DK165990B - Fremgangsmaade til fremstilling af carboxylsyren af en cholesterolsynteseinhiberende forbindelse kaldet monacolin k eller salte deraf - Google Patents

Description

i

DK 165990B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af carboxylsyren af en hidtil ukendt cholesterol-synteseinhiberende forbindelse kaldet monacolin K med formlen: ΗΟγγΟ v ° k ο'^γ^ 1°

A^AA

eller salte deraf, der er ejendommelig ved, at en stamme af Monascus ruber dyrkes i et dyrkningssubstrat indeholdende 15 assimilerbare carbon- eller nitrogenkilder, at et alkali sæt tes til dyrkningsblandingen til opnåelse af alkalisalte af carboxylsyren af monacolin K, og at man derefter enten isolerer alkalisaltene fra den alkaliske dyrkningsblanding eller ekstra-herer syren med et organisk opløsningsmiddel, fortrinsvis 20 med ethylacetat eller chloroform, ved en sur pH-værdi.

Høje blodcholesterolniveauer er velkendte for at være en af hovedårsagerne til cardiopati, således som hjerteinfakt eller arteriosclerose. Som et resultat heraf er der foretaget ad-25 skillige videnskabelige undersøgelser for at finde fysiologisk acceptable forbindelser, der er i stand til at hæmme choleste-rolbiosyntesen og derved reducere blodcholesterolniveauerne.

En af disse forbindelser er ML-236, der omhandles i engelsk patentskrift nr. 1 453 425 og i dansk patentskrift nr. 136.485. 30 ML-236 fremstilles ved at dyrke en mikroorganisme af slægten

Penicillium.

Det har nu vist sig, at stammer af arten Monascus ruber, specielt Monascus ruber stamme 1005 (FERM 4822), frembringer 35 en med ML-236 nært beslægtet forbindelse, og at det ved be handling med alkali er muligt at fremkalde ringåbning af denne forbindelses lactonring under dannelse af de tilsvarende salte, 2

DK 165990 B

hvorefter carboxylsyren af forbindelsen kan isoleres ved en sur pH-vserdi ved ekstraktion med et passende organisk opløsningsmiddel, såsom ethylacetat eller chloroform.

5 Monascus ruber stamme 1005 (FERM 4822) er en for nylig isoleret mikroorganisme, der udviser følgende mikrobiologiske egenskaber. Den isoleredes fra fodér produceret i Thailand og deponeredes den 16. februar 1979 under accessionsnummeret FERM 4822 i Fermentation Research Institute, Agency <5f Indu-10 strial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan, og under accessionsnummeret NRRL 12073 i Agricultural Research Service, Northern Regional Research Laboratory, USA.

15 1. VÆKST

Væksten på et kartoffel-glucose-agar substrat ved 25°C er hurtig, og diameteren af kolonierne når 6-6,5 centimeter 10 dage efter tilsåningen. Kolonien er flad og et relativt 20 tyndt basalt lag af hyfer udvikler sig. Udviklingen af luft- hyfers er dårlig; lufthyferne er hvide og de fleste af dem er uldagtige. Kleistotesia dannes på det basale lag af hyferne, og de biver rødligt brune ved modning. Både overfladen og bagsiden af kolonien har brun til rødligt brun farve.

25 Væksten på Sabouraud's agar substrat ved 25°C er meget hurtig, og koloniernes diameter når 6-6,5 centimeter 10 dage efter udsåningen. Overfladen af kolonien er meget flad, og basale hyfer og lufthyfer udvikler sig bedre end på kartoffel-glucose-30 agar substratet. Kleistotesia er meget sparsomme. Overfladen af kolonierne er rødlig-gullig til rødlig-brun i farve, og bagsiden er rødlig-brun til mørkbrun.

Væksten på havremelsagar ved 25°C er langsom, og koloniernes 35 diameter når 1,5-2 centimeter 10 dage efter tilsåningen.

Kolonien er flad. Udvikling af lufthyfer og dannelsen af kleistotesia er meget dårlig for begges vedkommende. Både overfladen og den modsatte side af kolonien er mørk rød til rødlig- brun i farve.

3

DK 165990 B

Væksten på Czapek's agar substrat ved 25°C er meget langsom, og koloniernes diameter når 1,6 - 1,8 centimeter 10 dage efter tilsåningen.

5 Væksthastighederne på hver af de oven for nævnte substrater ved 37°C er i det væsentlige lig med væksthastighederne ved 25°C.

2. MORFOLOGISKE EGENSKABER

10 Kleistotesia er sfæriske og 30 - 60 mikron i diameter; deres vægge er hvide og membranagtige; deres stilke har skillevægge, og hver består af en hyfe med en diameter på 3,5 - 4,5 mikron og en længde på 15 - 80 mikron. Sporesækken består af 8 sporer, og den er næsten sfærisk og svinder hurtig bort. Ascosporerne 15 er farveløse og ovoide eller elipsoide; de har en størrelse på 4 - 5 x 4 - 7 mikron; og deres overflade er glat. Conidia er farveløse og sfæriske eller pæreformede; deres størrelse er 6-9x6-11 mikron; deres basis er lige afskåret og deres vægge er forholdsvis tykke og glatte. Conidia er knyt-20 tet midtpunktflyende til hinanden som en slags dannelses vævs arthrospore. Conidiophoren er som en vegetativ hyfe og er forgrenet eller uforgrenet; Conidia dannes ved toppen. Mycelierne er farveløse og forgrenede og har skillevægge; de fleste af dem har en diameter på 3 - 5 mikron.

25

Baseret på disse observationer af egenskaberne identificeredes mikroorganismen som en stamme af Monascus ruber van Tieghem.

De mikrobiologiske egenskaber af Monascus ruber er angivet 30 i følgende litteratur: Takada, Transactions of the Micological

Society of Japan, 9^,125 - 130 (1969) [Materials for the Fungus Flora of Japan (7)], og van Tieghem, Bull, Soc.Botan.France, 31, 227 (1884). Ascosporedannelse af arten er omtalt af Cole et al in the Canadian Journal of Botany, £6, 987 (1968), 35 "Conidium Ontogeny in hyphomyceres. The imperfect state of

Monascus ruber and its meristem arthrospores".

4

DK 165990 B

Andre stammer af arten Monascus ruber, der er i stand til at producere monacolin K, kan anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

5 Ved dyrkningen anvendes metoder, som er velkendte af fagmanden til dyrkning af svampe og andre mikroorganismer. F.eks. kan den monacolin K-producerende mikroorganisme først dyrkes på en passende substrat, og herefter kan de frembragte mikroorganismer indsamles og udsås og dyrkes i et andet vækstsubstrat 10 for at frembringe det ønskede monacolin K; dyrkningssubstratet anvendt til opformering af mikroorganismerne og til produktion af monacolin K kan være det samme eller forskelligt.

Et hvilket som helst dyrkningssubstrat, der kendes af fagmanden 15 til dyrkning af svampe, kan anvendes, forudsat at det, som det er kendt, indeholder de nødvendige næringsstoffer, specielt en kilde for assimilerbart carbon og en kilde for assimilerbart nitrogen. Eksempler på velegnede kilder for assimilerbart carbon er glucose, maltose, dekstrin, stivelse, lactose, sucrose 20 og glycerol. Af disse kilder foretrækkes specielt glucose, glycerol og stivelse til frembringelsen af monacolin K. Eksempler på velegnede kilder for assimilerbart nitrogen er pepton, kødekstrakt>gær, gærekstrakt, sojabønnemel, jordnøddemel, majsstøbevæske, risskaller og uorganisk nitrogen. Af disse 25 nitrogenkilder foretrækkes specielt pepton. Når man producerer monacolin K, kan et uorganisk salt og/eller et metalsalt eventuelt sættes til dyrkningssubstratet. Yderligere kan en mindre mængde tungmetal også tilsættes.

30 Mikroorganismen dyrkes fortrinsvis under aerobe betingelser, idet man anvender dyrkningsmetoder^ der er velkendte af fagmanden som f.eks. faste kulturer, rystekulturer eller kulturer under gennemluftning og omrøring. Mikroorganismerne vokser inden for et bredt temperaturområde, f.eks. fra 7 til 40°C, men 35 specielt for dannelse af monacolin K er den foretrukne dyrk ningstemperatur inden for området 20 til 35°C.

DK 165990B

5

Under dyrkningen af mikroorganismerne kan produktionen af monacolin K kontrolleres ved at udtage prøver af dyrkningssubstratet og måle den fysiologisk aktivitet af monacolin K i dyrkningssubstratet ved forsøg, der er beskrevet nedenfor. 5 Dyrkningen fortsættes, indtil en væsentlig akkumulering af monacolin K er opnået i dyrkningssubstratet, på hvilket tidspunkt monacolin K kan isoleres og udvindes fra dyrknings -bouillonen ved en hvilken som helst kombination af isoleringsmetoder, der udvælges med hensyn til dets fysiske og kemiske 10 egenskaber. F.eks. kan en hvilken som helst eller alle af følgende isoleringsteknikker anvendes: Ekstraktion af væske fra kulturbouillonen med et hydrofilt opløsningsmiddel (f.eks. diethylether, ethylacetat, chloroform eller benzen); ekstraktion af selve organismen med et hydrofilt opløsningsmiddel 15 (f.eks. acetone eller en alkohol); opkoncentrering; opløsning i et mere polært opløsningsmiddel (f.eks. acetone eller en alkohol); fjernelse af urenheder med et mindre polært opløsningsmiddel (f.eks. petroleumsether eller hexan); gelfiltrering gennem en søjle af et materiale bestående af "Sephadex" 20 (handelsnavn for et materiale, der forhandles af Pharmacia

Co., Ltd., USA); absorptiv chromatografi med aktiv carbon eller silicagel osv. Ved at anvende en passende kombination af disse metoder, kan det omhandlede monacolin K isoleres fra dyrkningsbouillonen som en ren forbindelse.

25

Monacolin K har vist sig at have følgende egenskaber: 1. Farve og form: - farveløse krystaller 2. Smeltepunkt: - 157-159°C (under dekomponering) 30 3. Elementaranalyse: C 71,56%; H 8,85%; 019,59%.

4. Molekylvægt: - 404 (ved massespektrometri): 5. Molekylær formel - C24H36°5· 6. Ultraviolet absorptionsspektrum (methanol): 35 Som vist i fig. 1 er der etmaxdmum. ved 232, 238 og 246 μπι.

6

DK 165990 B

7. Infrarødt absorptionsspektrum (KBr):

Spekteret er som vist i fig. 2.

8. Kernemagnetisk resonansspektrum (60 MHz proton): 5 Spektret fremgår af fig. 3 i deutereret chloroform, idet man anvender tetramethylsilan som indre standard.

13 9. Kernemagnetisk resonans spektrum ( C)-:

Spektret fremgår af fig. 4 i deutereret methanol.

10 10. Opløselighed:

Opløselig i alkoholer (f.eks. methanol, ethanol og propanol), acetone, chloroform, ethylacetat og benzen. Uopløselig i petroleumsether og hexan.

15 2 5 11. Specifik drejning: [cc]D = 307,6 (c=l, methanol).

12. Tyndtlagschromatografi: Rf = 0,47 [Nr. 5715 "Kieselgel 60F254 silicagel (Merck & Co., Ltd) der fremkaldes med 20 en 4:1 rumfangsblanding af methylenchlorid og acetone, synlig som en ultraviolet bestrålingsabsorberende plet, 50 v/v svovlsyre (en svag rød og rødlig brun farve frembringes ved opvarmning) eller med jod].

25 Forbindelsen er neutral og uopløselig i neutrale eller sure vandige substrater. Den omdiannes til en sur forbindelse ved behandling med en alkali, og herefter kan den opløses i vand. Den sure forbindelse kan ekstraheres med ethylacetat eller chloroform ved en sur pH-værdi, og den vil omdannes til 30 monacolin K ved afdampning af opløsningsmidlet.

Den fysiologiske virkning af monacolin K salte kan undersøges og bestemmes kvantitativt ved følgende forsøg.

35 1. Hæmning af cholesterolbiosyntese

Lige som monacolin K selv kan monacolin K salte specifikt vende aktiviteten af 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase, der er det hastighedsbestemmende enzym ved biosyntesen af cholesterol. I tabel 1 anføres koncentrationerne (i ng/ml) 7

DK 165990B

af de omhandlede forbindelser, der hæmmer aktiviteten af 3-hydroxy-3-methylglutaryl (HMG)-CoA reductase med 50 pct. (målt ved metoden beskrevet i Analytical Biochemistry, 383 (1969), og koncentrationerne (i ng/ml) af den omhandlede forbindelse, 5 der hæmmer cholesterolbiosynthesen med 50 pct. [målt ved metoden beskrevet i Journal of Biological Chemistry, 247, 4914 (1972)].

De tilsvarende resultater er også angivet for den kendte forbindelse ML-236B (der er en forbindelse, der vides at have 10 samme type aktivitet, og som fremstilles ved at dyrke mikro organismer af slægten Penicillium, der er omhandlet i engelsk patentskrift nr. 1 453 425). Den koncentration af monacolin K selv, der hæmmer cholesterolbiosynthesen med 50 pct., er også angivet. Det vil fremgå, at medens koncentrationen af 15 ML-236B, der er nødvendig for at hæmme cholesterolbiosynthesen med 50 pct., er 10,0 ng/ml, er den tilsvarende koncentration af natriumsaltet af monacolin K cirka 0,14 ng/mg (dvs. cirka halvfjerds gange bedre). Virkningerne af saltene af monacolin K er sammenlignelige med eller bedre end selve mona-20 colin K.

Tabel 1 25 Forbindelse Koncentration (ng/ml) nødvendig for at hamme med 50 pct.

HMG-CoA cholesterol _ reductase_biosyntese natriumsalt 2,0 0,14 3Q calciumsalt 12,0 1,8 monacolin K - 2,0 ML-236B _10,0_10,0 35 2. Reduktion af blodcholesterolniveauerne

De anvendte forsøgsdyr var rotter af Wistar Imamichistammen, der hver havde en legemsvægt på cirka 300 g. Forsøgene udførtes på grupper af rotter, der hver bestod af fem dyr. Hvert dyr

DK 165990B

8 S) injiceredes intravenøst med 400 mg/kg "Triton'** " WR-1339 (handelsnavn for et materiale, der vides at forøge blodcholesterol-niveauet), medens der samtidigt administreredes en af forbindelserne vist i tabel 2 peroralt i den mængde, der er angivet 5 i tabellen. 20 timer efter den perorale administrering af livedes dyrene ved afblødning, og blod og lever undersøgtes, og deres cholesterolniveauer bestemtes ved almindelige metoder. Resultaterne er angivet i tabel 2, der angiver reduktionen i blod- og levercholesterolniveauer sammenlignet med en kon-10 trolgruppe af rotter, der kun havde fået "Triton®' WR-1339 alene.

For at sammenligne er de tilsvarende resultater angivet for selve monacolin K og for ML-236B, men disse forbindelser ad-15 ministreredes i doser, der var væsentligt større end de doser, der anvendtes af de omhandlede forbindelser, for at opnå en lignende reduktion af cholesterolniveauerne.

Tabel 2 20

Reduktion af cholesterol-Eorbindelse Dosis niveauer (%) i mg/kg blod lever natriumsalt 2 27,5 18/9 25 calciumsalt 5 21,4 17,1 monacolin K 10 22,4 16,7 ML-236B 40 24,6 20,9 30

Reduktionen i blod- og levercholesterolmveauet angives med følgende formel: 1 ", ft) x loo A - B 35

DK 165990 B

hvori A = niveau i gruppe behandlet kun med "Tritor®" WR-1339 9 B = niveau i ubehandlet kontrolgruppe 5 C = niveau i forsøgsgruppe 3. Akut toxicitet

De undersøgte forbindelser var natrium- og calciumsaltene 10 af monacolin K. Man fandt, at den 50 pct. lethale dosis (LD^q) af hver af forbindelserne var mindst 2.000 mg/kg ved intraperi-toneal administrering. Forbindelserne har således særdeles lav toxicitet.

15 Resultaterne viser, at de omhandlede forbindelser hæmmer bio- synthesen af cholesterol, og som et resultat heraf sænker cholesterolniveauet i blod. De er således værdifulde lægemidler ved behandling af hvperlipaemi og arteriosclerose.

20 De omhandlede forbindelser administreres peroralt eller paren- teralt i form af kapsler, tabletter, injicerbare præparater eller på andre velkendte måder, skønt det sædvanligvis foretræk kes at administrere dem peroralt. Dosis afhænger af patientens alder og vægt og tilstand, men sædvanligvis foretrækkes en 25 daglig dosis for en voksen på 0,1 - 100 mg, fortrinsvis 0,1 - 100 mg, når der er tale om monacolin K salte.

Opfindelsen illustreres nærmere i følgende eksempel.

30 EKSEMPEL

Monascus ruber 1005 stammen udsåedes på et flydende væskesubstrat, der indeholdt 6 vægt/vol. glucose, 2,5 vægt/vol. pepton,0,5 vægt/vol. majsstøbevæske og 0,5 vægt/vol.pct. am-moniumchlorid. Dyrkningen fortsattes under aerobe betingelser 35 ved en temperatur på 28°C i 10 dage. Det fremkomne filtrat (5 1) fra dyrkningsbouillonen indstilledes til en pH-værdi på 3 ved tilsætning af 6N saltsyre, hvorefter man ekstraherede med et lige stort rumfang ethylacetat. Opløsningsmidlet afdamp-edes under reduceret tryk fra ekstrakten, og den fremkomne

Claims (4)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af carboxylsyren af en cho-25 lesterolsynteseinhiberende forbindelse kaldet monacolin K og med formlen: 3° V O ^x o^Y^ \ \ 13 35 6 11 DK 165990 B eller alkalisalte deraf, kendetegnet ved, at en stamme af Monascus ruber dyrkes i et dyrkningssubstrat indeholdende assimilerbare carbon- og nitrogenkilder, at et alkali sættes til dyrkningsblandingen til opnåelse af alkalisalte af 5 carboxylsyren af monacolin K, og at man derefter enten isolerer alkalisaltene fra den alkaliske dyrkningsblanding eller ekstraherer syren med et organisk opløsningsmiddel, fortrinsvis med ethylacetat eller chloroform, ved en sur pH-værdi.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at stammen er Monascus ruber stamme 1005 (FERM 4822, NRRL 12073).

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet 15 ved, at dyrkningen udføres ved en temperatur fra 7 til 40eC.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at temperaturen er fra 20 til 35°C. 20 25 30 35