SE453301B - Antihyperkolesterolemiskt medel, monakolin k, forfarande for framstellning derav samt farmaceutisk komposition innehallande detsamma - Google Patents

Description

55 453 301 2 Föreliggande uppfinning avser vidare ett förfarande för fram- ställning av ett antihyperkolestrolemiskt medel benämnt monakolin K, vilket förfarande omfattar odling av en monakolin K-alstrande mikroorganism av släktet Monascus i ett därför avsett odlingsmedi- um.

Föreliggande uppfinning avser likväl vidare en farmaceutisk komposition, som omfattar monakolin K i blandning med en farmaceu- tiskt godtagbar bärare eller ett farmaceutiskt godtagbart spädnings- medel.

Höga kolesterolhalter i blodet är erkända såsom varande en av huvudorsakerna till kardiopati, såsom hjärtinfarkt eller arterio- skleros. Såsom resultat har átskillig forskning företagits med av- sikt att hämma kolesterolbiosyntesen och sålunda minska kolesterol- halterna i blodet. En sådan förening är ML-236, som är föremål för den brittiska patentskriften l 455 425. ML-236 alstras genom att od- la mikroorganismer av släktet Penícillium.

Vid undersökning av svampar av släktet Monascus visade det sig, att dessa, speciellt Monascus ruber stam 1005 (FERM 4822), alstrade ett antihyperkolesteroiemiskt medel med väsentligt bätt- re aktivitet ün den för ML-236. Detta medel benämndes monakolin K.

Alla mikroorganismer av släktet Monascus, som är i stånd att alstra monakolin K,kan användas i förfarandet enligt föreliggande uppfinning. Speciellt användbara är stammar av Monascus ruber, speciellt Monascus ruber stam 1005 (FERM 4822 Monascus ruber stam l005 (FERM 4822) är en nyligen isolerad mikroorganism med följande mikrobiologiska egenskaper. Den isole- rades frän födoämnen, som alstrats i Thailand,och deponerades den l 16 februari 1979 under tillträdesnumret FERM 4822 i Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan och under tillträdesnumret NRRL 12075 i the Agricultural Research Service, Northern Regional Research Laboratory, USA. 1. Tillväxt Å Tillväxten på ett potatis-glukos-agar-medium vid 25 OC är É snabb och diametern av kolonien uppnår 6 - 6,5 cm 10 dagar efter ympningen. kolonien är plan och ett relativt tunt grundskikt av hyfer utvecklas. Utveckling av lufthyfer är dålig; lufthyferna är vita och de flesta av dem är ulliga. Många cleistothecia bildas på grundskiktet av hyfer och blir rödaktigt bruna vid mognad. Både 40 ° 453 301 ytan och baksidan av kolonien är brun till rödaktigt brun i färg.

Tillväxten på Sabourauds agarmedium vid 25 OC är mycket snabb och koloniens diameter uppnår 6-6,5 cm 10 dagar efter ympningen.

Koloniens yta är mycket plan, och grundhyfer och lufthyfer ut- vecklas bättre än på potatis-glukos-agar-medlet. Antalet cleisto- thecia är mycket få. Koloniens yta är rödaktigt gul till rödak- tigt brun i färg och baksidan är rödaktigt brun till mörkt brun.

OC är långsam och kolo- _ Tillväxten på havremjölsagar vid 25 niens diameter uppnår 1,5 - 2 cm 10 dagar efter ympningen. Kolo- nien är plan. Utveckling av lufthyfer och bildning av cleisto- thecia är båda mycket dåliga. Både ytan och baksidan av kolonien är mörkt röda till rödaktigt bruna i färg.

Tillväxten på Czapeks agarmedium vid 25 OC är mycket långsam och koloniens diameter uppnår 1,6 - 1,8 cm lO dagar efter ympningen.

Tillväxthastigheterna pa vardera av ovanstående medier vid 37 OC är väsentligen lika med de vid 25 OC. 2- Morfologiska egenskaper Cleistothecia är sfäriska och 30 - 60 um i iiameter: deras väggar är tunna och membranlika; deras stjälkar har skiljeväggar och består vardera av en hyf med diametern 5,5 4,5 um och längden lå - 80 um. Sporsäcken består av S sporer och är nästan sfärisk och försvinnande liten. Askosporerna är färgïösa och äggformiga eller ellipïoída. De har en storlek av 4-5 x 4-7 um och deras ytor är jäm- na. Konidierna är färglösa och sfäriska eller pyramidformiga; deras storlek är 6 - 9 x 6 - ll um, deras baser är stympade och deras väg- gar relativt tjocka och jämna. Konidierna är förenade basipetalt såsom en typ av mcristem atrospor. Konidioforen är lik en vegetativ hyf och är grenad eller ogrenad; konidierna bildas vid toppen. Myce- lierna är färglösa och grenade och har skiljeväggar; de flesta av dem har en diameter av 3-5 um.

Grundat på observationerna av dessa. kännetecken som rappor- terats ovan, identifierades denna mikroorganísm såsom en stam av Monascus ruber van Tieghem.

Nikrobiologiska egenskaper av Nonascus ruber har rapporterats i följande litteratur: Takada, Transactions of the Micological So- ciety of Japan, 2, 125-150 (1969) (Materials for the Fungus Flora of Japan (7)) och van Tieghem, Bull. Soc. Botan. France, ål, 327 (1884). Askosporalstring av stammen har rapporterats av Cole et al i the Canadian Journal of Botany, gg, 987 (1963), "C0flídíUm Ontogeny in hyphomycetes. The imperfect state of Monascus ruber /Ä _ zs 40 453 301 A and its meristem arthrospores." Fastän användningen av Monascus ruber stam 1005 härefter sär- skilt är exemplifierad, kommer det inses, att vilka stammar som helst av släktet Monascus omfattande varieteter och mutanter, som är i stånd att alstra monakolín K kan användas i förfarandet en- ligt föreliggande uppfinning.

Monakolin K kan alstras genom att odla den valda mikroorga- nismen i en odlingslösning under aeroba förhållanden under använd- ning av samma förfaranden som är välkända för fackmannen vid od- ling av svamp och andra mikroorganismer. Exempelvis kan den monako- lín K-alstrande mikroorganismen först odlas på ett lämpligt medium och sedan kan de alstrade mikroorganísmerna uppsamlas och inympas och odlas på ett annat odlíngsmedium för att alstra önskat monako- lin K; odlingsmedlet, som användes för mångfaldigande av mikroor- ganismen och för alstring av monakolín K kan vara lika eller olika.

Varje odlíngsmedium välkänt för fackmannen för odling av svamp kan användas förutsatt att det innehåller, som är välkänt, de nöd- vändiga näringsmaterialen, speciellt en assimilerbar kolkälla och en assimilerbar kvävekälla. Exempel på lämpliga källor med assimilerbart kol är glukos, maltos, dextrin, stärkelse, laktos, sackaros och glycerol. Av dessa källor är glukos, glycerol och stärkelse speci- ellt lämpliga för alstring av monakolín K. Exempel på lämpliga källor av assimilerbart kväve är pepton, köttextrakt, jäst, jäst- extrakt, sojabönmjöl, jordnötsmjöl, majsstöpvatten, riskli och o- organiska kvävekällor. Av dessa kvävekällor är pepton speciellt lämpligt. När man alstrar monakolín K kan ett oorganískt salt och/ eller ett metallsalt, om så är nödvändigt,sättas till odlingsmediet.

Dessutom kan om_såenfonhas en mindre mängd av en tungmetall även tillsättas.

Mikroorganismen odlas lämpligen under aeroba förhållande un- der användning av odlingsmetoder välkända för fackmannen, t ex odling i fast fas, skakodling eller odling under luftning och omröring. Mikroorganismen kommer att gro över ett brett tempera- turomráde, t ex fràn 7 till 40 OC, men speciellt för alstring av monakolín K ligger den mera lämpliga odlingstemperaturen inom om- rade: från zo :iii ss °c.

Under odling av míkroorganismen kan alstringen av monakolín k' registreras genom provtagning av odlingsmediet och mätning av den fysiologiska verkan av monakolín K i odlingsmediet genom testet, som beskrives härefter. Odling kan sedan fortsättas, till en vä- sentlig ackumulering av monakolín K har uppnåtts i odlingsmediet, 453 501 vid vilken tidpunkt monakolin K kan isoleras och utvinnas från od- lingslösningen genom vilken lämplig kombination av valda ísolerings- metoder som helst med hänsyn till dess fysikaliska och kemiska egen- skaper. Exempelvis kan vilken som helst eller alla av följande iso- leringsmetoder användas: extraktion av vätskan från odlingslösningen med ett hydrofilt lösningsmedel (t ex díetyleter, etylacetat, klo- roform eller bensen); extraktion av organismen med ett hydrofílt lösningsmedel (såsom aceton eller en alkohol); koncentrering: upp- lösning i ett mer polârt lösningsmedel (t ex aceton eller en al- ï0 kohol); borttagande aviïüormfingarmed ett mindre polärt lösningsme- del (såsom petroleumetcr eller hexan); gelfiltrering genom en ko- lonn av ett material såsom Sephadex® (ett olösligt hydrofilt ämne som framställts genom tvärbindning av dextran och som är tillgängligt från Pharmacia, Co. Ltd, USAJ; absorptiv kromatografi med aktivt kol eller silikagel; osv. Genom att använda en lämplig kombination av dessa metoder, kan önskat monakolín K isoleras från odlingsbul- jongen såsom en ren substans.

Monakolin K har visat sig ha följande egenskaper: l. Färg och form: Färglösa kristaller 2. Smältpunkt: 157-159°C (med sönderdelning) 3. Elementaranalysz C, 71,56 %; H, 8,85 %; 0, 19,59 %. 4. Molekylvikt: 404 (genom masspektrometri) . Molekylformelz C H O 24 36 5' 6. Ultraviolett absorptionsspektrum (metanol): Såsom visas i figur 1 i vidföljande ritningar med maxima vid 232, 238 och 246 nm. 7. lnfrarött absorptionsspektrum (KBr): Såsom visas i figur 2 i vidföljande ritningar. 8. Kärmagnetiskt resonansspektrum (60 MHz proton): Såsom visas i figur 3 i vidföljande ritningar i denaturerad kloroform under användning av tetrametylsilan såsom inre standard. 9. Kärnmagnetiskt resonansspektrum (13C): Såsom visas i figur 4 i vidföljande ritningar i denaturerad 40 metanol.

. Löslíghetz Löslig i lågalkoholer (t ex metanol, etanol och propnnol), 40 453 301 aceton, kloroform, etylacetat och bensen.

Olöslig i petroleumeter och hexan. ll. Specifík vridning: (al äs = + 307,6 (c = l, metanol)._ 12. Tunnskiktskromatografi Rf = O,47(Nr. S715 Kiselgel 60F254 silikagel (Merck & Co., Ltd) framkallad av en 4:1 i volym blandning av metylenklorid och ace- ton, püvisbar såsom en ultraviolett strâlningsabsorberande mas- sa, 50 % volym/volym svavelsyra (en blekt röd till rödaktigt brun färg framkallas vid upphettning) eller med jod).

Föreningen är neutral och är olöslig i neutralt och surt vat- tenhaltigt medium. Den omvandlas till en sur substans vid behand- ling med ett alkali och kan sedan upplösas i vatten. Denna sura substans kan extraheras med etylacetat eller klorofom vid surt pH-värde och kommer att återgå till monakolin K vid indunstníng av lösningsmedlet.

Den fysiologiskaveflænravnnnakolin K kan prövas och bestämmas kvantitativt genom följande in vivo försök.

In vivo försök med kaniner I detta försök mätes förmågan av monakolin K att minska kole- sterolhalterna i kaninblod. De använda djuren skall väga från 2,5 tíll3ß1qLOmedäbart innan början av försöket uppsamlas blod från venen i ett öra hos varje kanin och kolesterolhalten i blod- serumet mätes med en konventionell metod. En förutbestämd kvan- titet av monakolin K administreras sedan oralt kontinuerligt i 1 till 5 dagar och kolesterolhalten i blodserumet efter administre- ring mätes. Styrkan av monakolin K eller det monakolin K - inne- hållande odlingsmediet kan bestämmas kvantitativt från kolesterol värdena, som erhålles innan och efter administrering av monakolin K.

Förmågan av monakolin K att sänka kolesterolhalterna i blod och lever har visats genom olika in vivo-försök.

Reduktion av kolesterolhalterna i blod hos råttor._ Använda djur var råttor av Wistar Imamichi-stammen, vardera med en kroppsvikt på ca 300 g. Försöken utfördes pà grupper av råttor, varje grupp bestående av 5 djur. Varje djur injicerades intravenöst med 400 mg/kg Triton-WR-l359® (ett material känt att öka kolesterolhalten i blod), under samtidig administrering intra- peritonealt av 10 mg/kg monakolin K. 14 timmar efter intraperito- ,_~ ___* s ra-.fw ~_.-..,.___, UI UI 40 7 _ , _ __ 453 301 neal administrering dodades ráttorna genom förblödning och blodet uppsamlades och dess kolesterolhalt bestämdes på konventionellt blodet hade reducerats med 23,9 % jämfört med en kontrollgrupp av djur, sätt. Såsom resultat fastställdes att kolesterolhalterna i till vilken Triton WR-l339® ensamt hade administrerats.

Reduktion av kolesterolhalterna i blod hos kaniner.

Använda försöksdjur var kaniner med en kroppsvikt från 2,? kg till 2,9 kg. Varje kanin gavs oralt l mg/kg monakolin K två gånger varje dag (morgon och kväll) kontinuerligt i 5 dagar. Innan admi- nístreríngen och 3 till 5 dagar efter administreringen uppsamla- des blod från en Såsom ven i örat och kolesterolhalterna i blodserumet bestämdes. ett resultat visade det sig att kolesterolhalter- och 5 dagar efter administreringen av monakolin K var 15 29 % lagre än halten innan administreringen av monako- na 3 respektive lin K.

Förutom dess värdefulla hammande verkan på hiosyntesen av kolesterol har monakolin K en mycket lag toxicitet. Sålunda är den akuta orala toxiciteten (LDSU) av monakolin K för mus l g/kg kropps- vikt eller mera.

Monakolin K kan administreras oralt eller parenteralt i form av en kapsel, tablett, injicerbart preparat eller vilken annan känd beredning som helst, fastän man normalt föredrar att administrera den oralt. Dosen kommer att variera, beroende pa patientens ålder och kroppsvikt och tillstândets allvar men i allmänhet skulle den dagliga dosen för en vuxen vara fran 0,5 till 50 mg, antingen som en enda dos eller 2 eller 3 delade doser. Med hänsyn till förening- ens laga toxicitet kan emellertid högre doser användas, om sz behövs.

Föreliggande uppfinning belyses ytterligare med följande inte begränsande exempel.

Exempel Monascus ruber stam 1005 ympades pa ett vatskeformigt od- lingsmedium, som innehöll 6 % vikt/volym glukos, % vikt/volym pepton, 0,5 $ vikt/volym majsstöpvätska och 0,5 $ vikt/volym ammo- níumklorid. Odling fortsattes under aeroba förhållanden vid en V av 28 OC i 10 dagar. Erhallet filtrat (5 liter) av od- 3 genom tillsats , , _,5 temperatur lingslösningen reglerades till ett pH-värde av av 6 N saltsyra och extraherades sedan med en lika volym av etyl- acetat. Lösningsmedlet indunstades under reducerat tryck från ex- traktet och erhållen återstod löstes i 100 ml bensen. Olösliga ma- 40 453 301 terial avfiltrcrades.

Filtratet tvättades sedan tvâ gånger, var gång med 100 ml av en 5 % vikt/volym vattenhaltig lösning av natriumbikarbonat. 100 ml av en 0,2 N vattenhaltig lösning av natriumhydroxid sattes sedan till det tvättade filtratet och blandningen omrördes vid rumstem- peratur. Efter bestämning av försvinnandet av monakolin K från ben- senskíktet genom tunnskiktskromatografí, separerades det vatten- haltiga skiktet_ pH-värdet hos det vattenhaltiga skiktet reglera- des sedan till 5 genom tillsats HVÖN saltsyra och erhàllen lösning extraherades två gånger, var gång med 100 ml etylacetat. Extraktet indunstades till torrhet under reducerat tryck för att ge 260 mg av en olja. Denna olja löstes i bensen och tilläts kristallisera och omkristalliserades sedan frán_en vattenhaltig acetonlösníng för att ge S7 mg färglösa nålar av monakolin K med tidigare be- skrivna egenskaper.

Claims (5)

9 453 301 Patentkrav

1. Förening till awvärdning som ett antihyperkolesterolemiskt medel och ett antihypnrlipemiskt medel, kännetecknad därav, att den utgöres av monakolin K med formeln eller denna förening i form av den fria syran eller ett salt därav.

2. Förfarande för framställning av ett antihyperkolesterolemiskt medel betecknat monakolin K med formaln Ä? 7 8\ I i 3 . ° \ \/\\ 5 f] kännetecknat därav, att en monakolin K-alstrande mikroorganism av släktet Monascus odlas i ett lämpligt näringsmedium inne- hållande åtminstone en assimilerbar kolkälla och en assimiler- bar kvävekälla. 10

3. är en stam av Monascus ruber. Förfarande enligt krav 2, kännetecknat av att mikroorganismen

4. Förfarande enligt någon av kraven 2-3, kännetecknat därav, att odlingen utföres vid en temperatur från 7 till 4OOC. 5. Förfarande enligt krav 4, kännetecknat därav, att temperaturen är från 20 till 3s°c.

5. Farmaceutisk komposition, som omfattar en aktiv beståndsdel i blandning med en farmaceutiskt godtagbar bärare eller ett farmaceutiskt godtagbart spädningsmedel, kännetecknad därav, att den aktiva beståndsdelen är monakolin K med formeln