JP2016220690A - 微生物培養シート及びその製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明の微生物培養シートは、基材シートと、前記基材シートの上に形成された培養層と、前記培養層を被覆するカバーシートと、を有する微生物培養シートであって、前記培養層は、ポリビニルピロリドンと、ゲル化剤、栄養成分、発色指示薬、選択剤及び基質からなる群から選択される少なくとも1種と、を含有する培地液がパターン形成されたものである微生物培養シート。
【選択図】図1
Description
本発明の微生物培養シートは、基材シートと、上記基材シートの上に形成された培養層と、上記培養層を被覆するカバーシートと、を有する微生物培養シートであって、上記培養層は、ポリビニルピロリドンと、ゲル化剤、栄養成分、発色指示薬、選択剤及び基質からなる群から選択される少なくとも1種と、を含有する培地液がパターン形成されたものである。
本発明の微生物培養シートの好適な態様の一例を図1(a)、(b)に示す。図1(a)は平面図であり、図1(b)は図1(a)のA−A’断面図である。
本発明の微生物培養シートでは、基材シートの上に、ポリビニルピロリドンと、ゲル化剤、栄養成分、発色指示薬、選択剤及び基質からなる群から選択される少なくとも1種と、を含有する培地液をパターン形成するため、基材シートは、耐溶媒性、印刷適性を有する必要がある。また、微生物培養シートとして、耐水性も要求され、培養層を形成する際の乾燥処理に耐える耐熱性を有することも要求される。基材シートは、単層でもよく、2層以上の積層シートであってもよい。
本発明の微生物培養シートにおいて、基材シートの上に設ける培養層は、ポリビニルピロリドンと、ゲル化剤、栄養成分、発色指示薬、選択剤及び基質からなる群から選択される少なくとも1種と、を含有する培地液がパターン形成されたものであり、ポリビニルピロリドンを培地液の必須の成分とする。
本発明の微生物培養シートでは、ポリビニルピロリドンは、培地液の必須の成分であり、培地液の粘度調整としての役割を有する。ポリビニルピロリドンによれば、溶媒中の濃度を調整することで容易に粘度調整することができるので、ゲル化剤、栄養成分、発色指示薬、選択剤及び基質からなる群から選択される少なくとも1種を均一に分散させることができ、また、必要な部分にのみパターン形成することが可能となり、高価な材料の無駄が生じない。しかも、パターン形成後に溶媒を除去すると、ポリビニルピロリドンは皮膜性が高いので、ゲル化剤や栄養成分を取り込んで成膜可能である。また、基材とも良好な密着性を有するので、接着剤を使用せずに培養層を形成することができ、従来の微生物培養シート等のように、接着剤成分によって微生物の発育に影響が現れるおそれがない。
本発明の微生物培養シートでは、培地液にゲル化剤が含有されていてもよい。ゲル化剤を含有する培地液をパターン形成することにより形成された培養層は、被検液を接種すると増粘若しくはゲル化するため、菌の育成に良好な粘度となる。また、増粘後にはカバーシートに密着し得るため、培養時の培養層の乾燥を抑制することができる。
本発明の微生物培養シートでは、培地液に栄養成分が含有されていてもよい。栄養成分としては、例えば、一般生菌検査用であれば、酵母エキス・ペプトン・ブドウ糖混合物、肉エキス・ペプトン混合物、ペプトン・大豆ペプトン・ブドウ糖混合物等や、これらにリン酸二カリウム及び/又は塩化ナトリウムを加えた混合物が用いられる。大腸菌・大腸菌群検査用であれば、デソキシコール酸ナトリウム・ペプトン・クエン酸鉄アンモニウム・塩化ナトリウム・リン酸二カリウム・乳糖・ペプトン・乳糖・リン酸二カリウム等が用いられる。ブドウ球菌用であれば、肉エキス・ペプトン・塩化ナトリウム・マンニット・卵黄混合物、ペプトン・肉エキス・酵母エキス・ピルビン酸ナトリウム・グリシン・塩化リチウム・亜テルル酸卵黄液混合物等が用いられる。ビブリオ用であれば、酵母エキス・ペプトン・蔗糖・チオ硫酸ナトリウム・クエン酸ナトリウム・コール酸ナトリウム・クエン酸第2鉄・塩化ナトリウム・牛胆汁等が用いられる。腸球菌用であれば、牛脳エキス・ハートエキス・ペプトン・ブドウ糖・リン酸二カリウム・窒化ナトリウム等が用いられる。真菌用であれば、ペプトン・ブドウ糖混合物、酵母エキス・ブドウ糖混合物、ポテトエキス・ブドウ糖混合物等が用いられる。本発明の微生物培養シートでは、これらの中から発育させようとする微生物に応じて一種又はそれ以上の栄養成分を選択し、混合して使用することができる。なお、培養層中に栄養成分を含まない場合や不足する栄養成分がある場合には、被検液に栄養成分を加え、微生物を生育してもよい。
本発明の微生物培養シートでは、培地液に発色指示薬、選択剤、基質等他の成分が含有されていてもよい。
本発明の微生物培養シートにおける培養層は、上記基材シートの上に上記培地液がパターン形成されたものである。本発明の微生物培養シートでは、培養層がパターン形成されているので、被検液の滴下後に速やかにカバーシートを被覆することで、被検液が自然に一定範囲に拡がり操作性に優れる。本発明において、「パターン形成」とは、上記基材シートの上に、上記培地液を予定した形状に印刷、塗布、塗工、噴霧等することをいい、その方法は、特に限定されるものではない。したがって、パターン形成には、スクリーン印刷、グラビア印刷、凸版印刷、転写印刷、フレキソ印刷、その他の印刷、ディスペンサーやインクジェット等による塗布、バー等を使用してコーティングするバーコートやナイフコート、ダイコート等の塗工、スプレー方式等の噴霧、その他の方法を使用することができる。
本発明の微生物培養シートでは、カバーシートは、基材シートに固設されていることが好ましい。カバーシートは、培養中の落下菌等による汚染を防止すると共に、培養層の水分蒸発を防止する作用を有する。カバーシートは、防水性、水蒸気不透過性を有すると同時に、微生物の培養後、カバーシートを通してコロニーを観察及び計数できるように、透明であることが好ましく、例えば、上記基材シートで挙げたようなポリエチレン、ポリプロピレン等のポリオレフィン、ポリエステル、ポリアミド、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル等のプラスチックシートを使用することができる。本発明の微生物培養シートでは、上記基材シートとカバーフィルムとが透明であれば、微生物培養シートの背面からの投射光で観察することもでき、また、側面からの入射光で観察することもできる。すなわち、カバーシート側からも基材シート側からもコロニーを観察及び計数することができるので、観察方法及び計測方法の選択の幅が広がることとなる。なお、カバーシートの開け閉め等の作業性を考慮すると、ポリエステルフィルム、ポリオレフィンフィルムが特に好ましい。
本発明の微生物培養シートでは、上記培養層の外周に、疎水性樹脂からなる枠層が形成されていることが好ましい。枠層が形成されていると、被検液を培養層に接種し、カバーシートを被覆した場合に、被検液が枠層まで速やかに拡散されるため、培養層による被検液の吸水を待たずにカバーシートを被覆することができ、接種操作を短時間で行うことができる。また、枠層によって被検液の遺漏をより確実に防げ、接種時の作業効率を向上することできる。培養層にゲル化剤が含まれる場合には、被検液が枠層の内側にある培養層に吸水され、ゲル化剤が増粘し、培養層とカバーシートとの密着性により培養層の乾燥を防止することができる。また、培養層にゲル化剤が含まれない場合であっても、ポリビニルピロリドンが溶解し増粘するため、培養層とカバーシートとの密着性により培養層の乾燥を防止することができる。培養層とカバーシートとの密着性が優れると、カバーシートにコロニー形成のための層等を形成する必要がなく、コロニーの優れた視認性を確保することができる。
本発明の微生物培養シートでは、基材シートやカバーシートに粘着層を形成することができる。このような粘着層は、培養層を被覆したカバーシートを固定し、培養層の水分蒸発や汚染を防止する目的で配設され、基材シートを密封できればいかなる種類の粘着剤を用いてもよい。作業性を考えると基材シートとカバーシートとが再接着できる程度に、弱い粘着力を有する粘着剤が好ましい。例えば、ゴム系粘着剤やアクリル系粘着剤が好ましく、特に再剥離タイプ及び微粘着タイプのアクリル系粘着剤が好ましく用いられる。具体的には、ブチルアクリレートや2−エチルヘキシルアクリレート等の炭素数が2〜12のアクリレート100質量部に対し、カルボキシル基や水酸基、アミノ基等の官能基を含有するモノマーを2〜15質量部共重合させたポリマーに、粘着付与剤としてロジン、キシレン樹脂、フェノール樹脂等を加え、メラミン類、イソシアネート類、エポキシ等で架橋したもの等を使用することができる。また、粘着層はどのような形状でもよいが、基材シートとカバーシートとの接着部分に隙間がなく接着できるように配設されることが好ましい。
なお、本発明では、カバーシートで培養層を密封できれば粘着層に限定されず、把持部材を使用したり、重石を配設したりする方法等であってもよい。
本発明の微生物培養シートには、格子印刷層が積層されていてもよい。格子印刷は、着色剤、樹脂、溶剤等の選択範囲が広い点でグラビア印刷等が好ましい。枡目の大きさは1cm角程度が適当である。
本発明では、上記微生物培養シートと、特定成分を含む被検液とを組み合わせて、微生物培養キットとすることができる。
(i)培養層の形成
本発明の微生物培養シートは、上記基材シートの上に、ポリビニルピロリドンと、ゲル化剤、栄養成分、発色指示薬、選択剤及び基質からなる群から選択される少なくとも1種と、を含有する培地液がパターン形成された培養層を形成することができれば、その製造方法は問わない。また、パターン形成の方法も、上記培地液を基材シートの予定した形状に塗布できるものであれば、特に制限はなく、上記した印刷、塗布、塗工、噴霧等のいずれの方法でもよい。好ましくは、ポリビニルピロリドンのアルコール溶液に、ゲル化剤、栄養成分、発色指示薬、選択剤及び基質からなる群から選択される少なくとも1種と、を含有させた培地液を調製し、該培地液を基材シートの上にパターン形成した後、上記培地液に含まれる上記アルコール溶液を除去して培養層を形成する。
本発明の微生物培養シートは、基材シートの表面、かつ培養層の外周に枠層を形成してもよい。枠層は、疎水性樹脂を用いて形成することができる。なお、枠層の製造方法は特に問わない。あらかじめ枠層が形成された基材シートを使用することもできる。
本発明の微生物培養シートは、培養層に被検液を接種した後にカバーシートで培養層を被覆し、これを培養するため、カバーシートの一部が基材シートに固設されていることが操作上、簡便である。ただし、直接スタンプや拭き取り試験等の場合、カバーシートが無いことで作業効率が向上する場合には、カバーシートを取り除いて使用してもよい。
メタノール130gにポリビニルピロリドン(日本触媒社製、商品名「ポリビニルピロリドン K−90」)20gを溶解し、これにグアーガム粉末(三晶社製、商品名「ネオビスコ G」、200メッシュタイプ)60gを分散し、更に栄養成分としてトリプトン(Becton、 Dickinson and Company 社製、商品名「BACT TRYPTONE」)20.16g、酵母エキス(Becton、 Dickinson and Company 社製、商品名「YEAST EXTRACT」)2.58g、ブドウ糖(和光純薬社製、商品名「D−(+)−GLUCOSE」)1.03gを混合して培地液を調製し、この培地液をポリエチレンテレフタラートフィルム(帝人デュポン社製、商品名「テイジンテトロンフィルム」)の上に必要な部分パターン形成した後、50℃で15分間乾燥し、培養層を形成した。乾燥時の培養層の厚さは、約250μmであった。次いで、ディスペンサーを用いて、UV硬化インク(十条ケミカル社製、商品名「レイキュアーGA 4100−2」)を幅1.0mm、高さ750μm、直径52mmの円状に塗布した後、水銀ランプを用いて積算光量250mJ/cm2の紫外線を照射し、硬化させて培養層の周りに疎水性樹脂で枠層を形成した。
E.coli(ATCC 25922)を液体培地(TRYPTIC SOY BROTH)にて37℃で24時間振盪培養した。そして、得られた被検液を菌数が102/mlとなるように滅菌生理食塩水で希釈し、TTCを添加して、培養試験用被検液を調製した。この培養試験用被検液を、製造例1の方法により製造した微生物培養シートの培養層の上に滅菌済みのピペットで1ml接種し、その上にカバーシートを乗せて、被検液を培養層全体に拡げた。その後、約1分間静置してゲルを形成させ、実施例1の培養試験用試料を得た。なお、培養試験用試料は5個作成した。
菌株として、E.coliのかわりにK.pneumoniae(ATCC 13883)を使用して培養試験用被検液を調製した以外、実施例1と同様の方法にて、実施例2の培養試験用試料を得た。
菌株として、E.coliのかわりにE.cloacae(ATCC 13536)を使用して培養試験用被検液を調製した以外、実施例1と同様の方法にて、実施例3の培養試験用試料を得た。
菌株として、E.coliのかわりにC.freundii(JCM 1657)を使用して培養試験用被検液を調製した以外、実施例1と同様の方法にて、実施例4の培養試験用試料を得た。
菌株として、E.coliのかわりにS.aureus(ATCC 25923)を使用して培養試験用被検液を調製した以外、実施例1と同様の方法にて、実施例5の培養試験用試料を得た。
実施例1の培養試験用被検液1mlをペトリ皿に加え、従来の混釈法により準備した標準寒天培地20mlと混釈し、比較例1の培養試験用試料を得た。
実施例2の培養試験用被検液を使用した以外は、比較例1と同様の方法にて、比較例2の培養試験用試料を得た。
実施例3の培養試験用被検液を使用した以外は、比較例1と同様の方法にて、比較例3の培養試験用試料を得た。
実施例4の培養試験用被検液を使用した以外は、比較例1と同様の方法にて、比較例4の培養試験用試料を得た。
実施例5の培養試験用被検液を使用した以外は、比較例1と同様の方法にて、比較例5の培養試験用試料を得た。
実施例1〜5及び比較例1〜5の培養試験用試料を孵卵器に入れ、37℃で48時間培養した。そして、培養後に発生したコロニー数をそれぞれ計測した。また、本発明の微生物培養シートを使用した実施例1の培養試験用試料のコロニー発生状態を図14に示す。
ポリエチレンテレフタラートフィルム(帝人デュポン社製、商品名「テイジンテトロンフィルム」)の上に、ディスペンサーを用いて、熱可塑性樹脂(コニシ社製、商品名「MP973」)を幅1.0mm、高さ750μm、直径52mmの円状に塗布し、枠層を形成した。
高さ600μmの枠層を形成した以外は、製造例2と同様の方法にて、本発明の微生物培養シートを得た。なお、培養層の高さとの差は、+350μmであった。
高さ950μmの枠層を形成した以外は、製造例2と同様の方法にて、本発明の微生物培養シートを得た。なお、培養層の高さとの差は、+700μmであった。
E.coli(ATCC 25922)を液体培地(TRYPTIC SOY BROTH)にて37℃で24時間振盪培養した。そして、得られた被検液を菌数が102/mlとなるように滅菌生理食塩水で希釈し、TTCを添加して、培養試験用被検液を調製した。この培養試験用被検液を、製造例2の方法により製造した微生物培養シートの培養層の上に滅菌済みのピペットで1ml接種し、その上にカバーシートを乗せて、被検液を枠層内の培養層全体に拡げた。その後、約1分間静置してゲルを形成させ、実施例6の培養試験用試料を得た。なお、培養試験用試料は5個作成した。
菌株として、E.coliのかわりにK.pneumoniae(ATCC 13883)を使用して培養試験用被検液を調製した以外、実施例6と同様の方法にて、実施例7の培養試験用試料を得た。
菌株として、E.coliのかわりにE.cloacae(ATCC 13536)を使用して培養試験用被検液を調製した以外、実施例6と同様の方法にて、実施例8の培養試験用試料を得た。
菌株として、E.coliのかわりにC.freundii(JCM 1657)を使用して培養試験用被検液を調製した以外、実施例6と同様の方法にて、実施例9の培養試験用試料を得た。
菌株として、E.coliのかわりにS.aureus(ATCC 25923)を使用して培養試験用被検液を調製した以外、実施例6と同様の方法にて、実施例10の培養試験用試料を得た。
実施例6にて調製した培養試験用被検液1mlをペトリ皿に加え、従来の混釈法により準備した標準寒天培地20mlと混釈し、比較例6の培養試験用試料を得た。
実施例7にて調製した培養試験用被検液を使用した以外は、比較例6と同様の方法にて、比較例7の培養試験用試料を得た。
実施例8にて調製した培養試験用被検液を使用した以外は、比較例6と同様の方法にて、比較例8の培養試験用試料を得た。
実施例9にて調製した培養試験用被検液を使用した以外は、比較例6と同様の方法にて、比較例9の培養試験用試料を得た。
実施例10にて調製した培養試験用被検液を使用した以外は、比較例6と同様の方法にて、比較例10の培養試験用試料を得た。
製造例3の方法により製造した微生物培養シートを使用した以外は、実施例6と同様の方法にて、実施例11の培養試験用試料を得た。
製造例4の方法により製造した微生物培養シートを使用した以外は、実施例6と同様の方法にて、実施例12の培養試験用試料を得た。
実施例6〜12及び比較例6〜10の培養試験用試料を孵卵器に入れ、37℃で48時間培養した。そして、培養後に発生したコロニー数をそれぞれ計測した。その結果を表1に示す。また、本発明の微生物培養シートを使用した実施例6の培養試験用試料のコロニー発生状態を図15に示す。
20 枠層
30 培養層
30’ 特定成分層
40 カバーシート
50 粘着層
60 両面接着テープ
Claims (11)
- 基材シートと、前記基材シートの上に形成された培養層と、前記培養層を被覆するカバーシートと、を有する微生物培養シートであって、
前記培養層は、ポリビニルピロリドンと、ゲル化剤、栄養成分、発色指示薬、選択剤及び基質からなる群から選択される少なくとも1種と、を含有する微生物培養シート。 - 前記培養層は、ポリビニルピロリドンと、ゲル化剤とを含有する請求項1に記載の微生物培養シート。
- 前記ゲル化剤は高分子多糖類である請求項2に記載の微生物培養シート。
- 前記培養層における前記ゲル化剤の含有量は、前記ポリビニルピロリドン100質量部に対して100〜600質量部である請求項2又は3に記載の微生物培養シート。
- 前記培養層の外周に、疎水性樹脂からなる枠層が形成されている請求項1〜4いずれかに記載の微生物培養シート。
- 前記基材シート及び/又は前記カバーシートは、透明プラスチックシートからなる請求項1〜5のいずれかに記載の微生物培養シート。
- 前記カバーシートは、前記基材シートに固設されている請求項1〜6のいずれかに記載の微生物培養シート。
- 基材シートと、前記基材シートの上に形成された培養層と、前記培養層を被覆するカバーシートと、を有する微生物培養シートの製造方法であって、
ポリビニルピロリドンのアルコール溶液に、ゲル化剤、栄養成分、発色指示薬、選択剤及び基質からなる群から選択される少なくとも1種を含有させた培地液を、前記基材シートの上にパターン形成した後、前記培地液に含まれる前記アルコールを除去して前記培養層を形成する培養層形成工程を含む微生物培養シートの製造方法。 - 前記培養層形成工程後に、疎水性樹脂をパターン形成して前記培養層の外周を囲む凸形状の枠層を形成する枠層形成工程を行う請求項8に記載の微生物培養シートの製造方法。
- 前記培養層形成工程前に、前記培養層が形成された際に前記培養層の外周を囲む凸形状の枠層を、疎水性樹脂のパターン形成によりあらかじめ形成する枠層形成工程を行う請求項8に記載の微生物培養シートの製造方法。
- 基材シートと、前記基材シートの上に形成された培養層と、前記培養層を被覆するカバーシートと、を有する微生物培養シートの製造方法であって、
前記基材シートは、前記培養層が形成された際に前記培養層の外周を囲む凸形状の疎水性樹脂からなる枠層があらかじめ形成されており、
前記枠層の内側に、ポリビニルピロリドンのアルコール溶液にゲル化剤、栄養成分、発色指示薬、選択剤及び基質からなる群から選択される少なくとも1種を含有させた培地液をパターン形成した後、前記培地液に含まれる前記アルコールを除去して前記培養層を形成する微生物培養シートの製造方法。
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