JP6724333B2 - 微生物培養シート及び微生物の検出方法 - Google Patents
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Description
前記培養層が、ポリビニルピロリドン、ゲル化剤、及び栄養成分を含有し、
前記還元系発色試薬が、少なくとも2つ以上のテトラゾール環を有するテトラゾリウム塩である微生物培養シート。
(2) 前記還元系発色試薬が、前記培養層に含まれる、(1)に記載の微生物培養シート。
(3) 前記培養層を被覆するカバーシートをさらに有し、
前記カバーシートは、該カバーシートが前記培養層を被覆した際に前記培養層に対向する面の上に、前記還元系発色試薬を含む試薬層を有する、(1)に記載の微生物培養シート。
(4) 前記還元系発色試薬が、3,3’−[3,3’−ジメトキシ−(1,1’−ビフェニル)−4,4’−ジイル]ビス(2,5−ジフェニル−2H−テトラゾリウムクロリド)(TB)又は2,2’−Di−p−ニトロフェニル−5,5’−ジフェニル−(3,3’−ジメトキシ)−4,4’−ビスフェニレンジテトラゾリウムクロリド(NTB)である、(1)乃至(3)のいずれか1つに記載の微生物培養シート。
(5) 前記培養層が、可塑剤をさらに含有する、(1)乃至(4)のいずれか1つに記載の微生物培養シート。
(6) 前記培養層が、選択剤をさらに含有する、(1)乃至(5)のいずれか1つに記載の微生物培養シート。
(7) 試料中の微生物を検出する方法であって、
(1)乃至(6)のいずれか1つに記載の微生物培養シートの前記培養層に、前記試料の少なくとも一部を接種する工程と、
前記培養層上に接種された微生物を培養する工程と、
を含む方法。
(8) ポリビニルピロリドン及びゲル化剤を含む培養層において還元系発色試薬を用いて微生物を検出する方法であって、
前記還元系発色試薬が、少なくとも2つ以上のテトラゾール環を有するテトラゾリウム塩である方法。
基材シートの上に設ける培養層は、ポリビニルピロリドン、ゲル化剤、及び栄養成分を少なくとも含有する。また、培養層は、場合により可塑剤を含有することができ、また、場合により選択剤を含有することができる。培養層は、これらの成分を分散又は溶解させる溶媒を含む培地液から形成することができる。培養層は、還元系発色試薬としての少なくとも2つ以上のテトラゾール環を有するテトラゾリウム塩を含んでもよい。
ポリビニルピロリドンは、培地液の粘度調整剤としての役割を有する。ポリビニルピロリドンによれば、濃度を調整することで容易に培地液の粘度調整することができるので、ゲル化剤、還元系発色試薬、栄養成分、可塑剤及び選択剤を均一に分散させることができる。また、培養層を必要な部分に形成することが可能となり、高価な材料の無駄が生じない。また、培地液を所定のパターンに配置した後に溶媒を除去すると、ポリビニルピロリドンの優れた皮膜性のため、ゲル化剤や栄養成分を取り込んで培養層を成膜することができる。また、基材シートとも良好な密着性を有するので、接着剤を使用しなくても培養層を形成することができる。そのため、接着剤成分による微生物の発育の影響を低減することができる。
ゲル化剤を含有する培地液を用いて形成される培養層は、被検液を接種すると増粘若しくはゲル化するため、微生物の育成に良好な粘度を付与することができる。また、増粘後にはカバーシートに密着し得るため、培養時の培養層の乾燥を抑制することができる。
栄養成分としては、特に制限されるものではなく、公知の栄養成分を用いることができる。栄養成分としては、例えば、一般生菌検査用の微生物培養シートの場合、栄養成分としては、酵母エキス・ペプトン・ブドウ糖混合物、肉エキス・ペプトン混合物、又はペプトン・大豆ペプトン・ブドウ糖混合物など、あるいはこれらにリン酸二カリウム及び/又は塩化ナトリウムを加えた混合物が好ましく用いられる。大腸菌群検査用の微生物培養シートの場合、栄養成分としては、デソキシコール酸ナトリウム・ペプトン・クエン酸鉄アンモニウム・塩化ナトリウム・リン酸二カリウム・乳糖などが好ましく用いられる。黄色ブドウ球菌検査用の微生物培養シートの場合、栄養成分としては、肉エキス・ペプトン・塩化ナトリウム・マンニット・卵黄液混合物、又はペプトン・肉エキス・酵母エキス・ピルビン酸ナトリウム・グリシン・塩化リチウム・亜テルル酸・卵黄液混合物などが好ましく用いられる。ビブリオ検査用の微生物培養シートの場合、栄養成分としては、酵母エキス・ペプトン・蔗糖・チオ硫酸ナトリウム・クエン酸ナトリウム・コール酸ナトリウム・クエン酸第2鉄・塩化ナトリウム・牛胆汁などが好ましく用いられる。腸球菌検査用の微生物培養シートの場合、栄養成分としては、牛脳エキス・ハートエキス・ペプトン・ブドウ糖・リン酸二カリウム・窒化ナトリウムなどが好ましく用いられる。真菌検査用の微生物培養シートの場合、栄養成分としては、ペプトン・ブドウ糖混合物、酵母エキス・ブドウ糖混合物、又はポテトエキス・ブドウ糖混合物などが好ましく用いられる。これらの中から発育させようとする微生物に応じて一種又はそれ以上の栄養成分を選択して用いることができる。なお、培養層中で栄養成分が不足している場合は、被検液に不足分の栄養成分を加えてもよい。
培養層は、可塑剤を含有してもよい。可塑剤としては、例えば、エーテルエステル誘導体系可塑剤、グリセリンやグリセリン誘導体系可塑剤、プロピレングリコールやグリコール誘導体系可塑剤、グリコールエーテル誘導体系可塑剤、ポリヒドロキシカルボン酸誘導体系可塑剤、フタル酸誘導体系可塑剤などを例示することができるが、これらに限定されるものではない。これらの中でもグリセリンが好ましい。
培養層は、検出目的以外の微生物の発育を抑える選択剤を含有してもよい。このような選択剤としては、例えば、抗生物質、合成抗菌剤などの抗生剤、色素、界面活性剤、無機塩などが用いられる。抗生物質としては、メチシリン、セフタメタゾール、セフィキシム、セフタジジム、セフスロジン、バシトラシン、ポリミキシンB、リファンピシン、ノボビオシン、コリスチン、リンコマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、又はストレプトマイシンなどを挙げることができる。合成抗菌剤としては、例えば、サルファ剤、ナリジクス酸、又はオラキンドックスなどを挙げることができる。また、色素としては、例えば、静菌又は殺菌作用のあるクリスタルバイオレット、ブリリアントグリーン、マラカイトグリーン、メチレンブルーなどを挙げることができる。また、界面活性剤としては、例えば、Tergitol7、ドデシル硫酸塩、ラウリル硫酸塩などを挙げることができる。また、無機塩としては、例えば、亜セレン酸塩、亜テルル酸塩、亜硫酸塩、窒化ナトリウム、塩化リチウム、シュウ酸塩、又は高濃度の塩化ナトリウムなどを挙げることができる。これら以外にも、例えば、タウロコール酸塩、グリシン、胆汁末、胆汁酸塩、又はデオキシコール酸塩などを挙げることができる。
培養層は、1層で構成されてもよく、2層以上で構成されてもよい。例えば、ポリビニルピロリドン溶液(i)にゲル化剤(ii)を含有する培地液で第1培養層を形成し、その上にポリビニルピロリドン溶液(i)にゲル化剤(ii)、栄養成分(iii)、選択剤(v)を含有する培地液で第2培養層を形成し、本発明で使用する培養層としてもよい。
培養層は、基材シートの上に培地液を所定のパターンに塗布して乾燥することにより形成することができる。培養層をパターン形成することにより、被検液の滴下後に速やかにカバーシートを被覆することで、被検液が自然に一定範囲に拡がるため、優れた操作性を提供することができる。本発明において、「パターン形成」とは、基材シートの上に、培地液を予め決められた形状に印刷、塗布、塗工、又は噴霧などによって配置することをいう。培地液を基材上に配置する方法は、特に制限されるものではない。したがって、パターン形成には、スクリーン印刷、グラビア印刷、凸版印刷、転写印刷、フレキソ印刷、その他の印刷、ディスペンサーやインクジェットなどによる塗布、バーなどを使用してコーティングするバーコートやナイフコート、ダイコートなどの塗工、スプレー方式などの噴霧などの方法を使用することができる。
還元系発色試薬は、少なくとも2つ以上のテトラゾール環を有するテトラゾリウム塩である。少なくとも2つ以上のテトラゾール環を有するテトラゾリウム塩は、2つのテトラゾール環を有することが好ましい。テトラゾール環は還元反応によりホルマザン骨格を形成する。
微生物培養シートの好適な態様の一例を図1(a)、(b)に示す。図1(a)は平面図であり、図1(b)は図1(a)のA−A’断面図である。
微生物培養シートでは、基材シートの上に培地液をパターン形成するため、基材シートは、耐溶媒性、印刷適性を有する必要がある。また、微生物培養シートとして、耐水性も要求され、培養層を形成する際の乾燥処理に耐える耐熱性を有することも要求される。基材シートは、単層でもよく、2層以上の積層シートであってもよい。
カバーシートは、基材シートに固設されていることが好ましい。カバーシートは、培養中の落下菌などによる汚染を防止すると共に、培養層の水分蒸発を防止する作用を有する。カバーシートは、防水性、水蒸気不透過性を有すると同時に、微生物の培養後、カバーシートを通してコロニーを観察及び計数できるように、透明であることが好ましい。カバーシートとしては、例えば、前記基材シートで挙げたようなポリエチレン、ポリプロピレンなどのポリオレフィン、ポリエステル、ポリアミド、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニルなどのプラスチックシートを使用することができる。微生物培養シートでは、前記基材シートとカバーフィルムとが透明であれば、微生物培養シートの背面からの投射光で観察することもでき、また、側面からの入射光で観察することもできる。すなわち、カバーシート側からも基材シート側からもコロニーを観察及び計数することができるので、観察方法及び計測方法の選択の幅が広がることとなる。なお、カバーシートの開け閉めなどの作業性を考慮すると、ポリエステルフィルム、ポリオレフィンフィルムが特に好ましい。
培養層の外周に、疎水性樹脂からなる枠層が形成されていることが好ましい。枠層が形成されていると、被検液を培養層に接種し、カバーシートを被覆した場合に、被検液が枠層まで速やかに拡散されるため、培養層による被検液の吸水を待たずにカバーシートを被覆することができ、接種操作を短時間で行うことができる。また、枠層によって被検液の遺漏をより確実に防げ、接種時の作業効率を向上することできる。培養層にゲル化剤が含まれる場合には、被検液が枠層の内側にある培養層に吸水され、ゲル化剤が増粘し、培養層とカバーシートとの密着性により培養層の乾燥を防止することができる。また、培養層にゲル化剤が含まれない場合であっても、ポリビニルピロリドンが溶解し増粘するため、培養層とカバーシートとの密着性により培養層の乾燥を防止することができる。培養層とカバーシートとの密着性が優れると、カバーシートにコロニー形成のための層などを形成する必要がなく、コロニーの優れた視認性を確保することができる。
基材シートやカバーシートに粘着層を形成することができる。このような粘着層は、培養層を被覆したカバーシートを固定し、培養層の水分蒸発や汚染を防止する目的で配設され、基材シートを密封できればいかなる種類の粘着剤を用いてもよい。作業性を考えると基材シートとカバーシートとが再接着できる程度に、弱い粘着力を有する粘着剤が好ましい。例えば、ゴム系粘着剤やアクリル系粘着剤が好ましく、特に再剥離タイプ及び微粘着タイプのアクリル系粘着剤が好ましく用いられる。具体的には、ブチルアクリレートや2−エチルヘキシルアクリレートなどのアルキルアクリレート(好ましくはアルキルの炭素数が2〜12)100質量部に対し、カルボキシル基や水酸基、アミノ基などの官能基を含有するモノマーを2〜15質量部共重合させたポリマーに、粘着付与剤としてロジン、キシレン樹脂、フェノール樹脂などを加え、メラミン類、イソシアネート類、エポキシなどで架橋したものなどを使用することができる。また、粘着層はどのような形状でもよいが、基材シートとカバーシートとの接着部分に隙間がなく接着できるように配設されることが好ましい。
格子印刷層が積層されていてもよい。格子印刷は、着色剤、樹脂、溶剤などの選択範囲が広い点でグラビア印刷などが好ましい。枡目の大きさは1cm角程度が適当である。
本発明では、前記微生物培養シートと、特定成分を含む被検液とを組み合わせて、微生物培養キットとすることができる。被検液に、培養層に添加することが望ましい成分を添加して培養することができる。特に、滅菌処理その他の工程で変質、変色、分解などを受けやすい成分を含む場合に、有効である。
(i)培養層の形成
基材シートの上に培地液を所定のパターンに配置して乾燥することにより形成することができる。また、パターン形成の方法も、培地液を基材シートの予定した形状に塗布できるものであれば、特に制限はなく、印刷、塗布、塗工、噴霧などの任意の方法を用いることができる。好ましくは、ポリビニルピロリドンのアルコール溶液に、ゲル化剤、還元系発色試薬及び栄養成分、並びに場合により可塑剤及び選択剤を含有させた培地液を調製し、該培地液を基材シートの上にパターン形成した後、前記培地液に含まれるアルコールを除去して培養層を形成する。
基材シートの表面、かつ培養層の外周に枠層を形成してもよい。枠層は、疎水性樹脂を用いて形成することができる。なお、枠層の製造方法は特に問わない。あらかじめ枠層が形成された基材シートを使用することもできる。
培養層に被検液を接種した後にカバーシートで培養層を被覆し、これを培養するため、カバーシートの一部が基材シートに固設されていることが好ましい。ただし、直接スタンプや拭き取り試験などの場合、カバーシートが無いことで作業効率が向上する場合には、カバーシートを取り除いて使用してもよい。
また、本発明の一形態は、ポリビニルピロリドン及びゲル化剤を含む培養層において還元系発色試薬を用いて微生物を検出する方法であって、前記還元系発色試薬が、少なくとも2つ以上のテトラゾール環を有するテトラゾリウム塩である方法である。少なくとも2つ以上のテトラゾール環を有するテトラゾリウム塩を用いることにより、ポリビニルピロリドン及びゲル化剤を含む培養層においても微生物の発育を良好な状態とすることができ、還元系発色試薬による微生物の検出時間を短くすることができる。また、この実施形態は、特に黄色ブドウ球菌の検出に好ましく用いることができる。
<微生物培養シートの作製>
メタノール276gにポリビニルピロリドン24gを溶解し、ポリビニルピロリドンのメタノール溶液を調製した。このポリビニルピロリドンのメタノール溶液に、ゲル化剤としてのグアーガム粉末75.8g、栄養成分としてのトリプトン9.3g、酵母エキス0.9g、ピルビン酸ナトリウム0.35g、L−トリプトファン0.35g、塩化ナトリウム1.7g、リン酸二水素ナトリウム0.18g、リン酸水素二ナトリウム0.95g、硝酸カリウム0.18g、選択剤としてのラウリル硫酸ナトリウム0.04g、可塑剤としてのグリセリン10gを添加して培地液を調製した。なお、使用した材料の入手先は以下の通りである。
・グアーガム粉末(三晶社製、商品名「ネオビスコ G」、200メッシュタイプ)
・トリプトン(Becton,Dickinson and Company社製、商品名「BACT TRYPTONE」)
・酵母エキス(Becton,Dickinson and Company社製、商品名「YEAST EXTRACT」)
・ピルビン酸ナトリウム(和光純薬工業社製)
・L−トリプトファン(和光純薬工業社製)
・塩化ナトリウム(和光純薬工業社製)
・リン酸二水素ナトリウム(和光純薬工業社製)
・リン酸水素二ナトリウム(和光純薬工業社製)
・硝酸カリウム(和光純薬工業社製)
・ラウリル硫酸ナトリウム(和光純薬工業社製)
・グリセリン(和光純薬工業社製)
発色試薬溶液の調製:還元系発色試薬としての3,3’−[3,3’−ジメトキシ−(1,1’−ビフェニル)−4,4’−ジイル]ビス(2,5−ジフェニル−2H−テトラゾリウムクロリド)(TB)を減菌水で希釈し、発色試薬溶液を調製した。
上述の微生物培養シートの培養層に試料1mlを接種し、その上にカバーシートを乗せて、試料を培養層全体に広げた。その後、約1分間静置してゲルを形成させ、培養試験用サンプルを得た。
得られた培養試験用サンプルを35℃で48時間培養した。そして、24、27、48時間後における培養試験用サンプルについて、コロニーを目視にてカウントし、また、発色の視認性を下記評価基準に従って評価した。
A:発色を充分に視認できる。
B:発色をわずかに視認できる。
C:発色を視認できない。
S.aureus(ATCC25923)の代わりにKlebsiella pneumoniae(ATCC13883)を用いたこと以外は、実施例1と同様にして、培養試験用サンプルを作製し、評価した。
TBの代わりに2,3,5−トリフェニルテトラゾリウムクロリド(TTC)を用いたこと以外は、実施例1と同様にして、培養試験用サンプルを作製し、評価した。
TBの代わりにTTCを用いたこと以外は、実施例2と同様にして、培養試験用サンプルを作製し、評価した。
TBの代わりに3−(4,5−ジメチル−2−チアゾリル)−2,5−ジフェニル−2H−テトラゾリウムブロミド(MTT)を用いたこと以外は、実施例1と同様にして、培養試験用サンプルを作製し、評価した。
TBの代わりにMTTを用いたこと以外は、実施例2と同様にして、培養試験用サンプルを作製し、評価した。
20 枠層
30 培養層
30’ 試薬層
40 カバーシート
50 粘着層
60 両面接着テープ
Claims (7)
- 基材シートと、前記基材シートの上に形成された培養層と、を有し、還元系発色試薬を含む微生物培養シートであって、
前記培養層が、ポリビニルピロリドン、ゲル化剤、及び栄養成分を含有し、
前記還元系発色試薬が、3,3’−[3,3’−ジメトキシ−(1,1’−ビフェニル)−4,4’−ジイル]ビス(2,5−ジフェニル−2H−テトラゾリウムクロリド)(TB)を含む微生物培養シート。 - 前記還元系発色試薬が、前記培養層に含まれる、請求項1に記載の微生物培養シート。
- 前記培養層を被覆するカバーシートをさらに有し、
前記カバーシートは、該カバーシートが前記培養層を被覆した際に前記培養層に対向する面の上に、前記還元系発色試薬を含む試薬層を有する、請求項1に記載の微生物培養シート。 - 前記培養層が、可塑剤をさらに含有する、請求項1乃至3のいずれか1項に記載の微生物培養シート。
- 前記培養層が、選択剤をさらに含有する、請求項1乃至4のいずれか1項に記載の微生物培養シート。
- 試料中の微生物を検出する方法であって、
請求項1乃至5のいずれか1項に記載の微生物培養シートの前記培養層に、前記試料の少なくとも一部を接種する工程と、
前記培養層上に接種された微生物を培養する工程と、
を含む方法。 - ポリビニルピロリドン及びゲル化剤を含む培養層において還元系発色試薬を用いて微生物を検出する方法であって、
前記還元系発色試薬が、3,3’−[3,3’−ジメトキシ−(1,1’−ビフェニル)−4,4’−ジイル]ビス(2,5−ジフェニル−2H−テトラゾリウムクロリド)(TB)を含む方法。
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