JP2021159052A - 微生物培養シート - Google Patents

Abstract

【課題】本発明の課題は、様々な種類の好気性微生物の培養に適した微生物培養シートを提供することである。【解決手段】本発明は、基材シートと、前記基材シートの上に形成された培養層と、前記培養層を被覆するカバーシートと、を備え、前記カバーシートの、ＪＩＳ Ｋ ７１２６ Ｂ法に準拠した、２３℃、９０％ＲＨにおける酸素透過度は１００００ｃｃ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ以上５００００ｃｃ／ｍ２・ｄａｙ・ａｔｍ以下であり、好気性微生物の培養のために用いられる、微生物培養シートを提供する。【選択図】図１

Description

本発明は、微生物培養シートに関する。

微生物検査において微生物の存在を確認できる手段として、基材シート上に乾燥培地を設けた微生物培養シートが知られる。

簡便な微生物検査を実現できる微生物培養シートが各種開発されており、例えば特許文献１には、基材シートと、該基材シートの上に形成された所定の成分を含む培養層と、該培養層を被覆するカバーシートと、を有する微生物培養シートが提案されている。

国際公開第２０１１／００７８０２号公報

しかし、より効率的に様々な種類の微生物を培養でき、微生物コロニーの発生状態を検出しやすい微生物培養シートに対するニーズがある。

本発明は以上の実情に鑑みてなされたものであり、様々な種類の好気性微生物の培養に適した微生物培養シートを提供することを目的とする。

本発明者らは、基材シートと、該基材シートの上に形成された培養層と、該培養層を被覆するカバーシートと、を有する微生物培養シートにおいて、カバーシートの酸素透過度を所定の範囲に調整することで上記課題を解決できる点を見出し、本発明を完成するに至った。より具体的には、本発明は以下を提供する。

（１） 基材シートと、
該基材シートの上に形成された培養層と、
該培養層を被覆するカバーシートと、を備え、
該カバーシートの、ＪＩＳ Ｋ ７１２６ Ｂ法に準拠した、２３℃、９０％ＲＨにおける酸素透過度は１００００ｃｃ／ｍ^２・ｄａｙ・ａｔｍ以上５００００ｃｃ／ｍ^２・ｄａｙ・ａｔｍ以下であり、
好気性微生物の培養のために用いられる、
微生物培養シート。

（２） 前記カバーシートはポリメチルペンテンを含む、（１）に記載の微生物培養シート。

（３） 前記カバーシートの厚さは１００μｍ以下である、（１）又は（２）に記載の微生物培養シート。

（４） 前記好気性微生物は真菌である、（１）から（３）のいずれかに記載の微生物培養シート。

（５） 前記培養層の外周に、疎水性樹脂からなる枠層が形成されている、（１）から（４）のいずれかに記載の微生物培養シート。

本発明によれば、様々な種類の好気性微生物の培養に適した微生物培養シートが提供される。

本発明に係る微生物培養シートの一例を示す図である。 本発明に係る微生物培養シートの一例を示す図である。 本発明に係る微生物培養シートの一例を示す図である。 本発明に係る微生物培養シートの一例を示す図である。 本発明に係る微生物培養シートの一例を示す図である。 本発明に係る微生物培養シートの一例を示す図である。 本発明に係る微生物培養シートの一例を示す図である。 本発明に係る微生物培養シートの一例を示す図である。 本発明に係る微生物培養シートの一例を示す図である。 本発明に係る微生物培養シートの一例を示す図である。 本発明に係る微生物培養シートの一例を示す図である。 本発明に係る微生物培養シートの一例を示す外観斜視図である。 本発明に係る微生物培養シートの一例を示す外観斜視図である。 実施例に係る微生物培養シートにおけるコロニーの発生状態を示す図である。 実施例に係る微生物培養シートにおけるコロニーの発生状態を示す図である。

以下、本発明の具体的な実施形態について詳細に説明するが、本発明は、以下の実施形態に何ら限定されるものではなく、本発明の目的の範囲内において適宜変更を加えて実施することができる。

＜微生物培養シート＞
本発明の微生物培養シートは、基材シートと、該基材シートの上に形成された培養層と、該培養層を被覆するカバーシートと、を備え、該カバーシートの、ＪＩＳ Ｋ ７１２６ Ｂ法に準拠した、２３℃、９０％ＲＨにおける酸素透過度は１００００ｃｃ／ｍ^２・ｄａｙ・ａｔｍ以上５００００ｃｃ／ｍ^２・ｄａｙ・ａｔｍ以下であり、好気性微生物の培養のために用いられるものである。

（微生物培養シートの構成例）
以下、適宜図面を参照し、本発明の微生物培養シートの構成例を説明する。

本発明の微生物培養シートの代表的な態様の一例を図１（ａ）、（ｂ）に示す。図１（ａ）は平面図であり、図１（ｂ）は図１（ａ）のＡ−Ａ’断面図である。
図１は、方形の基材シート（１０）の略中央に培養層（３０）が形成され、かつ上記培養層（３０）を被覆するように、方形のカバーシート（４０）が設けられている態様を示す。

図２（ａ）の断面図に示すように、基材シート（１０）は、基材シート（１１）と、基材シート（１３）との２層からなる多層シートであってもよく、さらに、プラスチック以外の他の層を積層する多層シートであってもよい。また、図２（ｂ）に示すように、培養層（３０）が２層以上の多層で構成されていてもよい。

培養層（３０）の形状は特に限定されず、図１に示すように円形であってもよく、正方形、長方形、その他の多角形、不定形等であってもよい。

本発明の微生物培養シートは、図３（ａ）の展開図に示すように、基材シート（１０）とカバーシート（４０）との双方に、培養層（３０）と、バインダー成分及び栄養成分その他の成分を含有する特定成分層（３０’）と、がそれぞれ形成されていてもよい。
例えば、培養層（３０）と、上記特定成分層（３０’）との双方にゲル化剤が含まれている場合には、基材シートの上の培養層（３０）と、カバーシート（４０）に設けられた特定成分層（３０’）とが対向して配設されるため、例えば、基材シート（１０）の上の培養層（３０）に被検液を接種した後に、カバーシート（４０）で培養層（３０）を被覆すると、上記被検液が培養層（３０）と特定成分層（３０’）とに吸水され、培養層（３０）と特定成分層（３０’）との双方で微生物を観察することができる。
また、指示薬の種類によっては、培養層（３０）に含有させると滅菌処理時に着色が目立つものもあり、その場合には、上記指示薬を特定成分層（３０’）に含有させることで、滅菌処理時の着色を防止することができる。
なお、図３（ｂ）は、特定成分層（３０’）を備える微生物培養シートの横断面図である。

本発明の微生物培養シートは、図４（ａ）の平面図及び図４（ｂ）のＡ−Ａ’線断面図に示すように、基材シート（１０）の略中央に培養層（３０）が形成され、上記培養層の外周に円形の枠層（２０）が形成されたものであってもよい。
枠層（２０）によれば、培養層（３０）に接種した被検液が拡がる範囲を限定しやすくなり、微生物培養シートからの被検液の漏れを防ぐことができる。さらには、枠層（２０）によれば、培養層（３０）に接種した被検液を所定範囲内にまんべんなく拡げやすくなる。枠層（２０）の形状は特に限定されず、図４に示すように円形であってもよく、方形、楕円形、多角形、不定形等いずれであってもよい。

図４に示す態様において、図５に示すように、さらにカバーシート（４０）に、基材シート（１０）の上の培養層（３０）と対向するように特定成分層（３０’）が形成されていてもよい。

図６に示すように、上記枠層（２０）と対向するように、カバーシート（４０）に粘着層（５０）が形成されていてもよい。枠層（２０）と粘着層（５０）とが密着することで、培養層（３０）の乾燥や汚染をより効果的に防止することができる。

基材シート（１０）及び培養層（３０）は、それぞれ単層であってもよく、多層であってもよい。
例えば、図７の（ａ）の断面図に示すように、疎水性樹脂からなる枠層（２０）が基材シート（１０）の表面に形成されている場合、基材シート（１０）は、基材シート（１１）と、基材シート（１３）との２層からなる多層シートであってもよいし、プラスチック以外の他の層を積層する多層シートであってもよい。
図７（ｂ）の断面図に示すように、疎水性樹脂からなる枠層（２０）が基材シート（１０）の表面に形成されている場合、培養層（３０）は２層以上の多層で構成されていてもよい。

培養層（３０）は、基材シート（１０）の上に複数存在してもよい。
例えば、図８（ａ）及び（ｂ）は、複数の培養層（３０）と、それらの外周を囲む凸形状の疎水性樹脂からなる枠層（２０）と、上記培養層（３０）を被覆するカバーシート（４０）とが基材シート（１０）の端部で固設された態様を示す。図８（ａ）は平面図であり、図８（ｂ）は、図８（ａ）のＡ−Ａ’断面図である。
図８において、カバーシート（４０）が培養層（３０）を被覆し、かつ枠層（２０）の上部に密着することができるように、２つの角部（Ｃ１，Ｃ２）が形成されている。
なお、この態様において、上記基材シート（１０）上に形成された培養層（３０）と対向するように、カバーシート（４０）に特定成分層（３０’）が形成されていてもよい。

基材シートと、後述するカバーシートとが同一の材料からなる場合、図９（ａ）の展開図、図９（ｂ）の断面図に示すように、基材シート（１０）とカバーシート（４０）とを連設したまま基材シート（１０）に、培養層（３０）及び任意に枠層（２０）を形成し、カバーシート（４０）を折り曲げて微生物培養シートを形成してもよい。図９（ｃ）に折り曲げた状態の断面図を示す。この方法によれば、カバーシートに特定成分層（３０’）や粘着層（５０）を形成する場合でも、基材シート（１０）とカバーシート（４０）が連設されているため、基材シート（１０）の上の培養層（３０）と対向する位置に正確かつ簡便に特定成分層（３０’）を形成することができる。

また、図１０及び図１１の横断面図に示すように、カバーシート（４０）と基材シート（１０）とを異なる部材で構成し、カバーシート（４０）と、培養層（３０）を形成した基材シート（１０）とを、両面接着テープ（６０）等で貼り合わせてもよい。

図１２及び図１３に、カバーシート（４０）に格子印刷が形成され、カバーシート（４０）と培養層（３０）を形成した基材シート（１０）とが端部で接着された微生物培養シートの外観斜視図を示す。図１３では、培養層（３０）の周囲に枠層（２０）が形成されている。

本発明の微生物培養シートは、本発明の目的を阻害しない範囲で、把持部等の任意の構成を備えていてもよい。

（基材シート）
本発明の微生物培養シートにおける基材シートは、微生物の培養において用いられる任意の形状、大きさ、材質等であるものを採用できる。基材シートは、耐溶媒性、印刷適性、耐水性、培養層を形成する際の乾燥処理に耐える耐熱性等を有することが好ましい。

基材シートは、単層でもよく、２層以上の積層シートであってもよい。

基材シートは、後述するカバーシートと同一の材料であってもよく、異なる材料であってもよい。

基材シートが単層である場合、プラスチックシート（例えば、ポリメチルペンテン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル等のシート）、紙基材等を好適に使用することができる。

プラスチックシートは、通常、透明性を有するため、基材シートからの透過光によって微生物コロニーを容易に観察することができ、コロニーの発生状態について視認性が向上する。ただし、基材シートが不透明である態様（発泡により白色を呈するもの、着色されたもの等）は排除されない。基材シートの透明度は、培養菌の計数のしやすさ等に応じて、適宜選択することができる。

紙基材としては、合成樹脂を主原料とした合成紙等が挙げられる。このような合成紙として、ユポ・コーポレーション製、商品名「ユポ」や東洋紡製、「クリスパー」等を例示することができる。

基材シートが積層シートである場合、上記プラスチックシートや紙基材のうち２種以上を積層したものを好適に使用することができる。例えば、上記プラスチックシートに紙基材を積層した積層シートや、紙基材に合成樹脂をコーティングした積層シート等を好適に使用することができる。より具体的には、例えば、ポリエチレンフィルムと紙基材との積層シートを例示することができる。

基材シートは、培養層との密着性を向上させるため、培養層を設ける面に、表面処理を行ってもよい。このような表面処理としては、アンカーコート剤等の塗布、コロナ放電処理、オゾン処理、低温プラズマ処理（酸素ガス又は窒素ガス等を用いたプラズマ処理）、グロー放電処理、酸化処理（化学薬品等を用いた酸化処理）等が挙げられる。

アンカーコート剤としては、イソシアネート系（ウレタン系）、ポリエチレンイミン系、ポリブタジエン系、有機チタン系等が挙げられる。例えば、芳香族ポリイソシアナート（トリレンジイソシアナート、ジフェニルメタンジイソシアナート、ポリメチレンポリフェニレンポリイソシアナート等）、多官能イソシアナート（ヘキサメチレンジイソシアナート、キシリレンジイソシアナート等の脂肪族ポリイソシアナート等）、ヒドロキシル基含有化合物（ポリエーテル系ポリオール、ポリエステル系ポリオール、ポリアクリレートポリオール等）との反応によって得られるポリエーテルポリウレタン系樹脂、ポリエステル系ポリウレタン系樹脂、ポリアクリレートポリウレタン系樹脂を主成分とするもの等が挙げられる。

基材シートは、カール等がなく平坦であることが好ましく、その厚さは、特に限定されないが、通常、２５μｍ以上１５００μｍ以下、好ましくは５０μｍ以上５００μｍ以下である。

基材シートには、枡目印刷柄等が印刷されていてもよい。

（培養層）
培養層の形状、組成等は特に限定されず、培養対象である微生物の種類等に応じて適宜設定できる。

培養層は、通常、培地液（培地水溶液等）を、基材シートの上に任意の方法で塗布及び乾燥等することで得られる。被検液を培養層に滴下後、速やかにカバーシートを被覆することで、被検液が自然に一定範囲に拡げることができ、良好な操作性を実現できる。

培地液を基材シートに塗布する方法は特に限定されず、例えば、印刷（スクリーン印刷、グラビア印刷、凸版印刷、転写印刷、フレキソ印刷等）による塗布、ディスペンサー及びインクジェット等を用いた塗布、バー、バーコート、ナイフコート、及びダイコート等を用いたコーティング、並びに、スプレー方式等による噴霧等が挙げられる。

培地液を乾燥する方法は特に限定されず、溶媒を除去できればよく、温度や圧力の調整等、従来公知の方法に準じて乾燥することができる。

培養層は、単層でもよく、２層以上の多層であってもよい。

培養層の形状は特に限定されないが、好ましくは円である。円の直径は、好ましくは２０ｍｍ以上８０ｍｍ以下、より好ましくは３０ｍｍ以上７０ｍｍ以下である。微生物培養シートに滴下する被検液は一般に１ｍｌであり、上記範囲であれば、充分に被検液を吸水することができる。

培養層の厚さ（基材シートの表面からの高さ）は、乾燥時５０μｍ以上１０００μｍ以下、より好ましくは２００μｍ以上６００μｍ以下である。また、塗布量は、乾燥時５ｇ／ｍ^２以上４００ｇ／ｍ^２以下、より好ましくは１００ｇ／ｍ^２以上３００ｇ／ｍ^２以下である。上記範囲に調整すると、菌の発育に最適な培養層を得られやすい。

培地液の溶媒は特に限定されないが、乾燥によって除去されるものが好ましい。例えば、水、アルコール（エタノール等）が挙げられる。

培養層を構成する培地液の組成は特に限定されないが、例えば、ポリビニルピロリドンと、ゲル化剤、栄養成分、発色指示薬、選択剤及び基質からなる群から選択される少なくとも１種と、を含む。

［ポリビニルピロリドン］
ポリビニルピロリドンは、培地液の粘度調整を可能にする成分であり、固着剤としての機能も有する。

［ゲル化剤］
ゲル化剤は、被検液を接種すると増粘若しくはゲル化するため、菌の育成に良好な粘度となる。また、増粘後にはカバーシートに密着し得るため、培養時の培養層の乾燥を抑制することができる。

ゲル化剤としては、高分子多糖類を好適に使用することができ、カラギーナン、グアーガム、キタンサンガム、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ローカストビーンガム、アルギン等を例示することができる。これらの高分子多糖類によれば、被検液の滴下によって水で増粘又はゲル化するため、菌の発育が良好となり、また、透明性が高いためコロニーの視認性に優れ、さらに、増粘によりカバーシートに密着するため、培養時の乾燥を抑制することが可能となる。

［栄養成分］
栄養成分は、微生物の成育を可能にする成分であり、公知の成分（ペプトン、糖類、エキス類、無機塩類等）を組み合わせて用いることができる。使用する栄養成分は、微生物の種類等に応じてその種類、量、組み合わせ等を適宜設定できる。

栄養成分としては、例えば、一般生菌検査用であれば、酵母エキス・ペプトン・ブドウ糖混合物、肉エキス・ペプトン混合物、ペプトン・大豆ペプトン・ブドウ糖混合物等や、これらにリン酸二カリウム及び／又は塩化ナトリウムを加えた混合物が用いられる。
大腸菌・大腸菌群検査用であれば、デソキシコール酸ナトリウム・ペプトン・クエン酸鉄アンモニウム・塩化ナトリウム・リン酸二カリウム・乳糖・ペプトン・乳糖・リン酸二カリウム等が用いられる。
ブドウ球菌用であれば、肉エキス・ペプトン・塩化ナトリウム・マンニット・卵黄混合物、ペプトン・肉エキス・酵母エキス・ピルビン酸ナトリウム・グリシン・塩化リチウム・亜テルル酸卵黄液混合物等が用いられる。
ビブリオ用であれば、酵母エキス・ペプトン・蔗糖・チオ硫酸ナトリウム・クエン酸ナトリウム・コール酸ナトリウム・クエン酸第２鉄・塩化ナトリウム・牛胆汁等が用いられる。
腸球菌用であれば、牛脳エキス・ハートエキス・ペプトン・ブドウ糖・リン酸二カリウム・窒化ナトリウム等が用いられる。
真菌用であれば、ペプトン・ブドウ糖混合物、酵母エキス・ブドウ糖混合物、ポテトエキス・ブドウ糖混合物等が用いられる。

［発色指示薬、選択剤、基質等他の成分］
本発明の微生物培養シートでは、培地液に発色指示薬、選択剤、基質等他の成分が含有されていてもよい。

発色指示薬は、培養過程で発育する微生物の代謝により産出される特異物質との反応、ｐＨ変化の認識、酵素との反応等によって発色してコロニーを着色するため、コロニー数の計数を極めて容易にする効果がある。
このような発色指示薬としては、具体的には、テトラゾリウム塩（トリフェニルテトラゾリウムクロライド（以下ＴＴＣと表示）、ｐ−トリルテトラゾリウムレッド、テトラゾリウムバイオレット、ペテトリルテトラゾリウムブルー等）、ｐＨ指示薬（ニュートラルレッド混合物、フェノールレッド、ブロムチモールブルー、チモールブルー混合物等）、発色酵素基質（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ―Ｄ−グルコピラノシド、リン酸５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル等）等が挙げられる。

培地液には、検出目的以外の微生物の生育を抑える選択剤が含有されていてもよい。このような選択剤としては、抗生物質、合成抗菌剤等の抗生剤、色素、界面活性剤、無機塩等が用いられる。
抗生物質としては、メチシリン、セフタメタゾール、セフィキシム、セフタジジム、セフスロジン、バシトラシン、ポリミキシンＢ、リファンピシン、ノボビオシン、コリスチン、リンコマイシン、ゲンタマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ストレプトマイシン等を例示することができる。
合成抗菌剤としては、サルファ剤、ナリジクス酸、オラキンドックス等を例示することができる。
色素としては、静菌又は殺菌作用のあるクリスタルバイオレット、ブリリアントグリーン、マラカイトグリーン、メチレンブルー等を例示することができる。
界面活性剤としては、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ７、ドデシル硫酸塩、ラウリル硫酸塩等を例示することができる。
無機塩類としては、亜セレン酸塩、亜テルル酸塩、亜硫酸塩、窒化ナトリウム、塩化リチウム、シュウ酸塩、高濃度の塩化ナトリウム等を例示することができる。
上記以外にもタウロコール酸塩、グリシン、胆汁末、胆汁酸塩、デオキシコール酸塩等を用いることができる。

培地液に配合し得るその他の成分として、可塑剤（グリセリン、ポリエチレングリコール等）等が挙げられる。

（カバーシート）
カバーシートは、培養層を被覆し、かつ、その酸素透過度は１００００ｃｃ／ｍ^２・ｄａｙ・ａｔｍ以上５００００ｃｃ／ｍ^２・ｄａｙ・ａｔｍ以下、好ましくは１５０００ｃｃ／ｍ^２・ｄａｙ・ａｔｍ以上４００００ｃｃ／ｍ^２・ｄａｙ・ａｔｍ以下である。

本発明における「酸素透過度」は、ＪＩＳ Ｋ ７１２６ Ｂ法に準拠した、２３℃、９０％ＲＨにおける酸素透過度である。

本発明の微生物培養シートは、カバーシートが上記の要件を満たすことで、好気性微生物の培養に適する。さらに、カバーシートは、培養中の落下菌等による汚染を防止すると共に、培養層の水分蒸発を防止する作用を有し得る。

カバーシートの構成は、上記要件を満たすことができれば特に限定されないが、通常、樹脂から構成される。カバーシートは、好ましくはポリメチルペンテンを含み、より好ましくはポリメチルペンテンからなる。

カバーシートは、全体として、その酸素透過度が１００００ｃｃ／ｍ^２・ｄａｙ・ａｔｍ以上５００００ｃｃ／ｍ^２・ｄａｙ・ａｔｍ以下となればよく、任意の樹脂の組み合わせを含んでいてもよい。

カバーシートは、微生物の培養後、カバーシートを通してコロニーを観察及び計数できるように、透明であることが好ましい。

カバーシートは、接合部を介して基材シートに固設されていてもよく、固設されていなくともよい。接合部としては、両面テープ等の粘着層が挙げられる。カバーシートと基材シートとは、ヒートシールやラミネートによって接着されていてもよい。

カバーシートには、基材シートの項で記載したコロナ放電処理等の表面処理が施されていてもよい。

カバーシートの厚さは、酸素透過度を上記範囲に調整しやすいという観点から、好ましくは１００μｍ以下であり、より好ましくは２０μｍ以上５０μｍ以下である。

カバーシートの形状は、特に限定されないが、培養層への雑菌の混入等を防ぐために、その大きさが、培養層全体を被覆できる大きさであることが好ましい。

カバーシートには、枡目印刷柄等が印刷されていてもよい。

（枠層）
培養層の外周には、疎水性樹脂からなる枠層が形成されていることが好ましい。枠層が形成されていると、被検液を培養層に接種し、カバーシートで被覆した際に、被検液が枠層まで速やかに拡散されるため、培養層による被検液の吸水を待たずにカバーシートを被覆することができ、接種操作を短時間で行うことができる。また、枠層によって被検液の遺漏をより確実に防げ、接種時の作業効率を向上することできる。

枠層の幅（枠層における培養層側の表面とその逆側の表面との距離）は、均一であってもよく、不均一であってもよい。例えば、枠の最細部は、好ましくは幅０．５ｍｍ以上５．０ｍｍ以下であり、より好ましくは１．０ｍｍ以上３．０ｍｍ以下である。上記範囲であれば、培養層が吸水して膨潤した場合であっても、枠層の形状が崩れるおそれが少なく、被検液を枠層内の領域内に拡げることができる。

枠層の高さ（基材シート表面からの高さ）は特に限定されないが、被検液の遺漏等を防ぐ観点から、培養層の高さ（基材シート表面からの高さ）よりも高いことが好ましい。枠層の高さが培養層の高さよりも高い場合、枠層の高さと培養層の高さとの差は、例えば、好ましくは１００μｍ以上１２００μｍ以下、より好ましくは２００μｍ以上１０００μｍ以下、特に好ましくは３００μｍ以上８００μｍ以下である。
上記範囲であれば、被検液を培養層に吸水させつつ全面に拡げることができ、かつ、被検液の遺漏をより確実に防げ、カバーシートとの密着性も確保できる。

枠層の高さが培養層の高さよりも過度に低いと、拡散した被検液の拡がりを抑制することができず、漏れが生じる場合がある。
枠層の高さが培養層の高さよりも過度に高いと、被検液接種時に培養層とカバーシートとの間に過度の空間部が発生するため、培養層表面とカバーシートとが密着しづらくなる。その結果、培養中に培養層が乾燥しやすくなり得る。

培養層の上に枠層を形成すると、培養層が被検液の吸水により膨潤してゲル状となった際に、崩れるおそれがある。そのため、作業の操作性及び安定性を高める観点から、枠層は基材シートの上に直接形成されていることが好ましい。

枠層の形態としては、培養層の外周に配置されていれば特に限定されない。例えば、以下の形態が挙げられる。
基材シートの表面において、培養層を形成する部分を囲うように疎水性樹脂を印刷や塗布等の任意の方法で載せることで形成された枠層。
疎水性材料のくりぬき品を培養層の外周に接着して形成された枠層。
基材シートをエンボス加工して形成された枠層。
基材シート（厚い疎水性基材等）において、培養層を形成する部分を凹状に削り、該凹部の外周として形成された枠層。

枠層を、エンボス加工によって形成する場合、以下の２通りの形成方法が考えられる。
（１）基材シートの表面において、培養層の外周に相当する位置に凸状を枠層として形成する。なお、該凸状に囲まれる領域内に培養層が形成される。
（２）基材シートの表面において、培養層を形成する位置に凹部を形成する。該凹部の外周が枠層に相当する。

枠層は単一のものであってもよく、１つの枠層の外側に、さらに枠層が形成された２重枠からなる枠層であってもよい。

枠層を形成する疎水性樹脂としては、特に限定されないが、ＵＶ硬化樹脂、ホットメルト樹脂、熱発泡インキ、ＵＶ発泡剤等を好適に使用することができる。これらの樹脂は着色されていてもよく、着色されていなくともよい。

ＵＶ硬化樹脂としては、ラジカル型又はカチオン型のいずれであってもよい。ラジカル型としては、アクリレート系樹脂、不飽和ポリエステル系樹脂等が挙げられる。カチオン型としては、エポキシアクリレート系樹脂、オキセタン系樹脂、ビニルエーテル系樹脂等が挙げられる。

ホットメルト樹脂としては、軟化点温度が好ましくは１２０℃以下、より好ましくは１００℃以下のものを好適に使用することができる。１２０℃を超えると基材シートがカールする場合がある。ホットメルト樹脂としては、ウレタン系樹脂、ポリアミド系樹脂、ポリオレフィン系樹脂、ポリエステル系樹脂、エチレン酢酸ビニル系樹脂、スチレンブタジエンゴム系樹脂、ウレタンゴム系樹脂等の合成ゴム系等が挙げられる。

熱発泡インキとしては、例えば、任意のバインダー（ポリウレタン系樹脂、ポリアミド系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、ポリアクリレート系樹脂、ポリエステル系樹脂、塩素化ポリプロピレン等のポリオレフィン系樹脂、塩化ゴムや環化ゴム等のゴム類等）を用いたインキを使用することができる。これらのインキは、撥水性であればより好ましい。撥水性がより高いという観点から、上記の樹脂にシリコーン類やワックス類を添加したインキがさらに好ましい。

ＵＶ発泡剤としては、熱発泡インキに使用され得る樹脂に従来公知の発泡剤等を添加したものが挙げられる。好ましいＵＶ発泡インキとして、反応性希釈剤（アクリレート反応性希釈剤、メタクリレート反応性希釈等）、光重合性オリゴマー（ウレタンアクリレート光重合性オリゴマー、ポリエステルアクリレート光重合性オリゴマー、エポキシアクリレート光重合性オリゴマー、アクリル系光重合性オリゴマー、特殊光重合性オリゴマー等）、及び光重合開始剤を少なくとも含む紫外線硬化型インキに、発泡剤（無機発泡剤、有機発泡剤、液体発泡剤等）を配合したものを例示することができる。
ＵＶ発泡インキを用いる場合は、ＵＶ照射によって樹脂を硬化させることで枠層を形成できる。

疎水性樹脂には、添加剤として、消泡剤、重合禁止剤、顔料分散剤等を添加してもよい。その種類や量は、得ようとする目的等に応じて設定できる。

（培養対象）
本発明の微生物培養シートは、様々な種類の好気性微生物の培養のために用いることができる。好気性微生物としては、特に限定されないが、真菌、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ 属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属等が挙げられる。
本発明の微生物培養シートの好ましい培養対象は、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍ、Ｗａｌｌｅｍｉａ ｓｅｂｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ等の真菌が挙げられる。本発明の微生物培養シートの好ましい培養対象は、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍである。

本発明によれば、従来好気性微生物の培養のために用いられてきた微生物培養シートよりも多様な種類の好気性微生物の培養を実現できる。

（微生物培養キット）
本発明は、上記微生物培養シートと、任意の被検液とを組み合わせた、微生物培養キットも包含する。

被検液としては特に限定されず、検出目的である好気性微生物の存否が不明な液体試料等が挙げられる。

（微生物培養シートの製造方法）
本発明の微生物培養シートの製造方法は特に限定されない。例えば、基材シートの上に、培地液を塗布及び乾燥させ培養層を形成し、該培地層をカバーシートで被覆することで得られる。

微生物培養シートが枠層を備える場合、枠層及び培養層の作製の順序はいずれが先であってもよい。

本発明の微生物培養シートは、ガンマ線照射やエチレンオキサイドガス滅菌等の滅菌を施し、本発明の微生物培養シートの製品としてもよい。

次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。

＜微生物培養シートの作製＞
以下の方法で、微生物培養シートを作製した。

（基材シートの準備）
基材シート（１０）として、合成樹脂を主原料とした合成紙（商品名「ユポ」、ユポ・コーポレーション製）を準備した。基材シート（１０）の寸法は、幅７２ｍｍ×奥行９０ｍｍ×厚さ２７０μｍに設定した。

基材シート（１０）の上面に、基材シート（１０）の１辺に沿って、長さ６ｍｍ、幅７２ｍｍの両面テープからなる接合部を設けた。該接合部は、基材シートと、後述するカバーシートとを接合させるものである。

（枠層の作製）
基材シート（１０）の上面に、エチレン酢酸ビニル系のホットメルト樹脂からなる円形状の枠層（２０）を設けた。枠層（２０）の幅（枠層（２０）の外縁と内縁との間の間隔）は１ｍｍであり、枠層（２０）の内径（内縁によって形成される円の直径）は５０ｍｍであり、枠層（２０）の高さ（基材シート（１０）の表面からの高さ）は７５０μｍに設定した。

（培養層の作製）
基材シート（１０）の上面、かつ、枠層（２０）によって囲まれた領域内に、ディスペンサーを用いて培養層（３０）を形成するための培地液を塗布した。塗布した培地液を乾燥させ、基材シート（１０）の上に培養層（３０）を形成した。得られた培養層（３０）の厚さ（基材シート（１０）の表面からの高さ）は２５０μｍであった。

培地液は、ゲル化剤、栄養成分、発色指示薬、選択剤、固着剤、及び可塑剤を含む固形成分と、粘度調整のための溶媒（メタノール）とを含む。培地液の組成を表１に示す。
［培地液の固形成分］
ゲル化剤：グアーガム及びサイリウムシードガムの混合物（グアーガム：サイリウムシードガム（質量比）＝３：２）
栄養成分：ペプトン、糖類、エキス類、及び無機塩類の混合物
発色指示薬：リン酸５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル
選択剤：クロラムフェニコール
固着剤：ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）
可塑剤：ポリエチレングリコール

（カバーシートの作製）
カバーシート（４０）として、表２に示す厚さ及び酸素透過度を有する材料からなるシートを準備した。カバーシート（４０）の寸法は、幅は７２ｍｍ×奥行９５ｍｍに設定した。

各カバーシートの材料の詳細は下記のとおりである。
ポリプロピレン：２軸延伸ポリプロピレン、商品名「ＯＰ Ｕ―１」、東セロ社製
ポリメチルペンテン：商品名「オピュラン ＴＰＸフィルム」、三井化学株式会社製
ポリスチレン：二軸延伸ポリスチレンシート、商品名「ＯＰＳ フィルム」、旭化成ケミカルズ株式会社製
ポリエチレン：低密度ポリエチレン、大日本印刷株式会社製

なお、各カバーシートの酸素透過度は、ＪＩＳ Ｋ ７１２６ Ｂ法に準拠して特定した。

各カバーシート４０の１辺を、枠層２０及び培養層３０を備える基材シート１０の接合部に貼り合わせ、カバーシートの材料以外は共通する構成を有する、実施例又は比較例に係る微生物培養シートを得た。

＜微生物培養試験＞
以下の方法で、各種菌株から培養試験用被検液を調製し、上記で得られた微生物培養シートを用いて培養試験を行った。

（培養試験用被検液の作製）
表３に示す各菌株の胞子懸濁液を用いて、菌数が１０〜１０^２／ｍｌとなるように滅菌生理食塩水（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ８０を含む）で希釈し、培養試験用被検液を調製した。

なお、表３に示す各菌は、いずれも好気性微生物（真菌）である。

（培養試験の方法）
得られた培養試験用被検液を、滅菌済みのピペットを用いて、各微生物培養シートの培養層（３０）の表面に１ｍｌ接種した。その上にカバーシート（４０）を載せて、被検液を培養層全体に拡げた。
次いで、各微生物培養シートを孵卵器に入れ、２５℃で、４８時間、６６時間、又は７２時間培養し、各時点でのコロニーの発生状態を目視確認した。なお、本例において、コロニーは青の点として確認される。

各微生物培養シートにおけるコロニーの発生状態を図１４及び１５に示す。なお、コロニーの発生状態は以下の基準に基づき評価した。
［評価基準］
〇：菌数を計数できる程度に発色しており視認性が高い。
△：菌数を計数できる程度に発色しているが、視認性が低い。
×：菌数を計数できる程度に発色していない。

ポリメチルペンテンからなるカバーシートを備える、本発明に係る微生物培養シートによれば、いずれの好気性菌も良好に検出できた。また、本発明に係る微生物培養シートによれば、種々の真菌を良好に検出できることがわかった。

他方、比較例に係る微生物培養シートでは、一部の好気性菌について充分に検出できなかった。特に、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｔｒｉｎｕｍについては、本発明に係る微生物培養シートによってのみ検出可能だった。

以上から、本発明に係る微生物培養シートは、様々な種類の好気性微生物の培養に適していることがわかった。

１０ 基材シート
２０ 枠層
３０ 培養層
３０’ 特定成分層
４０ カバーシート
５０ 粘着層
６０ 両面接着テープ

Claims (5)

1. 基材シートと、
   前記基材シートの上に形成された培養層と、
   前記培養層を被覆するカバーシートと、を備え、
   前記カバーシートの、ＪＩＳ Ｋ ７１２６ Ｂ法に準拠した、２３℃、９０％ＲＨにおける酸素透過度は１００００ｃｃ／ｍ^２・ｄａｙ・ａｔｍ以上５００００ｃｃ／ｍ^２・ｄａｙ・ａｔｍ以下であり、
   好気性微生物の培養のために用いられる、
   微生物培養シート。
2. 前記カバーシートはポリメチルペンテンを含む、請求項１に記載の微生物培養シート。
3. 前記カバーシートの厚さは１００μｍ以下である、請求項１又は２に記載の微生物培養シート。
4. 前記好気性微生物は真菌である、請求項１から３のいずれかに記載の微生物培養シート。
5. 前記培養層の外周に、疎水性樹脂からなる枠層が形成されている、請求項１から４のいずれかに記載の微生物培養シート。

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