CN108603215A - 用于检测金黄色葡萄球菌的培养基和具有该培养基的金黄色葡萄球菌检测片、以及使用它们的金黄色葡萄球菌的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供能够高精度地鉴定金黄色葡萄球菌的检测手段。本发明的一个方式涉及一种用于检测金黄色葡萄球菌的培养基，其包含1种以上的营养成分、在α‑葡萄糖苷酶的存在下显色的显色剂、在磷酸酶的存在下显色的显色剂、以及0.5mg/cm3以上的粘菌素甲磺酸钠。本发明的另一方式还涉及具有所述培养基的金黄色葡萄球菌检测片、以及使用它们的金黄色葡萄球菌的检测方法。

Description

用于检测金黄色葡萄球菌的培养基和具有该培养基的金黄色 葡萄球菌检测片、以及使用它们的金黄色葡萄球菌的检测 方法
技术领域
本发明涉及用于检测金黄色葡萄球菌的培养基和具有该培养基的金黄色葡萄球菌检测片、以及使用它们的金黄色葡萄球菌的检测方法。
背景技术
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是产生各种毒素的细菌。金黄色葡萄球菌也是引起败血症、心内膜炎以及肺或骨关节病之类的严重的细菌感染症的病原菌。因此，在对食品或饮料品进行处理的设施(例如工厂或餐厅等)以及医疗设施等中，需要简便且高精度地检测金黄色葡萄球菌的手段。
例如，专利文献1记载了一种用于对包含1种以上细菌的样品内的葡萄球菌进行鉴定和测定的方法，其特征在于，包括下述步骤：i)将部分量的样品接种在选择培养基中的步骤，该步骤的特征在于，上述培养基包含用于促进葡萄球菌的增殖的抑制剂、在β-葡萄糖苷酶的存在下能够形成可观察的第1颜色的第1底物、以及在葡萄球菌的存在下能够形成第2颜色的第2底物；ii)对上述接种后的培养基进行温育，形成在该培养基中的上述第1底物和第2底物的存在下能够观察到细菌菌落的充分大小的上述细菌菌落的步骤；以及iii)对通过上述第2底物的上述第2颜色的存在而鉴定出的上述菌落进行测定从而得出上述样品内的葡萄球菌数的步骤。该文献中记载了上述抑制剂可从由粘菌素甲磺酸盐、萘啶酸和氯化锂组成的组中选择。另外，该文献记载了上述第1底物为在β-葡萄糖苷酶的存在下发生视觉上的颜色变化的吲哚基吡喃葡萄糖苷底物，上述第2底物在葡萄球菌的存在下发生视觉上的颜色变化。
专利文献2记载了一种用于检测金黄色葡萄球菌和/或凝固酶阳性葡萄球菌(Staphylococci)的培养基，其包含金黄色葡萄球菌培养基和用于α-葡萄糖苷酶活性表达的至少1种酶底物。该文献中，作为用于α-葡萄糖苷酶活性表达的至少1种酶底物，记载了吲哚氧基系化合物。
专利文献1和专利文献2中所公开的培养基通常以使用琼脂之类的凝胶化剂在灭菌培养皿中形成的平板固体培养基的形态来使用。在这种实施方式的情况下，有时在平板固体培养基的制备、试样的分注和微生物的培养等操作中需要高技术。
专利文献3记载了一种微生物培养片，其是具有基材片、在上述基材片上形成的培养层、以及覆盖上述培养层的盖板的微生物培养片，上述培养层是使培养液进行图案形成而得到的，该培养液包含聚乙烯吡咯烷酮以及选自由凝胶化剂、营养成分、显色指示剂、选择剂和底物组成的组中的至少一种。该文献中记载了使用者可利用上述微生物培养片简便且稳定地对食品或饮料品等实施细菌菌数检查等。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表平9-508279号公报
专利文献2：日本特表2004-524041号公报
专利文献3：国际公开第2011/007802号
发明内容
发明所要解决的课题
迄今为止，已知有几种用于检测金黄色葡萄球菌的手段。但是，这些公知的手段存在改良的余地。例如，在将专利文献1或2所记载的培养基应用于特定的实施方式的情况下，有时金黄色葡萄球菌以外的葡萄球菌会成为假阳性。
因此，本发明的目的在于提供能够高精度地鉴定出金黄色葡萄球菌的检测手段。
用于解决课题的手段
本发明人对用于解决上述课题的手段进行了各种研究。本发明人发现，通过在培养基中添加对于在金黄色葡萄球菌中表达的两种酶具有特异性的显色底物和高浓度的选择剂，能够以在该培养基上形成的菌落的颜色为指标高精度地检测出金黄色葡萄球菌。本发明人基于上述见解完成了本发明。
即，本发明的要点如下。
(1)一种用于检测金黄色葡萄球菌的培养基，其包含1种以上的营养成分、在α-葡萄糖苷酶的存在下显色的显色剂、在磷酸酶的存在下显色的显色剂、以及0.5mg/cm3以上的粘菌素甲磺酸钠。
(2)如上述(1)所述的培养基，其中，在α-葡萄糖苷酶的存在下显色的显色剂为6-氯-3-吲哚氧基-α-D-葡萄糖苷，在磷酸酶的存在下显色的显色剂为5-溴-3-吲哚氧基磷酸酯。
(3)如上述(1)所述的培养基，其中，在α-葡萄糖苷酶的存在下显色的显色剂为5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-α-D-葡萄糖苷，在磷酸酶的存在下显色的显色剂为5-溴-6-氯-3-吲哚氧基磷酸酯。
(4)如上述(1)～(3)中任一项所述的培养基，其中，包含0.5～4.1mg/cm3的范围的粘菌素甲磺酸钠。
(5)如上述(4)所述的培养基，其中，包含0.5～2.8mg/cm3的范围的粘菌素甲磺酸钠。
(6)如上述(5)所述的培养基，其中，包含2.3～2.8mg/cm3的范围的粘菌素甲磺酸钠。
(7)一种微生物培养基材，其为具有基材以及配置在上述基材的上表面的培养层的、用于检测金黄色葡萄球菌的微生物培养基材，
上述培养层包含上述(1)～(6)中任一项所述的培养基。
(8)如上述(7)所述的微生物培养基材，其中，进一步具有片形状的基材以及覆盖上述培养层的盖板，上述培养层进一步包含聚乙烯吡咯烷酮以及1种以上的凝胶化剂。
(9)一种对金黄色葡萄球菌进行检测的方法，其包括下述步骤：
试样添加步骤，向上述(1)～(6)中任一项所述的培养基或者上述(7)或(8)所述的微生物培养基材的培养层中添加包含微生物的试样；
菌落形成步骤，对添加有试样的培养基或微生物培养基材进行温育，形成微生物的菌落；以及
菌株鉴定步骤，基于所形成的微生物菌落的颜色对金黄色葡萄球菌进行鉴定。
(10)如上述(9)所述的方法，其中，在试样添加步骤中，向上述(7)或(8)所述的微生物培养基材的培养层中添加包含微生物的试样，该微生物培养基材的培养层包含相对于包含微生物的试样的总体积为0.2mg/ml以上的粘菌素甲磺酸钠。
发明的效果
利用本发明能够提供可高精度地鉴定金黄色葡萄球菌的检测手段。
附图说明
图1是示出本发明的一个方式的用于检测金黄色葡萄球菌的微生物培养基材的一个实施方式的图。图1(a)是本发明的一个方式的微生物培养基材的俯视图，图1(b)是沿图1(a)中的I-I’的垂直截面示意图，图1(c)是示出将盖板弯折来覆盖培养层的状态的垂直截面示意图。
图2是示出本发明的一个方式的用于检测金黄色葡萄球菌的微生物培养基材的另一实施方式的图。图2(a)是本发明的一个方式的微生物培养基材的俯视图，图2(b)是沿着图2(a)中的II-II’的垂直截面示意图，图2(c)是示出将盖板弯折来覆盖培养层的状态的垂直截面示意图。
图3是示出本发明的一个方式的用于检测金黄色葡萄球菌的微生物培养基材的另一实施方式的垂直截面示意图。
图4是示出本发明的一个方式的用于检测金黄色葡萄球菌的微生物培养基材的另一实施方式的垂直截面示意图。
图5是示出本发明的一个方式的用于检测金黄色葡萄球菌的微生物培养基材的一个实施方式的外观立体图。
图6是示出本发明的一个方式的用于检测金黄色葡萄球菌的微生物培养基材的另一实施方式的外观立体图。
图7是示出实验5中显色后的各菌株菌落的形成状态和颜色的照片。图7(a)：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC25923菌株、图7(b)：金黄色葡萄球菌NBRC100910菌株、图7(c)：金黄色葡萄球菌NBRC12732菌株、图7(d)：中间型葡萄球菌(Staphylococcus intermedius)、图7(e)：猪葡萄球菌(Staphylococcus hyicus)、图7(f)：表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)。
图8是示出实验5中显色后的各菌株菌落的形成状态和颜色的照片。图8(a)：腐生葡萄球菌腐生亚种(Staphylococcus saprophyticus subsp.saprophyticus)、图8(b)：木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)、图8(c)：松鼠葡萄球菌(Staphylococcussciuri)、图8(d)：腊样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、图8(e)：地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)、图8(f)：枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)。
图9是示出实验6中显色后的各菌株菌落的形成状态和颜色的照片。图9(a)：金黄色葡萄球菌ATCC25923菌株、图9(b)：金黄色葡萄球菌NBRC100910菌株、图9(c)：金黄色葡萄球菌NBRC12732菌株、图9(d)：中间型葡萄球菌、图9(e)：猪葡萄球菌、图9(f)：表皮葡萄球菌。
图10是示出实验6中显色后的各菌株菌落的形成状态和颜色的照片。图10(a)：腐生葡萄球菌腐生亚种、图10(b)：木糖葡萄球菌、图10(c)：松鼠葡萄球菌、图10(d)：模仿葡萄球菌(Staphylococcus simulans)、图10(e)：溶血葡萄球菌(Staphylococcushaemolyticus)、图10(f)：沃氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)。
图11是示出实验6中显色后的各菌株菌落的形成状态和颜色的照片。图11(a)：人葡萄球菌(Staphylococcus hominis)、图11(b)：科氏葡萄球菌(Staphylococcus cohnii)、图11(c)：头状葡萄球菌(Staphylococcus capitis)、图11(d)：腊样芽胞杆菌、图11(e)：地衣芽胞杆菌、图11(f)：枯草芽胞杆菌。
具体实施方式
在本说明书中，适当地参照附图对本发明的特征进行说明。在附图中，为清楚起见，对各部分的尺寸和形状进行了夸张，并未准确地描绘出实际的尺寸和形状。因此，本发明的技术范围并不限于在这些附图中示出的各部分的尺寸和形状。
<1：用于检测金黄色葡萄球菌的培养基>
本发明的一个方式涉及用于检测金黄色葡萄球菌的培养基。
在本发明中，金黄色葡萄球菌是指Staphylococcus aureus。金黄色葡萄球菌是被分类在葡萄球菌属(Staphylococcus属)中的革兰氏阳性菌。金黄色葡萄球菌通常可通过使用Baird-Parker琼脂培养基或加蛋黄甘露醇食盐琼脂培养基等金黄色葡萄球菌用选择培养基的培养试验来确认其存在。在使用这些选择培养基的培养试验中，利用添加到培养基中的选择剂使金黄色葡萄球菌选择性地生长，通过蛋黄反应或甘露醇分解性等判定为金黄色葡萄球菌。但是，在使用这些选择培养基的培养试验中，有时会将金黄色葡萄球菌以外的菌种检测为假阳性。因此，通常在上述培养试验后进一步通过以凝固酶活性为指标的凝固酶试验来进行金黄色葡萄球菌的判定。凝固酶是在金黄色葡萄球菌中表达的具有血浆凝固作用的菌体外酶。已知凝固酶与金黄色葡萄球菌所致的人类病原性相关。因此认为，通过以凝固酶活性作为指标，能够与肠球菌(Enterococcus属菌)和芽胞杆菌(Bacillus属菌)之类的非葡萄球菌、以及金黄色葡萄球菌以外的多种葡萄球菌相区别地检测出葡萄球菌。但是，金黄色葡萄球菌以外的几种葡萄球菌像金黄色葡萄球菌那样具有凝固酶产生能力。因此，这些葡萄球菌在以凝固酶活性作为指标的金黄色葡萄球菌的检测试验中可能被检测为假阳性。
因此开发出了以凝固酶以外的酶活性、例如α-葡萄糖苷酶、磷酸酶、β-葡萄糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶或β-葡萄糖苷酶之类的各种菌体外酶的酶活性作为指标的金黄色葡萄球菌的检测手段(专利文献1和2等)。但是，在这些检测手段中，由于所使用的酶的组合和/或培养条件等原因，有时金黄色葡萄球菌以外的葡萄球菌也会成为假阳性。
例如，在α-葡萄糖苷酶和磷酸酶的组合的情况下，认为金黄色葡萄球菌以菌体外酶的形式表达上述两种酶，与之相对，金黄色葡萄球菌以外的葡萄球菌仅表达上述酶中的任一种、或者两种酶均不表达。因此认为，通过以α-葡萄糖苷酶和磷酸酶这两者的酶活性作为指标，能特异性地检测出金黄色葡萄球菌(专利文献2)。但是，本发明人发现，即使在以α-葡萄糖苷酶和磷酸酶这两者的酶活性作为指标的试验中，有时金黄色葡萄球菌以外的几种葡萄球菌也被检测为假阳性。
本发明人发现，通过在培养基中除了添加对于α-葡萄糖苷酶和磷酸酶(它们是在金黄色葡萄球菌中表达的凝固酶以外的菌体外酶)分别具有特异性的两种显色底物以外还添加高浓度的选择剂，能够以在该培养基上形成的菌落的颜色为指标高精度地检测出金黄色葡萄球菌。
本方式的用于检测金黄色葡萄球菌的培养基需要包含1种以上的营养成分、在α-葡萄糖苷酶的存在下显色的显色剂、在磷酸酶的存在下显色的显色剂、以及高浓度的粘菌素甲磺酸钠。通过使用除了包含上述两种显色底物以外还包含高浓度的粘菌素甲磺酸钠的本方式的培养基，不仅葡萄球菌以外的微生物、而且金黄色葡萄球菌以外的其他葡萄球菌均不会被检测为假阳性，能够高精度地仅检测出金黄色葡萄球菌。
在本方式的培养基中，作为1种以上的营养成分，可以适当地选择在该技术领域中作为在金黄色葡萄球菌的检测中使用的培养基的营养成分通常使用的物质。作为营养成分并无限定，例如可以举出蛋白胨、胰蛋白胨、大豆胨、肉提取物、酵母提取物、丙酮酸钠和蛋黄混合物；D(-)-甘露醇等糖或糖醇；磷酸钾、磷酸钠、碳酸钠和碳酸钾等无机盐；以及甘氨酸等氨基酸。营养成分的浓度可以由本领域技术人员基于本方式的培养基和/或包含作为对象的微生物的试样在使用时的状态、体积、和/或培养条件等从该技术领域中通常使用的范围中适当地设定。
本发明中，“选择剂”是指具有可抑制不是检测对象即金黄色葡萄球菌的特定微生物的生长的抗菌活性的化合物。在本说明书中，有时将具有抗菌活性的化合物记载为“抗菌剂”。本方式的培养基包含0.5mg/cm3以上的粘菌素甲磺酸钠作为选择剂。粘菌素甲磺酸钠的浓度优选为0.5～4.1mg/cm3的范围、更优选为0.5～2.8mg/cm3的范围、进一步优选为2.3～2.8mg/cm3的范围、特别优选为约2.5mg/cm3。上述浓度以相对于本方式的培养基的总体积的质量浓度来定义。例如，在本发明的一个方式为具有以下说明的基材以及配置在基材的上表面的包含本方式的培养基的培养层的、用于检测金黄色葡萄球菌的微生物培养基材的情况下，上述浓度以本方式的微生物培养基材中相对于包含本方式的培养基的干燥状态的培养层的总体积的质量浓度来定义。这种情况下，以相对于添加在干燥状态的培养层中的试样的总体积的质量浓度计，粘菌素甲磺酸钠的浓度通常为0.2mg/ml以上、优选为0.2～1.6mg/ml的范围、更优选为0.2～1.1mg/ml的范围、进一步优选为0.9～1.1mg/ml的范围、特别优选为约1mg/ml。粘菌素甲磺酸钠是作为针对革兰氏阴性菌的抗菌剂已知的化合物，其通常以0.1mg/ml(100μg/ml)以下、例如1～20μg/ml的浓度使用(日本化学療法学会雑誌(日本化学疗法学会杂志),第60卷第4号,p.446-467,2012年)。粘菌素甲磺酸钠通常不作为针对葡萄球菌之类的革兰氏阳性菌的抗菌剂来使用。本发明人发现，粘菌素甲磺酸钠对于作为金黄色葡萄球菌以外的葡萄球菌的腐生葡萄球菌(腐生葡萄球菌腐生亚种(Staphylococcus saprophyticus subsp.saprophyticus))在0.5mg/cm3以上的高浓度下显示出生长抑制，对于肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)在1.3mg/cm3以上的高浓度下显示出生长抑制，对于木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus)和松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri)在2.3mg/cm3以上的高浓度下显示出生长抑制。因此，在粘菌素甲磺酸钠的浓度为0.5mg/cm3(在微生物培养基材的方式的情况下，以相对于添加到干燥状态的培养层中的试样的总体积的质量浓度计为0.2mg/ml)以上的情况下，能够实质上抑制腐生葡萄球菌的生长，能够防止将该菌株被检测为假阳性。在粘菌素甲磺酸钠的浓度为2.3mg/cm3(在微生物培养基材的方式的情况下，以相对于添加到干燥状态的培养层中的试样的总体积的质量浓度计为0.9mg/ml)以上的情况下，除了腐生葡萄球菌以外，还能够实质上抑制肉葡萄球菌、木糖葡萄球菌和松鼠葡萄球菌的生长，能够防止该菌株被检测为假阳性。另外，在粘菌素甲磺酸钠的浓度为4.1mg/cm3(在微生物培养基材的方式的情况下，以相对于添加到干燥状态的培养层中的试样的总体积的质量浓度计为1.6mg/ml)以下的情况下，不会抑制在该技术领域中作为检测对象的主要的金黄色葡萄球菌的生长，能够将该菌株检测为阳性。特别是在粘菌素甲磺酸钠的浓度为2.8mg/cm3(在微生物培养基材的方式的情况下，以相对于添加到干燥状态的培养层中的试样的总体积的质量浓度计为1.1mg/ml)以下的情况下，不会抑制在该技术领域中作为检测对象的几乎全部的金黄色葡萄球菌的生长，能够将该菌株检测为阳性。因此，通过以上述的高浓度包含粘菌素甲磺酸钠，能够实质上防止在本方式的培养基中将金黄色葡萄球菌以外的葡萄球菌检测为假阳性。
本方式的培养基可以根据期望包含1种以上的其他选择剂。1种以上的其他选择剂可以从在该技术领域中作为添加到用于检测金黄色葡萄球菌的培养基中的选择剂通常使用的具有抗菌活性的化合物中适当地选择。作为1种以上的其他选择剂没有限定，例如可以举出氯化锂、硫酸锂、氯化钠、叠氮化钠、亚碲酸钾、萘啶酸、去铁胺、氨曲南和杆菌肽。1种以上的其他选择剂优选为氯化锂、叠氮化钠和萘啶酸的组合。1种以上的其他选择剂的浓度可以由本领域技术人员基于本方式的培养基和/或包含作为对象的微生物的试样在使用时的状态、体积、和/或培养条件等从该技术领域中通常使用的范围中适当地设定。例如，氯化锂的浓度优选为1～40mg/cm3的范围。例如，叠氮化钠的浓度优选为20～200μg/cm3的范围。例如，萘啶酸的浓度优选为10～40μg/cm3的范围。上述浓度以相对于本方式的培养基的总体积的质量浓度来定义。例如，在本发明的一个方式为用于检测金黄色葡萄球菌的微生物培养基材的情况下，上述浓度以本方式的微生物培养基材中相对于包含本方式的培养基的干燥状态的培养层的总体积的质量浓度来定义。通过包含1种以上的其他选择剂，能够实质上防止在本方式的培养基中将金黄色葡萄球菌以外的葡萄球菌和其他微生物检测为假阳性。
需要说明的是，本方式的培养基中包含的粘菌素甲磺酸钠等选择剂的浓度例如可以如下确定：使用溶剂提取、蒸馏、再结晶以及吸附、分配和凝胶过滤等层析法等中的1种以上的分离手段将一定体积的培养基中包含的选择剂进行纯化，之后使用液相色谱/质谱(LC/MS)等分析手段对该选择剂进行定量分析，由此确定上述选择剂的浓度。
本方式的培养基包含在已知为金黄色葡萄球菌的菌体外酶的α-葡萄糖苷酶的存在下显色的显色剂。作为在α-葡萄糖苷酶的存在下显色的显色剂没有限定，例如可以举出6-氯-3-吲哚氧基-α-D-葡萄糖苷(粉色)、6-溴-3-吲哚氧基-α-D-葡萄糖苷(红色)、5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-α-D-葡萄糖苷(淡蓝色)、5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-N-甲基-α-D-葡萄糖苷(绿色)、5-溴-6-氯-3-吲哚氧基-α-D-葡萄糖苷(紫红色)、5-溴-3-吲哚氧基-α-D-葡萄糖苷(蓝色)。上述显色剂均为在α-葡萄糖苷酶的存在下显色的酶底物。以上述显色剂为6-氯-3-吲哚氧基-α-D-葡萄糖苷的情况作为一例来进行说明，在作为对象的微生物表达α-葡萄糖苷酶的情况下，随着微生物的生长，培养基中包含的6-氯-3-吲哚氧基-α-D-葡萄糖苷被水解成葡萄糖和吲哚化合物(6-氯-3-吲哚)。所形成的吲哚化合物进一步发生二聚物化，显色为粉色。在其他显色剂的情况下也同样地发生水解和二聚物化，显色为上述括号内所示的颜色。
本方式的培养基包含在已知为金黄色葡萄球菌的菌体外酶的磷酸酶的存在下显色的显色剂。作为在磷酸酶的存在下显色的显色剂没有限定，例如可以举出5-溴-3-吲哚氧基磷酸酯(蓝色)、6-氯-3-吲哚氧基磷酸酯(粉色)、6-溴-3-吲哚氧基磷酸酯(红色)、5-溴-4-氯-3-吲哚氧基磷酸酯(淡蓝色)、5-溴-6-氯-3-吲哚氧基磷酸酯(紫红色)。上述显色剂均为在磷酸酶的存在下显色的酶底物。以上述显色剂为5-溴-3-吲哚氧基磷酸酯的情况作为一例来进行说明，在作为对象的微生物表达磷酸酶的情况下，随着微生物的生长，培养基中包含的5-溴-3-吲哚氧基磷酸酯被水解成磷酸和吲哚化合物(5-溴-3-吲哚)。所形成的吲哚化合物进一步发生二聚物化，显色为蓝色～深蓝色。在其他显色剂的情况下也同样地发生水解和二聚物化，显色为上述括号内所示的颜色。
本方式的培养基包含在α-葡萄糖苷酶的存在下显色的显色剂和在磷酸酶的存在下显色的显色剂。优选在α-葡萄糖苷酶的存在下显色的显色剂为6-氯-3-吲哚氧基-α-D-葡萄糖苷、在磷酸酶的存在下显色的显色剂为5-溴-3-吲哚氧基磷酸酯。或者，优选在α-葡萄糖苷酶的存在下显色的显色剂为5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-α-D-葡萄糖苷、在磷酸酶的存在下显色的显色剂为5-溴-6-氯-3-吲哚氧基磷酸酯。由于金黄色葡萄球菌具有α-葡萄糖苷酶产生能力和磷酸酶产生能力，因而例如在α-葡萄糖苷酶的存在下显色的显色剂为6-氯-3-吲哚氧基-α-D-葡萄糖苷、在磷酸酶的存在下显色的显色剂为5-溴-3-吲哚氧基磷酸酯的本方式的培养基中存在金黄色葡萄球菌的情况下，预想该菌株生长出的菌落显色为基于α-葡萄糖苷酶活性而产生的粉色和基于磷酸酶活性而产生的蓝色～深蓝色的混合色、例如紫色。但是，在包含上述显色剂的组合的本方式的培养基中存在金黄色葡萄球菌的情况下，令人惊奇地明确了，该菌株生长且菌落显色为蓝色～深蓝色。与之相对，在包含上述显色剂的组合的本方式的培养基中存在金黄色葡萄球菌以外的葡萄球菌中的具有α-葡萄糖苷酶产生能力和磷酸酶产生能力这两者的中间型葡萄球菌的情况下，该菌株生长且菌落显色为紫色。另外，在包含上述显色剂的组合的本方式的培养基中存在金黄色葡萄球菌以外的葡萄球菌中的中间型葡萄球菌以外的其他葡萄球菌、例如腐生葡萄球菌、肉葡萄球菌、木糖葡萄球菌或松鼠葡萄球菌的情况下，由于该菌株的生长受到高浓度的粘菌素甲磺酸钠的抑制，因而无法表现出α-葡萄糖苷酶产生能力和/或磷酸酶产生能力从而不发生显色。此外，在包含上述显色剂的组合的本方式的培养基中存在葡萄球菌以外的芽胞杆菌属菌的情况下，该菌株的生长受到抑制、或者根据情况生长且菌落显色为粉色。或者，在α-葡萄糖苷酶的存在下显色的显色剂为5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-α-D-葡萄糖苷、在磷酸酶的存在下显色的显色剂为5-溴-6-氯-3-吲哚氧基磷酸酯的本方式的培养基中存在金黄色葡萄球菌的情况下，明确了该菌株生长且菌落显色为紫红色。与之相对，在包含上述显色剂的组合的本方式的培养基中存在金黄色葡萄球菌以外的葡萄球菌中的具有α-葡萄糖苷酶产生能力和磷酸酶产生能力这两者的中间型葡萄球菌的情况下，该菌株生长且菌落显色为灰色。另外，在包含上述显色剂的组合的本方式的培养基中存在金黄色葡萄球菌以外的葡萄球菌中的中间型葡萄球菌以外的其他葡萄球菌、例如腐生葡萄球菌、木糖葡萄球菌或松鼠葡萄球菌的情况下，由于该菌株的生长受到高浓度的粘菌素甲磺酸钠的抑制，因而无法表现出α-葡萄糖苷酶产生能力和/或磷酸酶产生能力从而不发生显色。此外，在包含上述显色剂的组合的本方式的培养基中存在葡萄球菌以外的芽胞杆菌属菌的情况下，该菌株的生长受到抑制、或者根据情况生长且菌落显色为灰色或蓝色。因此，通过在两种显色剂的基础上还包含高浓度的粘菌素甲磺酸钠，本方式的培养基不会将金黄色葡萄球菌以外的葡萄球菌和其他微生物检测为假阳性，能够高精度地仅检测出金黄色葡萄球菌。
本方式的培养基可以根据期望包含1种以上的溶剂。作为1种以上的溶剂没有限定，例如可以举出水、低级醇(例如甲醇、乙醇或2-丙醇(异丙醇)之类的具有1～6的碳原子数的醇)、高级醇(例如1-庚醇或1-辛醇之类的具有7以上的碳原子数的醇)和二甲基亚砜(DMSO)。1种以上的溶剂优选为水。上述溶剂通过优选使用水，即使在本方式的培养基包含溶剂的情况下，也不会抑制作为检测对象的金黄色葡萄球菌的生长，能够高精度地进行该菌株的检测。
本方式的培养基以固体培养基和液体培养基中的任一种形态均可以使用。在本方式的培养基为液体培养基的实施方式的情况下，本方式的培养基可以以容纳在该技术领域中通常使用的烧瓶、培养皿、管或多孔板之类的培养容器中的状态作为液体培养用的培养基来使用。
在本方式的培养基为固体培养基的实施方式的情况下，本方式的培养基可以以任意的形状使用。在本实施方式的情况下，本方式的培养基例如可以以容纳在该技术领域中通常使用的培养皿或多孔板之类的培养容器中而成的平板固体培养基的状态、或者以在基材的上表面配置为特定形状的培养基材的状态来使用。在固体培养基的实施方式的情况下，本方式的培养基通常包含1种以上的凝胶化剂。1种以上的凝胶化剂可以从在该技术领域中作为使用于检测金黄色葡萄球菌的培养基固化的凝胶化剂通常使用的化合物中适当地选择。作为1种以上的凝胶化剂没有限定，例如可以举出卡拉胶、黄原胶、刺槐豆胶、车前子胶、瓜尔豆胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、藻酸和藻酸盐、琼脂以及明胶。1种以上的凝胶化剂优选为车前子胶和瓜尔豆胶的组合。1种以上的凝胶化剂的浓度可以由本领域技术人员基于本方式的培养基和/或包含作为对象的微生物的试样在使用时的状态、体积、和/或培养条件等从该技术领域中通常使用的范围中适当地设定。
通过具备上述特征，本方式的培养基不会将共存的葡萄球菌和其他微生物检测为假阳性，能够高精度地仅检测出金黄色葡萄球菌。
<2：用于检测金黄色葡萄球菌的微生物培养基材>
本发明的一个方式的培养基可以以任意形状的固体培养基的形式来使用。因此，本发明的另一方式涉及一种用于检测金黄色葡萄球菌的微生物培养基材，其具有基材以及配置在基材的上表面的包含本发明的培养基的培养层。
在本方式中，基材例如可以从片状、膜状、板状或容器状(例如圆形或方形的培养皿)等该技术领域中通常使用的各种形状中适当地选择。
在本方式中，培养层的形状没有特别限定。可以基于基材的形状等适当地选择。另外，在本方式中，培养层包含本发明的一个方式的培养基。在本方式的微生物培养基材中，培养层中包含的本发明的一个方式的培养基具有上述说明的特征。因此，本方式的微生物培养基材不会将共存的葡萄球菌和其他微生物检测为假阳性，能够高精度地仅检测出金黄色葡萄球菌。
本方式的微生物培养基材优选具有片形状的基材(以下也记载为“基材片”)。具有基材片的本方式的微生物培养基材(以下也记载为“用于检测金黄色葡萄球菌的微生物培养片”或简记为“微生物培养片”)可以具有基材片、配置在上述基材片的上表面的培养层、以及覆盖上述培养层的盖板。这种情况下，上述培养层例如包含本发明的一个方式的培养基、1种以上的固定剂、以及1种以上的凝胶化剂。
在该技术领域中，具有基材片以及配置在基材片的上表面的包含固体培养基的培养层的微生物培养片是公知的。这样的微生物培养片例如公开在国际公开第2011/007802号和日本特开2014-90701号公报等中。可以将上述文献所公开的在该技术领域中公知的任意的微生物培养片的形态应用于本方式的用于检测金黄色葡萄球菌的微生物培养基材中。
将本方式的用于检测金黄色葡萄球菌的微生物培养基材的一个实施方式示于图1中。图中，(a)为本方式的微生物培养基材的俯视图，(b)为沿(a)中的I-I’的垂直截面示意图，(c)是示出将盖板弯折来覆盖培养层的状态的垂直截面示意图。例如如图1所示，作为本方式的微生物培养基材的一个实施方式的具有片形状的基材的实施方式的微生物培养片具有基材片10、配置在上述基材片10的上表面的培养层30、以及覆盖上述培养层30的盖板40。基材片10既可以为单层片、也可以为具有由相同或不同的材料构成的2层以上的片层积而成的结构的多层片。另外，盖板40也既可以为单层片、也可以为具有由相同或不同材料构成的2层以上的片层积而成的结构的多层片。此外，培养层30也既可以为单层、也可以为具有将相同或不同组成的2层以上的层层积而成的结构的多层。在培养层30具有多层结构的情况下，至少1个层包含本方式的培养基即可。
在本实施方式的微生物培养片中，基材片和盖板的形状没有特别限定。例如，如图1所示，基材片10和盖板40的形状可以为四边形，也可以为三角形等其他多边形、正圆形或椭圆形等圆形、或者无定形。基材片10和盖板40的形状相互可以相同、也可以不同。另外，基材片10和盖板40的尺寸相互可以相同、也可以不同。优选基材片10和盖板40具有相互相同的形状和尺寸。这种情况下，盖板40可以覆盖配置有培养层30的基材片10的整个上表面从而对培养层30进行保护。
在本实施方式的微生物培养片中，培养层的形状没有特别限定。例如，如图1所示，培养层30的形状可以为正圆形或椭圆形等圆形，也可以为正方形或长方形之类的四边形或三角形等多边形、或者无定形。培养层30的尺寸可以在能够配置在基材片10的上表面的范围内适当地设定。优选的是，培养层30为圆形。这种情况下，通过将试样添加到培养层30的中心附近，能够使试样遍布整个培养层30而均匀地扩散。
在本实施方式的微生物培养片中，盖板优选被固定于基材片上。固定盖板的手段没有特别限定。例如，如图1和图2所示，盖板40可以通过压接等任意的手段直接固定于基材片10上。或者，如图3和图4所示，盖板40也可以藉由双面胶带或粘接剂之类的固定部件25而固定于基材片10上。
本方式的用于检测金黄色葡萄球菌的微生物培养基材可以根据期望具有按照包围培养层的外周的方式配置的框层。将本方式的用于检测金黄色葡萄球菌的微生物培养基材的另一实施方式示于图2中。图中，(a)为本方式的微生物培养基材的俯视图，(b)为沿(a)中的II-II’的垂直截面示意图，(c)是示出将盖板弯折来覆盖培养层的状态的垂直截面示意图。例如如图2所示，作为本方式的微生物培养基材的一个实施方式的具有片形状的基材的实施方式的微生物培养片具有基材片10、配置在上述基材片10的上表面的培养层30、按照包围上述培养层30的方式配置的框层20、以及覆盖上述培养层30的盖板40。在具有框层20的实施方式的情况下，在向培养层30中添加试样时，能够将试样的扩散限定在培养层30的范围中。框层20可以按照与培养层30的外周密合的方式配置，也可以按照与培养层30的外周分开的方式配置。优选的是，框层20按照与培养层30的外周密合的方式配置。在这样的实施方式的情况下，在向培养层30中添加试样时，能够将试样的扩散更确实地限定在培养层30的范围中。框层20的形状没有特别限定，本领域技术人员可以基于培养层30的形状适当地选择。例如，如图2所示，框层20的形状可以为正圆形或椭圆形等圆形，也可以为正方形或长方形之类的四边形或三角形等多边形、或者无定形。框层20优选为圆形，更优选为圆形且按照与培养层30的外周密合的方式配置。这种情况下，通过将试样添加到培养层30的中心附近，能够使试样遍布整个培养层30而均匀地扩散，并且能够将试样的扩散更确实地限定在培养层30的范围中。
在本方式的用于检测金黄色葡萄球菌的微生物培养基材中，培养层和框层(存在的情况下)在基材的上表面配置至少1个。即，培养层和框层(存在的情况下)可以在基材的上表面配置两个以上。在这样的实施方式的情况下，两个以上的培养层和框层(存在的情况下)可以配置在基材的上表面的任意位置。
本方式的用于检测金黄色葡萄球菌的微生物培养基材的尺寸可以由本领域技术人员考虑包含作为检测对象的微生物的试样的体积等而适当地设定。例如，在具有片形状的基材的微生物培养片的实施方式中，在基材片10的形状为四边形的情况下，基材片10一边的长度通常为50～100mm的范围、典型地为70～90mm的范围。厚度通常为25～1500μm的范围、典型地为50～500μm的范围。盖板40的形状和尺寸优选与基材片10相同。盖板40的厚度优选为10～200μm的范围、更优选为20～70μm的范围。这种情况下，在培养层30的形状为圆形的情况下，培养层30的直径优选为20～80mm的范围、更优选为30～70mm的范围。在培养层30为圆形以外的形状的情况下，与由培养层30的外周界定的图形内切的最大圆的直径优选为上述范围。另外，培养层30的厚度优选为150～250μm的范围、更优选为190～210μm的范围。培养层30的厚度以本实施方式的微生物培养片中从干燥状态的培养层30的下表面、即与基材片10相接的面到培养层30的上表面的距离的平均值来定义。培养层30的厚度例如可以如下确定：在多个部位测定从基材片10的下表面到上表面的距离、以及从基材片10的下表面到干燥状态的培养层30的上表面的距离，计算出两距离之差的平均值，由此确定培养层30的厚度。在培养层30的尺寸为上述范围的情况下，能够确实地吸收并保持规定量的试样。
在本方式的用于检测金黄色葡萄球菌的微生物培养基材具有框层的情况下，框层的尺寸可以由本领域技术人员基于培养层的尺寸适当地设定。例如，在具有片形状的基材的微生物培养片的实施方式中，框层20的高度比培养层30的厚度优选高100～1200μm、更优选高200～1000μm、进一步优选高300～800μm。框层20的宽度优选为0.5～5.0mm的范围、更优选为1.0～3.0mm的范围。框层20的高度以本实施方式的微生物培养片中从框层20的下表面、即与基材片10相接的面到框层20的上表面的距离的平均值来定义。框层20的高度例如可以如下确定：在多个部位测定从基材片10的下表面到上表面的距离、以及从基材片10的下表面到框层20的上表面的距离，计算出两距离之差的平均值，由此确定框层20的高度。另外，框层20的宽度以框层20的侧面间的距离的平均值来定义。在框层20的尺寸为上述范围的情况下，在向培养层30中添加试样时能够防止试样流出。另外，在用盖板40覆盖培养层30时，能够实质上防止在盖板40和培养层30之间产生空隙。由此，能够使试样在培养层30中确实地扩散。
在本方式的微生物培养基材中，基材优选包含选自由聚酯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯和聚氯乙烯组成的组中的至少一种塑料作为主要成分。包含上述塑料作为主要成分的基材具有耐水性和耐溶剂性，因而能够在该基材的上表面配置包含水和/或溶剂的培养层。另外，包含上述塑料作为主要成分的基材具有耐热性和印刷适性，因而能够使用印刷、涂布或喷雾等手段在该基材的上表面形成培养层。此外，包含上述塑料作为主要成分的基材透明性优异，因而能够利用基材的透过光对在培养层中生长的微生物的菌落进行观察。或者，基材也可以以通过在上述塑料中添加着色剂或发泡剂等手段而被着色的状态来使用。通过使用被着色的基材，能够更明确地评价在培养层中生长的微生物的菌落的颜色。
在具有片形状的基材的微生物培养片的实施方式中，在基材片具有多层结构的情况下，该基材片可以具有将包含上述塑料作为主要成分的相同的片层积而成的结构，也可以具有将不同的片层积而成的结构。或者，具有多层结构的基材片也可以具有将包含纸和/或合成树脂作为主要成分的片与包含上述塑料作为主要成分的相同或不同的片层积而成的结构。作为具有包含纸和合成树脂作为主要成分的片的多层结构的基材片，例如可以举出Yupo(商标)(Yupo Corporation制)以及Crisper(商标)(东洋纺制)。
在本实施方式的微生物培养片中，盖板是为了防止培养层的污染和/或防止培养层的水分蒸发而使用的。盖板优选包含选自由聚酯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯和聚氯乙烯组成的组中的至少一种塑料作为主要成分。包含上述塑料作为主要成分的盖板透明性优异，因而能够利用盖板的透过光对在培养层中生长的微生物的菌落进行观察。另外，例如如图5和图6所示，盖板40可以具有一定尺寸的方格图案作为观察的指标。在本实施方式的情况下，方格图案可以通过使用水不溶性且对微生物的生长不会带来实质性影响的油墨在盖板的表面进行印刷而形成。
在本方式的微生物培养基材中，培养层可以包含1种以上的固定剂。在本发明中，“固定剂”是指用于调整培养层中包含的培养基的粘度且使培养层与基材片的表面密合的化合物。在具有片形状的基材的微生物培养片的实施方式中，1种以上的固定剂优选为聚乙烯吡咯烷酮。通过使用聚乙烯吡咯烷酮作为1种以上的固定剂，能够使培养层中包含的培养基成分均匀地分散。另外，通过增大本发明的一个方式的培养基的粘度，能够在本实施方式的微生物培养片的制造时在基材片的上表面的期望位置形成期望尺寸的培养层。另外，由于聚乙烯吡咯烷酮与包含上述塑料作为主要成分的基材片的密合性高，因而能够在不使用粘接剂等的情况下使培养层与基材片的表面密合。作为1种以上的固定剂使用的聚乙烯吡咯烷酮的浓度优选为15～20％的范围。上述浓度以相对于本实施方式的微生物培养片中的培养层的干燥状态的总质量的最终浓度(质量百分数)来定义。通过包含聚乙烯吡咯烷酮作为1种以上的固定剂，能够形成具有期望特性的培养层。
在本方式的微生物培养基材中，培养层可以包含1种以上的凝胶化剂。作为1种以上的凝胶化剂，可以使用作为本发明的一个方式的培养基的成分在上述所例示的凝胶化剂。在具有片形状的基材的微生物培养片的实施方式中，1种以上的凝胶化剂优选为车前子胶和瓜尔豆胶的组合。1种以上的凝胶化剂的浓度优选为50～60％的范围。上述浓度以相对于本实施方式的微生物培养片中的培养层的干燥状态的总质量的最终浓度(质量百分数)来定义。通过包含1种以上的凝胶化剂，能够形成具有期望特性的培养层。
在本方式的微生物培养基材中，培养层根据期望包含1种以上的增塑剂。作为1种以上的增塑剂，可以举出甘油、甘油衍生物系增塑剂以及聚乙二醇。在具有片形状的基材的微生物培养片的实施方式中，1种以上的增塑剂优选为甘油。1种以上的增塑剂的浓度优选为5～10％的范围。上述浓度以相对于本实施方式的微生物培养片中的培养层的干燥状态的总质量的最终浓度(质量百分数)来定义。通过包含1种以上的增塑剂，能够提高培养层的可塑性、柔软性和弹性等。
在本方式中，具有片形状的基材的微生物培养片例如可以基于公开在国际公开第2011/007802号和日本特开2014-90701号公报等中的该技术领域中公知的任意的微生物培养片的制造方法进行制造。本实施方式的微生物培养片例如可以通过包括准备基材片的步骤、在基材片的上表面进行培养层的图案形成的步骤、将基材片与盖板固定的步骤的方法进行制造。另外，在本实施方式的微生物培养片具有框层的实施方式的情况下，上述制造方法优选进一步包括在基材片的上表面形成框层的步骤。
在本实施方式的微生物培养片的制造方法中，在基材片的上表面进行培养层的图案形成的步骤进一步包括下述步骤：制备将培养层中包含的各成分悬浮在1种以上的溶剂中而成的培养液的步骤；将培养液应用至基材片的上表面的步骤；使所应用的培养液干燥，形成规定形状的培养层的步骤。在培养液的制备中，例如为了粘度调整而使用的1种以上的溶剂可以从作为本发明的一个方式的培养基的成分在上述所例示的溶剂中适当地选择。在培养液的制备中使用的1种以上的溶剂优选低级醇，更优选甲醇、乙醇或2-丙醇(异丙醇)，进一步优选甲醇。在制备步骤的时刻培养液通常包含培养层中所含有的全部成分。但是，在制备步骤的时刻培养液也可以不包含培养层中所含有的一部分成分。这种情况下，余下的成分在将培养液应用于基材片的上表面的步骤的同时、或在该步骤后的任意时刻添加到所涂布的培养液或所形成的培养层中即可。
将培养液应用至基材片的上表面的步骤例如可以通过印刷、涂布或喷雾等手段来实施。之后，在使所应用的培养液干燥的步骤中，可以将培养液中含有的溶剂蒸发除去，形成规定形状的培养层。培养层中包含的聚乙烯吡咯烷酮与包含上述塑料作为主要成分的基材片的密合性高。因此，通过实施将培养液应用至基材片的上表面的步骤以及之后的干燥步骤，能够在不使用粘接剂等的情况下将培养层与基材片的表面密合。
本实施方式的微生物培养片的制造方法可以进一步包括对所得到的微生物培养片进行灭菌的步骤。作为对微生物培养片进行灭菌的手段，例如可以举出γ射线等放射线照射灭菌、或者使用环氧乙烷气体等的化学灭菌。
通过实施包括上述步骤的方法，能够制造出具有片形状的基材的微生物培养片。
<3：对金黄色葡萄球菌进行检测的方法>
本发明的一个方式的培养基和微生物培养基材能够用于从存在有包括金黄色葡萄球菌以外的葡萄球菌在内的多种微生物的试样中高精度地仅检测出金黄色葡萄球菌。因此，本发明的另一方式涉及使用本发明的一个方式的培养基和微生物培养基材对金黄色葡萄球菌进行检测的方法。本方式的对金黄色葡萄球菌进行检测的方法包括试样添加步骤、菌落形成步骤和菌株鉴定步骤。
[3-1：试样添加步骤]
本步骤为在本发明的一个方式的培养基和微生物培养基材的培养层中添加包含微生物的试样的步骤。
本步骤中使用的试样通常包含金黄色葡萄球菌，并且根据情况包含金黄色葡萄球菌以外的其他微生物。如已经说明的那样，本发明的一个方式的培养基和微生物培养基材能够从存在有金黄色葡萄球菌以外的葡萄球菌这样的其他微生物的试样中高精度地仅检测出金黄色葡萄球菌。因此，对试样中包含的其他微生物没有特别限定。作为试样中包含的其他微生物没有限定，例如，除了金黄色葡萄球菌以外的葡萄球菌以外，还可以举出大肠杆菌、肠球菌和芽胞杆菌属菌这样的非葡萄球菌。利用本方式的方法，能够从包含上述所例示的多种微生物的试样中高精度地仅检测出金黄色葡萄球菌。
包含微生物的试样可以由可能存在金黄色葡萄球菌的制品(例如食品、饮料品、药品或动物饲料等)、器具、装置和场所等任意的对象进行制备。
在本步骤中，包含微生物的试样通常以液体的形态使用。这种情况下，试样的溶剂通常为灭菌水。溶剂可以根据期望包含无机盐、缓冲成分和培养基成分等。
在本步骤中，在本发明的一个方式的培养基和微生物培养基材的培养层中所添加的试样的体积可以由本领域技术人员基于所使用的本发明的一个方式的培养基和微生物培养基材的培养层的尺寸等适当地设定。例如，在图1所示的具有片形状的基材的本发明的一个方式的微生物培养基材、即微生物培养片的实施方式的情况下，优选添加约1ml的试样。通过以上述体积添加试样，能够在培养层中确实地吸收并保持所添加的试样。
在本步骤中，在使用本发明的一个方式的微生物培养基材、例如微生物培养片的情况下，微生物培养基材的培养层优选包含相对于包含微生物的试样的总体积为0.2mg/ml以上的粘菌素甲磺酸钠。这种情况下，微生物培养基材的培养层中包含的粘菌素甲磺酸钠的浓度优选为0.2～1.6mg/ml的范围、更优选为0.2～1.1mg/ml的范围、进一步优选为0.9～1.1mg/ml的范围、特别优选为约1mg/ml。通过使用以上述的高浓度包含粘菌素甲磺酸钠的微生物培养基材，能够实质上防止金黄色葡萄球菌以外的葡萄球菌被检测为假阳性。
在本方式的方法中，基于在本发明的一个方式的培养基和微生物培养基材的培养层中形成的菌落的颜色来进行金黄色葡萄球菌的鉴定。因此，在试样中包含的微生物的菌密度高的情况下，可能难以将所形成的菌落以多个单一菌落的形式进行分离、识别。因此，包含微生物的试样优选预先用溶剂稀释以达到适当的菌密度。试样中包含的微生物的菌密度可以由本领域技术人员基于所添加的试样的体积以及所使用的本发明的一个方式的培养基和微生物培养基材的培养层的尺寸等适当地设定。例如，在图1所示的具有片形状的基材的本发明的一个方式的微生物培养基材、即微生物培养片的实施方式的情况下，试样中包含的微生物的菌密度优选为1～500cfu/ml的范围。在试样中包含的微生物的菌密度为上述范围的情况下，通过在培养层中添加约1ml的试样，能够将试样中包含的全部微生物在培养层中以单一菌落的形式进行分离、识别。
[3-2：菌落形成步骤]
本步骤为对添加有试样的培养基或微生物培养基材进行温育从而形成微生物的菌落的步骤。
在本步骤中，对添加有试样的培养基或微生物培养基材进行温育的条件可以由本领域技术人员基于该技术领域中通常使用的金黄色葡萄球菌等微生物的培养条件适当地设定。
[3-3：菌株鉴定步骤]
本步骤为基于所形成的微生物的菌落的颜色进行金黄色葡萄球菌的鉴定的步骤。
如已经说明的那样，例如在α-葡萄糖苷酶的存在下显色的显色剂为6-氯-3-吲哚氧基-α-D-葡萄糖苷、在磷酸酶的存在下显色的显色剂为5-溴-3-吲哚氧基磷酸酯的、本发明的一个方式的培养基或微生物培养基材的培养层中存在金黄色葡萄球菌的情况下，该菌株生长出的菌落显色为蓝色～深蓝色。与之相对，在包含上述显色剂的组合的本发明的一个方式的培养基或微生物培养基材的培养层中存在金黄色葡萄球菌以外的葡萄球菌中的具有α-葡萄糖苷酶产生能力和磷酸酶产生能力这两者的中间型葡萄球菌的情况下，该菌株生长出的菌落显色为紫色。另外，在包含上述显色剂的组合的本发明的一个方式的培养基或微生物培养基材的培养层中存在金黄色葡萄球菌以外的葡萄球菌中的中间型葡萄球菌以外的其他葡萄球菌、例如腐生葡萄球菌、肉葡萄球菌、木糖葡萄球菌或松鼠葡萄球菌的情况下，由于该菌株的生长受到高浓度的粘菌素甲磺酸钠的抑制，因而无法表现出α-葡萄糖苷酶产生能力和/或磷酸酶产生能力从而不发生显色。此外，在包含上述显色剂的组合的本发明的一个方式的培养基或微生物培养基材的培养层中存在葡萄球菌以外的芽胞杆菌属菌的情况下，该菌株的生长受到抑制、或者根据情况生长且菌落显色为粉色。或者，在α-葡萄糖苷酶的存在下显色的显色剂为5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-α-D-葡萄糖苷、在磷酸酶的存在下显色的显色剂为5-溴-6-氯-3-吲哚氧基磷酸酯的、本方式的培养基或微生物培养基材的培养层中存在金黄色葡萄球菌的情况下，该菌株生长出的菌落显色为紫红色。与之相对，在包含上述显色剂的组合的本方式的培养基或微生物培养基材的培养层中存在金黄色葡萄球菌以外的葡萄球菌中的具有α-葡萄糖苷酶产生能力和磷酸酶产生能力这两者的中间型葡萄球菌的情况下，该菌株生长且菌落显色为灰色。另外，在包含上述显色剂的组合的本方式的培养基或微生物培养基材的培养层中存在金黄色葡萄球菌以外的葡萄球菌中的中间型葡萄球菌以外的其他葡萄球菌、例如腐生葡萄球菌、木糖葡萄球菌或松鼠葡萄球菌的情况下，由于该菌株的生长受到高浓度的粘菌素甲磺酸钠的抑制，因而无法表现出α-葡萄糖苷酶产生能力和/或磷酸酶产生能力从而不发生显色。此外，在包含上述显色剂的组合的本方式的培养基或微生物培养基材的培养层中存在葡萄球菌以外的芽胞杆菌属菌的情况下，该菌株的生长受到抑制、或者根据情况生长且菌落显色为灰色或蓝色。因此，可以基于所形成的微生物的菌落的颜色高精度地鉴定出金黄色葡萄球菌。
如上文所详细说明的那样，本发明的一个方式的培养基和微生物培养基材不会将金黄色葡萄球菌以外的葡萄球菌检测为假阳性，能够仅检测出金黄色葡萄球菌。因此，通过使用本发明的一个方式的培养基和微生物培养基材，能够高精度且迅速地检测出在各种对象中存在的金黄色葡萄球菌。
实施例
以下使用实施例进一步具体地说明本发明。但是，本发明的技术范围并不受这些实施例的限定。
<I：微生物培养片的制作>
作为基材片10，准备以合成树脂作为主原料的合成纸(Yupo Corporation制造，Yupo)。基材片10的形状为长方形。基材片10的厚度为270μm，基材片10的长边长度为90mm，基材片10的短边长度为72mm。
在基材片10的上表面设置由乙烯乙酸乙烯酯系热熔性树脂构成的圆形的框层20。框层20的宽度(框层20的外缘与内缘之间的间隔)为1mm，框层20的内径(由内缘形成的圆的直径)为50mm，框层20的高度为750μm。
在基材片10的上表面的被框层20围起的区域内涂布用于形成培养层30的培养液。培养液包含固体成分以及用于粘度调整的溶剂(甲醇)，上述固体成分包含营养成分、显色剂、选择剂、固定剂、凝胶化剂和增塑剂。作为营养成分，使用胰蛋白胨、大豆胨、酵母提取物、丙酮酸钠、D(-)-甘露醇、磷酸氢二钾和甘氨酸。将培养液中包含的固体成分示于表1中。
[表1]
成分名 实验1 实验2 实验3
营养成分 56 56 56
氯化锂 16.8 16.8 16.8
叠氮化钠 0.05 0.05 0.05
萘啶酸 0.019 0.019 0.019
6-氯-3-吲哚氧基-α-D-葡萄糖苷 0.83 - 0.83
5-溴-3-吲哚氧基磷酸酯 - 0.83 0.83
聚乙烯吡咯烷酮 59 59 59
车前子胶 72 72 72
瓜尔豆胶 107 107 107
甘油 23.5 23.5 23.5
使涂布至基材片10上的培养液干燥，蒸发除去甲醇，在基材片10的上表面形成培养层30。培养层30的厚度为200μm。需要说明的是，培养层30的厚度如下确定：在5个部位测定从基材片10的下表面到上表面的距离、以及从基材片10的下表面到干燥状态的培养层30的上表面的距离，计算出两距离之差的平均值，由此确定培养层30的厚度。
在基材片10的上表面沿着基材片10的一个短边粘贴长6mm、宽72mm的双面胶带作为固定部件25。接着，作为盖膜40，准备具有基材层、印刷层和防水层的盖膜40。基材层由厚度为40μm的透明的取向聚丙烯形成。在印刷层上配置10mm间隔的方格线。防水层由以聚酰胺为主要成分的树脂形成。盖膜40的长边长度为95mm、短边长度为72mm。接着，藉由固定部件25将盖膜40的一个短边附近的部分与基材片10接合。如此制作出微生物培养片。
<II：微生物的检测>
[实验1：使用包含在α-葡萄糖苷酶的存在下显色的显色剂的培养基的微生物的检测试验]
将规定的试验用微生物菌株接种在液体培养基(SCD肉汤培养基)中，在35℃培养24小时，制备试验用微生物悬浮液。将该试验用微生物悬浮液用磷酸缓冲生理盐水稀释使其达到约1～500cfu/ml的菌密度。使用微量移液管将所得到的试验用微生物试样在使用包含表1记载的成分的培养液制作的微生物培养片的培养层中接种1ml。将接种了试样的微生物培养片在培养箱中静置，在35℃培养24或48小时。培养结束后，将微生物培养片从培养箱中取出。通过目视确认在各微生物培养片的培养层中形成的菌落的颜色和着色强度。对于试验用微生物菌株分别实施上述实验。将实验中使用的试验用微生物菌株名称以及各菌株菌落的形成状态和颜色示于表2中。
[表2]
如表1所示，使用包含实验1的成分的培养液制作出的微生物培养片在培养层的培养基中仅包含在α-葡萄糖苷酶的存在下显色的6-氯-3-吲哚氧基-α-D-葡萄糖苷作为显色剂，并且不包含作为选择剂的粘菌素甲磺酸钠。例如在日本特表2004-524041号公报(专利文献2)中记载了，通过使用包含在α-葡萄糖苷酶的存在下显色的酶底物作为显色剂的培养基，能够与其他葡萄球菌相区别地检测出金黄色葡萄球菌。
如表2所示，在使用实验1的微生物培养片的情况下，金黄色葡萄球菌以外的几种葡萄球菌的菌落显色为粉色。另外，2种芽胞杆菌属菌的菌落也显色为粉色。由以上的结果可知，在具有仅包含6-氯-3-吲哚氧基-α-D-葡萄糖苷作为显色剂、且不包含作为选择剂的粘菌素甲磺酸钠的培养层的微生物培养片中，可能将金黄色葡萄球菌以外的葡萄球菌和芽胞杆菌属菌检测为假阳性。
[实验2：使用包含在磷酸酶的存在下显色的显色剂的培养基的微生物的检测试验]
按照与实验1同样的过程制备试验用微生物试样。使用微量移液管将试验用微生物试样在使用包含表1记载的成分的培养液制作出的微生物培养片的培养层中接种1ml。通过与实验1同样的过程对接种了试样的微生物培养片进行温育，通过目视确认在各微生物培养片的培养层中形成的菌落的颜色和着色强度。对试验用微生物菌株分别实施上述实验。将实验中使用的试验用微生物菌株的名称以及各菌株菌落的形成状态和颜色示于表3中。
[表3]
如表1所示，使用包含实验2的成分的培养液制作出的微生物培养片在培养层的培养基中仅包含在磷酸酶的存在下显色的5-溴-3-吲哚氧基磷酸酯作为显色剂，并且不包含作为选择剂的粘菌素甲磺酸钠。
如表3所示，在使用实验2的微生物培养片的情况下，金黄色葡萄球菌以外的几种葡萄球菌的菌落显色为深蓝色～淡蓝色。另外，2种芽胞杆菌属菌的菌落也显色为深蓝色。由以上的结果可知，在具有仅包含5-溴-3-吲哚氧基磷酸酯作为显色剂、并且不包含作为选择剂的粘菌素甲磺酸钠的培养层的微生物培养片中，可能将金黄色葡萄球菌以外的葡萄球菌和芽胞杆菌属菌检测为假阳性。
[实验3：使用包含两种显色剂的培养基的微生物的检测试验]
通过与实验1同样的过程制备试验用微生物试样。使用微量移液管将试验用微生物试样在使用包含表1记载的成分的培养液制作的微生物培养片的培养层中接种1ml接种。通过与实验1同样的过程对接种了试样的微生物培养片进行温育，通过目视确认在各微生物培养片的培养层中形成的菌落的颜色和着色强度。对于试验用微生物菌株分别实施上述实验。将实验中使用的试验用微生物菌株的名称以及各菌株菌落的形成状态和颜色示于表4中。
[表4]
如表1所示，使用包含实验3的成分的培养液制作出的微生物培养片在培养层的培养基中包含在α-葡萄糖苷酶的存在下显色的6-氯-3-吲哚氧基-α-D-葡萄糖苷和在磷酸酶的存在下显色的5-溴-3-吲哚氧基磷酸酯作为显色剂，并且不包含作为选择剂的粘菌素甲磺酸钠。
在实验3的微生物培养片的培养层的培养基中存在金黄色葡萄球菌的情况下，预想该菌株生长出的菌落显色为基于α-葡萄糖苷酶活性而产生的粉色与基于磷酸酶活性而产生的蓝色～深蓝色的混合色、例如紫色。但是，如表4所示，在使用实验3的微生物培养片的情况下，令人惊奇的是，金黄色葡萄球菌的菌落显色为深蓝色。与之相对，中间型葡萄球菌和松鼠葡萄球菌以外的其他葡萄球菌未形成菌落、或者菌落未显色、或者菌落显色为粉色。中间型葡萄球菌的菌落显色为紫色。推测该显色模式是由于中间型葡萄球菌表达了α-葡萄糖苷酶和磷酸酶这两者所致的。因此，将形成了深蓝色的菌落的试样判定为阳性，将未形成菌落、或者菌落未显色、或者菌落显色为粉色的试样判定为阴性，由此能够特异性地检测出金黄色葡萄球菌。但是，由于松鼠葡萄球菌的菌落显色为淡蓝色，因而可知该菌株可能被检测为假阳性。
[实验4：使用包含粘菌素甲磺酸钠的培养基的微生物的检测试验]
通过与实验1同样的过程制备试验用微生物试样。另外，通过与实验1同样的过程制作微生物培养片。微生物培养片的制作中使用的培养液包含与表1记载的实验3的情况同样的固体成分、达到表5记载的最终质量浓度的规定量的粘菌素甲磺酸钠、以及用于粘度调整的溶剂(甲醇)。使用微量移液管将试验用微生物试样在微生物培养片的培养层中接种1ml。通过与实验1同样的过程对添加有试样的微生物培养片进行温育，培养24小时后通过目视确认在各微生物培养片的培养层中形成的菌落的颜色和着色强度。对于试验用微生物菌株分别实施上述实验。将实验中使用的试验用微生物菌株的名称以及各菌株菌落的形成状态示于表5中。表中，空栏表示以通常的生长状态形成了菌落，“抑制”表示生长被抑制的状态。粘菌素甲磺酸钠的浓度中，上段浓度为相对于接种试样前的干燥状态的培养层的总体积的质量浓度(mg/cm3)，下段浓度为相对于使用时接种到培养层中的试样的溶液的总体积的质量浓度(mg/ml)。
如表1和表5所示，使用包含实验4的成分的培养液制作出的微生物培养片在培养层的培养基中包含在α-葡萄糖苷酶的存在下显色的6-氯-3-吲哚氧基-α-D-葡萄糖苷和在磷酸酶的存在下显色的5-溴-3-吲哚氧基磷酸酯作为显色剂，并且以表5记载的浓度包含粘菌素甲磺酸钠作为选择剂。
如表5所示，粘菌素甲磺酸钠对于金黄色葡萄球菌ATCC25923株和NBRC100910株在所试验的0.3～4.1mg/cm3(即0.1～1.6mg/ml试样溶液)的范围的浓度下未显示出生长抑制。仅金黄色葡萄球菌NBRC12732株在包含3.1mg/cm3(即1.2mg/ml试样溶液)的粘菌素甲磺酸钠的微生物培养片中显示出了生长抑制。与之相对，腐生葡萄球菌(腐生葡萄球菌腐生亚种)尽管为革兰氏阳性菌，但在包含0.5mg/cm3(即0.2mg/ml试样溶液)以上的粘菌素甲磺酸钠的微生物培养片中显示出了生长抑制。同样地，木糖葡萄球菌和松鼠葡萄球菌在包含2.3mg/cm3(即0.9mg/ml试样溶液)以上的粘菌素甲磺酸钠的微生物培养片中显示出了生长抑制。另外，肉葡萄球菌在包含1.3mg/cm3(即0.5mg/ml试样溶液)以上的粘菌素甲磺酸钠的微生物培养片中显示出了生长抑制。由以上的结果可知，高浓度的粘菌素甲磺酸钠能够作为对特定种类的葡萄球菌显示出抑制效果的选择剂使用。
[实验5：使用包含两种显色剂和高浓度的粘菌素甲磺酸钠的培养基的微生物的检测试验(1)]
通过与实验1同样的过程制备试验用微生物试样。另外，通过与实验1同样的过程制作微生物培养片。微生物培养片的制作中使用的培养液包含与表1记载的实验3的情况同样的固体成分、达到2.5mg/cm3(即1mg/ml试样溶液)的最终质量浓度的规定量的粘菌素甲磺酸钠、以及用于粘度调整的溶剂(甲醇)。使用微量移液管将试验用微生物试样在微生物培养片的培养层中接种1ml。通过与实验1同样的过程对添加有试样的微生物培养片进行温育，通过目视确认在各微生物培养片的培养层中形成的菌落的颜色和着色强度。对于试验用微生物菌株分别实施上述实验。将实验中使用的试验用微生物菌株的名称以及各菌株菌落的形成状态和颜色示于表6中。另外，将显色后的各菌株菌落的形成状态和颜色示于图7和图8中。图中，图7(a)表示金黄色葡萄球菌ATCC25923菌株、图7(b)表示金黄色葡萄球菌NBRC100910菌株、图7(c)表示金黄色葡萄球菌NBRC12732菌株、图7(d)表示中间型葡萄球菌、图7(e)表示猪葡萄球菌(Staphylococcus hyicus)、图7(f)表示表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)。图8(a)表示腐生葡萄球菌、图8(b)表示木糖葡萄球菌、图8(c)表示松鼠葡萄球菌、图8(d)表示腊样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、图8(e)表示地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)、图8(f)表示枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)。
[表6]
如表6所示，在使用实验5的微生物培养片的情况下，金黄色葡萄球菌的菌落与实验3的情况同样地显色为深蓝色(图7(a)～图7(c))。与之相对，中间型葡萄球菌以外的其他葡萄球菌未形成菌落。特别是在实验1～3中确认到菌落形成的松鼠葡萄球菌在包含2.5mg/cm3(即1mg/ml试样溶液)的粘菌素甲磺酸钠的微生物培养片中的生长受到抑制，未形成菌落。中间型葡萄球菌的菌落显色为紫色(图7(d))。2种芽胞杆菌属菌的菌落显色为粉色(图8(d)和图8(e))。因此可知，通过将形成了深蓝色的菌落的试样判定为阳性、将未形成菌落或者菌落显色为紫色或粉色的试样判定为阴性，即使在试样中存在其他葡萄球菌和芽胞杆菌属菌的情况下，也不会检测到假阳性，能够特异性地检测出金黄色葡萄球菌。
[实验6：使用包含两种显色剂和高浓度的粘菌素甲磺酸钠的培养基的微生物的检测试验(2)]
通过与实验1同样的过程制备试验用微生物试样。另外，通过与实验1同样的过程制作微生物培养片。微生物培养片的制作中使用的培养液包含在表1记载的实验3的情况下的固体成分中将在α-葡萄糖苷酶的存在下显色的显色剂变更为5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-α-D-葡萄糖苷、将在磷酸酶的存在下显色的显色剂变更为5-溴-6-氯-3-吲哚氧基磷酸酯的固体成分。培养液进一步包含达到2.5mg/cm3(即1mg/ml试样溶液)的最终质量浓度的规定量的粘菌素甲磺酸钠、以及用于粘度调整的溶剂(甲醇)。使用微量移液管将试验用微生物试样在微生物培养片的培养层中接种1ml。通过与实验1同样的过程对添加有试样的微生物培养片进行温育，通过目视确认在各微生物培养片的培养层中形成的菌落的颜色和着色强度。对于试验用微生物菌株分别实施上述实验。将实验中使用的试验用微生物菌株的名称以及各菌株菌落的形成状态和颜色示于表7中。另外，将显色后的各菌株菌落的形成状态和颜色示于图9～图11中。图中，图9(a)表示金黄色葡萄球菌ATCC25923菌株、图9(b)表示金黄色葡萄球菌NBRC100910菌株、图9(c)表示金黄色葡萄球菌NBRC12732菌株、图9(d)表示中间型葡萄球菌、图9(e)表示猪葡萄球菌、图9(f)表示表皮葡萄球菌。图10(a)表示腐生葡萄球菌腐生亚种、图10(b)表示木糖葡萄球菌、图10(c)表示松鼠葡萄球菌、图10(d)表示模仿葡萄球菌(Staphylococcus simulans)、图10(e)表示溶血葡萄球菌(Staphylococcushaemolyticus)、图10(f)表示沃氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)。图11(a)表示人葡萄球菌(Staphylococcus hominis)、图11(b)表示科氏葡萄球菌(Staphylococcuscohnii)、图11(c)表示头状葡萄球菌(Staphylococcus capitis)、图11(d)表示腊样芽胞杆菌、图11(e)表示地衣芽胞杆菌、图11(f)表示枯草芽胞杆菌。
[表7]
如表7所示，在使用实验6的微生物培养片的情况下，金黄色葡萄球菌的菌落显色为紫红色(品红色)(图9(a)～(c))。与之相对，中间型葡萄球菌以外的其他葡萄球菌未形成菌落。特别是在实验1～3中确认到菌落形成的松鼠葡萄球菌在包含2.5mg/cm3(即1mg/ml试样溶液)的粘菌素甲磺酸钠的微生物培养片中的生长受到抑制，未形成菌落。中间型葡萄球菌的菌落显色为灰色(图9(d))。2种芽胞杆菌属菌的菌落显色为蓝色或灰色(图11(d)和图11(e))。因此可知，通过将形成了紫红色的菌落的试样判定为阳性、将未形成菌落或者菌落显色为灰色或蓝色的试样判定为阴性，即使在试样中存在其他葡萄球菌和芽胞杆菌属菌的情况下，也不会检测到假阳性，能够特异性地检测出金黄色葡萄球菌。
本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请第2016-016378号和2016-113278号的说明书和/或附图中记载的内容。
本说明书中引用的全部的出版物、专利和专利申请直接以参考的形式并入到本说明书中。
符号说明
10…基材片
20…框层
25…固定部件
30…培养层
40…盖板

Claims (10)

1.一种用于检测金黄色葡萄球菌的培养基，其包含1种以上的营养成分、在α-葡萄糖苷酶的存在下显色的显色剂、在磷酸酶的存在下显色的显色剂、以及0.5mg/cm3以上的粘菌素甲磺酸钠。
2.如权利要求1所述的培养基，其中，在α-葡萄糖苷酶的存在下显色的显色剂为6-氯-3-吲哚氧基-α-D-葡萄糖苷，在磷酸酶的存在下显色的显色剂为5-溴-3-吲哚氧基磷酸酯。
3.如权利要求1所述的培养基，其中，在α-葡萄糖苷酶的存在下显色的显色剂为5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-α-D-葡萄糖苷，在磷酸酶的存在下显色的显色剂为5-溴-6-氯-3-吲哚氧基磷酸酯。
4.如权利要求1～3中任一项所述的培养基，其中，包含0.5mg/cm3～4.1mg/cm3的范围的粘菌素甲磺酸钠。
5.如权利要求4所述的培养基，其中，包含0.5mg/cm3～2.8mg/cm3的范围的粘菌素甲磺酸钠。
6.如权利要求5所述的培养基，其中，包含2.3mg/cm3～2.8mg/cm3的范围的粘菌素甲磺酸钠。
7.一种微生物培养基材，其为具有基材以及配置在所述基材的上表面的培养层的、用于检测金黄色葡萄球菌的微生物培养基材，
所述培养层包含权利要求1～6中任一项所述的培养基。
8.如权利要求7所述的微生物培养基材，其中，进一步具有片形状的基材以及覆盖所述培养层的盖板，所述培养层进一步包含聚乙烯吡咯烷酮以及1种以上的凝胶化剂。
9.一种对金黄色葡萄球菌进行检测的方法，其包括下述步骤：
试样添加步骤，向权利要求1～6中任一项所述的培养基或者权利要求7或8所述的微生物培养基材的培养层中添加包含微生物的试样；
菌落形成步骤，对添加有试样的培养基或微生物培养基材进行温育，形成微生物的菌落；以及
菌株鉴定步骤，基于所形成的微生物的菌落的颜色进行金黄色葡萄球菌的鉴定。
10.如权利要求9所述的方法，其中，在试样添加步骤中，向权利要求7或8所述的微生物培养基材的培养层中添加包含微生物的试样，该微生物培养基材的培养层包含相对于包含微生物的试样的总体积为0.2mg/ml以上的粘菌素甲磺酸钠。
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