DK151273B - Fremgangsmaade til fremstilling af cholesterolbiosynteseinhibitoren mb- 530a. - Google Patents

Description

i 151273

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af forbindelsen betegnet MB-530A med inhiberende virkning overfor biosyntesen af cholesterol. MB-530A har formlen (V): 5 0 (V) 10 L i ch3^," ' Y ">x

O ^ J

15 Hyperlipidæmi, især hypercholesterolæmi, vides at være en af hovedårsagerne til cardiopati, såsom hjerteinfarkt eller arteriesclerose. Som resultat heraf har en betydelig forskning været udført med henblik på at finde frem til forbindelser, der er i stand til at formindske lipidmængden, og især chole- 2Q sterolmængden i blodet. En gruppe forbindelser af denne type er omhandlet i USA-patentskrift nr. 3.983.140, hvilke forbindelser isoleres fra mikroorganismer af slægten PeniciIlium.

Denne gruppe forbindelser betegnes kollektivt ML-236.

25 ML-236A og NL-236B (to af forbindelserne i ML-236-komplekset, som er omhandlet i USA-patentskrift nr. 3.983.140) har henholdsvis formlen (II) og (III):

so to'rV ΗΟγ Y

γ Y

x \

OH 1 9 T

CH, I I (ID CH I i (III)

35 YyS Y yS

XXX X XX

151273 2

Det har nu vist sig, at forbindelsen MB-530A kan fremstilles ved dyrkning af en stamme af arten Monascus ruber, og fremgangsmåden ifølge opfindelsen er i overensstemmelse hermed ejendommelig ved, at man dyrker en stamme af arten Monascus 5 ruber i et dyrkningsmedium derfor, og at den dannede MB-530A-forbindelse fraskilles fra dyrkningsmediet.

MB-530A fremstilles fortrinsvis ved dyrkning af stammen Monascus ruber SANK 15177. Denne stamme blev deponeret den 27.

10 april 1979 under accessionsnummeret FERM 4956 hos The Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry,

Japan, og den 25. januar 1980 under accessionsnummeret NRRL 12081 hos The Agricultural Research Service Culture Collection, 15 Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois, U.S.A.

Fra beskrivelsen til den danske patentansøgning nr 731/80, som svarer til fremlæggelsesskrift nr. 148.807, må det anses for kendt at fremstille monacolin K med formlen (IV): 20

HS V

Y o 25 i i ^ 0 CH3\Yv>^k (IV) ^ Ύ' CH-30 3 ved dyrkning af stammer af arten Monacus ruber, bl.a. Monacus 35 ruber SANK 15.177.

151273 3

Fra beskrivelsen til den danske patentansøgning nr. 461/81 må det anses for kendt at fremstille bl.a. MB-530A ved en kemisk fremgangsmåde.

5 Forbindelsen MB-530A kan fremstilles ved dyrkning af den udvalgte mikroorganisme i et dyrkningssubstrat under aerobe betingelser under anvendelse af den samme teknik, som er velkendt til dyrkning af svampe og andre mikroorganismer. For eksempel kan den valgte stamme af Monacus ruber først dyrkes IQ på et egnet medium, og den producerede mikroorganisme kan derefter opsamles og podes på og dyrkes på et andet dyrkningsmedium til fremstilling af den ønskede MB-530A-forbindelse.

Det til formeringen af mikroorganismen benyttede dyrkningsmedium og det til produktionen af MB-530A benyttede dyrknings-15 medium kan være ens eller forskellige.

Ethvert velkendt dyrkningsmedium til dyrkning af svampe kan benyttes, forudsat at det, som der er velkendt, indeholder de nødvendige næringsstoffer, især en assimilerbar carbonkil-20 de og en assimilerbar nitrogenkilde. Eksempler på sådanne kilder for assimilerbart carbon indbefatter glucose, maltose, dextrin, stivelse, lactose, sucrose og glycerol. Af disse kilder er glucose, glycerol og stivelse særlig foretrukne til fremstilling af MB-530A. Eksempler på egnede kilder for 25 assimilerbart nitrogen er pepton, kødekstrakt, gær, gærekstrakt, sojabønnemel, jordnøddemel, majsstøbevæske, risklid og uorganiske nitrogenkilder. Af disse nitrogenkilder er majsstøbevæske og pepton særlig foretrukne. Ved fremstilling af MB-530A kan et uorganisk salt og/eller et metalsalt om nødvendigt 30 sættes til dyrkningsmediet. Endvidere kan om nødvendigt en mindre mængde af et tungt metal også tilsættes.

Mikroorganismen dyrkes fortrinsvis under aerobe betingelser under anvendelse af dyrkningsmetoder, der er velkendte indenfor 35 teknikken, f.eks. fast dyrkning, rystedyrkning eller dyrkning under luftning og omrøring. Mikroorganismen vil vokse over et bredt temperaturinterval, f.eks. 7 til 40°C, men til 151273 4 fremstilling af MB-530A ligger den mere foretrukne dyrkningstemperatur indenfor intervallet fra 20 til 30°C.

Under dyrkningen af mikroorganismen kan produktionen af MB-530A 5 måles ved prøveudtagning af dyrkningsmedium og måling af mediets fysiologiske aktivitet ved hjælp af velkendte forsøg. Dyrkningen kan derefter fortsættes, indtil en væsentlig akkumulering af MB-530A er blevet opnået i dyrkningsmediet, på hvilket tidspunkt MB-530A-forbindelsen derefter kan isoleres ^0 og udvindes fra dyrkningsmediet ved hjælp af enhver egnet kombination af isolationsteknik, der vælges under hensyntagen til dets fysiske og kemiske egenskaber. For eksempel kan enhver af eller alle de nedenfor anførte isolationsmetoder anvendes: ^5 Ekstraktion af væsken fra dyrkningssubstratet med et hydrofilt opløsningsmiddel (såsom diethylether, ethylacetat, chloroform eller benzen), koncentrering, f.eks. ved afdampning af noget eller en del af opløsningsmidlet under formindsket tryk, opløsning i et mere polært opløsningsmiddel (såsom acetone 2q eller en alkohol), fjernelse af urenheder med et mindre polært opløsningsmiddel (såsom petroleumsether eller hexan), gelfiltrering gennem en søjle af et materiale, såsom "Sephadex" (et handelsnavn for et materiale, der fås fra Pharmacia Co. Limited, U.S.A.), absorptionskromatografi med aktivt carbon 25 eller silicagel og andre lignende metoder. Ved anvendelse .

af en passende kombination af disse metoder kan den ønskede MB-530A-forbindelse isoleres fra dyrkningssubstratet som et rent stof. 1 2 3 4 5 6

Den ifølge opfindelsen fremstillede forbindelse har vist sig 2 at have en specifik inhiberende virkning over for 3-hydroxy-3- 3 methylglutarylcoenzym A reduktase (HMG-CoA reduktase), som 4 er det hastigheds-kontrollerende enzym ved biosyntesen af 5 cholesterol.

6

Fremstillingen af forbindelsen MB-530A illustreres yderligere i det efterfølgende eksempel.

151273 5

Eksempel

Fremstilling af MB-530A

5 300 1 af et dyrkningsmedium med en pH-værdi på 5,5 før steri lisering og indeholdende 5% vægt/volumen glucose, 0,5% vægt/ volumen maj sstøbevæske og 2% vægt/volumen pepton (Kyokuto fabrikat, fås fra Kyokuto Seiyaku KK, Japan) og 0,5% ammonium-chlorid blev fyldt på en 600 1 gæringsbeholder og podet med 10 en kultur af Monascus ruber SANK 15177 (FERM 4956, NRRL 12081).

Dyrkning af microorganismen blev fortsat i 120 timer ved 27°C med en beluftningshastighed på 300 1/min og omrøring med 190 omdrejninger pr. minut.

15 Ved afslutningen af dette tidsrum blev dyrkningssubstratet filtreret i en filterpresse til opnåelse af et filtrat og en filterkage omfattende våde celler af microorganismen.

Filtratet blev indstillet til en pH-værdi på 3,0 ved tilsæt-20 ning af 6N saltsyre og derpå ekstraheret med 400 1 ethylacetat.

Ekstrakten (ca. 400 1) blev koncentreret ved inddampning under formindsket tryk og derefter afvandet over vandfrit natriumsulfat, hvorefter den blev inddampet til tørhed til opnåelse af ca. 60 g af et olieagtigt produkt. Dette olieagtige pro-25 dukt blev vasket med ethylcyklohexan og med hexan, og resten (20 g), blev separeret ved hjælp af kromatografi under anvendelse af et væskekromatografiapparat til udtagning af prøver med stort volumen (System 500 væskekromatografi, fremstillet af

Waters Co., USA), idet der blev elueret . med 60% volumen/vol-30 urnen vandig methanol.Fraktioner med en kromatografisk retentionstid på 6 minutter blev opsamlet og koncentreret ved inddampning under formindsket tryk til opnåelse af 100 mg af den ønskede MB-530A-forbindelse som et olieagtigt produkt. Denne olieagtige MB-530A-forbindelse blev rekrystalliseret fra en blanding af acetone og diethylether til opnåelse af 57 mg af det ønskede produkt i form af farveløse nåle med følgende egenskaber :

Claims (2)

151273

1. Fremgangsmåde til fremstilling af forbindelsen MB-530A med formlen (V):

30 HO ^ 0 ^C)

35. OH ch3~C^X^~- (V) 151273 kendetegnet ved, at man dyrker en stamme af arten Monascus ruber i et dyrkningsmedium derfor, og at den dannede MB-530A-forbindelse fraskilles fra dyrkningsmediet.

1. Smeltepunkt: 92 - 93QC.

2. Grundstofanalyse: Beregnet for ci9H28°4:c 69/76%;H 8,68%. Fundet: C71,22%;H 8,81%.

3. Molekylvægt: 320 (ved masseanalyse) .

4. Molekylformel: C^9H28°4

5. Ultraviolet absorptionsspektrum: Som vist i fig.l på tegningen .

6. Infrarødt absorptions spektrum: Som vist i fig. 2 på tegningen .

7. Kernemagnetisk resonansspektrum; Som vist i fig. 3 på teg ningen .

8. Opløselighed: Let opløselig i methanol, ethanol, acetone, ethylacetat: Opløselig i benzen: Uopløselig i hexan og petroløumsether.

9. Farvereaktion: En lyserød farve ses, når et tyndlagskroma-togram af forbindelsen på silikagel fremkaldes med 50% vol-umen/volumen svovlsyre.

10. Inhiberende virkning overfor biosyntesen af cholesterol:

20 En 50% inhibering af cholesterolsyntesen i rottelever iagt tages ved en koncentration på 0,04yg/ml. Patentkrav. 25 ---------------------

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at mikroorganismen er Monascus ruber SANK 15177 (FERM 4956, NRRL 12081).