KR100710500B1 - 홍국균을 이용한 모나콜린 ｋ 생산방법 - Google Patents
홍국균을 이용한 모나콜린 ｋ 생산방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR100710500B1 KR100710500B1 KR1020050041733A KR20050041733A KR100710500B1 KR 100710500 B1 KR100710500 B1 KR 100710500B1 KR 1020050041733 A KR1020050041733 A KR 1020050041733A KR 20050041733 A KR20050041733 A KR 20050041733A KR 100710500 B1 KR100710500 B1 KR 100710500B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- monacolin
- buckwheat
- culture
- production
- msg
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
- C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L7/00—Cereal-derived products; Malt products; Preparation or treatment thereof
- A23L7/10—Cereal-derived products
- A23L7/104—Fermentation of farinaceous cereal or cereal material; Addition of enzymes or microorganisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D309/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom, not condensed with other rings
- C07D309/16—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom, not condensed with other rings having one double bond between ring members or between a ring member and a non-ring member
- C07D309/20—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom, not condensed with other rings having one double bond between ring members or between a ring member and a non-ring member with hydrogen atoms and substituted hydrocarbon radicals directly attached to ring carbon atoms
- C07D309/22—Radicals substituted by oxygen atoms
Abstract
본 발명은 홍국균을 이용한 모나콜린 K 생산방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 홍국균을 껍질을 벗기지 않은 발아된 메밀을 기질로 함유하는 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 모나콜린 K(Monakolin K)의 생산방법에 관한 것이다.
본 발명에서는, 콜레스테롤 생합성 저해 기능을 가진 monacolin K 고생산하는 홍국균을 선발하였으며, 이 선발된 홍국균의 monacolin K 생산성을 우수히 향상시키는 껍질을 벗기지 않은 발아된 메밀을 새로운 기질로써 사용하였으며, 선발된 껍질을 벗기지 않은 발아된 메밀 홍국의 monacolin K 고생산을 위하여 새로운 고체배양 기술을 적용하였다.
Description
도 1은 monacolinK (a) 와 extracted sample (b)의 HPLC 분석 결과이다.
도 2 및 3은 각 균부별 고체배지에서 monacolin K의 농도(mg/kg)를 나타내는 그래프이다.
도 4는 다양한 곡류의 monacolin K 생산능에 대한 효과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 Monascus purpureus ATCC 6405에 의해 발효된 다양한 곡류 홍국을 촬영한 사진들이다.
도 6은 Monascus purpureus ATCC 6405에 의한 다양한 탄소원의 Monacolin K 생산능에 대한 효과를 나타난 그래프이다.
도 7은 Sucrosee의 농도에 따른 Monacolin K 생산능을 나타낸 그래프이다.
도 8은 Monascus purpureus ATCC 6405에 의한 다양한 질소원의 Monacolin K 생산능에 대한 효과를 나타난 그래프이다.
도 9는 MSG의 농도에 따른 Monacolin K 생산능을 나타낸 그래프이다.
도 10은 Monascus purpureus ATCC 6405에 의한 다양한 유기화합물의 Monacolin K 생산능에 대한 효과를 나타난 그래프이다.
도 11은 Olive oil의 농도에 따른 Monacolin K 생산능을 나타낸 그래프이다.
도 12는 Monascus purpureus ATCC 6405에 의한 다양한 미네랄의 Monacolin K 생산능에 대한 효과를 나타난 그래프이다.
도 13은 FeSO4의 농도에 따른 Monacolin K 생산능을 나타낸 그래프이다.
도 14는 Monascus purpureus ATCC 6405에 의한 다양한 온도 조건의 Monacolin K 생산능에 대한 효과를 나타난 그래프이다.
도 15는 Monascus purpureus ATCC 6405에 의한 다양한 pH 조건의 Monacolin K 생산능에 대한 효과를 나타난 그래프이다.
도 16은 Monascus purpureus ATCC 6405에 의한 다양한 접종량의 Monacolin K 생산능에 대한 효과를 나타난 그래프이다.
도 17은 Monacolin K production의 Main effects plot이다.
도 18은 Monacolin K production의 Interaction plot이다.
도 19는 Monacolin K production의 Three-dimensional response surface plots이다.
도 20은 Monacolin K production의 Contour plot이다.
도 21은 Desirability의 Three-dimensional response surface plots이다.
도 22는 Estimated response surface의 Contour plot이다.
본 발명은 홍국균을 이용한 모나콜린 K 생산방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 홍국균을 껍질을 벗기지 않은 발아된 메밀을 기질로 함유하는 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 모나콜린 K(Monakolin K)의 생산방법에 관한 것이다.
홍국 (紅麴)은 붉은 누룩이라는 뜻으로 쌀을 홍국균(Monascus sp.)으로 고체발효시킨 것으로 중국 한(漢)나라황제 유방이 처음 황실 음식으로 채택한 이래 조선 중기 우리나라에 유입되어 한방에서 어혈 해소제로 사용되고 있다. 특히 혈압을 떨어뜨리는데 효과가 높아 이미 홍국을 활용한 여러 가지 기능성 제품들이 선보이고 있다.
또한, 홍국은 모나콜린 K (monacolin K, 또는 lovastatin으로 불림)라고 불리는 강력한 콜레스테롤 생합성 저해물질을 생성하는 것으로 알려져 주목의 대상이 되고 있다. 모나콜린 K는 1979년 일본의 엔도 아키라(Endo, A.) 교수가 처음 발견한 물질로서, 모나콜린 J, L 등 홍국에 함유된 전체 모나콜린계의 약 80%를 차지하며, 콜레스테롤 생합성 경로에서 HMG-CoA 환원효소(HMG-CoA reductase)를 특이적으로 억제함으로써 강력한 콜레스테롤 생합성 저해작용을 나타내는 것으로 보고되어 있다 (참조: Endo, A., Monacolin K, A new hypocholestrolemic agent produced by a Monascusspecies, J. Antibiotics. 32: 852-854, 1979; Endo, A., Monacolin K, A new hypocholestrolemic agent that specifically inhibits 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase, J. Antibiotics. 33: 334-336, 1980). 또한, 모나콜린 K는, 소량 투여로 각종 동물(토끼, 개, 원숭이 등)의 혈중 콜레스테롤을 저하시킬 뿐 아니라 (참조: Kovanen, P. T. 등, Regulatory role for hepatic low density lipoprotein receptors in vivoin the dog, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 78 : 1194-1198, 1981; Kroon, P. A. 등, The effect of mevinolin on serum cholesterol levels of rabbits with endogenous hypercholesterolemia, Atherosclersis, 44: 41-48, 1982), 중증의 고콜레스테롤 혈증 환자에 대해서도 극히 유효한 것으로 보고되었으며 특히 동맥경화에서 가장 좋지 않은 것으로 되어 있는 LDL 콜레스테롤을 우선적으로 낮추는 작용이 있는 것이 큰 특징으로 알려져 있다 (참조: Bilheimer, D. W. 등, Mevinolin and colestipol stimulate receptor-mediated clearance of low density lipoprotein from plasma in familial hypercholesterolemia heterozygotes, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 80: 4124-4128, 1983). 따라서, 홍국에서 생성되는 모나콜린 K의 뛰어난 약리효능을 새로운 건강기능식품 소재로 활용하려는 연구가 현재 적극적으로 이루어지고 있다.
메밀(Fagopyrum esculentum Moench; 일반적으로는 'buckwheat'이라고 부름)은 마디풀과에 속하는 일년생 초본식물로, 분류학상 곡류와 구별되지만 낱알의 성분조성이 곡류와 비슷하여 보통 잡곡으로 취급된다. 원산지는 시베리아로 현재는 동남아 각지에서 많이 재배하고 있으며, 우리나라에서는 삼국시대 이전부터 재배되어 왔다고 하는데 구체적인 문헌에 메밀이 처음으로 나타난 것은 1417년에 간행된 우리나라 최고의 의서인 향약구급방(鄕藥救急方)이다. 메밀은 과거에 식량이 부족할 때 구황(救荒)작물로 이용되어 왔으나, 최근들어 뛰어난 영양성분과 약리활성 그리고 독특한 맛으로 건강기능성 별미식으로 인기가 높다.
메밀에는 단백질 13%, 지방 2.5%, 전분 67% 정도 함유되어 있으며, 식이섬유 함유량이 높다. 특히, 메밀에 함유된 단백질은 균형있는 아미노산 조성을 가지고 있으며 필수 아미노산인 트립토판, 트레오닌, 라이신 등의 비율도 높을 뿐 아니라, 토코페롤, 페놀산, 플라보노이드(flavonoid)와 같은 항산화 물질을 다량 함유하고 있다. 플라보노이드는 담황색 또는 노란색의 색소화합물로서, 기본구조인 플라본(flavone)과 플라보놀(flavonol), 플라바논(flavanone), 플라바놀(flavanol) 및 이소플라본(isoflavone) 등의 유도체들이 있다. 특히, 메밀에는 플라보놀의 하나이며 비타민 P로 알려진, 루틴(rutin)이 많이 함유되어 있다 (참조: 성환길, 식품은 약이다, 한국메디칼인덱스, 1988; 및 Marshall, H.G. 및 Pomeranz, Y., Buckwheat: Description, Breeding, Production and Utilization, Advances in Cereal Science and Technology, Am. Ass. of Cereal Chem. Volume V, p.157, 1982).
홍국균의 발효에 관한 종래기술로는, 홍국균으로 발효시킨 메밀에 관한 특허출원(출원번호: 10-2002-0079448), 모나스쿠스속 균류에 의해 발효된 곡물을 포함하는 다류의 제조방법에 관한 특허출원(출원번호: 10-2000-0024564) 및 발아현미 또는 발아현미 함유곡류를 배지로 한 홍국의 제조방법 및 이를 이용한 식품의 제조방법에 관한 특허출원(출원번호:10-2001-0056427)이 있다. 또한, 강동주 등은 홍국균 발효메밀에서의 rutin과 monacolin K의 함량 변화에 관하여 발표하였다(한국식품과학회, Vol. 35, NO .2, 242～245 (2003)). 이는 홍국의 monacolin K 생산성 향상을 목표로 하지 않으며 단지 홍국의 기능성과 메밀의 기능성을 접목하는데 초점을 두고 있다. 종래에 보고된 위 발명의 소재는 껍질을 벗긴 메밀을 이용하였으 며 발아시킨 메밀홍국으로 발아 시 monacolin K 함량이 오히려 감소하기 때문에 일반 도정된 메밀만 이용하여 발효시켰다.
본 발명에서는 monacolin K를 고함유 홍국의 개발을 위하여 36 종의 Monacus 균주들의 monacolin K 고생산능을 검증하여 고생산 우량균주를 선별하였으며 이 균주를 다양한 곡류기질(쌀, 보리, 현미, 수수, 율무, 발아현미, 차조, 기장, 메밀, 발아메밀)에 적용하여 가장 높은 생산성을 보인 발아메밀 홍국을 개발하였다. 따라서 본 발명은 기질의 적응이 우수한 균주선별과 monacolin K 생산성이 우수한 균주를 선별하여 고 기능성 홍국을 개발을 시도하였다. 종래 출원된 “홍국균으로 발효시킨 메밀”에서는 monacolin K 고생산성 배양기술 개발 보다는 단지 메밀의 기능성성분을 함유한 홍국의 시도라는 점에 특징이 있으나, 본 발명에서는 monacolin K의 고생산 균주를 특별히 선발하여 이를 다양한 곡류에 배양하여 monacolin K 함량을 3~4배정도 올려주는 껍질을 벗기지 않은 발아된 메밀을 새롭게 선정하였으며, 이 발아된 메밀 홍국에서 monacolin K 고생산을 위한 배양기술 개발이 새롭게 시도되었으며 이 기술을 이용하여 기존의 쌀을 이용한 monacolin K 생산성보다 10 배 이상 향상시켰다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 홍국균의 고체배양기술을 이용한 고레벨의 모나콜린 K (monacolin K) 생산방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 생산된 모나콜린 K (monacolin K)를 함유하는 발아 메밀 홍국을 제공하는데 있다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 홍국균을 껍질을 벗기지 않은 발아된 메밀을 기질로 함유하는 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 모나콜린 K(Monakolin K)의 생산방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 홍국균은 모나스쿠스 퍼퍼루스(Monascus purpureus) (ATCC 6405), 모나스쿠스 퍼퍼루스(Monascus purpureus) (ATCC 36928) 또는 모나스쿠스 필로서스(Monascus pilosus) (IFO 4525)인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 배지는 탄소원으로서 5% 내지 15% 농도의 수크로스(Sucrose) 또는 말토스(Maltose)를 함유하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 배지는 질소원으로서 1% 내지 4% 농도의 모노소디움 글루타메이트(MSG) 또는 오리니틴(Orinitine)를 함유하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 배지는 유기화합물로서 1.5% 내지 2.5% 농도의 올리브유(Olive oil) 또는 콩기름(Soybean oil)를 함유하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 배지는 미네랄로서 0.3% 내지 0.6% 농도의 황산철(FeSO4), 황산아연(ZnSO4) 또는 인산나트륨(NaH2PO4)를 함유하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 배양 pH는 pH 2 내지 4이고, 배양 온도는 27 내지 32℃인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 배지의 탄소원은 8-12% 수크로스(Sucrose), 질소원은 1-3% 모노소디움 글루타메이트(MSG), 유기화합물은 1.8-2.2% 올리브유(Olive oil), 미네랄은 0.4-0.6% 황산철(FeSO4), 배양 pH는 2.5-3.5, 배양 온도는 26-28℃인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 본 발명의 방법으로 생산된 모나콜린 K(Monakolin K)를 함유하는 발아 메밀 홍국을 제공한다.
본 발명의 발아 메일 홍국은 콜레스테롤 생합성 저해물질인 모나콜린 K(Monakolin K)를 고함유할뿐 아니라, 메밀의 함유된 유용대사산물을 부가적으로 함유하고 있다. 특히, 껍질을 벗기지 않은 발아된 통메밀에는 껍질에 다량 존재하는 항산화, 혈압강하 성분으로 잘 알려진 rutin과 quercetin이 대부분 껍질에 존재하며 게다가 발아시킬 경우는 더욱 향상 시킬 수 있다. 본 발명에서는 홍국의 Monakolin K와 일반메밀보다 껍질을 벗기지 않은 발아메밀 속에 존재하는 다량으로 존재하는 rutin과 quercetin 같은 유용생리활성 물질들이 함께 함유된다.
본 발명은 Monascus 균주의 이차대사산물로 잘 알려진 Monacolin K의 생산성 최적화를 위하여 monacolin K 고생산 균주를 선발하였으며 monacolin K의 생산성에 적합한 기질을 새롭게 선별하고 고체배양에 필요한 영양적인 조건과 외부의 환경적인 조건의 최적화를 통하여 새로운 고기능성 홍국의 고체배양 최적화 기술을 개발하고자 수행하였다. 이를 위하여 수집된 36 종의 Monascus 균주들을 고체배양 한 후TLC와 HPLC를 이용하여 monacolin K의 함량을 분석하였으며 분석결과 monacolin K (440 mg/kg) 생산성이 가장 우수한 Monascus purpureus ATCC 6405 균주를 선발하 게 되었다. 그리고 이 균주를 10 여종의 다양한 곡류에 배양하여 껍질을 벗기지 않은 발아된 메밀을 monacolin K를 증대시키는 최적의 기질임을 확인하게 되었다. Monacolin K 생산성 향상을 위한 영양학적, 환경학적 최적화 요소를 선별하기 위하여 고전적인 A factor at a time method를 이용하였다. 분석한 결과 Monacolin K에 영향을 동시에 미치는 중요한 요인으로 MSG, pH, 온도가 선발되었으며 이들 3 요소를 이용하여 Monacolin K 생산성을 증진시킬수있는 고체배양최적조건을 결정하기 위한 방법으로 반응표면분석법(response surface methodology, RSM)을 이용하였으며 실험계획법으로 중심합성계획법을 사용하였다. 그 결과 MSG 1%, 26℃, pH 3.28일 때 monacolin K의 최적조건임을 알 수 있었으며 이 조건에서 monacolin K는 5986 mg/kg으로 최적화 되지 않은 조건과 비교하여 monacolin K 생산성은 12 배정도 증진 시킬 수 있었다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
(실시예 1) Monacolin K 고생산능을 가진 균주의 선별
Monacolin K 고생산능을 가진 홍국 균주의 선별을 위하여 표 1과 같이 수집된 36 종 Monascus 균주를 시험에 사용하였다. ATCC는 미국의 American Type Culture Collection (URL: www.atcc.org)에서 구입하였으며, IFO는 일본의 Institute for Fermentation, Osaka (URL: www.ifo.or.jp)에서 구입하였다.
[표 1]
1) 종배양 (seed culture)
PDA(Potato dextrose agar) 사면배지에 Monascus 균주를 접종하여 28℃, 7일 동안 배양된 plate를 0.05% Tween-80 멸균수용액으로 세척하고, 얻어진 포자를 희석액에 현탁하여 stock (1.5x107spores/ml)을 얻었다.
포자현탁액 2.5 ml을 50 ml Mizutani 배지(Glucose 5.0%, Bacto peptone 2.0%, KH2PO4 0.8%, CH3COOK 0.2%, NaCl 0.1%, MgSO4·7H2O 0.05%)(pH 5.0)에, 30℃, 150 rpm, 2 일 동안 배양하였다.
2) 고체배양방법
쌀 20g 과 증류수 14ml을 121℃에서 30 min동안 증기로 찐 후 50℃ 건조기에 2 시간~3 시간 정도 넣은 후 수분을 적당히 제거하여 Clean bench에서 2 ml의 종배양액을 접종한 후 10 일 동안 배양하였다. 고체배양 시 3일 동안은 30℃에서 4~10일째까지는 28℃의 낮은 온도에서 배양하였다.
3) Monacolin K 분석방법
(1) 홍국샘풀에서 추출
1 g 홍국 샘플을 분말화한후 70 % Ethanol 9 ml을 혼합하여 150 rpm (30℃)으로 12 시간 동안 추출하였다.
(2) 홍국추출물의 유도체화
20 ㎕의 홍국추출물에 AccQ.Fluor Borate buffer 100 ㎕를 첨가한 후 AccQ.Fluor reagent (1 mg/ml) 20 ㎕를 넣어 잘 혼합하여 항온조에서 55℃, 10 min동안 유도체화 시켰다.
(3) HPLC를이용한 Monacolin K의 분석 조건
HPLC 분석은 Varian Prostar 210 (USA) 기기를 이용하며, 분석용 컬럼으로는 Xterra MS C18 5 ㎛ column (reverse phase, 4.5×150 ㎜, Waters)을 사용한다. 용매조건으로 아래에 설명된 gradient mobile phase를 사용하였으며, 사용 용매는 Acetonitrile - 0.025 M sodium Acetate (pH 5.03), 유속은 1 ml/min 샘플 injection volume은 20 ㎕의 조건에서 실시한다. 검출은 248 nm 에서 photodiode array detector (Varian Protstar 320)를 사용하여 분석하였다. - Gradient conditions: 초기 100% A: 17 min, 93% A: 21 min, 90% A: 32 min, 66% A (all liner). 분석시간은 (injection-to-injection) 45 분이다.
표준 monacolin K의 acid form은 monacolin K의 lactone form (LFM)의 alkaline hydrolysis에 의해 실험적으로 얻었다. 1.0 mg/ml의 LFM stock 용액을 메탄올로 순차 희석하여 800 ㎕/ml, 500 ㎕/ml, 300 ㎕/ml, 100 ㎕/ml, 50 ㎕/ml을 얻었다. 이들 용액을 이용하여 표준 곡선을 작성하였다. 도 1은 monacolinK (a) 와 extracted sample (b)의 HPLC 분석 결과이다.
상기 표 1의 36종의 균주을 Monacolin K 생산능에 대해 스크리닝하였다. 증기로 찐 쌀에서서의 7일째 배양물에 대해 Monacolin K 생산능을 비교 평가하였다. 그 결과, 시험한 36 종의 균주들 가운데에서 Monascus purpureus ATCC 6405, Monascus purpureus ATCC 36928 및 Monascus pilosus IFO 4525의 3종이 400 to 450 mg/kg의 monacolin K를 생산하여 우수한 것으로 나타났으며, 그중에서 Monascus purpureus ATCC 6405가 450 mg/kg으로 monacolin K 생산능이 가장 우수한 균주로 선정되었다. 도 2 및 3은 각 균부별 고체배지에서 monacolin K의 농도(mg/kg)를 나타내는 그래프이다.
(실시예 2) Monacolin K 고생산을 위한 최적의 기질 선택
실시예 1에서 monacolin K 생산능이 우수한 균주로 선정된 Monascus purpureus ATCC 6405의 Monacolin K 생산성을 더욱 향상시키기 위하여 본 실시예에서는 기존의 홍국의 기질로써 사용되었던 곡류(쌀, 보리)들과 최적의 신규한 기질 선택을 위하여 다양한 곡류(기장, 차조, 율무, 수수, 메밀, 발아메밀, 발아현미, 현미)들을 대상으로 검토하였다. 종배양은 실시예 1의 실험방법과 동일하고, 고체 배양방법은 쌀외에 보리, 수수, 차조, 기장, 현미, 발아현미, 율무, 메밀 및 발아메밀 각각을 대상으로 한 것을 제외하고 실시예 1의 실험방법이 동일하였으며, monacolin K 분석방법은 실시예 1과 동일하였다.
분석 결과, 시험한10 종의 다양한 곡류를 이용한 홍국들 가운데에서 발아된 메밀 홍국의 monacolin K 생산능이 350%가까이 개선되어 monacolin K 생산능이 가장 우수한 균주로 선정되었다. 도 4는 다양한 곡류의 monacolin K 생산능에 대한 효과를 나타낸 그래프이다. 도 5는 Monascus purpureus ATCC 6405에 의해 발효된 다양한 곡류 홍국을 촬영한 사진들이다.
Monacolin K 생산능이 우수한 Monascus purpureus ATCC 6405와 발아메밀을 기질로써 이용하여 생산력은 향상시켰지만 국외적으로 보고된 최적화한 홍국의 monacolin K 함유량에는 미치지 못하였기 때문에 새롭게 발아된 메밀을 이용한 홍국의 영양학적, 환경학적 관점에서 최적화된 monacolin K 고 생산성 홍국의 고체배양기술의 개발을 시도하였다.
(실시예 3) 일회일요인법(A factor at a time method)에 의한 Monacolin K 고생산 고체배양기술개발
1) 영양요인 최적화
고전적인 최적화 방법인 “A factor at a time method”를 이용하여 고체배양 시 영양학적, 환경학적으로 중요한 최적화 요소들과 그들의 최적농도를 결정하여 최적화하였다. 고체 배양 시 영양물질 중에서 monacolin K 생산성 향상의 최적요인을 분석하기 위하여 8 종 탄소원(glucose, fructose, xylose, galactose, mannitol, lactose, sucrose, maltose), 13 종 질소원(monosodium glutamic acid, yeast extract, beef extract, soytone, peptone, valine, orinitine, methionine, lysine, leucine, glycine, glutamate, alanine, control), 9 종 미네랄(NaNO3, FeSO4, ZnSO4, Na2HPO4, NaHPO4, KH2PO4, K2HPO4, MgSO4), 6 종 유기화합물(Olive oil, soybean oil, oleic acid, ethanol, polyethylene glycol 2000, glycerol)을 배양 시 각각 따로 첨가하여 배양하였다.
고체배양방법을 위해, 250ml 삼각플라스크에 발아메밀 20g 과 20ml 증류수 (다양한 탄소원, 질소원, 미네랄, 유기원 첨가)을 121℃에서 30 min동안 증기로 찐 후 50℃ 건조기에 2 시간~3 시간 정도 넣은 후 수분을 적당히 제거하여 clean bench에서 2 ml의 종배양액을 접종한 후 10 일 동안 배양하였다. 고체배양 시 3일 동안은 30℃에서 4~10일째까지는 28℃의 낮은 온도에서 배양하였다.
분석결과, 탄소원으로서는 수크로스(Sucrose) 또는 말토스(Maltose)가 좋은 탄소원으로 나타났으며, 이중에서 Sucrose가 Monacolin K 생합성에 가장 좋은 탄소원으로 선정되었으며, 최적 첨가 농도는 10%였다. 도 6은 Monascus purpureus ATCC 6405에 의한 다양한 탄소원의 Monacolin K 생산능에 대한 효과를 나타난 그래프이다. 도 7은 Sucrose의 농도에 따른 Monacolin K 생산능을 나타낸 그래프이다.
질소원으로서는 모노소디움 글루타메이트(MSG) 또는 오리니틴(Orinitine)이 좋은 것으로 나타났으며, 이중에서 MSG는 Monacolin K 생합성에 가장 좋은 질소원으로 선정되었으며, 최적 첨가 농도는 3%였다. 도 8은 Monascus purpureus ATCC 6405에 의한 다양한 질소원의 Monacolin K 생산능에 대한 효과를 나타난 그래프이 다. 도 9는 MSG의 농도에 따른 Monacolin K 생산능을 나타낸 그래프이다.
유기화합물로서는 올리브유(Olive oil) 또는 콩기름(Soybean oil)이 좋은 것으로 나타났으며, 이중에서 Olive oil은 Monacolin K 생산성 향상에 가장 좋은 유기화합물 선정되었으며, 최적 첨가 농도는 2%였다. 도 10은 Monascus purpureus ATCC 6405에 의한 다양한 유기화합물의 Monacolin K 생산능에 대한 효과를 나타난 그래프이다. 도 11은 Olive oil의 농도에 따른 Monacolin K 생산능을 나타낸 그래프이다.
미네랄로서는 황산철(FeSO4), 황산아연(ZnSO4) 또는 인산나트륨(NaH2PO4)이 좋은 것으로 나타났으며, 이중에서 FeSO4는 Monacolin K 생산성 향상에 가장 좋은 유기화합물 선정되었으며, 최적 첨가 농도는 0.5%였다. 도 12는 Monascus purpureus ATCC 6405에 의한 다양한 미네랄의 Monacolin K 생산능에 대한 효과를 나타난 그래프이다. 도 13은 FeSO4의 농도에 따른 Monacolin K 생산능을 나타낸 그래프이다.
2) 환경요인 최적화
고체 배양 시 환경요인 중에서 Monacolin K 생산성 향상의 최적요인을 분석하기 위하여 각기 다른 온도 (26℃, 28℃, 30℃, 32℃, 34℃, 36℃), pH (2,3,4,5,6,7), 접종량(5%, 10%, 15%, 20%, 25%)을 적용하여 배양 후 분석하였다.
고체배양방법을 위해, 250ml 삼각플라스크에 발아메밀 20g 과 20ml 증류수 (다양한 pH 조절)을 121℃에서 30 min동안 증기로 찐 후 50℃ 건조기에 2 시간~3 시간 정도 넣은 후 수분을 적당히 제거하여 clean bench에서 2 ml의 종배양액을 접종 한 후 10 일 동안 배양한다. 고체배양 시 3일 동안은 30℃에서 4~10일째까지는 다양한 온도에서 배양하였다.
분석 결과, 배양 pH는 2 내지 4이고, 배양 온도는 27 내지 32℃인 것이 좋은 것으로 나타났다. 이중에서도, 고체배양 시 pH 2 일때 Monacolin K 생산성이 가장 높았으며, 고체배양 시 온도는 28℃ 일때 Monacolin K 생산성이 가장 높았으며, 고체배양 시 접종량 5% 일때 Monacolin K 생산성이 가장 높았다. 도 14은 Monascus purpureus ATCC 6405에 의한 다양한 온도 조건의 Monacolin K 생산능에 대한 효과를 나타난 그래프이다. 도 15는 Monascus purpureus ATCC 6405에 의한 다양한 pH 조건의 Monacolin K 생산능에 대한 효과를 나타난 그래프이다. 도 16는 Monascus purpureus ATCC 6405에 의한 다양한 접종량의 Monacolin K 생산능에 대한 효과를 나타난 그래프이다.
(실시예 4) 반응표면분석법(Response surface methodology)에 의한 Monacolin K 고생산 고체배양기술개발
"A factor at a time method"는 고전적인 최적화 배양방법의 하나로써 하나의 조건에서 하나의 요인이 미치는 영향에 대해서 분석하기 위한 좋은 방법이지만 최적화된 각각의 요인들이 혼합되면 요인들 상호간의 영향에 의해서 최적화된 요인들의 최적 농도에서 배양결과가 반드시 최대의 생산량을 나타내지 못하기 때문에 각 요인들과 농도 상호간에 있을 수 있는 모든 경우의 수에 대한 결과를 통계학적 방법으로 최근 다양하게 응용 되어지고 있는 반응표면분석법을 이 실험에 도입하게 되었다.
1) Basal medium
A factor at a time method를 통해서 인정된 중요한 요인(MSG, pH)들을 기본배양액으로 첨가하여 주었다. 이 기본 배양액은 고체배양할 때 증류수를 대신하여 첨가하였다.
- 탄소원: 10% Sucrose (2g Sucrose /발아메밀 20g)
- 미네랄: 0.5% FeSO4 (0.1g FeSO4 /발아메밀 20g)
- 유기화합물: 2% Olive oil (0.4ml Olive oil /발아메밀 20g)
- 질소원: 1~5%MSG (0.2~ 2g MSG /발아메밀 20g)
- 초기 pH를 2~6으로 조절하였다(Acetic acid, NaOH 사용).
2) 고체배양방법
250 ml 삼각플라스크에 발아메밀 20 g 과 20 ml basal medium을 넣은 후 autoclave를 이용하여 121℃에서 30 min동안 증기로 찐 후 50℃ 건조기에 2 시간~3 시간 정도 넣은 후 수분을 적당히 제거하여 clean bench에서 2 ml의 종배양액을 접종한 후 10 일 동안 배양하였다. 고체배양 시 3일 동안은 30℃에서 4~10일째까지는 RSM에 적용된 온도 맞추어서 각각 배양하였다.
3) 분석 결과
본 실험에서 처리 조합을 할당하기 위해 Central Composite Design로서 3-factor 5-level response surface experiment를 사용하였다. 본 실험에서, Monascus purpureus ATCC 6405의 응답인 Monacolin K의 양(mg/kg)은 하기 표 2에 기술된 3가지 요인(MSG, pH, Temperature)의 영향하에 있다고 가정하였다. 데이터 는 STATGRAPHICS Plus Version 5.1 (USA)를 사용하여 분석하였다. Fitted model의 등식은 다음과 같다.
Monacolin K = 62147.2-11863.9 × MSG-2404.72 × Temperature-2877.41 × pH + 287.253 × MSG × pH + 391.506 × MSG × pH + 20.8739 × Temperature2 + 54.7558 × Temperature × pH- 4.1158 × pH2
[표 2] Central composite design(CCD)을 위한 변수들과 그 레벨
[표 3] Central composite design (CCD)의 실험디자인과 결과
이 모델의 fit은 0.85로 계산된 coefficient of determination R2로 체크되었으며, 이는 응답에서 85.4452%의 variability를 가리킨다. 이 모델의 최대점을 얻기 위한 3가지 변수의 최적수치는 MSG, temperature, pH 각각 1.0 %, 26 ℃, 3.073로 계산되었다. 이 최대점에서 모델은 6211 mg/kg Monacolin K의 최대 응답을 예상하였다.
따라서, 최적의 고체배양조건은 아래와 같으며, 이때, 6211 mg/kg Monacolin K의 최대 응답을 보이는 것으로 예상되었다.
- 탄소원: 10% Sucrose (2g Sucrose /발아메밀 20g)
- 미네랄: 0.5% FeSO4 (0.1g FeSO4 /발아메밀 20g)
- 유기화합물: 2% Olive oil (0.4ml Olive oil /발아메밀 20g)
- 질소원: 1 % MSG (0.2 g MSG /발아메밀 20g)
- 초기 pH를 3.073으로 조절하였다(Acetic acid, NaOH 사용).
- 배양초기는 30℃로 동일하며 4일~10일 동안의 최적배양온도는 26℃ 였다.
도 17은 Monacolin K production의 Main effects plot이다. 도 18은 Monacolin K production의 Interaction plot이다 (A: MSG, B: Temperature, C: pH). 도 19는 Monacolin K production의 Three-dimensional response surface plots이다. 온도 26℃에서 Monacolin K 생산에 대한 MSG, temperature 및 pH의 combined effect를 나타낸다. 도 20은 Monacolin K production의 Contour plot이다. 온도 26℃에서 Monacolin K 생산에 대한 MSG, temperature 및 pH의 combined effect를 나타낸다. 도 21은 Desirability의 Three-dimensional response surface plots이다. 온도 26℃에서 Monacolin K 생산에 대한 MSG, temperature 및 pH의 combined effect를 나타낸다. 도 22는 Estimated response surface의 Contour plot이다. 온도 26℃에서 Monacolin K 생산에 대한 MSG, temperature 및 pH의 combined effect를 나타낸다. 도 22는 optimum conditions (MSG 1%, 26℃, pH 3.073)에서 Monacolin K content가 6211 mg/kg로 증가할 것으로 예상한다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에서는, 콜레스테롤 생합성 저해 기능을 가진 monacolin K 고생산하는 홍국균을 선발하였으며, 이 선발된 홍국균의 monacolin K 생산성을 우수히 향상시키는 껍질을 벗기지 않은 발아된 메밀을 새로운 기질로써 사용하였으며, 선발된 껍질을 벗기지 않은 발아된 메밀 홍국의 monacolin K 고생산 을 위하여 새로운 고체배양 기술을 적용하였다. 특히, “A factor at a time” 방법을 이용하여 Monacolin K의 최적화 배양방법 개발하였으며, 새로운 고체배양방법에 껍질을 벗기지 않은 통메밀을 기질로 이용한 홍국에서는 Monacolin K 농도가 일반적인 쌀을 기질로한 홍국과 비교하여 10 배 이상 높일 수 있었으며, 통메밀을 발아시켜 배양함으로써 메밀의 유용성분인 rutin과 quercetin의 함량을 최대화 시킬 수 있었다. 본 발명에 따르면, 홍국의 발효기질로써 Monacolin K 생산성을 증진시키는 껍질이 벗겨지지 않은 발아된 통메밀을 이용한 고체배양방법 확립함으로써, 새로운 발효기질 사용으로 다기능성 홍국의 개발을 통하여 활용도를 높일 수 있을 것으로 기대되며, 기능성이 강화된 홍국을 다양한 식품의 원재료로 활용할 수 있으며, 이를 통한 새로운 식음료의 개발 또한 가능하며, 국내외 기능성식품 시장에서 홍국의 활용도가 점차 높아지고 있으므로, 다양한 기능성 식품의 원재료로 활용성이 뛰어날 것으로 기대된다.
Claims (9)
- 홍국균을 껍질을 벗기지 않은 발아된 메밀을 기질로 함유하는 배지에서 배양함에 있어서, 상기 홍국균은 모나스쿠스 퍼퍼루스(Monascus purpureus) (ATCC 6405), 모나스쿠스 퍼퍼루스(Monascus purpureus) (ATCC 36928) 및 모나스쿠스 필로서스(Monascus pilosus) (IFO 4525)로 구성된 군에서 선택되고, 상기 배지는 탄소원으로서 5% 내지 15% 농도의 수크로스(Sucrose) 또는 말토스(Maltose)를 함유하고, 질소원으로서 1% 내지 4% 농도의 모노소디움 글루타메이트(MSG) 또는 오리니틴(Orinitine)를 함유하고, 유기화합물로서 1.5% 내지 2.5% 농도의 올리브유(Olive oil) 또는 콩기름(Soybean oil)를 함유하고, 미네랄로서 0.3% 내지 0.6% 농도의 황산철(FeSO4), 황산아연(ZnSO4) 및 인산나트륨(NaH2PO4)로 구성된 군에서 선택된 것을 함유하고, 상기 배양 pH는 2 내지 4이고, 배양 온도는 26 내지 32℃인 것을 특징으로 하는 모나콜린 K(Monakolin K)를 함유하는 발아 메밀 홍국의 생산방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제 1항에 있어서, 상기 배지의 탄소원은 8-12% 수크로스(Sucrose), 질소원은 1-3% 모노소디움 글루타메이트(MSG), 유기화합물은 1.8-2.2% 올리브유(Olive oil), 미네랄은 0.4-0.6% 황산철(FeSO4), 배양 pH는 2.5-3.5, 배양 온도는 26-28℃인 것을 특징으로 하는 생산방법.
- 삭제
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020050041733A KR100710500B1 (ko) | 2005-05-18 | 2005-05-18 | 홍국균을 이용한 모나콜린 ｋ 생산방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020050041733A KR100710500B1 (ko) | 2005-05-18 | 2005-05-18 | 홍국균을 이용한 모나콜린 ｋ 생산방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20060119136A KR20060119136A (ko) | 2006-11-24 |
| KR100710500B1 true KR100710500B1 (ko) | 2007-04-24 |
Family
ID=37706039
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020050041733A KR100710500B1 (ko) | 2005-05-18 | 2005-05-18 | 홍국균을 이용한 모나콜린 ｋ 생산방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR100710500B1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101193980B1 (ko) * | 2008-02-12 | 2012-10-25 | 주식회사 에프앤피 | 홍국의 제조 방법 및 이에 의해 제조된 홍국 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102911977A (zh) * | 2012-10-24 | 2013-02-06 | 江南大学 | 一种以固态基质为载体红曲菌发酵生产莫纳可林k的方法 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS55111790A (en) | 1979-02-20 | 1980-08-28 | Sankyo Co Ltd | Novel physiologically active substance monacolin k and production thereof |
| US4323648A (en) * | 1979-05-11 | 1982-04-06 | Sankyo Company Limited | Preparation of Monacolin K |
| US5013655A (en) * | 1988-01-21 | 1991-05-07 | Hoechst Aktiengesellschaft | Process for the preparation of colorants or monacolin K in a sterile fluidized bed of low water content |
| KR20030023281A (ko) * | 2001-09-13 | 2003-03-19 | 박동기 | 발아현미 또는 발아현미 함유 혼합곡류를 배지로 한홍국의 제조방법 및 이를 이용한 식품의 제조방법 |
| KR20040051783A (ko) * | 2002-12-13 | 2004-06-19 | 이성구 | 홍국균으로 발효시킨 메밀 |
| KR20060021769A (ko) * | 2004-09-04 | 2006-03-08 | 고려대학교 산학협력단 | 홍국균 변이주 및 이를 이용한 콜레스테롤 저하제 |
-
2005
- 2005-05-18 KR KR1020050041733A patent/KR100710500B1/ko not_active IP Right Cessation
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS55111790A (en) | 1979-02-20 | 1980-08-28 | Sankyo Co Ltd | Novel physiologically active substance monacolin k and production thereof |
| US4323648A (en) * | 1979-05-11 | 1982-04-06 | Sankyo Company Limited | Preparation of Monacolin K |
| US5013655A (en) * | 1988-01-21 | 1991-05-07 | Hoechst Aktiengesellschaft | Process for the preparation of colorants or monacolin K in a sterile fluidized bed of low water content |
| KR20030023281A (ko) * | 2001-09-13 | 2003-03-19 | 박동기 | 발아현미 또는 발아현미 함유 혼합곡류를 배지로 한홍국의 제조방법 및 이를 이용한 식품의 제조방법 |
| KR20040051783A (ko) * | 2002-12-13 | 2004-06-19 | 이성구 | 홍국균으로 발효시킨 메밀 |
| KR20060021769A (ko) * | 2004-09-04 | 2006-03-08 | 고려대학교 산학협력단 | 홍국균 변이주 및 이를 이용한 콜레스테롤 저하제 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101193980B1 (ko) * | 2008-02-12 | 2012-10-25 | 주식회사 에프앤피 | 홍국의 제조 방법 및 이에 의해 제조된 홍국 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20060119136A (ko) | 2006-11-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Gan et al. | Effects of fermented edible seeds and their products on human health: Bioactive components and bioactivities | |
| Handa et al. | Optimisation of soy flour fermentation parameters to produce β-glucosidase for bioconversion into aglycones | |
| Jůzlová et al. | Secondary metabolites of the fungus Monascus: a review | |
| Tian et al. | The fungal leaf endophyte Paraconiothyrium variabile specifically metabolizes the host-plant metabolome for its own benefit | |
| Szakács et al. | Production of lovastatin by a wild strain of Aspergillus terreus | |
| Chen et al. | Study on red fermented rice with high concentration of monacolin K and low concentration of citrinin | |
| Cai et al. | Evaluation of γ-aminobutyric acid, phytate and antioxidant activity of tempeh-like fermented oats (Avena sativa L.) prepared with different filamentous fungi | |
| Mostafa et al. | Secondary metabolites and bioactivity of the Monascus pigments review article | |
| Marič et al. | Comparison of lovastatin, citrinin and pigment production of different Monascus purpureus strains grown on rice and millet | |
| Teng et al. | Anka and anka pigment production | |
| Reddy et al. | Optimization of culture conditions of Streptomyces rochei (MTCC 10109) for the production of antimicrobial metabolites | |
| Kamath et al. | Optimization of culture conditions for maximal lovastatin production by Aspergillus terreus (KM017963) under solid state fermentation | |
| Ribeiro et al. | Isoflavone content and β-glucosidase activity in soybean cultivars of different maturity groups | |
| Rashmi et al. | Exploring Monascus sanguineus as a potential natural source for pigment production | |
| Liu et al. | Effects on total phenolic and flavonoid content, antioxidant properties, and angiotensin I-converting enzyme inhibitory activity of beans by solid-state fermentation with Cordyceps militaris | |
| Ghosh et al. | Genome shuffling improves pigment and other bioactive compound production in Monascus purpureus | |
| Liu et al. | Changes in the metabolite composition and enzyme activity of fermented tea during processing | |
| KR100710500B1 (ko) | 홍국균을 이용한 모나콜린 ｋ 생산방법 | |
| KR100710497B1 (ko) | 홍국균을 이용한 ｇａｂａ 생산방법 | |
| Ng et al. | Development and production of cholesterol-lowering Monascus-nata complex | |
| KR20120021725A (ko) | 홍국을 이용한 기능성 곡류의 제조방법 | |
| Wu et al. | Production of 8-hydroxydaidzein polyphenol using biotransformation by Aspergillus oryzae | |
| Srikantha et al. | Characterization of best naringinase producing fungus isolated from the citrus fruits | |
| KR20100035786A (ko) | 배당체 이소플라본을 비배당체로 전환하는 고효율 플라므리나 베루티페스 에스에이치피21001 균주 및 이를 이용한 비배당체 전환법 | |
| Hsiao et al. | Antioxidant activity and contents of total phenolic, monacolin K, GABA and citrinin of Monascus-fermented soy sauce |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20130405 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20140314 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20150423 Year of fee payment: 9 |
|
| LAPS | Lapse due to unpaid annual fee |