CN109705177A - 一种底物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一类用于检测α‑葡萄糖苷酶活性的底物‑‑α‑D‑葡萄糖苷，本发明还公开了该底物的合成工艺：首先将化合物α‑D‑葡萄糖与乙酰氯反应，经纯化得到α‑D‑五乙酰葡萄糖；所得物经N，N‑二甲基‑1，3‑二氨基丙烷催化，酸洗、萃取、干燥、纯化得到2,3,4,6‑四‑O‑α‑D‑乙酰基葡萄糖；所得物在二氯甲烷溶液中经催化与三氯乙腈反应，过滤、纯化得到2,3,4,6‑四‑O‑乙酰基‑β‑D‑葡萄糖基三氯乙酰亚胺；所得物在二氯甲烷溶液中经催化与色原或荧光基团反应，萃取，合并有机相，干燥、浓缩、甲醇复溶、4℃养晶过滤，得到2,3,4,6‑四‑O‑乙酰基‑α‑D‑葡萄糖苷；所得物在甲醇溶液中催化，反应完成后脱色吸附、过滤、纯化制得。本发明底物的合成工艺简单，收率高，可提高试剂盒灵敏度，稳定性好，特异性强。

Description

一种底物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物化学医药技术领域，尤其是涉及一种底物，本发明还涉及该底物的制备方法，以及该底物在检测α-葡萄糖苷酶活性方面的应用。

背景技术

目前，酶类测定是临床生化检验中常做的项目之一。α-葡萄糖苷酶为水解酶的一种，其活性测定具有重要的临床意义。如羊水细胞、成纤维细胞或尿中α-葡萄糖苷酶活力的下降或缺乏用于判断Ⅱ型糖原积累症，血清中α-葡萄糖苷酶活力下降用于分析男性不育症等。

念珠菌和滴虫引起的疾病直接从症状上难以鉴别，往往需要辅以实验室检测手段。而目前能够直接鉴别滴虫和念珠菌的方法有显微镜镜检和免疫学的方法。显微镜镜检受检验人员的经验、观察视野以及标本中其他颗粒的影响大；免疫学的方法受技术所限，特别是病原体受白带包裹，灵敏度会受到影响。利用微生物所具有的特异性酶检测相应微生物的酶化学检测技术是微生物检测的又一大技术方向，事实上越来越多的科技人员正尝试利用该技术检测滴虫和念珠菌，比如通过胱氨酰蛋白酶检测滴虫，通过门冬酰胺蛋白酶检测念珠菌，但其灵敏度和特异性都有待考证。目前可以同时检测并鉴别滴虫和念珠菌的方法有N-乙酰-氨基糖苷酶法，但此法灵敏度和特异性均偏低。

研究发现，滴虫有α-葡萄糖苷酶和凝固酶活性，白色念珠菌、光滑念珠菌和热带念珠菌也同样具有该酶活，虽然克柔氏念珠菌等无该酶活性，但白色念珠菌、光滑念珠菌和热带念珠菌占所有病原念珠菌中的95%以上，因此以阿尔法-葡萄糖苷酶和凝固酶活性可以把滴虫及绝大数念珠菌检测出来。

中性α-葡萄糖苷酶是附睾分泌功能的标志酶和特异性酶。精浆中性α-葡萄糖苷酶结合其他指标如精浆果糖和精子染色等检测，还可实现梗阻性无精子症患者的梗阻部位定位，分泌型或排泄型无精子症的鉴别、附睾水平上局部梗阻的判断等。目前，精浆中性α-葡萄糖苷酶检测的方法为化学比色法，该法多为手工或半自动操作，加样程序多，操作复杂，试剂和样品混匀一定时间后，通过分光光度计逐一进行比色测定，再根据标准曲线回算出结果，耗时耗力，且人为误差也比较大。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可用于α-葡萄糖苷酶检测的底物，本发明同时提供该底物的制备方法以及该底物在制备鉴别念珠菌和滴虫的联检试剂盒以及精浆联检试剂盒方面的应用。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的底物，其结构式为：

，

其中，R为吲哚衍生物、硝基苯及其衍生物、萘衍生物、苯胺衍生物或香豆素衍生物中之一。

所述R为吲哚衍生物时，其底物的结构式为：

，

式中的R_Ⅰ-1选自氢、甲基、乙基中其中之一；R_Ⅰ-2~R_Ⅰ-5各自独立选择氢、C1~C3烷基或卤素中其中之一。

所述R为硝基苯及其衍生物时，其底物的结构式为：

式中的R_Ⅱ-1~R_Ⅱ-5各自独立选择氢、C1~C3烷基或硝基中其中之一。进一步的，式中的R_Ⅱ-1~R_Ⅱ-5中包含一个硝基。

所述R为萘衍生物时，其底物的结构式为：

或

，

式中 R_Ⅲ-1~R_Ⅲ-4各自独立选择氢、C1~C3烷基或卤素中其中之一。

所述R为苯胺衍生物时，其底物的结构式为：

式中R_Ⅳ-1~R_Ⅳ-5各自独立选自氢、C1~C3烷基或氨基中其中之一。进一步的，所述R_Ⅳ-1~R_Ⅳ-5中包含一个氨基。

所述R为香豆素衍生物时，其底物的结构式为：

或

式中R_Ⅴ-1~R_Ⅴ-5各自独立选择氢或C1~C3烷基。

本发明底物的制备方法包括下述具体步骤：

第一步，将式（Ⅰ）（α-D-葡萄糖）化合物与乙酰氯于室温下反应，反应完成后，减压浓缩除去溶剂，经柱层析纯化得到式（Ⅱ）（α-D-五乙酰葡萄糖）化合物，备用；

第二步，将第一步所得化合物在乙腈溶液中经N，N-二甲基-1，3-二氨基丙烷催化反应，反应完成后经盐酸酸洗、乙酸乙酯萃取、无水硫酸钠干燥、柱层析纯化得到式（Ⅲ）（2,3,4,6-四-O-α-D-乙酰基葡萄糖）化合物，备用；

第三步，将第二步所得化合物在二氯甲烷溶液中经碳酸钾催化与三氯乙腈反应，反应完成后经过滤、柱层析纯化得到式（Ⅳ）（2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-葡萄糖基三氯乙酰亚胺）化合物，备用；

第四步，将第三步所得化合物在二氯甲烷溶液中，在氩氛保护下，经三氟化硼乙醚催化与式（Ⅴ）（色原或荧光基团物质）化合物反应，反应完成后经饱和食盐水、二氯甲烷萃取，合并有机相，干燥、浓缩、甲醇复溶、4℃养晶2小时过滤，得到式（Ⅵ）（2,3,4,6-四-O-乙酰基-α-D-葡萄糖苷）化合物，备用；

第五步，第四步所得化合物在甲醇溶液中经甲醇钠催化反应，反应完成后经活性炭脱色吸附、过滤、柱层析纯化即制得式（Ⅷ）（α-D-葡萄糖苷）的目标底物化合物。

本发明的合成路线如图1所示。

本发明底物在检测α-葡萄糖苷酶活性中的应用，尤其是在制备鉴别念珠菌和滴虫的联检试剂盒以及精浆联检试剂盒方面的应用。

本发明底物的合成工艺简单，收率高，将其应用在现有鉴别念珠菌和滴虫的联检试剂盒以及精浆联检试剂盒中，可大大提高试剂盒的灵敏度，且稳定性好，特异性强。

附图说明

图1是本发明底物的合成路线图。

图2是实施例1制备6-氯-3-吲哚-α-D-吡喃葡萄糖苷底物的合成路线图。

图3是实施例1中式（Ⅱ）化合物的¹HNMR图。

图4是实施例2制备对硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷底物的合成路线图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做更加详细的说明，以便于本领域技术人员的理解。需要说明的是，以下实施例并不用于限制本发明的保护范围。

实施例1 制备底物化合物6-氯-3-吲哚-α-D-吡喃葡萄糖苷--式（Ⅷ-1）

其合成路线如图2所示，具体步骤为：

1、式（Ⅱ）化合物的制备

取式（Ⅰ）所示化合物180.2g于1L圆底烧瓶中，加入500mL乙酰氯，室温反应15个小时，减压浓缩除去溶剂，粗产品用硅胶柱层析法分离，得到白色式（Ⅱ）所示化合物276.3g，收率为71%。MS(ESI)：m/z(%) 413.1 [M+Na]⁺。¹HNMR如图3所示。

2、式（Ⅲ）化合物的制备

将以上得到的式（Ⅱ）所示化合物195.2g置于1L圆底烧瓶中，加入500mL乙腈，室温搅拌至完全溶解，加入126mLN，N-二甲基-1，3-二氨基丙烷，室温反应12h，将反应液加入1L浓度为1M盐酸溶液中，乙酸乙酯萃取（500mL×3），有机相使用无水硫酸钠干燥，减压浓缩除去溶剂，粗产品用硅胶柱层析法分离，展开剂为乙酸乙酯：石油醚（体积比）=1:3，得到式（Ⅲ）所示化合物白色固体125.8g，收率72%。MS(ESI)：m/z(%) 371.1 [M+Na]⁺。¹HNMR (400 MHz,CDCl₃), δ(ppm) 5.43 (t, 1H, J = 10.2 Hz), 5.37 (s, 1H), 4.97 (t, 1H, J = 10.2Hz), 4.77 (dd, 1H, J = 3.5, 3.5 Hz), 4.19-4.13 (m, 2H), 4.02 (d, 1H, J = 5.6Hz), 2.00 (s, 3H), 1.98 (s, 3H), 1.97 (s, 3H), 1.95 (s, 3H)。

3、式（Ⅳ）化合物的制备

将以上得到式（Ⅲ）化合物87.1g置于500mL烧瓶中，加入250mL二氯甲烷，室温搅拌至完全溶解，氩氛保护下，加入碳酸钾69.1g、三氯乙腈100mL，室温下反应6小时，过滤除去不溶物，减压浓缩除去溶剂，粗产品用硅胶柱层析法分离，展开剂为乙酸乙酯：石油醚（体积比）=1:3，得到式（Ⅳ）所示化合物白色固体87.5g，收率71%。MS(ESI)：m/z(%) 514.0 [M+Na]⁺。¹HNMR (400 MHz, CDCl3): δ(ppm) 8.64 (s, 1H, NH), 6.56 (s, 1H, H1), 5.51 (s,1H, H4), 5.37 (m, 2H, H3, H2), 4.20 (t, 1H, J = 6.5 Hz, H5), 4.14-4.03 (m,2H, H6), 2.14 (s, 3H, CH₃), 1.98 (s, 9H, CH₃)。

4、式（Ⅵ-1）化合物的制备

取以上所得式（Ⅳ）所示化合物49.3g溶于250mL二氯甲烷中，在氩氛保护下，加入19.3g式（Ⅴ-1）所示化合物，加入9.1mL三氟化硼乙醚，室温反应9h，反应结束，加入500mL饱和食盐水中，二氯甲烷萃取（200mL×3），合并有机相，干燥、浓缩、甲醇复溶、4℃养晶2小时过滤，得到白色式（Ⅵ-1）化合物19.7g,收率40%。MS(ESI)：m/z(%) 562.1 [M+Na]⁺。¹HNMR (400MHz, CDCl3): δ(ppm) 8.36 (d, 1H, Ar-H), 8.19 (s, 1H), 7.80 (s, 1H, Ar-H),7.00 (d, 1H, Ar-H), 6.38 (d, 1H), 5.92 (t, 1H), 5.83 (t, 1H), 5.25 (t, 1H),4.76 (q, 1H), 4.29 (q, 2H, CH₂), 4.04 (q, 1H, CH₂), 2.67 (s, 3H, CH₃), 2.05(s, 3H, CH₃), 1.98 (s, 9H, CH₃)。

5、式（Ⅷ-1）6-氯-3-吲哚-α-D-吡喃葡萄糖苷底物的制备

取以上得到式（Ⅵ-1）化合物12.4g于250mL圆底烧瓶中，加入100mL无水甲醇，室温搅拌均匀，加入甲醇钠6.8g，TLC（薄层色谱）检测，反应结束，反应溶液使用1g活性炭脱色处理，过滤除去不溶物，减压浓缩至干，粗产品用硅胶柱层析法分离，展开剂为甲醇：二氯甲烷（体积比）=1:7，得到白色式（Ⅷ-1）所示6-氯-3-吲哚-α-D-吡喃葡萄糖苷底物4.7g,收率62%。MS(ESI)：m/z(%) 352.1 [M+Na]⁺。¹HNMR (400 MHz, CDCl3): δ(ppm) 10.83 (s, 1H, NH),7.93 (d, 1H, Ar-H), 7.63 (s, 1H, =CH), 7.51 (t, 1H, Ar-H), 7.11 (s, 1H, Ar-H), 5.76 (d, 1H), 4.91 (s, 1H), 4.75 (s, 1H), 4.69 (s, 1H), 4.17 (t, 1H),3.96 (s, 1H), 3.72 (t, 1H), 3.49-3.50 (m, 4H)。

实施例2 制备底物化合物对硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷--式（Ⅷ-2）

其合成路线如图4所示，具体步骤为：

1、式（Ⅱ）化合物的制备

同实施例1

2、式（Ⅲ）化合物的制备

同实施例1

3、式（Ⅳ）化合物的制备

式（Ⅳ）化合物的制备

4、式（Ⅵ-2）化合物的制备

取以上所得式（Ⅳ）所示化合物49.3g溶于250mL二氯甲烷中，在氩氛保护下，加入11.1g式（Ⅴ-2）所示化合物，加入3.9mL三氟化硼乙醚，室温反应5h，反应结束，加入300mL饱和食盐水中，二氯甲烷萃取（200mL×3），合并有机相，干燥、浓缩、甲醇复溶、4℃养晶2小时过滤，得到白色式（Ⅵ-2）化合物16.4g,收率44%。MS(ESI)：m/z(%) 492.1 [M+Na]⁺。¹HNMR (400MHz, CDCl3): δ(ppm) 8.14 (d, 2H, Ar-H)， 7.19 (d, 2H, Ar-H), 6.37 (d, 1H),5.93 (t, 1H), 5.83 (t, 1H), 5.26 (t, 1H), 4.73 (dd, 1H), 4.28 (q, 1H, CH₂),4.04 (q, 1H, CH₂), 2.04 (s, 3H, CH₃), 2.01 (s, 9H, CH₃)。

5、式（Ⅷ-2）对硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷底物的制备

取以上得到式（Ⅵ-2）化合物11.7g于250mL圆底烧瓶中，加入90mL无水甲醇，室温搅拌均匀，加入甲醇钠5.4g，TLC（薄层色谱）检测，反应结束，反应溶液使用1g活性炭脱色处理，过滤除去不溶物，减压浓缩至干，粗产品用硅胶柱层析法分离，展开剂为甲醇：二氯甲烷（体积比）=1:6，得到白色式（Ⅷ-2）所示对硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷底物3.8g,收率51%。MS(ESI)：m/z(%) 324.3 [M+Na]⁺。¹HNMR (400 MHz, CDCl3): δ(ppm) 8.13 (d, 2H, Ar-H)，7.20 (d, 2H, Ar-H), 5.78 (d, 1H), 4.90 (s, 1H), 4.79 (s, 1H), 4.69 (s, 1H),4.23 (t, 1H), 3.92 (s, 1H), 3.69 (t, 1H), 3.48-3.61 (m, 4H)。

实施例3 实施例1制备的6-氯-3-吲哚-α-D-吡喃葡萄糖苷底物在检测鉴别念珠菌和滴虫的联检试剂盒中的应用

1、制备一种检测鉴别念珠菌和滴虫的联检试剂盒，如（专利号2013102326735，公告号CN 103266163B）的检测鉴别念珠菌和滴虫的联检试剂盒，其中的α-葡萄糖苷酶活性检测试剂选用实施例1制备的6-氯-3-吲哚-α-D-吡喃葡萄糖苷底物。

2、试剂盒的临床试验

临床试验2523例郑州市妇幼保健院妇科门诊患者，通过扩阴器，用无菌试子采取四份阴道后穹窿分泌物，一份采用悬滴法镜检滴虫和念珠菌，一份采用实施例3制备的试剂盒检测滴虫和念珠菌，另两份分别采用沙宝罗培养基和滴虫培养基培养检测念珠菌和滴虫，以培养法为金标准。

检测结果如下表1、表2所示：

表1

表2

表1、表2结果显示，采用实施例1制备的6-氯-3-吲哚-α-D-吡喃葡萄糖苷底物制备的检测鉴别念珠菌和滴虫的联检试剂盒（实施例3）检测鉴别滴虫和念珠菌，其灵敏度高，特异性强，更加满足临床应用要求。

同理，由于在精浆等其他样本中也存在α-葡萄糖苷酶成分，为准确检测α-葡萄糖苷酶的活性，在精浆联检试剂盒（如专利号2014100477171，公告号CN 103760331B）中，其底物也可采用本发明制备的α-D-葡萄糖苷底物化合物，效果相同。

Claims (10)

1.一种底物，其特征在于：所述底物的结构式为：

，

其中，R为吲哚衍生物、硝基苯及其衍生物、萘衍生物、苯胺衍生物或香豆素衍生物中之一。

2.根据权利要求1所述的底物，其特征在于：所述R为吲哚衍生物时，其底物的结构式为：

，

式中的R_Ⅰ-1选自氢、甲基、乙基中其中之一；R_Ⅰ-2~R_Ⅰ-5各自独立选择氢、C1~C3烷基或卤素中其中之一。

3.根据权利要求1所述的底物，其特征在于：所述R为硝基苯及其衍生物时，其底物的结构式为：

式中的R_Ⅱ-1~R_Ⅱ-5各自独立选择氢、C1~C3烷基或硝基中其中之一。

4.根据权利要求3所述的底物，其特征在于：式中的R_Ⅱ-1~R_Ⅱ-5中包含一个硝基。

5.根据权利要求1所述的底物，其特征在于：所述R为萘衍生物时，其底物的结构式为：

或

，

式中 R_Ⅲ-1~R_Ⅲ-4各自独立选择氢、C1~C3烷基或卤素中其中之一。

6.根据权利要求1所述的底物，其特征在于：所述R为苯胺衍生物时，其底物的结构式为：

式中R_Ⅳ-1~R_Ⅳ-5各自独立选自氢、C1~C3烷基或氨基中其中之一。

7.根据权利要求6所述的底物，其特征在于：所述R_Ⅳ-1~R_Ⅳ-5中包含一个氨基。

8.根据权利要求1所述的底物，其特征在于：所述R为香豆素衍生物时，其底物的结构式为：

或

式中R_Ⅴ-1~R_Ⅴ-5各自独立选择氢或C1~C3烷基。

9.权利要求1-8中任一项底物的制备方法，其特征在于：包括下述具体步骤：

第一步，将化合物α-D-葡萄糖与乙酰氯于室温下反应，反应完成后，减压浓缩除去溶剂，经柱层析纯化得到化合物α-D-五乙酰葡萄糖，备用；

第二步，将第一步所得化合物在乙腈溶液中经N，N-二甲基-1，3-二氨基丙烷催化反应，反应完成后经盐酸酸洗、乙酸乙酯萃取、无水硫酸钠干燥、柱层析纯化得到化合物2,3,4,6-四-O-α-D-乙酰基葡萄糖，备用；

第三步，将第二步所得化合物在二氯甲烷溶液中经碳酸钾催化与三氯乙腈反应，反应完成后经过滤、柱层析纯化得到化合物2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-葡萄糖基三氯乙酰亚胺，备用；

第四步，将第三步所得化合物在二氯甲烷溶液中，在氩氛保护下，经三氟化硼乙醚催化与色原或荧光基团反应，反应完成后经饱和食盐水、二氯甲烷萃取，合并有机相，干燥、浓缩、甲醇复溶、4℃养晶2小时过滤，得到化合物2,3,4,6-四-O-乙酰基-α-D-葡萄糖苷，备用；

第五步，第四步所得化合物在甲醇溶液中经甲醇钠催化反应，反应完成后经活性炭脱色吸附、过滤、柱层析纯化制得α-D-葡萄糖苷底物化合物。

10.权利要求1-8中任一项底物在检测α-葡萄糖苷酶活性中的应用。