野、例えば、バイオテクノロジー、環境保
護、公衆衛生などに適用可能である。この従来技術の比色検定法の実施には、光
学的透明度、光電子増倍、シグナルのデジタル化またはアナログの定量化および
送達、粘着性またはバックグランドの発光中性を要件とするという弱点がある。
【０００５】 免疫化学の分野において、例えば、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）および特に
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、当業者によく知られており、異物
、例えば体液および体組織中の抗原または抗体の存在を検出するための臨床検査
室での重要で比較的コスト効率のよい手段となっている（参照、例えばImmunoas
say, Diamandis, E. and Christopoulos, T. eds., (1996); Clausen, J., Immu
nochemical Techniques for the Identification and Estimation of Macromole
cules (Laboratory Techniques in Biochemestry and Molecular Biology) Vol.
1 (1989); Tijssen, P., Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Labo
ratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology), (1985); Princi
ples and Practice of Immunoassay 2d ed., Price, C. and Newman, D., eds.
(1997))。
【０００６】 このようなイムノアッセイは、一般的に信頼性はあるが、結果を出すのに高度
で非常に高額な光学的工程に依存する。このような光学的工程は高価であり、清
潔で汚れていない測定室を要し、視覚的に表示されたシグナルは、単純な方法で
結果を正確に定量化することを妨げるので、扱いにくい。光学システムの状態に
は、いくつかの欠点があり、一般的に光学的透明度、光電子増倍、シグナルのデ
ジタル化またはアナログの定量化および送達、および適当な粘着度および／また
は中性光学的バックグランドを要する。透明な支持媒体は、水性またはその他で
も、汚れたりまたは不透明になり、光学レポーターを用いる正確な分析を妨げ、
困難にする。
【０００７】 体液中の抗原を検出する光学システム以外のシステムを提供する試みがなされ
たきた。Duan, C. et al., "Separation -Free Sandwich Enzyme Immunoassays
Using Microporous Gold Electrodes and Self-Assembled Monolayer/Immobiliz
ed Capture Antibodies, "Analytical Chemistry, 66/9:1369-77(1994)は、金メ
ッキ微多孔性細胞膜を用いる、従来のイムノアッセイプロトコルを単純化する目
的の分離遊離システムを開示する。金メッキ微多孔性細胞膜は、非競合的サンド
ウィッチ型イムノアッセイのための固体相として働き、電流測定による検出シス
テムの電極を動かす。捕捉モノクローナル抗体は、従来の化学結合剤によって細
胞膜の金メッキ側に共有結合的に固定される。モデル分析タンパク質およびアル
カリホスファターゼ標識抗体は、固定化捕捉抗体で同時にインキュベートされる
。表面結合抗体は次いで、金メッキされていない細胞膜の裏側から酵素基質、例
えば、４−アミノフェノールホスフェートを導入することにより、サンプル中の
過剰のコンジュゲートから分離して検出される。基質は、細胞膜からしみ出て、
金メッキ表面で結合酵素抗体コンジュゲートに接する。従って、アミノフェノー
ルは、酵素で発生し、金電極において酸化により検出される。電流の大きさはサ
ンプル中の分析物の濃度の測定である。しかしながら、Duanに開示されたシステ
ムの感受性は非常に低く、本発明の０．１ｎＡと比較して２０ｎＡシグナルも要
する。実際のタンパク質検出限界を考えると、本発明は感受性が５０倍優位であ
ることになる。Duanに記載のシステムは、５００ng/lのレベルまでタンパク質（
ヒトchorionoicゴナドトロピン）を検出可能なだけだが、本明細書に記載の新規
な方法は１０ng/lのタンパク質検出限界を示した。
【０００８】 Meyerhoff, M. et al., "Novel Nonseparation Sandwich-Type Electrochemic
al Enzyme Immunoassay System for Detecting Marker Proteins in Undiluted
Blood," Clinical Chemistry, 41/9:1378-1384(1995) で報告されている別の実 験によれば、類似の微多孔性細胞膜は、非希釈血液におけるマーカータンパク質
の検出のための非分離サンドウィッチ型電気化学的酵素イムノアッセイシステム
で使用された。しかしながら、この方法は、血液中の前立腺特異的抗原（ＰＳＡ
）測定に限られる。この参考文献に記載の方法には、前述のDuanの文献と比較し
て、付加的感受性はなにもない。むしろ付加的なタンパク質部分（前立腺特異的
抗原、ＰＳＡ）の測定に対する技法の適用を単純に記載したにすぎない。
【０００９】 Niwa, O. et al., "Small-Volume Voltammetric Detection of 4Aminophenol
with Interdigitated Array Electrodes and Its Application Electrochemical
Enzyme Immunoassay," Analytical Chemisty, 65:1559-1563(1993)は、少量の ４−アミノフェノールの電圧測定による検出においてデジタル間配置（ＩＤＡ）
微電極細胞の使用について報告している。しかし、Niwaでは、アルカリホスファ
ターゼのみが用いられている。使用のセンサーは、面積が比較的小さく２ｘ２ｍ
ｍであり、電極の幅が比較的大きく３−５μｍで、お互いの間隔は２または５μ
ｍであった。さらに、その検出範囲は、ｐ−アミノフェノールについて１，００
０ｎｍｏｌ／ｌ以上でマウスＩｇＧ分子について１０−１，０００ｎｇ／ｍｌで
あった。これは、本発明より感度が１００倍低く、疾患特異的抗体の検出および
定量について臨床的な適用が技術上できない。
【００１０】 Hangら（H. T. Hang et al., Anal. Him. Acta, 214: 187-95 (1988)）は、イ
ムノアッセイにおける低分子ジゴキシンの電気化学的検出についてのシステムを
記載しているが、ｐ−アミノフェノールの酸化により生じる電流のみを記録して
いる。
【００１１】 分子生物学の分野におけるのと同様に重要なのは、反応が進行中または平衡終
了点にあるときに反応物および産物の組成および比較量を測定することである。
このような監視を行う一つの具体的な手段では、生物的または非生物的な標識法
あるいは構造制限的に反応物または産物のいずれかを結合し得るレポーター分子
を用いる。分子生物学の分野で普通に行われている多くの方法が、この中に入る
。核酸の反応物や産物は、多年来、放射活性３２−Ｐまたは３−Ｈの組込み、ま
たはエチヂウムブロマイドなどの層間発蛍光団を組込んだ電気泳動ゲルの使用な
どの種々の手段により直接的に標識されている。さらに最近、免疫化学または受
容体リガンドの分野から持ち込まれた技術を適用して、安全で、環境にやさしく
、費用効率がよく、一層速い、広範な方法での使用に適し、効果的に多数の方法
を実施するのに適合するレポーターシステムが提供されている。レポーターは最
近になって、蛍光、化学発光および分光法による検出などについての分子生物学
の分野に導入された。これらの標識は、核酸の反応物または産物に直接的に連結
またはコンジュゲートするか、あるいはＥＬＩＳＡ法に匹敵する方法で核酸−酵
素コンジュゲートを介して間接的に生じる。（参照、例えば、Tijssen, P., Hyb
ridization With Nucleic Acid Probes: Theory and Nucleic Acid Probes, Vol
. 1 (1993); Tijssen, P., Hybridization With Nucleic Acid Probes: Probe L
abeling and Hybridization Techniques, Vol. 2 (1993); Meier, T. and Fahre
nholz, F. eds., A Laboratory Guide To Biotin-Labeling in Biomolecule Ana
lysis, BioMethods Vol. 7 (1996); German, A., Non-Radioactive Labelling:
A Practical Introduction (Biological Techniques Series) (1997); Agrawal,
S. ed., Protocols for Oligonucleotide Conjugates: Synthesis and Analyti
cal Techniques (Methods in Molecular Biology Vol. 26) (1993); Burden and
Whitney, Biotechnology: Proteins to PCR: A Course in Strategies and Lab
Techniques (1995)）。このようなレポーターを用いての特定の核酸分子の検出
は、反応が進行中のとき（速度測定すなわち反応速度測定）または反応が平衡に
達したとき（終了点報告）に効果的に実施できる。かかるレポーターシステムを
用いる分子生物学的方法は、バイオテクノロジー、環境保護、公衆衛生などの多
くの分野で普通に適用されている。
【００１２】 さらに具体的には、シグナル増幅方法（Dewar R. L., et al., Application o
f Branched Chain DNA Signal Amplification to Monitor Human Immunodeficie
ncy Virus Type 1 Burden in Human Plasma, Jrnl. of Inf. Dis., Vol 170: 11
72-1179 (1994)および鋳型増幅方法の進歩によって、核酸の検出および測定の方
法が非常に多数もたらされている。そこでは、危険性の高い、環境にやさしくな
い、時間がかかるような従来のラジオグラフ・レポーターに代わって比色的また
は化学発光的レポーター産物とともに酵素コンジュゲートが使用される。これら
の新しいレポーターのすべてが、現在のところ光学検出方法に基づいており、次
のような事項が必要であるという欠陥がある。すなわち、溶液の光度、光電子増
倍、複合シグナルのデジタル化またはアナログ定量化および送達、粘度の制限、
バックグランドの発光中性などの必要性である。
【００１３】 従って、改善しようとのすべての試みにかかわらず、満足すべきレベルの検出
感度で未処置の免疫化学的および生物的サンプルを直接試験する経済的な方法を
提供し得るような、電気化学的に検出される酵素コンジュゲート／レポーター基
質については、なにも記述したものがない。
【００１４】 （発明の概要） 本発明の目的は、反応物または産物を検出し定量するための免疫化学的または
分子生物学的レポーターシステムを提供することである。本発明は、終了点と反
応速度の両方を報告する適用を含むことを意図している。このシステムは、密接
した貴金属電極のシリコンマイクロチップ−デジタル間構成配置（ＩＤＡ）から
なる。このシステムの用途は、レドックス・リサイクルし得て、もって電流また
は電圧計数の手段で検出し得る、電気化学的に活性な分子を含有している免疫化
学的または核酸のコンジュゲートを検出することである。
【００１５】 本発明の別の目的は、従来の比色酵素レポーターシステムに代り得るシステム
を提供し、高い性能と費用改善をもたらすことである。
【００１６】 本発明の別の目的は、分析工程の広い能力を完了するのに要する時間を軽減す
ることである。
【００１７】 本発明の別の目的は、検出に要するレポーター分子の絶対数および溶液の量に
比して検出感度を増加することである。
【００１８】 本発明の別の目的は、検出または定量し得るレポーター分子についての濃度範
囲を拡大することである。
【００１９】 本発明の別の目的は、方法論的にも検出成分からしても施設の縮少化および簡
素化についての能力を拡げることであって、その適用においては小規模でも大規
模でもなし得る。
【００２０】 本発明の別の目的は、サンプル溶液の光学的透明度または周りの光学的密度に
ついての必要条件をなくすることである。
【００２１】 本発明の別の目的は、マイクロリットル以下の標本を用い得ることであって、
試薬費用の軽減につながる。
【００２２】 本発明の別の目的は、比較の光学レポーターシステムにおける主要な成分の光
学増倍に実質的に匹敵するＩＤＡの製造費用を有することである。
【００２３】 一つの好ましい実施態様において、この電気化学的レポーターシステムは、ウ
イルス感染の結果として生じる抗体を検出するために免疫化学的方法を用いる。
そこではレドックス活性分子を放出するための多価酵素コンジュゲート（ビオチ
ン／アビジン）およびレドックス活性分子を測定するためのＩＤＡを含むイムノ
アッセイを使用する。第１の実施態様に加えて、この新規のレポーターシステム
は、すべての酵素標識免疫化学法に同様に適用され得る。このシステムが適用さ
れる方法は、普通、しかし限定的ではなく、１）感染疾患（微生物抗原または抗
体タンパク質）、２）自己免疫疾患（自己抗原または自己抗体タンパク質）、３
）癌マーカー（いわゆる腫瘍特異的タンパク質またはステロイド）、４）内分泌
ホルモン（ポリペプチド、チロニン、ステロイド）、５）治療薬剤および毒物の
検査に用いられる。
【００２４】 他の好ましい実施態様において、この新規な電気化学的レポーターシステムは
、分子生物学的分析法において特定の核酸およびそのアンプリコンを検出または
定量するのに使用される。特定の核酸またはその配列の分析は、臨床の場におい
て広い適用がある。例えば、感染微生物、悪性腫瘍、遺伝疾患（遺伝子異常）、
法医学的証拠、親子鑑定の存在のために体液または組織の検査がある。
【００２５】 （図面の簡単な説明） 本発明の特徴と考えられる新規な特性を請求項に明らかにした。しかし、本発
明自体は、その構造、構成、概観および製造技術において、他の目的および利点
とともに、添付の図面と併せて、好ましい実施態様から最もよく理解されるであ
ろう。
【００２６】 図１は、ＥＬＩＳＡ法の部分を記載した模式図であって、免疫化学技術におけ
る光学的および電気化学的レポーター系の使用を例示する。
【００２７】 図２および図３は、凡例を含む模式図であって、本発明に合せて、電気化学的
レポーター系の別の免疫化学方法への適用を記載する。図２では、非競合的イム
ノアッセイを例示し、アビジン−コンジュゲート電気化学的レポーターと対にな
ったビオチン化標識抗体からなる多価標識コンジュゲートを用いる。図３は、競
合イムノアッセイを例示し、そこでは、標識抗体（一価で、電気化学レポーター
にコンジュゲートされている）が同じ結合特異性の抗体、分析物により置きかえ
られている。
【００２８】 図４は、６人の患者からの結果を比較した図表であって、現有の光学システム
、本発明の電気化学システムおよび市販アッセイ（各欄の左から右へ）による測
定である。
【００２９】 図５は、用いたレポーターコンジュゲートが異なる対のイムノアッセイに由来
する結果をグラフでまた統計学的に比較した図表である。本発明の電気化学的レ
ポーターを１つのイムノアッセイで用い、光学的レポーターを対照のイムノアッ
セイで用いた。
【００３０】 図６は、１５人の血漿からのＨＩＶ ＲＮＡ定量結果を表わす図表であって、
（１）本発明の電気化学的システムを用いた定量アンプリコン、（２）光学的レ
ポーターシステムを用いた定量アンプリコンでのＲＴ ＰＣＲによる。
【００３１】 図７、図８および図９は、ＲＴ ＰＣＲによるＨＩＶ ＲＮＡ定量結果をグラフ
でおよび統計学的に比較した図表であって、用いたレポーターコンジュケートが
異なる２つの対のアンプリコン検出法による。本発明の電気化学的レポーターを
１つの検出法で用い、光学的レポーターを対照の検出法で用いた。
【００３２】 （発明の詳細な説明） 最も広い態様において、本電気化学的レポーター技法は、分析的および臨床的
な適用を含む臨床上および分析上の免疫化学的または分子生物学的方法において
終了点の検定または反応速度の監視ができる。本発明は、薄膜の貴金属電極の密
接な（ナノメーター間隙）デジタル間配置を採用して、電極表面でレドックス・
リサイクルを阻止し得る有機（または無機）のレポーター分子の濃度に比例して
生じる電圧シグナルを検出する。デジタル間配置における陰極と陽極は、約１０
０から約８００ｎｍの幅を有する。好ましくは、デジタル間配置は陰極と陽極の
幅が約１５０から約６５０ｎｍである。最も好ましくは、デジタル間配置は陰極
と陽極の幅が約３００ｎｍである。電極は互に約１００から約８００ｎｍ離れて
いる。好ましくは、距離が約１００から約６５０ｎｍである。最も好ましくは距
離が約３００ｎｍである。本発明の適用においては集合ＩＤＡを用いることがで
き、単一の多重強化状態によって単一チップ上のいくつかのＩＤＡからシグナル
を検出する。使用時に、読み取りによって、各ＩＤＡの反応状態が併用の電流読
み取りと共に示される。
【００３３】 電気化学的標識は、レポーター物質と直接的にコンジュゲートするか、リガン
ド／受容体工程とともに酵素／基質反応のコンジュゲートまたは非コンジュゲー
ト産物として生成する。本発明で用い得る酵素／基質としては、限定ではないが
下記のものが含まれる。
【００３４】 α−ガラクトシダーゼ／ｐ−アミノフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド、 β−ガラクトシダーゼ／ｐ−アミノフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、 α−グルコシダーゼ／ｐ−アミノフェニル−α−Ｄ−グルコピラノシド、 β−グルコシダーゼ／ｐ−アミノフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、 α−マノシダーゼ／ｐ−アミノフェニル−α−Ｄ−マノピライシド、 β−マノシダーゼ／ｐ−アミノフェニル−β−Ｄ−マノピライシド、 酸性ホスファターゼ／ｐ−アミノフェニルホスフェート、 アルカリ性ホスファターゼ／ｐ−アミノフェニルホスフェート、 ホスホジエステラーゼII／ｐ−アミノフェニルホスホリルコリン。
【００３５】免疫化学 指標種を検出するためのイムノアッセイは、種々の工程様式に適用される。例
えば、関係反応が溶液中ですべて起きるか、または特定の成分が結合リガンドか
ら容易に分離するように固形支持体に接着される。様式の多様性の別の例として
、所望の物質の存在を直接表示する標識認識分子の使用（非競合アッセイ）が含
まれる。また、特異的な認識分子を選択的に限定された量で、所望の内因性物質
を含有するサンプルと既知量の外因性標識とに反応せしめる。この外因性標識は
所望の物質と同じ結合特性を有するが、検出可能な標識とコンジュゲートしてい
るものである。このような様式（競合アッセイ）において、認識分子に結合した
標識物質の量は、内因性（サンプル）と外因性（標識）分子の比率に依存的であ
る。コンジュゲートは後に検出の対象とする分子種に必ずしも限定されない。好
ましいイムノアッセイ例であるＥＩＡまたはＥＬＩＳＡにおいて、抗体としてサ
ンプル中に含まれるタンパク質分析物は、例えば、抗原または捕捉抗体に結合し
ている。次いで、サンプルのマトリックスを水洗し、さらに過剰の酵素標識抗体
を除去する水洗後に、分析物が酵素標識に定量的に結合している。比色検出を用
いると、固相に接着した酵素の量の決定には、特異的な基質を加え、酵素的に生
成した着色産物の量または比率を測定する。この終了点の量および比率は、標本
中の抗体量の比較測定による。
【００３６】 電気化学的レポーターシステムは、従来の比色または化学発光の酵素連結イム
ノアッセイレポーターに一般的に置換できるものであって、分析試験様式の現存
範囲を通じて適用できる。これらの方法では普通、限定的ではなく、１）感染疾
患（微生物抗原または抗体タンパク質）、２）自己免疫疾患（自己抗原または自
己抗体タンパク質）、３）癌マーカー（いわゆる腫瘍特異的タンパク質またはス
テロイド）、４）内分泌ホルモン（ポリペプチド、チロニン、ステロイド）、５
）治療薬剤および毒物の検査に用いられる。
【００３７】 第１実施態様において、本発明は抗原または抗体を検出するのに用いられる。
“抗体”とは、すべてのイソ型の免疫グロブリン、またはそのｆａｂまたはｆｅ
断片などのサブクラスを意味する。すべての源の抗体が適用可能であって、すべ
ての動物種から得られるポリクローナル物質、すべてのハイブリドーマからのモ
ノクローナル抗体、およびウイルス、原核または真核の細胞発現系を用いてつく
られるすべての免疫グロブリン（または断片）を含む。抗体以外の生物的な認識
分子は、本発明に同様に適用可能である。それには、限定でないが、細胞接着分
子、細胞表面レポーター分子および固定化結合タンパク質が含まれる。“分子イ
ンプリント”（結合／複合形成を特異的に予じめ測定した合成ポリマー）などの
非生物的結合分子も、本発明に適用可能である。“抗原”、“免疫原”または“
ハプテン”は、インビボまたはインビトロ免疫要素によって認識され得、そして
細胞性または体性の免疫応答を起し得る物質を意味する。実施態様で用いられる
電気化学的活性レポーターは、具体的にｐ−アミノフェノール（特定の基質との
β−ガラクトシダーゼ・コンジュゲートの反応により生じる）が挙げられるが、
注目すべきことは、本発明がレドックス・リサイクル可能分子および該レポータ
ーを生成し得る酵素系に一般的に適用し得ることである。
【００３８】 特に、実施態様として挙げられるのは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対
する抗体を電気化学的に検出することである。さらに特定すると、ヒト免疫不全
ウイルスの感染の結果としてインビボで生じる抗体を検出することである。
【００３９】 本発明の実施で用いられる種類のデジタル間ミクロ電極の配置からなる電気化
学的センサーは、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／２９７０８（１９９４年１２月２２日公
開）に記載されている。この出願は、クシ型のデジタル間の陽極と陰極の４対か
らなる配置を開示する。電極は平面シリコンチップ上に順次配置されている。特
定の状況においては勿論、より以上の電極を配置する必要がある。例えば、電気
化学的細胞で普通に用いられる型の平面計数計および参考電極がデジタル間電極
以外に配置され得る。電極を電気接触表面に結合する伝導体は絶縁層に覆われて
いる。
【００４０】 図１を参照して、１対の酵素結合イムノアッセイを例示する模式図でもって、
光学的および電気化学的のレポーターシステムを比較する。
【００４１】 図１に示すように、対にしたイムノアッセイの各々において抗原基質としてＨ
ＩＶｐ２４で最初コートする。次いで、イムノアッセイ対の各々を、ｐ２４に対
する抗体を有するＨＩＶ陽性者からの血清とインキュベートし、アンチｐ２４抗
体と標的抗原基質との複合ができる。対のイムノアッセイの各々において、ビオ
チンとコンジュゲートしたヤギアンチ−ヒト免疫グロブリンでインキュベートす
る。この時点で対のイムノアッセイの１つをアビジン／ホースラディッシュ・ペ
ルオキシダーゼコンジュゲートで処理、他のイムノアッセイをβ−ガラクトシダ
ーゼ／アビジンコンジュゲートで処理して、夫々、光学的および電気化学的のレ
ポーターでのイムノアッセイができる。
【００４２】 図３を参照して、酵素結合イムノアッセイおよび本発明の電気化学的検出を示
す。第１工程で、非標識抗原を既知方法で固相マトリックスに結合さす。固相マ
トリックスは、ガラス製またはポリマー製のビード、ミクロタイタープレート、
多孔性または不浸透性または繊維状のマトリックスまたは膜などで、現存技術で
よく知られている。抗原すなわちタンパク質のマトリックスへの結合は、既知の
化学結合技術のいずれかで、吸収または共有結合で非特異的になされる。抗原は
、なんらかのＨＩＶタンパク質の特異的組成物であって、組み換えでも単離され
ていてもよく、またウイルス性分解物またはペプチドでもよく、ＨＩＶペプチド
およびタンパク質の特異的組成物でもよい。
【００４３】 第２工程において、β−ガラクトシダーゼやアルカリ性ホスファターゼなどの
１以上の酵素標識を有する抗体を共有結合的またはアフィニティ結合で（イオン
性、水素または疎水性、場合に応じて）、結合部位が最大的に飽和されるまで、
接触せしめる。抗体はＨＩＶ抗体であり得て、その全体および／または異なる断
片であってもよく、ハイブリド・エピトープ認識部位を有することも有さないこ
ともあり、組換え発現されるか、またはウイルス・ライブラリーまたは免疫動物
から得られる。これらの抗体は、単一類の抗体、または同様または特異的な抗原
アフィニティを有する別異の類の抗体の一定の混合物であり得る。
【００４４】 第３工程では、上記した種類のＨＩＶ抗体などの分析物を含有する体液のサン
プルを用いる。適当なインキュベーション時間と水洗工程に続いて、ｐ−アミノ
フェニル−ｇ−ガラクトピラノシドなどの基質を加える。抗体の酵素標識として
β−ガラクトシダーゼを用いると、得た産物はｐ−アミノフェノールである。
【００４５】 生成したｐ−アミノフェノールの量を、標本中の抗体の濃度の指標とし、デジ
タル間マイクロ電極の配置を用いて、ｐ−アミノフェノールとキノネイミンとの
間を繰り返し変化するレドックスにおいてｐ−アミノフェノールがデジタル間の
陽極と陰極で反応するときに、測定できる。
【００４６】 好ましくは、ｐ−アミノフェノールがマイクロ電極のデジタル間の陰極と陽極
で反応するとき、レドックス反応がｐ−アミノフェノールと対応のキノンの間で
くり返し起きることである。電流の検出すなわち測定は、終了点または反応速度
の電流計数によって完了する。換言すると、レドックス反応によって起きた電流
は、レドックスの開始に続く一定時間後に測定でき、電流の上昇を測定すること
で動的に行い得る。
【００４７】 図２を参照して、ビオチン−アビジン・コンジュゲートの多重結合酵素の適用
を含む捕捉イムノアッセイを、本発明の追加のシグナル増幅方法として示す。最
初に、抗原である精製ＨＩＶｐ２４を、固相保持マトリックスImmulonII ９６ウ
ェル・マイクロタイタープレート（Dynal社）に結合さす。次いで非感染者の血 漿またはα−ｐ２４抗体含有の陽性患者の血漿を、固体マトリックスに結合した
ｐ２４抗原との複合体に加える。次の工程で、アフィニティリガンド・コンジュ
ゲートを加え、結合せしめて、多価アフィニティレポーター標識コンジュゲート
をつくる。最後に、酵素基質、例えばｐ−アミノフェノール−β−ガラクトピラ
ノシドを標識酵素と反応せしめて、多量のｐ−アミノフェノールをつくる。この
ものは、マイクロ電気センサーの陰極または陽極のデジタル間配置上でレドック
ス・リサイクルにかけると、ｐ−アミノフェノールとキノネイミンとの間をリサ
イクルし、標本中に存在する抗体の濃度の指標となる強い電気シグナルを発する
。
【００４８】 当業者はよく分かるように、上記実施態様の免疫化学的局面には、いくつかの
準備工程を必要とし、少なくとも次の工程が含まれる。
【００４９】 抗原をグリセリンコート緩衝液中の固相マトリックに結合した。緩衝液中のマ
トリックスは再構築ｐ２４（Intracel．Inc）をコート緩衝液に濃度５μｇ／ｍ ｌまで加えることでつくった。
【００５０】 洗滌緩衝液は、Biowhittakerから得たｐＨ７．４のDulbeccoリン酸緩衝液（カ
ルシウムおよびマグネシウムなしのＤＰＢＳ）からなり、塩化ナトリウム１３７
ｍＭ、塩化カリウム３ｍＭ、リン酸水素ナトリウム１ｍＭ、リン酸２水素カリウ
ム１．５ｍＭを含んでいた。
【００５１】 抗体を１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン、熱ショック性（Gackson）および ０．０１％Tween２０（１０％ｗ／ｖ）（Boehringer）を有するＤＰＢＳからな る緩衝液中に希釈した。
【００５２】 遮断緩衝液を５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンおよび０．０１％（ｗ／ｖ）
Tween２０（１０％ｗ／ｖ）（Boehringer）を有するＤＰＢＳから作成した。
【００５３】 酵素基質緩衝液をリン酸ナトリウム緩衝液１００ｍＭ中の塩化ナトリウム１０
０ｍＭからｐＨ７．２５で作成した。酵素基質溶液を、ｐ−アミノフェノール−
β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Sigma）を１．５ｍＭのモル数で酵素基質緩衝液 に溶解して、作成した。
【００５４】 図４を参照して、本発明の模式図でもって血清中のｐ２４抗体の検出を示す。
好ましくは、組換えｐ２４は高度吸収マイクロタイタープレート壁に吸収により
非特異的に結合していた。吸収は上記コート溶液５０μｌを２時間３７℃でイン
キュベートすることでなされた。あるいは、マイクロタイタープレートのコーテ
ィングを完成するために４℃で一夜インキュベーションした。壁を上記洗滌緩衝
液１５０μｌで室温で洗い、その後遮断液１００μｌで２時間室温で遮断した。
この間サンプルは繰返し振動した。
【００５５】 その後、壁を３回室温で洗い、１：３０から１：３０，０００の範囲の希釈緩
衝液で希釈した患者血清１５０μｌを加え、３７℃で１時間インキュベートした
。次いで壁を３回、洗滌緩衝液１５０μｌで室温で洗った。希釈緩衝液に１：１
０，０００で希釈したビオチン化Ｆｃ−Ｆａｂ2抗体断片（Jackson）を含有する
溶液５０μｌを、特異的に結合したｐ２４抗体を検出するために各壁に加えて、
３７℃で１時間インキュベートした。壁を再び３回、洗滌緩衝液２００μｌで室
温で洗った。アビジン−Ｄ−β−ガラクトシダーゼ・コンジュゲート（Vector）
５０μｌ、希釈緩衝液に希釈したＣ−１０μｇ／ｍｌを加え、特異的に結合した
ビオチン化Ｆｃ−Ｆａｂ2 ’抗体断片を検出するために、０．５時間室温でイン キュベートした。壁を３回、洗滌緩衝液１５０μｌで室温で洗った後、酵素基質
溶液１７０μｌを壁に加えた。
【００５６】 約３０分のインキュベーションで、ｐ−アミノフェノール−β−Ｄ−ガラクト
シダーゼから電気化学的レドックス活性のｐ−アミノフェノールを遊離し、各々
の上澄液を個別に吸引して、１ｍｌの密封可能プラスチックバイアルに移した。
残っている残渣の酵素活性を中和するために、バイアルを８０℃で水浴中１０分
間インキュベートし、氷浴で室温に冷した。アビジンＤ−β−ガラクトシダーゼ
の活性を最大に中和または不活化するために、結合アビジンＤ−β−ガラクトシ
ダーゼについて不活化温度を測定した。
【００５７】 不活化すなわち中和の上澄液をフロー室に移行した。この室の底にはマイクロ
センサーが設置され、酵素的に遊離したｐ−アミノフェノールのリサイクルから
得られるすべてのレドックス電流が測定されるようにした。銀／塩化鉄参照電極
に対応して、デジタル間薄膜金属電極の陰極に＋２５０ｍＶを用い、陽極に−５
０ｍＭを用いた。測定可能な陰極と陽極の電流がｐ２４に対して特異的に結合し
た抗体の存在と量に相当して認められた。
【００５８】 レドックス電流は、陽極の血液サンプルと陰極の血液サンプルとでは明らかに
相違があった。陽性血液サンプルでは、血清標本中のｐ２４抗体の濃度に応じた
相違が認められた。すべての場合に、電気化学的に測定されたシグナルは、同じ
サンプルの光学的読みとりで得られた結果と相当した。対照の目的のために、ヒ
ト血清または血漿におけるヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）のｐ２４（
コア）タンパク質に対する抗体の検出または半定量について、アボット社の酵素
イムノアッセイ（今後、“アボットのイムノアッセイ”という）に開示された従
来技術の酵素結合免疫アッセイの光学状態で得られた終了点タイターと、本発明
の方法で得られたタイターを比較したところ、有意な差異は認められなかった。
【００５９】 図４を参照して、６人のＨＩＶ血陽性患者からのサンプルにおける終了点タイ
ターを、現有の光学システム、本発明の電気化学的システムおよび市販のアッセ
イについて比較した。１つの測定（図の左欄）は現有の対照ｐ２４イムノアッセ
イによる光学読みとりであり、別の測定（図の右欄）は市販のアボットイムノア
ッセイによるものであり、今１つの測定（図の中央欄）は本発明の方法により電
気化学的になされたものである。３種の測定結果は各患者について実質的に同じ
である。終了点タイターは血清の希釈因子を反映している。この血清において、
ＨＩＶ陽性血清で得られた検出可能シグナルは、多重ＨＩＶ陰性血清サンプルを
同様に分析したときに生じるシグナルに比べると、標準偏差の２倍をプラス・マ
イナスした平均に等しい。対にした結果および回帰解析を図５に示す。
【００６０】 相関係数(Ｒ平方)および最小平方の両者が１．０の線に最もよく適合し、光学
的と電気化学的とのレポーター法による結果が比例することを証明した。
【００６１】分子生物学 本発明はまた、分析適用および臨床適用を含む終了点検出または反応速度監視
の生物学的方法が可能である。上記した同じデジタル間配置を用いると、電極の
表面でリサイクルするレドックスを示し得る有機（または無機）のレポーター分
子の濃度に応じて生じる電圧シグナルを検出できる。
【００６２】 これらの電気化学標識は、（１）選択された鋳型の複製時に生成される核酸ア
ンプリコン・コンジュゲートとして生産されるものであり、その方法を例示する
と、限定ではなく、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反
応）、ＮＡＳＢＡ（核酸配列に基づく増幅）、ＳＤＡ（鎖置換増幅）、ＴＡＳ（
複製に基づく増幅系）、３ＳＲ（自己保有配列複製）およびＱ−β−レプリカー
ゼ系があり；（２）特異的ヌクレオチド配列の検出のためのシグナル増幅方法で
用いられる多枝ヌクレオチド標的プローブの基質部分として、またはこのプロー
ブの複合多重末端に直接コンジュゲートして、用いられるものであり；または（
３）電気化学活性的レポーターまたは関連酵素標識が、特異化された核酸の反応
物または産物に直接コンジュゲートされ得る。
【００６３】 分子生物学的実施態様において、酵素調節電気化学的レポーターシステムは、
前に記述したＩＤＡを用いて、核酸断片の検出および定量についての分析法に適
用される。特に、この分野におけるシステムの一般的適用性を明示するための例
では、ヒト血清のＨＩＶ ＲＮＡの定量について、新規の電気化学的レポーター システムを市販のＦＤＡ承認のポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）と比較した。
【００６４】 Roche Molecular System（Branchberg, ＮＪ）製造のＨＩＶモニターキットの
１対を添付文書の指示に従って、５人のＨＩＶ陰性のボランティアの血漿と９人
のＨＩＶ患者の血漿に用いた。１つのキットには、すべての調製、増幅および検
出のシステムを、添付文書の指示通りに行った。しかし、結果のＰＣＲ産物の検
出は、アビジン化−β−ガラクトシダーゼ・コンジュゲート（１０Ｍｇ／ｍｌア
ビジンＤ−β−ガラクトシダーゼ、Vector Labs、Burlingame, ＣＡ）を用いて 行った。このコンジュゲートは、１％ＢＳＡおよび０．０１％Tween２０を有す るリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）ＰＢＳに溶解し、溶液中でビオチン化アンプリコ
ンに結合している。標識核酸−コンジュゲート複合体を次いでハイブリダイゼー
ションにより溶液から単離し、マイクロタイタープレート壁（ＲＭＳ monitor( 商標)）上のオリゴマーを捕捉する。
【００６５】 ＰＢＳに溶液した基質のβ−ガラクトピラノシド（６０ｍＭ ｐ−アミノフェ
ノール−β−Ｄ−ガラクトロピラノシド，Sigma Chemical, St．Louis．ＭＯ） とのインキュベーション後に、得た電気化学的に活性の産物（ＰＡＰ）をデジタ
ル間マイクロ電極配置を電流計数に用いて測定した。対にした結果を図６に示し
、回帰解析を図７−９に示す。相関係数(Ｒ平方)および最小平方の両者が１．０
の線に最もよく適合し、光学的と電気化学的とのレポーター法による結果が比例
することを証明した。
【００６６】 ＨＩＶ陰性とＨＩＶ陽性のヒト血漿サンプルの分析の実施は、ＰＭＳモニター
の添付文書による方法と電気化学的レポーターシステムの修飾を用いた。結果を
比較して、２種の方法の分析上の適合性が分かる。電気メカニカル法は、簡単な
修飾として、すべての市販の酵素調節的または直接光学的レポーター法に等しく
適用でき、同様に上記のイムノアッセイに用いられて、従来の比色的または化学
発光的コンジュゲートに要する検出計についての要件を実質的に簡単にする。
【００６７】 このような方法は現在、広範な特定の微生物／ウイルス、および遺伝子ＲＮＡ
およびＤＮＡの配列を検定するのに市販され、用いられている。各事例において
、これらの方法は、必要な微少の化学的修飾をするのが容易であって、上記した
デジタル間マイクロ電極を用いての電気化学的レポーター検出または定量でもっ
て一般的に置換できる。
【００６８】 当業者は理解できるように、薄膜マイクロ電極配置およびレドックス・リサイ
クル・レポーター分子を利用する本発明は、下記に関連する核酸の存在について
組織や血液などの体液の検査に一般的に適用できる。すなわち、１）感染疾患、
２）自己免疫疾患、３）悪性腫瘍、４）遺伝疾患、５）親子鑑定の検査に適用で
きる。同様に当業者に理解できるように、本発明は、広範な臨床現場以外での基
礎研究および応用科学にも使用できる。その例を挙げると、限定するものでない
が、１）法医学、２）基礎的細胞および進化の生物学、３）考古学および古生物
学、および４）組換えＤＮＡ手法を用いる広範な動植物バイオテクノロジーがあ
る。
【００６９】 当業者は理解できるように、薄膜マイクロ電極配置およびレドックス・リサイ
クル・レポーター分子を利用する本発明は、下記のものを検出または測定する目
的で血液、体液または組織を検査するのにも適用できる。すなわち、１）健康ま
たは疾患（感染または自己免疫疾患）に関連する遊離または複合の免疫グロブリ
ン、２）正常または異常な過程に関する抗原の存在、３）正常または異常の遺伝
生長、悪性腫瘍または感染疾患に関連する特定のヌクレオチド配列の存在または
不存在の検査に適用できる。
【００７０】 好ましい実施態様を引用して本発明の原理を記述し、説明するが、明らかなよ
うに、本発明はかかる原理から逸脱することなしに整備し、および詳細を修飾す
ることができる。このように、詳細な実施態様は例示的なものにすぎず、本発明
の範囲を限定するものでないことが理解されねばならない。本発明として、すべ
ての実施態様は、下記の請求項およびその均等の範囲および精神内にある。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ＥＬＩＳＡ法の部分を記載した模式図であって、免疫化
学技術における光学的および電気化学的レポーター系の使用を例示する。
【図２】 図２は、凡例を含む模式図であって、本発明に合せて、電気化学
的レポーター系の別の免疫化学方法への適用を記載する。非競合的イムノアッセ
イを例示し、アビジン−コンジュゲート電気化学的レポーターと対になったビオ
チン化標識抗体からなる多価標識コンジュゲートを用いる。
【図３】 図３は、凡例を含む模式図であって、本発明に合せて、電気化学
的レポーター系の別の免疫化学方法への適用を記載する。競合イムノアッセイを
例示し、そこでは、標識抗体（一価で、電気化学レポーターにコンジュゲートさ
れている）が同じ結合特異性の抗体、分析物により置きかえられている。
【図４】 図４は、６人の患者からの結果を比較した図表であって、現有の
光学システム、本発明の電気化学システムおよび市販アッセイ（各欄の左から右
へ）による測定である。
【図５】 図５は、用いたレポーターコンジュゲートが異なる対のイムノア
ッセイに由来する結果をグラフでまた統計学的に比較した図表である。本発明の
電気化学的レポーターを１つのイムノアッセイで用い、光学的レポーターを対照
のイムノアッセイで用いた。
【図６】 図６は、１５人の血漿からのＨＩＶ ＲＮＡ定量結果を表わす図
表であって、（１）本発明の電気化学的システムを用いた定量アンプリコン、（
２）光学的レポーターシステムを用いた定量アンプリコンでのＲＴ ＰＣＲによ る。
【図７】 図７は、ＲＴ ＰＣＲによるＨＩＶ ＲＮＡ定量結果をグラフでお
よび統計学的に比較した図表であって、用いたレポーターコンジュケートが異な
る２つの対のアンプリコン検出法による。本発明の電気化学的レポーターを１つ
の検出法で用い、光学的レポーターを対照の検出法で用いた。
【図８】 図８は、ＲＴ ＰＣＲによるＨＩＶ ＲＮＡ定量結果をグラフでお
よび統計学的に比較した図表であって、用いたレポーターコンジュケートが異な
る２つの対のアンプリコン検出法による。本発明の電気化学的レポーターを１つ
の検出法で用い、光学的レポーターを対照の検出法で用いた。
【図９】 図９は、ＲＴ ＰＣＲによるＨＩＶ ＲＮＡ定量結果をグラフでお
よび統計学的に比較した図表であって、用いたレポーターコンジュケートが異な
る２つの対のアンプリコン検出法による。本発明の電気化学的レポーターを１つ
の検出法で用い、光学的レポーターを対照の検出法で用いた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｑ 1/00 Ｇ０１Ｎ 27/46 ３０１Ｚ ３３６Ｚ (31)優先権主張番号 ０９／１０５，５３８ (32)優先日 平成10年６月26日(1998．6．26) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０９／１０５，５３９ (32)優先日 平成10年６月26日(1998．6．26) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ロバート・ディ・マクフィー アメリカ合衆国90033カリフォルニア州ロ サンゼルス、アルカザー・ストリート2250 番、ルーム109、スクール・オブ・メディ シン、ユニバーシティ・オブ・サザン・カ リフォルニア (72)発明者 クライブ・アール・テイラー アメリカ合衆国90033カリフォルニア州ロ サンゼルス、ゾーンル・アベニュー2011 番、エイチエムアール204、スクール・オ ブ・メディシン、ユニバーシティ・オブ・ サザン・カリフォルニア (72)発明者 ライナー・ヒンチェ ドイツ連邦共和国デー−25524イッツェホ ー、フラウンホーファー・シュトラーセ１ 番、フラウンホーファー・インスティトゥ ート・ジリーツィウムテヒノロギー (72)発明者 レネ・ザイツ ドイツ連邦共和国デー−25524イッツェホ ー、フラウンホーファー・シュトラーセ１ 番、フラウンホーファー・インスティトゥ ート・ジリーツィウムテヒノロギー Ｆターム(参考） 4B029 AA07 AA21 AA23 BB15 BB20 CC03 CC08 CC11 CC13 FA12 4B063 QA01 QA13 QQ21 QQ41 QQ61 QR13 QR15 QR48 QR56 QR57 QR62 QR84 QS25 QS32 QS33 QS34 QS35 QS39

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 電気化学的レポーターシステムであって、 （ａ）構造制限的に分析物を特異的に結合し得る認識分子、 （ｂ）酵素、 （ｃ）酵素を認識分子または分析物に特異性をもって結合せしめるための
    結合要素、 （ｄ）レドックス・リサイクルを発揮し得るレポーター分子に酵素の存在
    で分解する基質、 （ｅ）電気化学的レポーター分子を検出するためのセンサー、なお該セン
    サーはレポーター分子がレドックス・リサイクルを発揮するような配置を有する
    ものである、 ことを含むシステム。
  2. 【請求項２】 センサーが電極間距離約１００から約８００ナノメートルの
    電極のマイクロ電気デジタル間配置である、請求項１の電気化学的レポーターシ
    ステム。
  3. 【請求項３】 センサーが電極間距離約３００ナノメートルの電極のマイク
    ロ電気デジタル間配置である、請求項１の電気化学的レポーターシステム。
  4. 【請求項４】 認識分子が免疫グロブリン、免疫グロブリンの断片、免疫グ
    ロブリン結合タンパク質および非生物的結合分子よりなる群から選ばれる、請求
    項１の電気化学的レポーターシステム。
  5. 【請求項５】 酵素が基質の共有結合の開裂を起こし得る、請求項１の電気
    化学的レポーターシステム。
  6. 【請求項６】 酵素がα−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−
    グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、α−マノシダーゼ、β−マノシダーゼ、
    酸性ホスファターゼ、アルカリ性ホスファターゼおよびホスホジエステラーゼII
    よりなる群から選ばれる、請求項５の電気化学的レポーターシステム。
  7. 【請求項７】 基質がｐ−アミノフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド、
    ｐ−アミノフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、ｐ−アミノフェニル−α−
    Ｄ−グルコピラノシド、ｐ−アミノフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｐ−
    アミノフェニル−α−Ｄ−マノピライシド、ｐ−アミノフェニル−β−Ｄ−マノ
    ピライシド、ｐ−アミノフェニルホスフェートおよびｐ−アミノフェニルホスホ
    リルコリンよりなる群から選ばれる、請求項１の電気的レポーターシステム。
  8. 【請求項８】 結合要素が、 （ａ）認識分子または分析物に特異的な抗体にコンジュゲートしたビオチ
    ンおよび酵素にコンジュゲートしたアビシン、 （ｂ）認識分子または分析物に特異的な抗体にコンジュゲートしたビオチ
    ンおよび酵素にコンジュゲートしたストレプタビジン、 （ｃ）認識分子または分析物に特異的な抗体にコンジュゲートしたジオキ
    シゲニンおよび酵素にコンジュゲートしたジオキシゲニン特異的抗体、 （ｄ）酵素を認識分子に架橋することによる、 （ｅ）酵素を認識分子に特異的な抗体に架橋することによる、 よりなる群から選ばれる、請求項１の電気化学的レポーターシステム。
  9. 【請求項９】 基質がｐ−アミノフェノールを含む少なくとも１つの成分に
    開裂する、請求項１の電気化学的レポーターシステム。
  10. 【請求項１０】 センサーが、電極間距離約１００から約８００ナノメート
    ルを有し、互いの間隔約１００から８００ナノメートルである電極のマイクロ電
    気デジタル間配置である、請求項１の電気化学的レポーターシステム。
  11. 【請求項１１】 サンプル中の分析物を検出するための電気化学的イムノア
    ッセイであって、次の工程： （ａ）表面に、抗原に結合した分析物に特異的な抗体を有する抗原を連結
    し、なお、抗体は、酵素に結合しているか、または酵素に特異的に結合するため
    の結合要素を有するものであり、 （ｂ）表面を分析すべきサンプルと接触せしめ、 （ｃ）サンプル中の分析物によって抗原から置換された抗体を収集し、 （ｄ）基質を収集抗体に加え、なお、該基質は、酵素により電気化学的成
    分に開裂し得るものであり、 （ｅ）電気化学成分のレドックス・リサイクルを起こし得る電極のデジタ
    ル間配置で電気化学成分の存在または量を測定する、 を含むイムノアッセイ。
  12. 【請求項１２】 サンプル中の分析物を検出するための電気化学的イムノア
    ッセイであって、次の工程： （ａ）表面に、分析物と抗体に結合した抗原とに特異的な抗体を連結し、
    なお、抗原は、酵素に結合しているか、または酵素に特異的に結合する手段を有
    するものであり、 （ｂ）表面を分析すべきサンプルと接触せしめ、 （ｃ）サンプル中の分析物によって抗体から置換された抗原を収集し、 （ｄ）基質を収集抗原に加え、なお、該基質は、酵素により電気化学的成
    分に開裂し得るものであり、 （ｅ）電気化学成分のレドックス・リサイクルを起こし得る電極のデジタ
    ル間配置で電気化学成分の存在または量を測定する、 を含むイムノアッセイ。
  13. 【請求項１３】 サンプル中の特定の分析物を検出するための電気化学的イ
    ムノアッセイであって、次の工程： （ａ）表面に連結した認識分子を有し、なお、該認識分子は、構造制限的
    に分析物を特異的に結合せしめ得るものであり、 （ｂ）表面を分析すべきサンプルと接触せしめ、 （ｃ）酵素を認識分子または分析物に特異性でもって結合せしめ、 （ｄ）基質を加え、この基質は酵素の存在でレドックス・リサイクルを発
    揮し得るレポーター分子に開裂し、 （ｅ）電気化学成分のレドックス・リサイクルを起こし得る電極のデジタ
    ル間配置で電気化学成分の存在または量を測定する、 を含むイムノアッセイ。
  14. 【請求項１４】 酵素が認識分子または分析物に特異性でもって結合してお
    り、酵素がアビジンまたはストレプタビジンコンジュゲート、および認識分子ま
    たは分析物に特異的なビオチン標識抗体であることによる、請求項１３の電気化
    学的イムノアッセイ。
  15. 【請求項１５】 電気化学的レポーターシステムであって、 （ａ）酵素、 （ｂ）酵素をヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、分枝オリゴヌクレオチ
    ド、核酸またはこれらの類似体に結合せしめるための結合要素、 （ｃ）レドックス・リサイクルを発揮し得るレポーター分子に酵素の存在
    で開裂する基質、 （ｄ）電気化学的レポーター分子を検出するためのセンサー、なお、該セ
    ンサーはレポーター分子がレドックス・リサイクルを発揮するような配置を有す
    るものである、 を含むシステム。
  16. 【請求項１６】 センサーが電極間距離約１００から約８００ナノメートル
    の電極のマイクロ電気デジタル間配置である、請求項１５の電気化学的レポータ
    ーシステム。
  17. 【請求項１７】 センサーが電極間距離約３００ナノメートルの電極のマイ
    クロ電気デジタル間配置である、請求項１６の電気化学的レポーターシステム。
  18. 【請求項１８】 酵素が基質の共有結合の開裂を起こし得る、請求項１５の
    電気化学的レポーターシステム。
  19. 【請求項１９】 酵素がα−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α
    −グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、α−マノシダーゼ、β−マノシダーゼ
    、酸性ホスファターゼ、アルカリ性ホスファターゼおよびホスホジエステラーゼ
    IIよりなる群から選ばれる、請求項１８の電気化学的レポーターシステム。
  20. 【請求項２０】 基質がｐ−アミノフェニル−α−Ｄ−ガラクトピラノシド
    、ｐ−アミノフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、ｐ−アミノフェニル−α
    −Ｄ−グルコピラノシド、ｐ−アミノフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシド、ｐ
    −アミノフェニル−α−Ｄ−マノピライシド、ｐ−アミノフェニル−β−Ｄ−マ
    ノピライシド、ｐ−アミノフェニルホスフェートおよびｐ−アミノフェニルホス
    ホリルコリンよりなる群から選ばれる、請求項１５の電気的レポーターシステム
    。
  21. 【請求項２１】 結合要素が、 （ａ）共有結合、 （ｂ）ビオチン化のヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、分枝オリゴヌク
    レオチド、核酸またはこれらの類似体、およびアビジンまたはストレプタビジン
    ・コンジュゲート酵素、 （ｃ）ジゴキシゲニン標識のヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、分枝オ
    リゴヌクレオチド、核酸またはこれらの類似体、およびジゴキシゲニン特異的抗
    体コンジュゲート酵素、 よりなる群から選ばれる、請求項１５の電気化学的レポーターシステム。
  22. 【請求項２２】 基質がｐ−アミノフェノールを含む少なくとも１つの成分
    に開裂する、請求項１５の電気化学的レポーターシステム。
  23. 【請求項２３】 センサーが、電極間距離約１００から約８００ナノメート
    ルを有し、互いの間隔が約１００から約８００ナノメートルである電極のマイク
    ロ電気デジタル間配置である、請求項１５の電気化学的レポーターシステム。
  24. 【請求項２４】 サンプル中の特定の核酸配列を検出または定量するためア
    ッセイであって、次の工程： （ａ）検出または定量すべき特定の核酸配列の第１セグメントにに相補的
    な配列を有する第１単一鎖核酸を有し、なお、第１単一鎖核酸は溶液中に存在す
    るか、または表面に結合しているものであり、 （ｂ）第１単一鎖核酸を分析すべきサンプルと接触せしめ、 （ｃ）第２単一鎖核酸を分析すべきサンプルに加え、なお、第２核酸は、
    検出または定量すべき核酸配列の第２セグメントに相補的な配列を有するもので
    あり、 （ｄ）基質を加え、なお、該基質は第２単一鎖核酸の存在で電気化学成分
    に開裂するものであり、 （ｅ）電気化学成分のレドックス・リサイクルを起こし得る電極のデジタ
    ル間配置で溶液中の電気化学成分の存在または量を測定する、 を含むアッセイ。
  25. 【請求項２５】 サンプル中の特定の核酸配列を検出または定量するため電
    気化学的アッセイであって、次の工程： （ａ）特定の核酸を標識ヌクレオチドまたはプライマー・オリゴヌクレオ
    チドの存在で増幅し、標識ヌクレオチドまたはプライマー・オリゴヌクレオチド
    が標識の新規合成核酸に組込まれるように増幅し、 （ｂ）基質を加え、該基質は標識の新規合成核酸の存在で電気化学成分に
    開裂するものであり、 （ｃ）電気化学成分のレドックス・リサイクルを起こし得る電極のデジタ
    ル間配置で電気化学成分の存在または量を測定する、 を含むアッセイ。
JP2000506361A 1997-08-12 1998-08-12 イムノアッセイ分析および分子生物学的な過程を調べるための電気化学的レポーターシステム Pending JP2001512691A (ja)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US5546697P 1997-08-12 1997-08-12
US5575997P 1997-08-14 1997-08-14
US10553998A 1998-06-26 1998-06-26
US09/105,538 1998-06-26
US60/055,759 1998-06-26
US09/105,539 1998-06-26
US09/105,538 US6682648B1 (en) 1997-08-12 1998-06-26 Electrochemical reporter system for detecting analytical immunoassay and molecular biology procedures
US60/055,466 1998-06-26
PCT/US1998/016714 WO1999007879A1 (en) 1997-08-12 1998-08-12 Electrochemical reporter system for detecting analytical immunoassay and molecular biology procedures

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2001512691A true JP2001512691A (ja) 2001-08-28

Family

ID=27489724

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000506361A Pending JP2001512691A (ja) 1997-08-12 1998-08-12 イムノアッセイ分析および分子生物学的な過程を調べるための電気化学的レポーターシステム

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP1003905A1 (ja)
JP (1) JP2001512691A (ja)
AU (1) AU8903998A (ja)
CA (1) CA2300268A1 (ja)
WO (1) WO1999007879A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102057273A (zh) * 2008-06-06 2011-05-11 弗劳恩霍弗应用技术研究院 用于检测化学或生物成分的方法以及用于此的电极布置

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6358752B1 (en) * 1996-09-27 2002-03-19 Cornell Research Foundation, Inc. Liposome-enhanced test device and method
US6391558B1 (en) 1997-03-18 2002-05-21 Andcare, Inc. Electrochemical detection of nucleic acid sequences
US6682648B1 (en) 1997-08-12 2004-01-27 University Of Southern California Electrochemical reporter system for detecting analytical immunoassay and molecular biology procedures
DE19916921A1 (de) * 1999-04-14 2000-10-19 Fraunhofer Ges Forschung Elektrisches Sensorarray
US6518024B2 (en) 1999-12-13 2003-02-11 Motorola, Inc. Electrochemical detection of single base extension
WO2001042508A2 (en) * 1999-12-09 2001-06-14 Motorola, Inc. Methods and compositions relating to electrical detection of nucleic acid reactions
US6824669B1 (en) 2000-02-17 2004-11-30 Motorola, Inc. Protein and peptide sensors using electrical detection methods
FR2805545B1 (fr) * 2000-02-24 2002-05-17 Argene Sa Procede electrochimique de detection d'acides nucleiques
EP1272849A2 (de) 2000-03-30 2003-01-08 Infineon Technologies AG Biosensor, biosensor-array und verfahren zum ermitteln makromolekularer biopolymere mit einem biosensor
US7455975B2 (en) 2000-04-14 2008-11-25 Esa Biosciences, Inc. Electrochemical detection of nucleic acid sequences
US6562209B1 (en) 2001-04-19 2003-05-13 Northrop Grumman Corporation Automated computer controlled reporter device for conducting imunnoassay and molecular biology procedures
US6803202B2 (en) * 2001-10-23 2004-10-12 Northrop Grumman Corporation Combinational strategy for identification of biological agents
EP1376111A1 (en) 2002-06-24 2004-01-02 Universite Catholique De Louvain Method and device for high sensitivity detection of the presence of DNA and other probes
DE102008025680A1 (de) 2008-05-29 2009-12-03 Siemens Healthcare Diagnostics Gmbh Analyseeinrichtung und Verfahren zum Redoxcycling ohne Potentiostat
DE102008025992B4 (de) 2008-05-30 2011-01-27 Siemens Healthcare Diagnostics Gmbh Titerplatte und Verfahren zur Detektion eines Analyten
CN109705177A (zh) * 2018-12-24 2019-05-03 郑州安图生物工程股份有限公司 一种底物及其制备方法和应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4840893A (en) * 1983-12-16 1989-06-20 Medisense, Inc. Electrochemical assay for nucleic acids and nucleic acid probes
US4963245A (en) * 1986-05-02 1990-10-16 Ciba Corning Diagnostics Corp. Unitary multiple electrode sensor
US5391272A (en) * 1992-03-06 1995-02-21 Andcare, Inc. Electrochemical immunoassay methods
DE4318519C2 (de) * 1993-06-03 1996-11-28 Fraunhofer Ges Forschung Elektrochemischer Sensor
DE19541033C1 (de) * 1995-11-03 1997-06-26 Inst Chemo Biosensorik Elektrochemisches Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Bindungsproteinen

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102057273A (zh) * 2008-06-06 2011-05-11 弗劳恩霍弗应用技术研究院 用于检测化学或生物成分的方法以及用于此的电极布置
JP2011522266A (ja) * 2008-06-06 2011-07-28 フラウンホーファー・ゲゼルシャフト・ツール・フェルデルング・デア・アンゲヴァンテン・フォルシュング・エー・ファウ 化学的又は生物学的な種を検知するための方法及びそのための電極配列
US8900440B2 (en) 2008-06-06 2014-12-02 Fraunhofer-Gesellschaft Zur Foerderung Der Angewandten Forschung E.V. Method for detecting chemical or biological species and electrode arrangement therefor
CN102057273B (zh) * 2008-06-06 2015-09-23 弗劳恩霍弗应用技术研究院 用于检测化学或生物成分的方法以及用于此的电极布置

Also Published As

Publication number Publication date
EP1003905A1 (en) 2000-05-31
AU8903998A (en) 1999-03-01
WO1999007879A1 (en) 1999-02-18
CA2300268A1 (en) 1999-02-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6682648B1 (en) Electrochemical reporter system for detecting analytical immunoassay and molecular biology procedures
Campuzano et al. Electrochemical bioaffinity sensors for salivary biomarkers detection
Torrente-Rodríguez et al. Electrochemical bioplatforms for the simultaneous determination of interleukin (IL)-8 mRNA and IL-8 protein oral cancer biomarkers in raw saliva
JP2001512691A (ja) イムノアッセイ分析および分子生物学的な過程を調べるための電気化学的レポーターシステム
US5824478A (en) Diagnostic methods and probes
WO2015188512A1 (zh) 一种基于气压检测靶标的定量检测方法
US8029985B2 (en) Amplified bioassay
US20030148362A1 (en) Diagnostic microarray and method of use thereof
Xu et al. Highly sensitive antibody-aptamer sensor for vascular endothelial growth factor based on hybridization chain reaction and pH meter/indicator
RU2107730C1 (ru) Молекулярный зонд
EP1813948A1 (en) Method of detecting target substances
WO2020130624A1 (ko) 치쿤군야 바이러스 e2에 특이적으로 결합하는 dna 압타머 및 이의 용도
JP2002531098A (ja) 表面上でのクローニング及びコピー作製方法
WO2023173711A1 (zh) 特异性识别可溶性st2蛋白的核酸适配体及其应用
Ma et al. A multiple-target simultaneous detection method for immunosorbent assay and immunospot assay
Díaz‐Fernández et al. Enzyme‐Linked DNA Displacement (ELIDIS) Assay for Ultrasensitive Electrochemical Detection of Antibodies
Calorenni et al. PCR‐Free Innovative Strategies for SARS‐CoV‐2 Detection
JP2005502366A (ja) 読み取り、検出、定量方法、前記方法で使用するハイブリッドまたは複合体およびそれを使用するバイオチップ
JP2005504988A (ja) 較正マイクロアレイ
CA2353920A1 (en) Test system for detecting different markers, and production and use thereof
WO2022140655A9 (en) Single-molecule electronic multiplex nanopore immunoassays for biomarker detection
Vetcha et al. Rapid and sensitive handheld biosensor for detection of hantavirus antibodies in wild mouse blood samples under field conditions
KR19990014922A (ko) 항원의 동일 반응계내 면역 검정 방법
Lisitsyn et al. Methods of protein immunoanalysis.
Madhurantakam et al. Electrochemical label-free methods for ultrasensitive multiplex protein profiling of infectious diseases

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20050812

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20070222

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20070227

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20070724