DK149095B - Fremgangsmaade til fremstilling af en cholesterolsynteseinhiberende forbindelse kaldet monacolin k - Google Patents

Description

i 149055

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af en hidtil ukendt cholesterolsynteseinhiberende forbindelse kaldet monacolin K med formlen: HO'y'-'Y0 6 der er ejendommelig ved, at en stamme af Monascus ruber dyrkes i et dyrkningssubstrat indeholdende assimilerbare carbon- og nitrogenkilder, hvorefter monacolin K isoleres fra dyrkningsblandingen.

Høje blodcholesterolniveauer er velkendte for at være en af hovedårsagerne til cardiopati, således som hjerteinfakt eller arterioscelerose. Som et resultat heraf er der foretaget adskillige videnskabelige undersøgelser for at finde fysiologisk acceptable forbindelser, der er i stand til at hæmme cholesterolbiosyntesen og derved reducere blodcholesterol-niveauerne. En af disse forbindelser er ML-236, der omhandles i engelsk patentskrift nr. 1 453 425 og i dansk patentskrift nr. 136.485. ML-236 fremstilles ved at dyrke en mikroorganisme af slægten Penicillium.

Det har nu vist sig, at stammer af arten Monascus ruber, specielt Monascus ruber stamme 1005 (FERM 4822), frembringer en med ML-236 nært beslægtet forbindelse, der har betydelig bedre virkning end ML-236.

Monascus ruber stamme 1005 (FERM 4822) er en for nylig isoleret mikroorganisme, der udviser følgende mikrobiologiske egenskaber. Den isoleredes fra foder produceret i Thailand og deponeredes den 16. februar 1979 under accessionsnummeret FERM 4822 i Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science 2 149095 and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan, og under accessionsnuinmeret NRRL 12073 i Agricultural Research Service, Northern Regional Research Laboratory, USA.

1. Vækst Væksten på et kartoffel-glucose-agar substrat ved 25°C er hurtig, og diameteren af kolonierne når 6 - 6,5 centimeter 10 dage efter tilsåningen. Kolonien er flad og et relativt tyndt basalt lag af hyfer udvikler sig. Udviklingen af lufthyfer er dårlig; lufthyferne er hvide og de fleste af dem er uldagtige. Kleistotesia dannes på det basale lag af hyferne, og de bliver rødligt brune ved modning. Både overfladen og bagsiden af kolonien har brun til rødligt brun farve.

Væksten på Sabouraud's agar substrat ved 25°C er meget hurtig, og koloniernes diameter når 6 - 6,5 centimeter 10 dage efter udsåningen. Overfladen af kolonien er meget flad, og basale hyfer og lufthyfer udvikler sig bedre end på kartoffel-glu-cose-agar substratet. Kleistotesia er meget sparsomme. Overfladen af kolonierne er rødlig-gullig til rødlig-brun i farve, og bagsiden er rødlig-brun til mørkbrun.

Væksten på havremelsagar ved 25°C er langsom, og koloniernes diameter når 1,5 - 2 centimeter 10 dage efter tilsåningen.

Kolonien er flad. Udvikling af lufthyfer og dannelsen af kleistotesia er meget dårlig for begges vedkommende. Både overfladen og den modsatte side af kolonien er mørkrød til rødlig-brun i farve.

Væksten på Czapek's agar substrat ved 25°C er meget langsom, og koloniernes diameter når 1,6 - 1,8 centimeter 10 dage efter tilsåningen.

Væksthastighederne på hver af de oven for nævnte substrater ved 37°C er i det væsentlige lig med væksthastighederne ved 25°C.

149095 3

2. MORFOLOGISKE EGENSKABER

Kleistotesia er sfæriske og 30 - 60 mikron i diameter; deres vægge er tynde og membranagtige; deres stilke har skillevægge, og hver består af en hyfe - med en diameter på 3>5 - 4,5 mikron og en længde på 15 - 80 mikron. Sporesækken består af 8 sporer, og den er næsten sfærisk og svinder .hurtig bort. Ascosporeme er farveløse og ovoide eller elipsoide; de har en størrelse på4-5x4-7 mikron; og deres overflade er glat. Conidia er farveløse og sfæriske eller pæreformede; deres størrelse er 6 - 9 x 6 - 11 mikron; deres basis er lige afskåret og deres vægge er forholdsvis -tykke og glatte. Conidia er knyttet midtpunktflyende til hinanden som en slags dannelse vævs arthrospore. Conidiophoren er som en vegetativ hyfe og er forgrenet eller uforgrenet; Conidia dannes ved toppen. Mycelierne er farveløse og forgrenede og har skillevægge; de fleste af dem har en diameter på 3 - 5 mikron.

Baseret på disse observationer af egenskaberne identificeredes mikroorganismen som en stamme af Monascus ruber van Tieghem.

De mikrobiologiske egenskaber af Monascus ruber er angivet i følgende litteratur: Takada, Transactions of the Micological Society of Japan, 9, 125 - 130 (1969) [Materials for the Fungus Flora of Japan (7)], og van Tieghem, Bull. Soc.Botan.France, 31. 227 (1884). Ascosporedannelsen af arten er omtalt af Cole et al in the Canadian Journal of Botany, 46, 987 (1968), "Conidium Ontogeny in hyphomyceres. The imperfect state οι: Monascus ruber and its meristem arthrospores".

Andre stammer af arten Monascus ruber, der er i stand til at producere monacolin K, kan anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Ved dyrkningen anvendes metoder, som er velkendte af fagmanden til dyrkning af svampe og andre mikroorganismer. F.eks. kan den monacolin K-producerende mikroorganisme først dyrkes på et passende substrat, og herefter kan de frembragte mikroorganismer indsamles og udsås og dyrkes i et andet vaekstsubstrat for at frembringe det ønskede monacolin K; dyrkningssubstratet 4 149095 anvendt til opformering af mikroorganismerne og til produktion af monacolin K kan være det samme eller forskelligt.

Et hvilket som helst dyrkningssubstrat, der kendes af fagmanden til dyrkning af svampe, kan anvendes, forudsat at det, som det er kendt, indeholder de nødvendige næringsstoffer, specielt en kilde for assimilerbart carbon og en kilde for assimilerbart nitrogen. Eksempler på velegnede kilder for assimilerbart carbon er glucose, maltose, dekstrin, stivelse, lactose, sucrose og glycerol. Af disse kilder foretrækkes specielt glucose, glycerol og stivelse til frembringelse af monacolin K. Eksempler på velegnede kilder for assimilerbart nitrogen er pepton, kødekstrakt, gær, gærekstrakt, sojabønnemel, jordnøddemel, majsstøbevæske, risskaller og uorganisk nitrogen. Af disse nitrogenkilder foretrækkes specielt pepton. Når man producerer monacolin K, kan et uorganisk salt og/eller et metalsalt eventuelt sættes til dyrkningssubstratet. Yderligere kan en mindre mængde tungmetal også tilsættes.

Mikroorganismen dyrkes fortrinsvis under aerobe betingelser, idet man anvender dyrkningsmetoder, der er velkendte af fagmanden som f.eks. faste kulturer, rystekulturer eller kulturer under gennemluftning og omrøring. Mikroorganismerne vokser inden for et bredt temperaturområde, f.eks. fra 7 til 40°C, men specielt for dannelse af monacolin K er den foretrukne dyrkningstemperatur inden for området 20 til 35°C.

Under dyrkningen af mikroorganismerne kan produktionen af monacolin K kontrolleres ved at udtage prøver af dyrkningssubstratet og måle den fysiologiske aktivitet af monacolin K i dyrkningssubstratet ved forsøg, der er beskrevet nedenfor. Dyrkningen fortsættes, indtil en væsentlig akkumulering af monacolin K er opnået i dyrkningssubstratet, på hvilket tidspunkt monacolin K kan isoleres og udvindes fra dyrkningsbouillonen ved en hvilken som helst kombination af isoleringsmetoder, der udvælges med hensyn til dets fysiske egen- 149095 5 skaber. F.eks. kan en hvilken som helst eller alle af følgende isoleringsteknikker anvendes: Ekstraktion af væske fra kulturbouillonen med et hydrofilt opløsningsmiddel (f.eks. diethylether, ethylacetat, chloroform eller benzen); ekstraktion af selve organismen med et hydrofilt opløsningsmiddel (f.eks. acetone eller en alkohol); opkoncentrering; opløsning i et mere polært opløsningsmiddel (f.eks. acetone eller en alkohol); fjernelse af urenheder med et mindre polært opløsningsmiddel (f.eks. petroleumsether eller hexan); gelfiltrering gennem en søjle af et materiale bestående af "Sephadex1* (handelsnavn for et materiale, der forhandles af Pharmacia Co. , Ltd., USA); absorptiv chromatografi med aktiv carbon eller silicagel osv. Ved at anvende en passende kombination af disse metoder, kan det omhandlede monacolin K isoleres fra dyrkningsbouillonen som en ren forbindelse.

Monacolin K har vist sig at have følgende egenskaber: 1. Farve og form : - farveløse krystaller 2. Smeltepunkt: - '157-159°C (under dekomponering) 3. Elementaranalyse: C 71,56$; H 8,85$; O 19,59$.

4. Molekylvægt: - 404 (ved massespektrometri): ^ Molekylær formel - C24®3gO * 6. Ultraviolet adsorptionsspektrum (methanol):

Som vist i fig. 1 er der et neximum ved 232, 238 og 246 μιη.

7. Infrarødt adsorptionsspektrum (KBr):

Spekteret er som vist i fig. 2.

8. Kernemagnetisk resonansspektrum (60 MHz proton):

Spektret fremgår af fig. 3 i deutereret chloroform, idet man anvender tetramethylsilan som indre standard.

9. Kernemagnetisk resonansspektrum (^C):

Spektret fremgår af fig. 4 i deutereret methanol.

6 U9095 10. Opløselighed:

Opløselig i alkoholer (f.eks. methanol, ethanol og propanol), acetone, chloroform, ethylacetat og benzen.

Uopløselig i petroleumsether og hexan.

11. Specifik drejning: [a]^ = 307,6 (c=l, methanol).

12. Tyndtlagschromatografi: Rf = 0,47 [Nr. 5715 "Kieselgel silicagel (Merck & Co., Ltd) der. fremkaldes med en 4:1 rumfangsblanding af methylenchlorid og acetone, synlig som et ultraviolet bestrålingsabsorberende plet, 50 v/v svovlsyre (en svag rød til rødlig brun farve frembringes ved opvarmning) eller med jod].

Forbindelsen er neutral og uopløselig i neutrale eller sure vandige substrater. Den omdannes til en sur forbindelse ved behandling med et alkali, og herefter kan den opløses i vand. Den sure forbindelse kan ekstraheres med ethylacetat eller chloroform ved en sur pH-værdi, og den vil omdannes til monacolin K ved afdampning af opløsningsmidlet.

Den fysiologiske virkning af monacolin K kan efterprøves og bestemmes kvantitativt ved følgende in vivo forsøg.

In vivoforsøq med kaniner.

I dette forsøg måltes monacolin K's evne til at reducere cholesterolniveauet i kaninblod. De anvendte dyr vejede fra 2,5 til 3,0 kg. Lige inden forsøgets start opsamledes blod fra en vene i kaninens øre, og man målte cholesterol-niveaufet i blodserumet ved den almindelig anvendte metode.

En forudbestemt mængde af monacolin K administreredes herefter peroralt kontinuert i 1 til 5 dage, og cholesterolniveauet i blodserumet efter administreringen måltes. Styrken af monacolin K eller det monacolin K-holdige dyrkningssubstrat kan bestemmes kvantitativt ud fra cholesterolværdierne opnået inden og efter administreringen af monacolin K.

7 149095

Der påvises en evne for monacolin K til at sænke blod og levercholesterolniveaueme ved forskellige in vivo-forsøg.

Reduktion af blodcholesterolniveaueme hos rotter

De anvendte dyr var rotter af Wistar Imamichi-stammen, der hver havde en legemsvægt på ca. 300 g. Forsøgene udførtes på grupper af rotter, idet hver. gruppe bestod af fem dyr. Hvert dyr injiceredes intravenøst med 400 ' mg/kg "Triton^" WR-1339,. (et handelsnavn for en forbindelse, der er kendt for at hæve blodcholesterolniveauet), medens man samtidig administrerede 10 mg/kg monacolin K intra- ,i peritonealt. 24 timer efter den . .intraperi tonea le administrering aflivedes rotterne ved afblødning, og man opsamlede blodet, og cholesterolniveauet heri bestemmes ved almindelige metoder. Herved fremgik det, at blodcholesterolniveaueme var blevet reduceret med 23,9% i forhold til kontrolgruppen af dyr, til hvilken man kun havde givet "Triton®" WR-1339.

Reduktion af blodcholesterolniveaueme hos kaniner

De anvendte forsøgsdyr var kaniner, der havde en legemsvægt på fra 2,7 til 2,9 kg. Hver kanin blev peroralt indgivet 1 mg/kg monacolin K to gange dagligt (morgen og aften) igennem 5 dage. Inden administreringen og ved 3· og 5. dag efter administreringen opsamledes blod fra en vene i øret, og cholesterolniveauerne i blodserumet bestemtes.

Heraf fremgik det, at cholesterolniveauerne ved den 3. og 5. dag efter administreringen af monacolin K og henholdsvis 15 og 29% lavere end niveauet inden administreringen .af. monacolin K.

Ud over den værdifulde hæmmende virkning på biosyntesen af cholesterol, har monacolin K en meget lav toxicitet.

Den akutte perorale toxicitet (LD^q) af monacolin K i mus er 1 g/kg legemsvæg eller mere.

149095 8

Monacolin K kan administrere s peroralt eller parenteralt i form af kapsler, tabletter, injicerbare præparater eller i en anden velkendt præparatform, skønt det sædvanligvis foretrækkes at administrere det peroralt.

Dosis varierer afhængigt af patientens alder og legemsvægt og sygdommens alvorlighed, men sædvanligvis administreres en daglig dosis til voksne på 0,5 til 50 mg enten som en enkelt dosis eller i to eller tre opdelte doser. Imidlertid kan på grund af forbindelsens lave toxicitet højere doser anvendes, dersom det ønskes.

Opfindelsen illustreres nærmere i følgende eksempel.

EKSEMPEL

Monascus ruber 1005 stammen udsåedes på et flydende væske-substrat, der indeholdt 6 vægt/vol. glucose, 2,5 vægt/vol. pepton, 0,5 vægt/vol. majsstøbevæske og 0,5 vægt/vol.pot. ammoniumchlorid. Dyrkningen fortsattes under aerobe betingelser ved en temperatur på 28°C i 10 dage. Det fremkomne filtrat (5 l) fra dyrkningsbouillonen indstilledes til en pH-værdi på 3 ved tilsætning af 6N saltsyre, hvorefter man ekstraherede med et lige stort rumfang ethylacetat. Opløsningsmidlet afdampedes under reduceret tryk fra ekstrakten, og den fremkomne remanens opløstes i 100 ml benzen. Uopløselige rester filtreredes fra.

Filtratet vaskedes to gange, hver gang med 100 ml af en 5 vægt/vol. vandig opløsning af natriumbicarbonat. 100 ml .af en 0,2N vandig opløsning af natriumhydroxid sattes herefter til det vaskede filtrat, og blandingen omrørtes ved stuetemperatur. Efter at have undersøgt, at monacolin K var forsvundet fra benzenlaget ved tyndtlagschromatografi, fraskiltes det vandige lag. pH-værdien af det vandige lag' indstilledes til 5 ved hjælp af 6N saltsyre, og den fremkomne opløsning ekstraheredes to gange, hver gang med 100 ml ethylacetat. Ekstrakten inddampedes til tørhed under reduceret tryk, hvorved man fik 260 mg olie. Denne olie opløstes i benzen, og man lod den udkrystallisere