JP2017136061A - 黄色ブドウ球菌を検出するための培地及び該培地を有する黄色ブドウ球菌検出シート、並びにそれらを用いる黄色ブドウ球菌の検出方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】1種以上の栄養成分と、α-グルコシダーゼの存在下で発色する発色剤と、ホスファターゼの存在下で発色する発色剤と、0.5mg/cm3以上のコリスチンメタンスルホン酸ナトリウムとを含む、黄色ブドウ球菌を検出するための培地。α−グルコシダーゼの存在下で発色する発色剤が6−クロロ−3−インドキシル−α−D−グルコシドであり、ホスファターゼの存在下で発色する発色剤が5−ブロモ−3−インドキシルホスフェートである、又は、α−グルコシダーゼの存在下で発色する発色剤が5−ブロモ−4−クロロ−3−インドキシル−α−D−グルコシドであり、ホスファターゼの存在下で発色する発色剤が5−ブロモ−6−クロロ−3−インドキシルホスフェートである、前記培地を有する黄色ブドウ球菌検出シート、並びにそれらを用いる黄色ブドウ球菌の検出方法。
【選択図】図1
Description
(1) 1種以上の栄養成分と、α-グルコシダーゼの存在下で発色する発色剤と、ホスファターゼの存在下で発色する発色剤と、0.5 mg/cm3以上のコリスチンメタンスルホン酸ナトリウムとを含む、黄色ブドウ球菌を検出するための培地。
(2) α-グルコシダーゼの存在下で発色する発色剤が6-クロロ-3-インドキシル-α-D-グルコシドであり、ホスファターゼの存在下で発色する発色剤が5-ブロモ-3-インドキシルホスフェートである、前記(1)に記載の培地。
(3) α-グルコシダーゼの存在下で発色する発色剤が5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-α-D-グルコシドであり、ホスファターゼの存在下で発色する発色剤が5-ブロモ-6-クロロ-3-インドキシルホスフェートである、前記(1)に記載の培地。
(4) 0.5〜4.1 mg/cm3の範囲のコリスチンメタンスルホン酸ナトリウムを含む、前記(1)〜(3)のいずれかに記載の培地。
(5) 0.5〜2.8 mg/cm3の範囲のコリスチンメタンスルホン酸ナトリウムを含む、前記(4)に記載の培地。
(6) 2.3〜2.8 mg/cm3の範囲のコリスチンメタンスルホン酸ナトリウムを含む、前記(5)に記載の培地。
(7) 基材と、前記基材の上面に配置された培養層とを有する黄色ブドウ球菌を検出するための微生物培養基材であって、
前記培養層が、前記(1)〜(6)のいずれかに記載の培地を含む、前記微生物培養基材。
(8) シート形状の基材と、前記培養層を被覆するカバーシートとをさらに有し、前記培養層が、ポリビニルピロリドンと、1種以上のゲル化剤とをさらに含む、前記(7)に記載の微生物培養基材。
(9) 黄色ブドウ球菌を検出する方法であって、
前記(1)〜(6)のいずれかに記載の培地又は前記(7)若しくは(8)に記載の微生物培養基材の培養層に微生物を含む試料を添加する、試料添加工程;
試料を添加した培地又は微生物培養基材をインキュベートして微生物のコロニーを形成させる、コロニー形成工程;
形成された微生物のコロニーの色に基づき黄色ブドウ球菌を同定する、菌株同定工程;を含む、前記方法。
(10) 試料添加工程において、前記(7)若しくは(8)に記載の微生物培養基材の培養層に微生物を含む試料を添加し、該微生物培養基材の培養層が、微生物を含む試料の総体積に対して0.2 mg/ml以上のコリスチンメタンスルホン酸ナトリウムを含む、前記(9)に記載の方法。
本発明の一態様は、黄色ブドウ球菌を検出するための培地に関する。
本発明において、黄色ブドウ球菌は、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)を意味する。黄色ブドウ球菌は、ブドウ球菌属(スタフィロコッカス属)に分類されるグラム陽性菌である。一般に、黄色ブドウ球菌は、ベアードパーカー寒天培地又は卵黄加マンニット食塩寒天培地等の黄色ブドウ球菌用選択培地を用いた培養試験により、存在を確認することができる。これらの選択培地を用いた培養試験は、培地に添加された選択剤により黄色ブドウ球菌を選択的に発育させ、卵黄反応又はマンニット分解性等により黄色ブドウ球菌と判定するものである。しかしながら、これらの選択培地を用いた培養試験では、黄色ブドウ球菌以外の菌種が偽陽性として検出される場合がある。このため、通常は、前記培養試験の後、さらにコアグラーゼ活性を指標としたコアグラーゼ試験により、黄色ブドウ球菌の判定がなされる。コアグラーゼは、黄色ブドウ球菌で発現する血漿凝固作用を有する菌体外酵素である。コアグラーゼは、黄色ブドウ球菌によるヒト病原性に関連していることが知られている。それ故、コアグラーゼ活性を指標とすることにより、腸球菌(エンテロコッカス属菌)及び芽胞菌(バチルス属菌)のような非ブドウ球菌、並びに黄色ブドウ球菌以外の多くのブドウ球菌と区別して、ブドウ球菌を検出することができると考えられてきた。しかしながら、黄色ブドウ球菌以外のいくつかのブドウ球菌は、黄色ブドウ球菌のようにコアグラーゼ産生能力を有する。このため、これらのブドウ球菌は、コアグラーゼ活性を指標とする黄色ブドウ球菌の検出試験において偽陽性として検出される可能性がある。
本発明の一態様の培地は、任意の形状の固体培地として使用することができる。それ故、本発明の別の態様は、基材と、基材の上面に配置され、本発明の培地を含む培養層とを有する、黄色ブドウ球菌を検出するための微生物培養基材に関する。
本発明の一態様の培地及び微生物培養基材は、黄色ブドウ球菌以外のブドウ球菌を含む多数の微生物が存在する試料から、黄色ブドウ球菌のみを高精度で検出するために使用することができる。それ故、本発明の別の一態様は、本発明の一態様の培地及び微生物培養基材を用いる黄色ブドウ球菌を検出する方法に関する。本態様の黄色ブドウ球菌を検出する方法は、試料添加工程、コロニー形成工程及び菌株同定工程を含む。
本工程は、本発明の一態様の培地及び微生物培養基材の培養層に微生物を含む試料を添加する工程である。
本工程は、試料を添加した培地又は微生物培養基材をインキュベートして微生物のコロニーを形成させる工程である。
本工程は、形成された微生物のコロニーの色に基づき黄色ブドウ球菌を同定する工程である。
基材シート10として、合成樹脂を主原料とした合成紙(ユポ・コーポレーション製、ユポ)を準備した。基材シート10の形状は、長方形であった。基材シート10の厚みは270 μmであり、基材シート10の長辺長さは90 mmであり、基材シート10の短辺長さは72 mmであった。
[実験1:α-グルコシダーゼの存在下で発色する発色剤を含む培地を用いる微生物の検出試験]
所定の試験用微生物菌株を液体培地(SCDブイヨン培地)に植菌し、35℃で24時間培養して、試験用微生物懸濁液を調製した。この試験用微生物懸濁液を、約1〜500 cfu/mlの菌密度となるようにリン酸緩衝生理食塩水で希釈した。得られた試験用微生物試料を、マイクロピペットを用いて、表1に記載の成分を含む培地液を用いて作製された微生物培養シートの培養層に1 ml接種した。試料を接種した微生物培養シートを、インキュベーターに静置し、35℃で24又は48時間培養した。培養終了後、微生物培養シートをインキュベーターから取り出した。各微生物培養シートの培養層に形成されたコロニーの色及び着色強度を目視で確認した。前記実験を試験用微生物菌株のそれぞれについて実施した。実験に用いた試験用微生物菌株の名前、並びに各菌株コロニーの形成状態及び色を表2に示す。
実験1と同様の手順で試験用微生物試料を調製した。試験用微生物試料を、マイクロピペットを用いて、表1に記載の成分を含む培地液を用いて作製された微生物培養シートの培養層に1 ml接種した。実験1と同様の手順で、試料を接種した微生物培養シートをインキュベートして、各微生物培養シートの培養層に形成されたコロニーの色及び着色強度を目視で確認した。前記実験を試験用微生物菌株のそれぞれについて実施した。実験に用いた試験用微生物菌株の名前、並びに各菌株コロニーの形成状態及び色を表3に示す。
実験1と同様の手順で試験用微生物試料を調製した。試験用微生物試料を、マイクロピペットを用いて、表1に記載の成分を含む培地液を用いて作製された微生物培養シートの培養層に1 ml接種した。実験1と同様の手順で、試料を接種した微生物培養シートをインキュベートして、各微生物培養シートの培養層に形成されたコロニーの色及び着色強度を目視で確認した。前記実験を試験用微生物菌株のそれぞれについて実施した。実験に用いた試験用微生物菌株の名前、並びに各菌株コロニーの形成状態及び色を表4に示す。
実験1と同様の手順で試験用微生物試料を調製した。また、実験1と同様の手順で微生物培養シートを作製した。微生物培養シートの作製に使用した培地液は、表1に記載の実験3の場合と同様の固形成分と、表5に記載の最終の質量濃度となる所定量のコリスチンメタンスルホン酸ナトリウムと、粘度調整のための溶媒(メタノール)とを含む。試験用微生物試料を、マイクロピペットを用いて、微生物培養シートの培養層に1 ml接種した。実験1と同様の手順で、試料を添加した微生物培養シートをインキュベートして、24時間培養後、各微生物培養シートの培養層に形成されたコロニーの色及び着色強度を目視で確認した。前記実験を試験用微生物菌株のそれぞれについて実施した。実験に用いた試験用微生物菌株の名前、並びに各菌株コロニーの形成状態を表5に示す。表中、空欄は、通常の生育状態でコロニーが形成されたことを、「抑制」は、生育抑制された状態であったことを、それぞれ示す。コリスチンメタンスルホン酸ナトリウムの濃度のうち、上段の濃度は、試料を接種する前の乾燥状態の培養層の総体積に対する質量濃度(mg/cm3)であり、下段の濃度は、使用時に培養層に接種された試料の溶液の総体積に対する質量濃度(mg/ml)である。
実験1と同様の手順で試験用微生物試料を調製した。また、実験1と同様の手順で微生物培養シートを作製した。微生物培養シートの作製に使用した培地液は、表1に記載の実験3の場合と同様の固形成分と、2.5 mg/cm3(すなわち1 mg/ml試料溶液)の最終の質量濃度となる所定量のコリスチンメタンスルホン酸ナトリウムと、粘度調整のための溶媒(メタノール)とを含む。試験用微生物試料を、マイクロピペットを用いて、微生物培養シートの培養層に1 ml接種した。実験1と同様の手順で、試料を添加した微生物培養シートをインキュベートして、各微生物培養シートの培養層に形成されたコロニーの色及び着色強度を目視で確認した。前記実験を試験用微生物菌株のそれぞれについて実施した。実験に用いた試験用微生物菌株の名前、並びに各菌株コロニーの形成状態及び色を表6に示す。また、発色後の各菌株コロニーの形成状態及び色を図7及び8に示す。図中、図7(a)は、黄色ブドウ球菌ATCC25923菌株を、図7(b)は、黄色ブドウ球菌NBRC100910菌株を、図7(c)は、黄色ブドウ球菌NBRC12732菌株を、図7(d)は、スタフィロコッカス・インターメディウスを、図7(e)は、スタフィロコッカス・ハイカス(Staphylococcus hyicus)を、図7(f)は、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcus epidermidis)を、それぞれ示す。図8(a)は、腐生ブドウ球菌を、図8(b)は、スタフィロコッカス・キシロサスを、図8(c)は、スタフィロコッカス・スキウリを、図8(d)は、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)を、図8(e)は、バチルス・リチェニホルミス(Bacillus licheniformis)を、図8(f)は、バチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)を、それぞれ示す。
実験1と同様の手順で試験用微生物試料を調製した。また、実験1と同様の手順で微生物培養シートを作製した。微生物培養シートの作製に使用した培地液は、表1に記載の実験3の場合の固形成分において、α-グルコシダーゼの存在下で発色する発色剤を5-ブロモ-4-クロロ-3-インドキシル-α-D-グルコシドに、ホスファターゼの存在下で発色する発色剤を5-ブロモ-6-クロロ-3-インドキシルホスフェートに、それぞれ変更した固形成分を含む。さらに、培地液は、2.5 mg/cm3(すなわち1 mg/ml試料溶液)の最終の質量濃度となる所定量のコリスチンメタンスルホン酸ナトリウムと、粘度調整のための溶媒(メタノール)とを含む。試験用微生物試料を、マイクロピペットを用いて、微生物培養シートの培養層に1 ml接種した。実験1と同様の手順で、試料を添加した微生物培養シートをインキュベートして、各微生物培養シートの培養層に形成されたコロニーの色及び着色強度を目視で確認した。前記実験を試験用微生物菌株のそれぞれについて実施した。実験に用いた試験用微生物菌株の名前、並びに各菌株コロニーの形成状態及び色を表7に示す。また、発色後の各菌株コロニーの形成状態及び色を図9〜11に示す。図中、図9(a)は、黄色ブドウ球菌ATCC25923菌株を、図9(b)は、黄色ブドウ球菌NBRC100910菌株を、図9(c)は、黄色ブドウ球菌NBRC12732菌株を、図9(d)は、スタフィロコッカス・インターメディウスを、図9(e)は、スタフィロコッカス・ハイカスを、図9(f)は、スタフィロコッカス・エピダーミディスを、それぞれ示す。図10(a)は、腐生ブドウ球菌スタフィロコッカス・サプロフィティカスを、図10(b)は、スタフィロコッカス・キシロサスを、図10(c)は、スタフィロコッカス・スキウリを、図10(d)は、スタフィロコッカス・シムランス(Staphylococcus simulans)を、図10(e)は、スタフィロコッカス・ハエモリティカス(Staphylococcus haemolyticus)を、図10(f)は、スタフィロコッカス・ワルネリ(Staphylococcus warneri)を、それぞれ示す。図11(a)は、スタフィロコッカス・ホミニス(Staphylococcus hominis)を、図11(b)は、スタフィロコッカス・コーニイ(Staphylococcus cohnii)を、図11(c)は、スタフィロコッカス・カピティス(Staphylococcus capitis)を、図11(d)は、バチルス・セレウスを、図11(e)は、バチルス・リチェニホルミスを、図11(f)は、バチルス・スブチリスを、それぞれ示す。
20…枠層
25…固定部材
30…培養層
40…カバーシート
Claims (10)
前記培養層が、請求項1〜6のいずれか1項に記載の培地を含む、前記微生物培養基材。
請求項1〜6のいずれか1項に記載の培地又は請求項7若しくは8に記載の微生物培養基材の培養層に微生物を含む試料を添加する、試料添加工程;
試料を添加した培地又は微生物培養基材をインキュベートして微生物のコロニーを形成させる、コロニー形成工程;
形成された微生物のコロニーの色に基づき黄色ブドウ球菌を同定する、菌株同定工程;を含む、前記方法。
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