CN102471747A - 微生物培养片及其制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种能够将昂贵的培养材料的使用限定在必要部分、制造时的工序简便、使用者能够简便且稳定地使用的微生物培养片。本发明的微生物培养片是一种具有基片、形成在所述基片上的培养层以及覆盖所述培养层的盖板的微生物培养片，其中，所述培养层是对含有选自由凝胶化剂、营养成分、显色指示剂、选择剂以及基质组成的组中的至少一种的和聚乙烯吡咯烷酮的培养液进行图案形成而得到的层。

Description

微生物培养片及其制造方法
技术领域
本发明涉及一种用于菌数检查等的微生物培养片，详细而言，涉及一种由于培养层被在基片的规定范围内形成图案，因而培养材料的浪费少且操作简便的微生物培养片。
背景技术
作为确认微生物的存在或者测定微生物数的方法，有琼脂平板混释法。在该琼脂平板混释法中，由于使用预先形成在已灭菌的培养皿的琼脂培养基，因而需要用于对琼脂培养基进行高压蒸汽灭菌的高压灭菌器和用于无菌地进行微生物检查的检查室，另外，对于从微生物的取样到样品液的制备、分注、与培养基的混释、培养、计数的微生物检查操作，要求熟练。于是，正在开发具备不需要高度熟练、能够简便地进行微生物检查的干燥培养基的微生物培养片。
例如，在专利文献1中，公开了一种片状培养装置，其在防水性基体上具备通过粘合剂均匀地粘合了含有凝胶化剂、营养成分的冷水可溶粉末的粘合剂层。对于通过粘合层使浸在凝胶化剂和微生物的生长培养基中的滤纸与膜粘合的现有装置，由于滤纸不具有透明性，细菌菌落的计数困难，另外，很难分离每个菌落，鉴于这些问题完成该片状培养装置，通过经由粘合剂直接固定凝胶化剂和营养成分的方法来解决使滤纸介于之间的装置存在的问题。另外，专利文献1中还记载有如下内容：在使用上述片状培养装置时，通过将具有重量的环状轮样的型板暂时放置在盖板上，从而使被检液以限定在特定的区域内的方式扩散。
在专利文献2中，公开了一种片状培养装置，其包括基材、形成在该基材面上的包括有非吸收性培养面的台座以及盖板，并且使培养基附着在上述培养面和/或者盖板的底面。利用经由粘合剂将冷水可溶粉末粘合在基体上的现有方法，由于形成不规则形状和尺寸的粘合物，因而不能将凝胶化剂、营养物质、抑制剂、指示剂等培养基构成成分维持在适当浓度，鉴于这样的问题完成该片状培养装置。根据专利文献2中记载的片状培养装置，使用者不需要特别的设备和操作，能够使水性试样扩散为均匀的形状和尺寸。此外，在专利文献2的实施例中，利用如下的方法制造片状培养装置。首先，在台座底部的一个面上涂布含有胶的肉汁溶液即培养液之后，在温度100℃下使水分蒸发。然后，使热敏粘合剂、聚苯乙烯发泡体以及聚丙烯酸酯PSA贴合在上述台座底部的另一个面上，将所得到的层积体冲裁成直径5.1cm。在将该冲裁后的层积体以PSA一侧为下方的方式贴合在基材面上之后，使盖板附着在上述基材的边缘，从而制造片状的培养装置。
在专利文献3中，公开了一种微生物培养器，其在方形的粘着片上层积圆形的多孔质基体层和水溶性高分子化合物层，在其上再配设有方形的透明膜。在该微生物培养器中，通过向多孔质基体层上添加样品液，样品液被多孔质基体层保持。于是，由于该被保持着的样品液的水分，与多孔质基体层接触的水溶性高分子化合物层溶解，进而产生水溶性高分子化合物水溶液，由该高分子化合物水溶液和生长营养成分构成微生物能够生长发育的环境。此外，在该微生物培养器中，由于溶解的水溶性高分子化合物层为高粘度溶液，因而微生物不会侵入至水溶性高分子化合物层内部，在溶解的水溶性高分子化合物层与多孔质基体层一体化的工序中，微生物被上推到多孔质基体层的表面。因此，菌落形成在多孔质层的表面或者表面附近。通过以上述多孔质基体层为上方的方式使其粘结在粘合片上，再以与上述多孔质基体层接触的方式覆盖透明膜，从而该微生物培养器能够用作轻量而体积小且容易处理的片状微生物培养器。此外，作为上述水溶性高分子，公开了皂化度为75％～95％、分子量为25000～250000的聚乙烯醇。
在专利文献4中，公开了一种微生物培养片，其在防水性的基片的整个面上涂布培养基混合物和吸水性树脂而形成培养层，在该培养层上形成有用于限定所要接种的被检液的扩散的疏水性油墨外框层。此外，在专利文献4的实施例中，将厚度100μm的透明的双轴延伸聚酯膜作为基片，在该基片上，利用逗号涂布机(コンマコ一タ一)以干燥时的涂布量为30g/m2的方式涂布在聚氧化乙烯(聚乙烯氧化物)的甲苯溶液中混合了营养成分和氯化三苯基四唑(鎓)而得的培养层形成用涂布液，在形成的培养层上，通过疏水性油墨的丝网印刷而形成有成为外框层的、内径50mm、外径70mm的环形图案。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利特公平2-49705号公报
专利文献2：日本专利特表2004-515236号公报
专利文献3：国际公开WO 01/044437号公报
专利文献4：日本专利特开平8-280377号公报
发明内容
发明要解决的技术问题
然而，由于微生物的培养材料昂贵，因而优选能够减少其使用量。但是，在专利文献4中，在基材膜上的整个区域上层积有培养层，在微生物的培养所必需的部分以外也形成有培养层，因而浪费了昂贵的材料。另外，在专利文献2、专利文献3中，在膜上全面涂布了培养液之后，将其一部分冲裁掉，将贴在基材上的部分作为培养层，在这一点上，仍然浪费材料。
另外，微生物培养片优选制造时工序简便。在这一点上，上述专利文献1记载的培养装置通过粘合剂使作为凝胶化剂、营养成分的冷水可溶粉末均匀地粘合在基体上而形成培养层，虽然可以说是简便的方法，但是在该方法中，微生物容易与粘合剂成分接触。因此，粘合剂成分有可能会对微生物的生长发育带来影响，因而不能说优选。相反，在专利文献2记载的片状培养装置中，不使用粘合剂，而在包含聚酯膜的台座底部上，通过涂布作为凝胶化剂而含有瓜尔豆胶的肉汁溶液而形成培养层。然而，在专利文献2记载的片状培养装置中，如上所述，在膜上整面涂布了培养液之后，进行冲裁加工，再利用粘合剂将所得到的冲裁加工品贴合在基材上而形成培养层，因而制造工序繁杂。专利文献3中记载的微生物培养器由于也进行与专利文献2中记载的片状培养装置同样的操作，因而制造工序仍然繁杂。
在专利文献2记载的片状培养装置中，培养基溶液含有水，因而必须在高温条件下进行加热干燥，营养成分、凝胶化剂、显色指示剂、基质以及基材可能会由于加热而被分解。因此，能够使用的营养成分或者凝胶化剂、显色指示剂、基质以及基材受到限制。这对于使用聚乙烯醇水溶液的专利文献3中记载的微生物培养器也是同样的。在专利文献4记载的微生物培养片中，作为培养基混合物使用了聚氧化乙烯的甲苯溶液，但甲苯也是超过100℃的高沸点的有机溶剂，从这一点来看，所能够使用的材料仍然受到限制。
而且，为了快速地进行，被检液的接种操作也优选简便。然而，在专利文献1记载的培养装置中，为了控制被检液的扩散，必须暂时将具有重量的环状轮样的型板放置在盖板上，将被检液限定在特定区域内，很难说操作简便。另外，在专利文献3记载的微生物培养器中，为了抑制被检液的扩散而包含了多孔质基体的培养层。因此，被检液的吸水时间变长，对于使用者来说，容易浪费操作时间。另外，在专利文献3记载的微生物培养器中，为了防止培养时的干燥，使盖板覆盖在被检液接种后的培养层上，但是由于上述培养层吸水而体积增加，如果不慎重地紧贴粘着片与盖板，有时会产生成为培养时干燥的原因的间隙。另外，如果在吸水后按压培养层，则被检液有时会从多孔质基体渗出，操作者必须慎重地进行操作。在这一点上，也容易浪费操作时间。
在专利文献4记载的微生物培养片中，为了限定所接种的被检液的扩散，设置有疏水性油墨外框层。由于该外框层形成在培养层上，因而随着被检液的滴下，外框层的下部含有水，有时外框层变形或被检液浸润至外框层的下部和外周，很难稳定地使用。
而且，在微生物检查中，菌落的计数必须正确进行。然而，在专利文献1、专利文献2中，由于不仅在纸基材的上面形成培养层，而且在盖板上也形成培养层，因而有时不能够得到充分的可识别性。另外，在专利文献3记载的微生物培养器中，由于培养层由多孔质基体构成，因而菌体会进入多孔质基体。因此，如果菌体进行繁殖，则所产生的菌落难以看到，尤其是在菌体接近地繁殖的情况下，菌落计数有时会变得困难。
本发明就是鉴于上述的问题点而完成的，目的在于提供能够将昂贵的培养材料的使用限定在必要部分、制造时的工序简便、使用者能够简便且稳定地使用的微生物培养片。
用于解决课题的手段
本发明对微生物培养片进行了详细地研究，其结果发现：(1)通过印刷或者涂布而在基片上图案形成培养层，能够减少昂贵的培养基材料的使用；(2)作为培养液，通过使用含有选自由凝胶化剂、营养成分、显色指示剂、选择剂以及基质组成的组中的至少一种的聚乙烯吡咯烷酮溶液，能够通过图案形成而廉价且简便地形成规定形状的培养层；(3)通过使用醇溶液作为用于培养液的溶剂，能够防止在溶剂除去时可能产生的混合成分的变质；以及(4)通过图案形成培养层，不使用环状的型板，仅通过盖上盖板而不等待被检液被吸水就能使被检液扩散为一定面积，然后，通过再形成框层，能够防止被检液的遗漏，从而完成了本发明。
即，在本发明中，提供一种微生物培养片，具有基片、形成在上述基片上的培养层以及覆盖上述培养层的盖板，其中，上述培养层是对含有选自由凝胶化剂、营养成分、显色指示剂、选择剂以及基质组成的组中的至少一种的和聚乙烯吡咯烷酮的培养液进行图案形成而得到的层。
另外，在本发明中，提供一种具有基片、形成在上述基片上的培养层以及覆盖上述培养层的盖板的微生物培养片的制造方法，其中，上述制造方法包括将在聚乙烯吡咯烷酮的醇溶液中含有选自由凝胶化剂、营养成分、显色指示剂、选择剂以及基质组成的组中的至少一种的培养液图案形成在上述基片上之后，除去上述培养液中含有的上述醇从而形成上述培养层的培养层形成工序。
提供一种具有基片、形成在上述基片上的培养层以及覆盖上述培养层的盖板的微生物培养片的制造方法，其中，上述基片预先形成有在形成有上述培养层时包围上述培养层的外周的凸状的包含疏水性树脂的框层，在上述框层的内侧，对在聚乙烯吡咯烷酮的醇溶液中含有选自由凝胶化剂、营养成分、显色指示剂、选择剂以及基质组成的组中的至少一种的培养液进行图案形成，然后除去上述培养液中含有的上述醇，从而形成上述培养层。
发明效果
根据本发明的微生物培养片，由于培养层被图案形成在基片上，因而能够将微生物的培养材料的使用仅限定在必要的部分，进而能够减少昂贵材料的使用量。另外，根据本发明的微生物培养片，由于将聚乙烯吡咯烷酮作为了培养液的必需成分，因而能够廉价且简便地图案形成规定形状的培养层。而且，由于在本发明的微生物培养片中图案形成了培养层，因而通过在被检液滴下后，迅速地覆盖盖板，使被检液自然地扩散到一定范围，操作性优异。
根据本发明的第一微生物培养片的制造方法，由于在基片上图案形成培养层，因而能够避免昂贵材料的浪费。另外，由于图案形成是印刷或者涂布等廉价的方法，因而也能够降低制造成本。而且，根据本发明的第一微生物培养片的制造方法，由于在培养液形成图案时，使用醇作为溶剂，因而容易除去溶剂，并且，由于溶剂的沸点低，因而能够有效地避免混合成分的热分解。
本发明的第二微生物培养片的制造方法，由于在基片上预先形成有在已形成上述培养层时包围上述培养层外周的凸状的、包含疏水性树脂的框层，因而即使接种被检液，框层也不会变形而一直稳定，作业的操作性和稳定性优异。另外，根据本发明的第二微生物培养片的制造方法，由于在基片上形成有包围培养层外周的框层，因而能够更可靠地防止被检液的遗漏，进而使接种时的作业效率提高。
附图说明
图1是示出本发明涉及的微生物培养片的一个示例的平面图(a)和截面图(b)，是示出在基片的大致中央形成有圆形的培养层的方式的图。
图2是示出本发明涉及的微生物培养片的一个示例的截面图，其中，图2(a)是示出基片为多层结构的方式的图，图2(b)是示出培养层为多层结构的方式的图。
图3是示出本发明涉及的微生物培养片的一个示例的展开图(a)和截面图(b)，是示出在基片上形成有培养层、在盖板上形成有特定成分层的方式的图。
图4是示出本发明涉及的微生物培养片的一个示例的平面图(a)和截面图(b)，是示出在基片上形成有培养层和框层的方式的图。
图5是示出本发明涉及的微生物培养片的一个示例的截面图，是示出在基片上形成有培养层和框层，并且特定成分层以与上述框层的内侧相对的方式形成于盖板的方式的图。
图6是示出本发明涉及的微生物培养片的一个示例的截面图，是示出在基片上形成有培养层和框层，特定成分层以与上述框层的内侧相对的方式且粘合层以与上述框层相对的方式形成于盖板的方式的图。
图7是本发明涉及的微生物培养片的一个示例，是在基片上形成有框层的截面图，其中，图7(a)是示出基片为多层结构的方式的图，图7(b)是示出培养层为多层结构的方式的图。
图8是示出本发明涉及的微生物培养片的一个示例的图，是示出在基片上形成有外周被框层包围的多个培养层，盖板被固定在基片上的方式的平面图(a)和截面图(b)。
图9是示出本发明涉及的微生物培养片的一个示例的图，是示出在连接设置有盖板的基片上形成有外周被框层包围的培养层的方式的展开图(a)、截面图(b)以及示出上述盖板折弯且培养层被覆盖的方式的截面图(c)。
图10是示出本发明涉及的微生物培养片的一个示例的图，是示出盖板由双面胶带固定设置于形成有培养层的基片上的方式的截面图。
图11是示出本发明涉及的微生物培养片的一个示例的图，是示出盖板由双面胶带固定设置于形成有培养层和框层的基片上的方式的截面图。
图12是示出本发明涉及的微生物培养片的一个示例的外观立体图。
图13是示出本发明涉及的微生物培养片的一个示例，是在基片上形成有框层的外观立体图。
图14是示出实施例1的微生物培养片的菌落生长状态的图。
图15是示出实施例6的微生物培养片的菌落生长状态的图。
具体实施方式
下面，将详细地说明本发明的具体的实施方式，但是本发明不受以下实施方式的任何限定，可以在本发明的目的范围内进行适当的变更来加以实施。
[微生物培养片]
本发明的微生物培养片是一种具有基片、形成在上述基片上的培养层以及覆盖上述培养层的盖板的微生物培养片，其中，上述培养层是对含有选自由凝胶化剂、营养成分、显色指示剂、选择剂以及基质组成的组中的至少一种的和聚乙烯吡咯烷酮的培养液进行图案形成而得到的层。
本发明的微生物培养片优选在上述培养层的外周形成有包含疏水性树脂的框层。另外，上述凝胶化剂优选为高分子多糖类。而且，上述凝胶化剂在上述培养基中的含量优选相对于上述聚乙烯吡咯烷酮100质量份为100～600质量份。而且，上述基片和/或上述盖板优选包含透明塑料片，上述盖板可以被固定设置于基片。
(1)微生物培养片的构成
图1(a)、(b)示出本发明的微生物培养片的优选实施方式的一个示例。图1(a)是平面图，图1(b)是图1(a)的A-A’截面图。
图1示出在方形的基片(10)的大致中央上形成培养层(30)且以覆盖上述培养层(30)的方式设置有方形的盖板(40)的方式。在本发明中，具有培养层(30)被图案形成于基片(10)这一特征，如图2(a)的截面图所示，基片(10)既可以是包含基片(11)与基片(13)这2层的多层片，而且也可以是还层积有塑料以外的其他层的多层片。另外，如图2(b)所示，培养层(30)可以由2层以上的多层构成。
通过图案形成而制作的培养层(30)的形状并不限于图1所示的圆形，也可以是正方形、长方形、其他多角形、不定形。
如图3(a)的展开图所示，本发明的微生物培养片可以在基片(10)和盖板(40)这两片上分别形成有培养层30和含有粘合剂成分、营养成分以及其他成分的特定成分层(30’)。例如，在培养层(30)与上述特定成分层(30’)这两层中含有凝胶化剂的情况下，由于基片上的培养层(30)与设在盖板(40)上的特定成分层(30’)被相对地配设，因而例如在基片(10)上的培养层(30)上接种了被检液之后，如果用盖板(40)覆盖培养层(30)，则上述被检液被培养层(30)与特定成分层(30’)吸水，进而能够在培养层(30)与特定成分层(30’)这两层上观察微生物。另外，如果使培养层(30)中含有指示剂，则在灭菌处理时也会存在因指示剂而使着色明显的菌，在那种情况下，通过使上述指示剂含有在特定成分层(30’)中，能够防止灭菌处理时的着色。图3(b)是横截面图。
另外，如图4(a)的平面图和图4(b)的A-A’线截面图所示，本发明的微生物培养片可以是在基片(10)的大致中央形成有培养层(30)，在上述培养层的外周形成有圆形的框层(20)的培养片。采用框层(20)能够更加可靠地限定接种到培养层(30)的被检液的吸水范围。此外，框层(20)的形状不限于圆形，可以是方形、椭圆形、多角形、不定形等任一种，优选以能够确保接种到培养层(30)的被检液的吸水范围为规定面积的方式形成框层。另外，在该方式中，如图5的截面图所示，还可以在盖板(40)上，以与基片(10)上的培养层(30)相对的方式形成有特定成分层(30’)。
而且，如图6所示，可以以与上述框层(20)相对的方式在盖板(40)上形成有粘着层(50)。通过框层(20)与粘着层(50)紧贴，能够更有效地防止培养层(30)的干燥或者污染。
如图7(a)的截面图所示，在本发明的微生物培养片中，即使在基片(10)的表面形成包含疏水性树脂的框层(20)的情况下，基片(10)可以是包含基片(11)与基片(13)这2层的多层片的方式，也可以是层积塑料以外的其他层的多层片。另外，如图7(b)的截面图所示，即使在包含疏水性树脂的框层(20)形成在基片(10)的表面的情况下，培养层(30)也可以由2层以上的多层构成。
另外，培养层(30)也可以在基片(10)上存在多个。图8(a)、(b)示出多个培养层(30)、包围这些培养层外周的凸状的、包含疏水性树脂的框层(20)以及在基片(10)的端部固定地设置了覆盖上述培养层(30)的盖板(40)的方式。图8(a)是平面图，图8(b)是图8(a)的A-A’截面图。在图8中，盖板(40)采用的是为了能够覆盖培养层(30)且紧贴框层(20)的上部而形成有2个角部(C1、C2)的方式。此外，也可以与图8不同地，以与形成在上述基片(10)上的培养层(30)相对的方式在盖板(40)上形成有特定成分层(30’)。
上述培养层(30)的等效圆的直径优选为20～80nm，更优选为30～70nm。向微生物培养片滴下的被检液一般为1ml，如果是上述范围，则能够对被检液进行充分吸水。
一般而言，框层(20)的高度被制作成比培养层的高度高100～1200μm，优选高200～1000μm，更优选高300～800μm。如果是上述范围，则在被检液接种到培养层(30)之后，覆盖了盖板(40)时，可以更可靠地防止被检液的遗漏，另外，不会在培养层(30)与盖板(40)之间形成空隙，被检液可以快速地扩散至框层(20)。另外，在被检液被培养层吸水之后，也能够保持培养层(30)与盖板(40)的紧贴性。由于可以立即覆盖盖板(40)而不等待接种后的被检液被培养层吸水，因而能够使接种时的作业效率提高。
框层的宽度并不限于均匀的宽度，而最细部的宽度优选为0.5～5.0mm，更优选为1.0～3.0mm。如果为上述范围，则即使在培养层吸水而膨润的情况下，框层的形状也不会变形，进而能够使被检液在规定区域扩散。
此外，框层可以是单一的，另外，也可以是在上述框层的外侧再形成框层的2重框的框层。
(2)基片
在本发明的微生物培养片中，由于在基片上对含有选自由凝胶化剂、营养成分、显色指示剂、选择剂以及基质组成的组的至少一种和聚乙烯吡咯烷酮的培养液进行图案形成，因而基片必须具有耐溶剂性、适于印刷性。另外，作为微生物培养片，也要求耐水性，并且也要求具有可以承受形成培养层时的干燥处理的耐热性。基片可以为单层，也可以为2层以上的层积片。
在基片为单层的情况下，能够适当使用例如聚酯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚氯乙烯等塑料片。如果采用这些塑料薄片，由于透明性优异，因而能够利用来自基片的透过光观察微生物菌落，进而可识别性提高。但是，能够使用通过发泡而呈白色的薄片、被着色成任意一种颜色的薄片。根据培养菌的不同，不限于透明，有时通过着色易于对生长发育的菌落进行计数，可以适当选择。
另外，作为层积片，能够例示出层积了2种以上上述塑料片的层积片。另外，也可以适当使用在上述塑料片上层积了纸基材的层积片、在纸基材上涂布了合成树脂的层积片。作为这种层积片，例如，能够例示出聚乙烯膜与纸基材的层积片。
而且，以合成树脂为主原料的合成纸也能够用作基片。作为这种合成纸，能够例示出日本YuPo公司生产的商品名“YuPo”或者东洋纺生产的“Crisper”等。
为了使与上述培养层的紧贴性提高，在本发明中使用的基片可以是对图案形成培养层的一侧预先进行了表面处理的基片。作为这种表面处理，包括电晕放电处理、臭氧处理、使用了氧气或氮气的低温等离子处理、辉光放电处理、使用化学药品等进行处理的氧化处理以及其他预处理等。
另外，在本发明中使用的基片可以是预先涂布锚涂剂(anchorcoating-agent)，进行了表面处理的基片。作为这种锚涂剂，能够例示出：异氰酸酯类(聚氨酯类)、聚乙烯亚胺类、聚丁二烯类、有机钛类以及其他锚涂剂。更优选为以如下物质为主要成分的：例如，甲苯二异氰酸酯、二苯基亚甲基二异氰酸酯、多亚甲基多亚苯基多异氰酸酯(Polymethylenepolyphenylene polyisocyanate)等芳香族聚异氰酸酯，或者通过六亚甲基二异氰酸酯、苯二甲基二异氰酸酯(xylylene diisocyanate)等脂肪族聚乙氰酸酯等多官能异氰酸酯与聚酯类多元醇、聚醚类多元醇、聚丙烯酸脂多元醇以及其他羟基含有化合物的反应而得到的聚醚型聚氨酯类树脂、聚酯型聚氨酯类树脂、聚丙烯酸脂型聚氨酯类树脂。
基片优选平坦、没有卷曲，其厚度没有特别限制，通常为25～1500μm，优选为50～500μm。
(3)培养层
在本发明的微生物培养片中，设在基片上的培养层是对含有选自由凝胶化剂、营养成分、显色指示剂、选择剂以及基质组成的组中的至少一种和聚乙烯吡咯烷酮的培养液进行图案形成而得到，将聚乙烯吡咯烷酮作为培养液的必需成分。
(i)聚乙烯吡咯烷酮
在本发明的微生物培养片中，聚乙烯吡咯烷酮是培养液的必需成分，具有调整培养液的粘度的作用。如果采用聚乙烯吡咯烷酮，则通过调整溶剂中的浓度能够容易地进行粘度调整，因而能够使选自由凝胶化剂、营养成分、显色指示剂、选择剂以及基质组成的组中的至少一种均匀地分散，另外，能够仅在必要部分上进行图案形成，不会浪费昂贵材料。而且，如果图案形成后除去溶剂，则由于聚乙烯吡咯烷酮成膜性高，因而能够摄取凝胶化剂、营养成分而成膜。另外，由于与基材也具有良好的紧贴性，因而能够不使用粘合剂地形成培养层，不会像现有微生物培养片那样因粘合剂成分而影响微生物的发育。
(ii)凝胶化剂
在本发明的微生物培养片中，在培养液中可以含有凝胶化剂。通过图案形成含有凝胶化剂的培养液而形成的培养层，一旦接种被检液，则会增粘或凝胶化，因而变为对菌的培育有益的粘度。另外，由于在增粘后能够与盖板紧贴，因而能够抑制培养时培养层的干燥。
作为这种凝胶化剂，能够适当使用高分子多糖类，能够例示出：角叉胶(角叉菜)、瓜尔豆胶、黄原胶(キタンサンガム，xanthan gum)、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、刺槐豆胶、藻胶(藻朊)等。如果采用这些高分子多糖类，则由于随着被检液的滴下而在水中增粘或者凝胶化，因而菌的发育良好，另外，由于透明性高，因而菌落的可识别性优异，并且，由于增粘而与盖板紧贴，因而能够抑制培养时的干燥。在本发明的微生物培养片中，这些高分子多糖尤其能够适当使用瓜尔豆胶。这是因为，瓜尔豆胶在低浓度下就呈现出极高的粘度，因此少量就能够形成适于菌发育的环境。瓜尔豆胶由一年生的豆科植物、瓜尔豆种子的胚乳部制造。
(iii)营养成分
在本发明的微生物培养片中，在培养液中可以含有营养成分。作为营养成分，例如，如果是一般生菌检查用，则可以使用酵母提取物/蛋白胨/葡萄糖混合物、肉提取物/蛋白胨混合物、蛋白胨/大豆胨/葡萄糖混合物等或者在它们中添加了磷酸氢二钾和/或氯化钠的混合物。如果是大肠杆菌、大肠菌群检查用，则可以使用去氧胆酸钠/蛋白胨/柠檬酸铁铵/氯化钠/磷酸氢二钾/乳糖/蛋白胨/乳糖/磷酸氢二钾等。如果是葡萄球菌用，则可以使用肉提取物/蛋白胨/氯化钠/甘露糖醇/卵黄混合物、蛋白胨/肉提取物/酵母提取物/丙酮酸钠/甘氨酸/氯化锂/亚碲酸盐卵黄液混合物等。如果是弧菌用，则可以使用酵母提取物/蛋白胨/蔗糖/硫代硫酸钠/柠檬酸钠/胆酸钠/柠檬酸铁/氯化钠/牛胆汁等。如果是肠球菌用，则可以使用牛脑提取物/心脏提取物/蛋白胨/葡萄糖/磷酸氢二钾/氮化钠等。如果是真菌用，则可以使用蛋白胨/葡萄糖混合物、酵母提取物/葡萄糖混合物、马铃薯提取物/葡萄糖混合物等。在本发明的微生物培养片中，能够根据所要发育的微生物的不同，从这些物质中选择一种或一种以上的营养成分来混合使用。此外，在培养层中不含营养成分时或者营养成分不足时，可以向被检液添加营养成分，进而使微生物生长发育。
(iv)显色指示剂、选择剂、基质等其他成分
在本发明的微生物培养片中，也可以在培养液中含有显色指示剂、选择剂、基质等其他成分。
显色指示剂通过与在培养过程中发育的微生物代谢而产出的特异物质反应、识别pH变化、与酶反应等而显色，进而使菌落着色，因而具有使菌落数的计数变得极其容易的效果。作为这种显色指示剂，具体而言，包括：氯化三苯基四唑(鎓)(以下表示为TTC)、对甲苯基四唑红、四唑紫、对甲苯基四唑蓝(ペテトリルテトラゾリウムブル一)等四唑盐或者中性红混合物；酚红、溴百里酚蓝、百里酚蓝混合物等pH指示剂。
在培养液中可以含有抑制检测目标以外的微生物生长发育的选择剂。作为这种选择剂，可以使用抗生素、合成抗菌剂等抗生剂，色素、表面活性剂、无机盐等。作为抗生素，能够例示出：甲氧西林、头孢美唑、头孢克肟、头孢他啶、头孢磺啶、杆菌肽、多粘菌素B、利福平、新生霉素、黏菌素、林可霉素、氯霉素、四环素、链霉素等，作为合成抗菌剂，能够例示出：磺胺剂、萘啶酮酸、喹乙醇等。另外，作为色素，能够例示出具有抑菌或者杀菌作用的结晶紫、亮绿、孔雀绿、亚甲蓝等。另外，作为表面活性剂，能够例示出：Tergitol 7、十二烷基硫酸盐、月桂基硫酸盐等。另外，作为无机盐类，能够例示出：亚硒酸盐、亚碲酸盐、亚硫酸盐、氮化钠、氯化锂、草酸盐、高浓度的氯化钠等。除这些以外，还能够使用牛磺胆酸盐、甘氨酸、胆汁粉、胆汁酸盐、脱氧胆酸盐等。
这些成分既可以以粉末形式添加，也可以将它们溶解于溶剂之后，例如混合到上述聚乙烯吡咯烷酮的醇溶液中，作为培养液。此外，由于显色指示剂的种类不同，也有在灭菌处理时着色明显的显色指示剂，也可以使培养层中不含显色指示剂，而是在被检液中含有显色指示剂，使其显色。
另外，在本发明的微生物培养片中，不限于由1层形成培养层的情况，可以由2层以上的多层构成。例如，可以由在聚乙烯吡咯烷酮溶液(i)中含有凝胶化剂(ii)的培养液形成第1培养层，在其上由在聚乙烯吡咯烷酮溶液(i)中含有凝胶化剂(ii)和营养成分(iii)的培养液形成第2培养层，作为在本发明中所要使用的培养层。另外，可以仅在第1培养层中混合凝胶化剂，也可以由在聚乙烯吡咯烷酮溶液(i)中含有凝胶化剂(ii)的培养液形成第1培养层，在其上由在聚乙烯吡咯烷酮溶液(i)中含有营养成分(iii)的培养液形成第2培养层，作为在本发明中所要使用的培养层。
另外，根据显色指示剂、选择剂的组合不同，有时由于混合而发生反应，通过使它们含有在不同的层中能够防止混合反应。另外，通过将显色指示剂形成在最上层，能够使菌落的可识别性提高。因此，在例如营养成分中含有形成混合反应的成分A与成分B的情况下，可以通过层积从聚乙烯吡咯烷酮溶液(i)+凝胶化剂(ii)+营养成分(iii)中除去了A成分的第1培养层与从聚乙烯吡咯烷酮溶液(i)+凝胶化剂(ii)+显色指示剂(iv)+营养成分(iii)中除去了B成分的第2培养层这2层来作为培养层，另外，可以通过依次层积从聚乙烯吡咯烷酮溶液(i)+凝胶化剂(ii)+营养成分(iii)中除去了A成分的第1培养层、从聚乙烯吡咯烷酮溶液(i)+凝胶化剂(ii)+营养成分(iii)中除去了B成分的第2培养层与包含聚乙烯吡咯烷酮溶液(i)+凝胶化剂(ii)+显色指示剂(iv)的第3培养层这3层来作为培养层。另外，混合反应不限于含有在营养成分中的情况，也有时因与选择剂、显色指示剂的关系而发生混合反应。不论在哪一种情况下，通过将成分A与B分开到不同的层中，能够避免混合反应。
在本发明中，在由多层构成培养层的情况下，构成多层结构的任一培养层只要是对含有选自由凝胶化剂、营养成分、显色指示剂、选择剂以及基质组成的组中的至少一种和聚乙烯吡咯烷酮的培养液进行图案形成而得到的就可以，而其他层的组成并不限定于上述，图案形成的方法也不限。
(v)图案形成
本发明的微生物培养片中的培养层是上述培养液被图案形成在上述基片上而成。在本发明的微生物培养片中，由于被图案形成有培养层，因而在被检液滴下后，迅速地覆盖盖板，从而使被检液自然地在一定范围扩散，且操作性优异。在本发明中，所谓“图案形成”，是指在上述基片上，将上述培养液印刷、涂布、涂工、喷雾等为预定的形状，而其方法并无特别限定。因此，在图案形成中，能够使用丝网印刷、凹版印刷、凸版印刷、转印印刷、柔板印刷以及其他印刷；采用分配器或者喷墨等的涂布、使用刮棒等进行涂布的刮棒涂布或者刮刀涂布、模具涂布等涂工；喷涂方式等喷雾以及其他方法。
(4)盖板
在本发明的微生物培养片中，盖板优选被固定设置于基片。盖板具有防止由培养中的落下菌等引起的污染同时防止培养层的水分蒸发的作用。盖板在具有防水性、水蒸气不透过性的同时，为了在微生物培养后能够通过盖板对菌落进行观察和计数，因此优选透明的，例如，能够使用：在上述基片中列举的聚乙烯、聚丙烯等聚烯烃；聚酯、聚酰胺、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚氯化乙烯等塑料片。在本发明的微生物培养片中，如果上述基片和覆盖膜透明，则也能够用来自微生物培养片背面的投射光观察，另外，也能够用从侧面射入的入射光来观察。即，从盖板一侧和基片一侧都能够对菌落进行观察和计数，因而观察方法和计测方法的选择范围变宽。此外，如果考虑到盖板的开闭等操作性，尤其优选聚酯膜、聚烯烃膜。
另外，在基片上，可以进行在基片项中记载的电晕放电处理等表面处理。此外，根据所培养的微生物的种类不同，盖板优选具有适当的气体透过性，主要是氧透过性或氧不透过性，考虑到这一点进行选定即可。
盖板优选在为了接种被检液而从基片上拿起时可以确保适度的柔软性。因此，盖板的厚度优选10～200μm左右，更优选20～70μm左右。此外，盖板虽然是什么样的形状都可以，但为了防止杂菌的进入，必须形成为能够覆盖培养层的比培养层大的尺寸。
在本发明的微生物培养片中，在盖板上，可以在与形成于基片的培养层相对的位置上具有通过涂布特定成分溶液而成的特定成分层，该特定成分溶液是在溶解或者分散有粘合剂树脂的液体中混合有选自由凝胶化剂、营养成分、显色指示剂、选择剂以及基质组成的组中的一种以上而成。如上所述，在本发明的微生物培养片中，形成于基片的培养层是对含有聚乙烯吡咯烷酮和凝胶化剂等的培养液进行图案形成而得到的，可以是不含有显色指示剂的方式。在这种情况下，虽然也能够向被检液中添加显色指示剂来培养，但如果在盖板上对包含粘合剂溶液与TTC试剂等显色指示剂的特定成分液进行图案形成而形成特定成分层，则能够省去向被检液中添加显色指示剂的麻烦，并且利用粘合剂的紧贴性，也能够确保可识别性。作为粘合剂，能够使用聚乙烯亚胺或者聚氧化乙烯(聚乙烯氧化物)、丙烯酸类聚合物等水溶性或者溶解于醇的树脂等。如果能够发挥混合在特定成分层中的成分的功能，则也可以使用疏水性粘合剂的溶解液或者分散液等。
盖板上的上述特定成分层只要至少存在于与基片的培养层相对的位置即可，也可以是涂布在盖板的整个面。这是因为，粘合剂溶液便宜，显色指示剂的使用量少。另外，特定成分层也可以含有凝胶化剂。上述特定成分层不限于1层的情况，可以是2层以上的多层。
在上述特定成分层的形成中，能够使用丝网印刷、凹版印刷、凸版印刷、转印印刷、柔板印刷以及其他印刷；采用分配器或者喷墨等的涂布、使用刮棒等进行涂布的刮棒涂布或者刮刀涂布、模具涂布等涂工；喷涂方式等的喷雾以及其他方法。此外，也可以进行图案形成。
在本发明的微生物培养片中，盖板不限于固定设置于微生物培养片的情况。因此，可以使用另外准备的盖板来覆盖接种有被检液的培养层。但是，如果是使盖板预先固定设置于基片的方式，则操作容易。
此外，在基片上尚未印刷方格印刷花纹的情况下，可以在盖板上预先用不溶于水且不会对微生物的生长发育带来影响的油墨印刷方格印刷花纹。印刷的版式与基片同样，从着色剂、树脂、溶剂等选择范围广的方面考虑优选凹版印刷。关于方格的大小，1cm见方左右是适当的。
(5)框层
在本发明的微生物培养片中，优选在上述培养层的外周形成有包含疏水性树脂的框层。如果形成有框层，则在被检液接种到培养层并覆盖了盖板的情况下，被检液迅速地扩散至框层，因而能够覆盖盖板而不等待被检液被培养层吸水，能够在短时间内进行接种操作。另外，通过框层能够更可靠地防止被检液的遗漏，进而能够提高接种时的作业效率。在培养层中含有凝胶化剂的情况下，被检液被框层内侧的培养层吸水，凝胶化剂增粘，进而能够利用培养层与盖板的紧贴性来防止培养层的干燥。另外，即使在培养层中不含凝胶化剂的情况下，由于聚乙烯吡咯烷酮溶解、增粘，利用培养层与盖板的紧贴性能够防止培养层的干燥。如果培养层与盖板的紧贴性优异，则没有必要在盖板上形成用于菌落形成的层等，能够确保菌落优异的可识别性。
框层的宽度并不限定于均匀的宽度，最细部的宽度优选为0.5～5.0mm，更优选为1.0～3.0mm。如果为上述范围，则即使在培养层吸水而膨润的情况下，框层的形状也不会变形，进而能够使被检液在规定的区域扩散。
在本发明的微生物培养片中，形成在基片上的框层的高度制作得比培养层的高度高100～1200μm，更优选高200～1000μm，尤其优选高300～800μm。如果低于100μm，就不能够在扩散后抑制被检液的扩散，有时发生泄漏。另一方面，如果超过1200μm，则在被检液接种时，会在培养层与盖板之间产生过度的空间部，因而难以确保与盖板的紧贴性，在培养中培养层容易干燥，或者，即使盖板与培养层暂且紧贴的情况下，在被检液被培养层吸水之后，由于过度的空间，盖板从培养层剥离，有可能引起培养层干燥。如果为上述范围，则能够一边使培养层对被检液进行吸水，一面使被检液扩散到整个面，并且能够更可靠地防止遗漏，也能够确保与盖板的紧贴性。
另外，上述框层形成在基片上。如果在培养层上形成框层，则在培养层由于被检液的吸水而膨润变为凝胶状时，框层有可能变形，因而优选将其直接形成在基片上。如果框层形成在基片上，则作业的操作性和稳定性优异。
在本发明的微生物培养片中，由于框层是由疏水性树脂形成的，框层既不吸水，也不溶解，能够防止被检液的遗漏。作为形成框层的疏水性树脂，并没有特别限定，能够适当使用UV固化树脂、热熔树脂、热发泡油墨或者UV发泡剂等，这些树脂可以被着色。
作为UV固化树脂，能够例示出：对于自由基型，可以例举丙烯酸酯类、不饱和聚酯类；对于阳离子型，可以例举环氧丙烯酸酯类、氧杂环丁烷类、乙烯基醚类等，但并不限定于这些。
另外，作为热熔树脂，能够适当使用软化点温度120℃以下、更优选100℃以下的树脂。如果超过120℃，则基片有可能卷曲。作为在本发明中能够适当使用的热熔树脂，可以列举出：聚氨酯类、聚酰胺类、聚烯烃类、聚酯类、乙烯醋酸乙烯酯类、苯乙烯丁二烯橡胶类或者聚氨酯橡胶类等合成橡胶类，但并不限定于这些。
作为疏水性树脂，能够适当使用热发泡油墨或者UV发泡剂等。例如，能够使用作为粘合剂的聚氨酯类树脂、聚酰胺类树脂、聚氯乙烯类树脂、聚丙烯酸酯类树脂、聚酯类树脂；氯化聚丙烯等聚烯烃类树脂以及使用了氯化橡胶或环化橡胶等橡胶类的油墨。这些油墨与其说仅是疏水性的，不如说是防水性更合适，根据这一点，在上述树脂中添加了聚硅氧烷类或者蜡类的油墨更优选。尤其是用于框层的疏水性树脂是疏水性、防水性的同时，还必须将涂膜的厚度变厚，在上述的树脂中添加现有公知的发泡剂等以作为发泡油墨使用是有效的。作为这种UV发泡油墨，能够例示出如下这样的紫外线固化型发泡油墨：在至少包括丙烯酸酯活性稀释剂或者甲基丙烯酸酯活性稀释剂等活性稀释剂；聚氨酯丙烯酸酯光聚合性低聚物、聚酯丙烯酸酯光聚合性低聚物、环氧丙烯酸酯光聚合性低聚物、丙烯酸类光聚合性低聚物、特殊光聚合性低聚物等光聚合性低聚物以及光聚合引发剂的紫外线固化型油墨中含有无机发泡剂、有机发泡剂、液体发泡剂等发泡剂而形成。
此外，在上述疏水性树脂中，作为添加剂，可以添加消泡剂、聚合抑制剂、颜料分散剂等。另外，可以在不足15质量％的范围内含有通常使用的着色颜料，而如果超过15质量％，则由于可能抑制发泡，因而往往不优选。
在本发明中，作为疏水性树脂，虽然上述全都能够适当使用，但UV固化树脂或者热熔树脂尤其适合。其理由是，框层的形成必须具有一定高度的图案形成，这2种树脂在非溶剂系统的状态下容易通过基于分配器(dispenser)等的涂布进行形状加工，然后，再通过光照射或者冷却容易使其固化，仅此即可图案形成。
另外，在本发明的微生物培养片中，可以将疏水性材料的中空品粘合在培养层的外周而形成框层。另外，也有使用压花加工品作为基片的方法。例如，如果在基片上形成了框层的形状为凸状的压花加工品，则可以在上述凸状的内侧形成培养层，另一方面，形成培养层的地方以凹部方式形成，由此以凸状方式形成的剩余部分能够用作框层。
另外，在使用厚的疏水性基材作为基片，并将形成培养层的部分削成凹状，进而将剩余部分作为框层的方法中，如果将凸状形成为框的形状，并在该凸状的内侧形成培养层，则能够将上述凸状用作框层。但是，并不限定于这些方法。
(6)粘着层
在本发明的微生物培养片中，能够在基片、盖板上形成粘着层。这样的粘着层以固定覆盖了培养层的盖板并防止培养层的水分蒸发或者污染为目的而配设，只要能够密封基片，可以使用任何种类的粘着剂。如果考虑到作业性，则优选以基片与盖板能够再粘合的程度具有弱的粘着力的粘着剂。例如，优选橡胶类粘着剂或丙烯酸类粘着剂，尤其优选使用再剥离型和微粘着型的丙烯酸类粘着剂。具体而言，能够使用通过以下方式得到的粘着剂：使含有羧基或者羟基、氨基等官能团的单体2～15质量份与丙烯酸丁酯、2-乙基己基丙烯酸酯等碳原子数为2～12的丙烯酸酯100质量份共聚，在所得到的聚合物中作为粘着赋予剂而添加松香、二甲苯树脂、苯酚树脂等，再利用三聚氰胺类、异氰酸酯类、环氧化合物等进行交联。另外，粘着层是任何形状都可以，优选以能够在基片与盖板的粘合部分没有间隙地粘合的方式配设。
粘着层的厚度没有特别限制，只要能够确保盖板可以覆盖形成于基片的培养层且与基片粘合的粘着性就可以。
在本发明中，如果能够用盖板密封培养层，则不限于粘着层，也可以是使用握持部件、或者配设镇石的方法等。
(7)方格印刷层
在本发明的微生物培养片上，可以层积有方格印刷层。从着色剂、树脂、溶剂等的选择范围广的方面考虑，方格印刷优选凹版印刷等。关于方格的大小，1cm见方左右是适当的。
如上所述，这种方格印刷层可以形成在基片或者盖板上，而在本发明中，在使用将纸基材层积于塑料薄片而得到的层积片作为上述基片的情况下，可以在这种纸基材上形成方格印刷层。
(8)微生物培养组件
在本发明中，能够组合上述微生物培养片与含有特定成分的被检液作为微生物培养组件。
如上所述，在本发明的微生物培养片中，形成在基片上的培养层是将含有凝胶化剂、营养成分、显色指示剂、选择剂和基质等至少一种和聚乙烯吡咯烷酮的培养液通过印刷或者涂布等进行图案形成而得的层，在这种情况下，能够由凝胶化剂、营养成分、显色指示剂、选择剂以及基质中向被检液添加上述培养层中不含有的成分进行培养。尤其是，在含有灭菌处理及其他工序中易于受到变质、变色、分解等的成分的情况下，是有效的。
作为能够用于这种微生物组件的微生物培养片，可以是在上述盖板上形成有特定成分层的微生物培养片。能够向被检液添加在特定成分层或者形成在基片上的培养层中不含有的成分进行培养。
(9)制造方法
(i)培养层的形成
在本发明的微生物培养片中，只要能够在上述基片上形成对含有选自由凝胶化剂、营养成分、显色指示剂、选择剂以及基质组成的组中的至少一种和聚乙烯吡咯烷酮的培养液进行图案形成而得的培养层，其制造方法不限。另外，只要是能够将上述培养液涂布为基片的预定形状的方法，则图案形成的方法没有特别限制，可以是上述印刷、涂布、涂工、喷雾等任意方法。优选，制备使聚乙烯吡咯烷酮的醇溶液含有选自由凝胶化剂、营养成分、显色指示剂、选择剂以及基质组成的组中的至少一种的培养液，在将该培养液图案形成在基片上之后，除去上述培养液中所含有的上述醇溶液，形成培养层。
在本发明的微生物培养片的制造方法中，从基片与培养层的紧贴性、图案形成的容易程度等理由来说，优选使用聚乙烯吡咯烷酮的醇溶液。作为醇，能够适当使用碳原子数1～5的醇。例如，能够使用甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇等1种或者2种以上的混合液。在这些醇中，优选甲醇、乙醇、异丙醇。现有技术，为了溶解营养成分而一直使用水或者甲苯等高沸点溶剂，但为了除去溶剂必须在高温下加热，这可能引起培养层中所含的成分或者基材的热分解。另外，在溶剂除去中必须使用过量的热能，进而成为成本上升的一个原因，而且，由于溶剂除去时间也变长，因而也成为生产效率下降的一个原因。在本发明中，使用聚乙烯吡咯烷酮，而作为其溶剂，使用低沸点的上述醇，从而能够避免培养液中所含有的成分或者基材的热变性，以及能够提高生产效率。此外，在不损害上述宗旨的范围内，也能够使用在醇中混合了三氯甲烷等副溶剂的溶剂。
之所以将聚乙烯吡咯烷酮作为培养液的必需成分，是因为通过如上所述地调整浓度，能够使选自由凝胶化剂、营养成分、显色指示剂、选择剂以及基质组成的组中的至少一种均匀地分散，而且，由于能够容易调整粘度，因而能够采用所得到的培养液进行图案形成。此外，由于聚乙烯吡咯烷酮具有优异的成膜性和与基材的紧贴性，因而能够在基片上形成培养层而不使用粘合剂，进而能够避免粘合剂对微生物生长发育的阻碍。
醇与聚乙烯吡咯烷酮的比例，相对于聚乙烯吡咯烷酮100质量份，溶剂为100～10000质量份，更优选为300～2000质量份，尤其优选为900～1400质量份。这是因为，如果超过10000质量份，则凝胶化剂等的分散性将显著下降，相反，如果低于100质量份，则培养液的粘度上升，对图案形成的适应性下降。
在本发明的微生物培养片中，如果构成培养液的凝胶化剂能够进行图案形成，则就没有必要将其溶解于上述聚乙烯吡咯烷酮的醇溶液中。因而，在本发明的微生物培养片的制造方法中，能够以粉末方式添加凝胶化剂。以粉末方式添加时的凝胶化剂的平均粒径为5～500μm，更优选为10～200μm。这是因为，如果平均粒径在上述范围内，则分散性优异。如果超过500μm，则分散性下降，有时图案形成适应性受到损害。但是，也可以将它们溶解于溶剂中，再混合到上述聚乙烯吡咯烷酮的醇溶液中，以作为培养液。
凝胶化剂在上述培养液中的混合量相对于聚乙烯吡咯烷酮100质量份为100～600质量份，更优选为250～400质量份。如果凝胶化剂的混合量在上述范围内，则由于被检液滴下时的水分而增粘或者凝胶化，进而能够形成有益于菌育成的粘度。如果低于100质量份，则有时培养层的粘度不足，另一方面，如果超过600质量份，则培养层就会变硬，有时菌的发育降低。
此外，由于聚乙烯吡咯烷酮的皮膜有时硬且脆，因而可以添加可塑剂。作为能够添加的可塑剂，能够例示出：醚酯衍生物类可塑剂、甘油或者甘油衍生物类可塑剂、丙二醇或者二醇衍生物类可塑剂、二醇醚衍生物类可塑剂、多羟基羧酸衍生物类可塑剂、苯二甲酸衍生物类可塑剂等，但并不限于这些。
在本发明的微生物培养片的制造方法中，使用上述培养液进行图案形成，尤其是，能够使用上述培养液，通过分配器涂布等适当地形成培养层。
如上所述，培养层可以是2层以上的多层。例如，只要是将在聚乙烯吡咯烷酮的醇溶液中分散有凝胶化剂和营养成分的粉末的培养液图案形成于基片，然后，通过图案形成来层积在聚乙烯吡咯烷酮的醇溶液中分散或溶解了显色指示剂的培养液，则能够形成进一步提高了菌落可识别性的培养层。此外，在本发明中，在培养层为由第1培养层与第2培养层构成的2层时，可以采用不同的方法进行图案形成。例如，用分配器涂布以对第1培养层进行图案形成，对于第2培养层的图案形成，可以使用喷雾等其他方法。
在本发明中，在将培养液图案形成在基片上之后，除去上述培养液中所含有的醇。已经清楚，通过使用在聚乙烯吡咯烷酮中混合有凝胶化剂等的培养层，则能够与琼脂培养基同样地对微生物菌落进行观察和计数，并且可识别性极其地优异。由于凝胶化剂是水溶性的，因而一般是在被制备为水溶液之后涂布在基材上，但是在除去水时必须进行高温且长时间的加热处理，并且由于在制备水溶液时粘度高，因而有时混入气泡等。根据本发明，由于使凝胶化剂等粉末分散在聚乙烯吡咯烷酮的醇溶液中，因而能够避免气泡的混入，由于没有使用水，因而能够在低温且短时间内进行干燥。另外，凝胶化剂等仅仅分散在聚乙烯吡咯烷酮的醇溶液中而尚未溶解，因而能够防止培养液的粘度上升，由此能够顺利地进行图案形成。而且，在所得到的培养层中，由于上述成分被聚乙烯吡咯烷酮覆盖，因而如果接种被检液，则聚乙烯吡咯烷酮立即进行溶解，上述成分进行溶解或吸水。因此，能够在被检液接种后，立即用盖板覆盖。另外，在聚乙烯吡咯烷酮溶解或者含有凝胶化剂的情况下，上述成分增粘而与盖板紧贴，因而能够防止干燥，同时还能够确保极其优异的可识别性。
在本发明的微生物培养片中，在盖板上形成特定成分层时，可以涂布在粘合剂溶液中含有选自由凝胶化剂、营养成分、显色指示剂、选择剂以及基质所组成的组中的1种以上的特定成分溶液，形成特定成分层。涂布方法可以是全面涂布，也可以是图案形成。在进行图案形成时，与培养层的形成同样，可以是印刷、涂布、涂工、喷雾等。
培养层的干燥只要能够除去培养液中所含有的上述醇即可，能够按照温度、压力等现有公知的方法进行干燥。
在本发明中，形成在基片上的培养层的厚度在干燥时为50～1000μm，更优选为200～600μm。另外，涂布量干燥时为5～400g/m2，更优选为100～300g/m2。在上述范围内，能够形成最适合于菌发育的粘度的培养层。
(ii)框层的形成
本发明的微生物培养片可以在基片的表面且培养层的外周形成框层。框层能够使用疏水性树脂来形成。此外，框层的制造方法没有特别限制。也能够使用预先形成有框层的基片。
作为形成有框层的基片，是表面至少具有疏水性树脂的基片，并可以列举通过对该疏水性树脂部分进行压花加工从而将凸部形成为框的形状。然后，如果在上述凸部的内侧形成培养层，则能够制造本发明的微生物培养片。另外，也能够将形成培养层的地方压花加工成凹状，将形成在凹部外周的凸部作为框层。
作为在基片上形成培养层之前形成框层的方法，例如，能够将疏水性树脂板打通为规定形状，再将其粘合在基片上，作为框层。另外，在使用厚的疏水性树脂板作为基片，将形成培养层的部分削成凹状，进而将剩余部分作为框层的方法中，如果将凸部形成为框的形状，在该凸部的内侧再形成培养层，则能够将上述凸部作为框层而使用。
另外，也可以使用上述的UV固化油墨、热熔油墨、热发泡油墨或者UV发泡剂等作为疏水性树脂，进行图案形成，形成框层。这些是无溶剂系统，能够通过分配器涂布等容易加工图案形成，也容易固化，因而尤其优选。
在使用上述UV固化油墨等作为疏水性树脂来形成框层的情况下，也可以将上述疏水性树脂溶解于适当的溶剂中，再通过印刷、涂布、涂工等进行图案形成。作为印刷方法，除了丝网印刷以外，还可以为凹版印刷、凸版印刷、转印印刷、柔版印刷以及其他等印刷方式。另外，能够使用利用刮棒等涂布为规定形状的刮棒涂布、刮刀涂布、模具涂布等涂工、分配器等涂布以及其他方法。
在疏水性树脂为UV固化油墨或者UV发泡油墨的情况下，在图案形成后，照射UV。作为紫外线(UV)照射条件，累积光量为50～2000mJ/cm2，更优选为100～1000mJ/cm2，能够并用紫外线照射灯的光与热。能够发泡的照射条件的范围根据发泡剂的种类不同而变化。在一次不能够确保规定的高度的情况下，可以通过多次的印刷来形成框层。作为紫外线照射灯，能够使用金属卤化物灯、水银灯等。
在形成了培养层之后形成框层时，能够使用上述的UV固化油墨、热熔油墨、热发泡油墨或者UV发泡剂等，通过图案形成来形成框层。此时，在培养层中含有因UV照射而变质的成分时，优选，在UV照射时，用金属等覆盖培养层。
另外，可以将疏水性树脂板打通为规定形状，并将其粘合在形成有培养层的基片的在上述培养层外周的基片上，形成框层。
在本发明中，框层的形成与上述培养层的形成首先进行哪一个都可以，而如果首先进行培养层的形成，则由于通过图案形成而制备的培养层是薄层，因而在其后能够容易形成框层。另一方面，如果首先形成框层，则利用分配器等能够容易地在框层内对培养液进行图案形成，以制备培养层。
在基片上形成框层时，优选，在培养层的外周与培养层紧贴地形成，在框层与培养层之间不形成间隙。在框层与培养层之间具有间隙时，在将被检液接种到培养层的情况下，被检液会存留在上述间隙内，有时被检液很难均匀扩散。要不形成间隙地形成框层与培养层，简便的方法是预先形成框层，并在框层内对上述培养液进行图案形成。作为图案形成方法，能够适当进行基于分配器的涂布。现有技术由于难以不形成间隙地形成框层与培养层，因而可以推测出，即使在形成框层的情况下，也是在培养层的上面形成了框层。根据本发明，通过使用在聚乙烯吡咯烷酮的醇溶液中含有选自由凝胶化剂、营养成分、显色指示剂、选择剂以及基质组成的组中的至少一种的培养液，能够进行图案形成，并且在框层的内部，能够不形成间隙地图案形成培养层，因而被检液能够均匀地扩散，进而能够制造性能高的微生物培养片。
(iii)盖板的固定设置
由于本发明的微生物培养片是在将被检液接种到培养层之后用盖板覆盖培养层，对其进行培养，因而盖板的一部分被固定设置于基片在操作上是简便的。但是，在直接压印(stamp)、擦拭试验等时、通过没有盖板来提高作业效率时，可以取下盖板。
在盖板和基片由同一部件构成的情况下，可以通过热封或者层压粘合以及其他方法来将另行制作的盖板固定设置在基片上，而在盖板和基片上可以使用相同材质的材料，如图9(a)的展开图、图9(b)的截面图所示，基片(10)与盖板(40)保持着连结设置而在基片(10)上形成框层(20)与培养层(30)，再将盖板(40)折弯而形成微生物培养片。图9(c)示出其截面图。根据该方法，即使在盖板上形成特定成分层(30’)或者粘着层(50)的情况下，由于基片(10)与盖板(40)被连结设置，因而也能够在与基片(10)上的培养层(30)相对的位置上准确且简便地形成特定成分层(30’)。
另外，如图10和图11的横截面图所示，可以由不同部件构成盖板(40)与基片(10)，用双面胶带(60)等粘贴盖板(40)与形成有培养层(30)的基片(10)。
图12和图13示出在盖板(40)上形成有方格印刷，盖板(40)与形成有培养层(30)的基片(10)在端部粘合的本发明的微生物培养片的外观立体图。在图13中，在培养层(30)的周围形成有框层(20)。
本发明的微生物培养片实施伽玛射线照射或者环氧乙烷气体灭菌等灭菌，得到为本发明的微生物培养片的产品。本发明的微生物培养片能够根据所含有的微生物营养成分的种类、所使用的基片、盖板的通气性以及其他因素，进行各种微生物的培养。
实施例
接下来，列举实施例来具体地说明本发明，而这些实施例并不对本发明作任何限制。
制造例1
在130g的甲醇中溶解20g的聚乙烯吡咯烷酮(日本触媒公司生产，商品名“聚乙烯吡咯烷酮K-90”)，并在其中分散60g的瓜尔豆胶粉末(三晶公司生产，商品名“Neovisco G”，200目型)，作为营养成分还混合20.16g的胰蛋白胨(Becton，Dickinson and Company公司生产，商品名“BACTTRYPTONE”)、2.58g的酵母提取物(Becton，Dickinson and Company公司生产，商品名“YEAST EXTRACT”)以及1.03g的葡萄糖(和光纯药公司生产，商品名“D-(+)-GLUCOSE”)而制备培养液，将该培养液在聚对苯二甲酸乙二酯膜(帝人杜邦公司生产，商品名“帝人蒂托纶膜(teijintetoron film)”)上的必要部分进行图案形成之后，在50℃下干燥15分钟，形成了培养层。干燥时的培养层的厚度为大约250μm。然后，使用分配器，将UV固化油墨(日本十条化工公司生产，商品名“Ray Cure GA 4100-2”)涂布为宽度1.0mm、高度750μm、直径52mm的圆状之后，使用水银灯照射了累积光量250mJ/cm2的紫外线，使其固化，进而在培养层的周围用疏水性树脂形成了框层。
然后，将盖板(日本Tohcello公司生产，OPP膜，型号“OP U-1(单面电晕放电处理)”，厚度：40μm)层积在上述聚对苯二甲酸乙二酯膜上，在粘合端部之后，用γ线灭菌，得到了本发明的微生物培养片。
(实施例1)
将E.coli(ATCC 25922)用液体培养基(TRYPTIC SOY BROTH)在37℃振荡培养了24小时。然后，用灭菌生理食盐水将所得到的被检液稀释成菌数为102/ml，添加TTC，制备了培养试验用被检液。用已灭菌过的移液管将1ml该培养试验用被检液接种到通过制造例1的方法制造的微生物培养片的培养层上，再将盖板放到其上面，使被检液扩散到整个培养层。然后，静置约1分钟，形成凝胶，得到了实施例1的培养试验用试样。培养试验用试样制备了5个。
(实施例2)
除使用K.pneumoniae(ATCC 13883)代替E.coli作为菌株来制备培养试验用被检液以外，采用与实施例1同样的方法，得到了实施例2的培养试验用试样。
(实施例3)
除使用E.cloacae(ATCC 13536)代替E.coli作为菌株来制备培养试验用被检液以外，采用与实施例1同样的方法，得到了实施例3的培养试验用试样。
(实施例4)
除使用C.freundii(JCM 1657)代替E.coli作为菌株来制备了培养试验用被检液以外，采用与实施例1同样的方法，得到了实施例4的培养试验用试样。
(实施例5)
除使用S.aureus(ATCC 25923)代替E.coli作为菌株来制备培养试验用被检液以外，采用与实施例1同样的方法，得到了实施例5的培养试验用试样。
(比较例1)
将实施例1的培养试验用被检液1ml添加到皮氏培养皿中，与利用现有稀释法准备的标准琼脂培养基20ml混释，得到了比较例1的培养试验用试样。
(比较例2)
除使用实施例2的培养试验用被检液以外，采用与比较例1同样的方法，得到了比较例2的培养试验用试样。
(比较例3)
除使用实施例3的培养试验用被检液以外，采用与比较例1同样的方法，得到了比较例3的培养试验用试样。
(比较例4)
除使用实施例4的培养试验用被检液以外，采用与比较例1同样的方法，得到了比较例4的培养试验用试样。
(比较例5)
除使用实施例5的培养试验用被检液以外，采用与比较例1同样的方法，得到了比较例5的培养试验用试样。
[培养试验]
将实施例1～5和比较例1～5的培养试验用试样放入孵卵器中，在37℃下培养了48小时。然后，分别测量了培养后产生的菌落数。另外，在图14示出使用了本发明的微生物培养片的实施例1的培养试验用试样的菌落生长状态。
比较了实施例1～5的培养试验用试样和比较例1～5的培养试验用试样的菌落数，结果为，不论在培养了E.coli、K.pneumoniae、E.cloacae、C.freundii、S.aureus哪一种菌的情况下，两者的相互关联都极其良好。另外，观察了使用本发明的微生物培养片的实施例1的培养试验用试样的菌落生长状态，结果为可识别性优异(图14)。可以认为，根据本发明的微生物培养片，通过增粘的凝胶化剂和聚乙烯吡咯烷酮，盖板与培养层紧贴，因而得到了这样的结果。
[制造例2]
在聚对苯二甲酸乙二酯膜(帝人杜邦公司生产，商品名“帝人蒂托纶膜”)上，使用分配器将热可塑性树脂(日本小西公司生产，商品名“MP93”)涂布为宽度1.0mm、高度750μm、直径52mm的圆状，形成了框层。
然后，在210ml的甲醇中溶解20g的聚乙烯吡咯烷酮(日本触媒社生产，商品名“聚乙烯吡咯烷酮K-90”)，并在其中分散60g的瓜尔豆胶粉末(三晶公司生产，商品名“NEOVISCO G”，400目型)，作为营养成分还混合20.16g的胰蛋白胨(Becton，Dickinson and Company公司生产，商品名“BACT TRYPTONE”)、2.58g的酵母提取物(Becton，Dickinson andCompany公司生产，商品名“YEAST EXTRACT”)以及1.03g的葡萄糖(和光纯药公司生产，商品名“D-(+)-GLUCOSE”)，制备了培养液。
使用分配器将该含有营养成分、凝胶化剂的培养液涂布在形成于基材上的框层的框内，然后，在50℃下干燥15分钟，形成了培养层。干燥时的层的厚度为大约250μm。
然后，将进行了方格印刷的盖板(日本Tohcello公司生产，OPP膜，型号“OP U-1(单面电晕放电处理)”，厚度：40μm)层积在上述聚对苯二甲酸乙二酯膜上，在粘合了端部之后，用γ线灭菌，得到了本发明的微生物培养片。此外，所得到的框层的高度为750μm(与培养层的高度之差：+500μm)，宽度为1mm。
[制造例3]
除了形成了高度600μm的框层以外，采用与制造例2同样的方法，得到了本发明的微生物培养片。与培养层的高度之差为+350μm。
[制造例4]
除了形成了高度950μm的框层以外，采用与制造例2同样的方法，得到了本发明的微生物培养片。与培养层的高度之差为+700μm。
(实施例6)
将E.coli(ATCC 25922)用液体培养基(TRYPTIC SOY BROTH)在37℃振荡培养了24小时。然后，用灭菌生理食盐水将所得到的被检液稀释成菌数为102/ml，再添加TTC，制备了培养试验用被检液。用已灭菌过的移液管将1ml该培养试验用被检液接种到通过制造例2的方法制造的微生物培养片的培养层上，再将盖板放到其上面，使被检液扩散到了框层内的整个培养层。然后，静置大约1分钟，形成凝胶，得到了实施例6的培养试验用试样。培养试验用试样制备了5个。
(实施例7)
除使用K.pneumoniae(ATCC 13883)代替E.coli作为菌株来制备培养试验用被检液以外，采用与实施例6同样的方法，得到了实施例7的培养试验用试样。
(实施例8)
除使用E.cloacae(ATCC 13536)代替E.coli作为菌株来制备培养试验用被检液以外，采用与实施例6同样的方法，得到了实施例8的培养试验用试样。
(实施例9)
除使用C.freundii(JCM 1657)代替E.coli作为菌株来制备培养试验用被检液以外，采用与实施例6同样的方法，得到了实施例9的培养试验用试样。
(实施例10)
除使用S.aureus(ATCC 25923)代替E.coli作为菌株来制备培养试验用被检液以外，采用与实施例6同样的方法，得到了实施例10的培养试验用试样。
(比较例6)
将在实施例6中制备的培养试验用被检液1ml添加到皮氏培养皿中，并与现有稀释法准备的标准琼脂培养基20ml混释，得到了比较例6的培养试验用试样。
(比较例7)
除使用在实施例7中制备的培养试验用被检液以外，采用与比较例6同样的方法，得到了比较例7的培养试验用试样。
(比较例8)
除使用在实施例8中制备的培养试验用被检液以外，采用与比较例6同样的方法，得到了比较例8的培养试验用试样。
(比较例9)
除使用在实施例9中制备的培养试验用被检液以外，采用与比较例6同样的方法，得到了比较例9的培养试验用试样。
(比较例10)
除使用在实施例10中制备的培养试验用被检液以外，采用与比较例6同样的方法，得到了比较例10的培养试验用试样。
(实施例11)
除使用通过制造例3的方法制造的微生物培养片以外，采用与比较例6同样的方法，得到了实施例11的培养试验用试样。
(实施例12)
除使用通过制造例4的方法制造的微生物培养片以外，采用与比较例6同样的方法，得到了实施例12的培养试验用试样。
[培养试验]
将实施例6～12和比较例6～10的培养试验用试样放入到孵卵器中，在37℃下培养了48小时。然后，分别测量了培养后所生成的菌落数。将其结果示出在表1中。另外，在图15中示出使用了本发明的微生物培养片的实施例6的培养试验用试样的菌落生长状态。
表1
Figure BDA0000129040750000341
比较了实施例6～10的培养试验用试样和比较例6～10的培养试验用试样的菌落数，结果为，不论在培养了E.coli、K.pneumoniae、E.cloacae、C.freundii、S.aureus哪一种菌的情况下，两者的相互关联都极其地良好(表1)。在改变了框层的高度的实施例11中，平均菌落数为97，另外，在实施例12中，平均菌落数为93，确认了如果框层的高度为规定的范围内，则将发挥同等的培养性能。另外，观察了使用本发明的微生物培养片的实施例6的培养试验用试样的菌落生长状态，结果为可识别性优异(图15)。
产业上的利用可能性
本发明的微生物培养片能够用于菌数检查等，操作性和可识别性都优异，是有用的。
符号说明
10基片
20框层
30培养层
30’特定成分层
40盖板
50粘着层
60双面胶带

Claims (11)

1.一种微生物培养片，具有基片、形成在所述基片上的培养层以及覆盖所述培养层的盖板，其中，
所述培养层是对含有选自由凝胶化剂、营养成分、显色指示剂、选择剂以及基质组成的组中的至少一种的和聚乙烯吡咯烷酮的培养液进行图案形成而得到的层。
2.根据权利要求1所述的微生物培养片，其特征在于，所述培养液含有聚乙烯吡咯烷酮和凝胶化剂。
3.根据权利要求2所述的微生物培养片，其特征在于，所述凝胶化剂是高分子多糖类。
4.根据权利要求2或3所述的微生物培养片，其特征在于，所述凝胶化剂在所述培养液中的含量相对于所述聚乙烯吡咯烷酮100质量份为100～600质量份。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的微生物培养片，其特征在于，在所述培养层的外周形成有包含疏水性树脂的框层。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的微生物培养片，其特征在于，所述基片和/或所述盖板包含透明塑料片。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的微生物培养片，其特征在于，所述盖板被固定设置于所述基片。
8.一种微生物培养片的制造方法，所述微生物培养片具有基片、形成在所述基片上的培养层以及覆盖所述培养层的盖板，其中，
所述制造方法包括将在聚乙烯吡咯烷酮的醇溶液中含有选自由凝胶化剂、营养成分、显色指示剂、选择剂以及基质组成的组中的至少一种的培养液图案形成在所述基片上之后，除去所述培养液中含有的所述醇，从而形成所述培养层的培养层形成工序。
9.根据权利要求8所述的微生物培养片的制造方法，其特征在于，在所述培养层形成工序后，实施通过疏水性树脂进行图案形成而形成包围所述培养层的外周的凸状的框层的框层形成工序。
10.根据权利要求8所述的微生物培养片的制造方法，其特征在于，在所述培养层形成工序前，实施通过疏水性树脂的图案形成而预先形成在形成了所述培养层时包围所述培养层的外周的凸状的框层的框层形成工序。
11.一种微生物培养片的制造方法，所述微生物培养片具有基片、形成在所述基片上的培养层以及覆盖所述培养层的盖板，其中，
所述基片预先形成有在形成有所述培养层时包围所述培养层的外周的凸状的包含疏水性树脂的框层，
在所述框层的内侧，对在聚乙烯吡咯烷酮的醇溶液中含有选自由凝胶化剂、营养成分、显色指示剂、选择剂以及基质组成的组中的至少一种的培养液进行图案形成，然后除去所述培养液中含有的所述醇，从而形成所述培养层。
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