KR20100035786A - 배당체 이소플라본을 비배당체로 전환하는 고효율 플라므리나 베루티페스 에스에이치피21001 균주 및 이를 이용한 비배당체 전환법 - Google Patents

배당체 이소플라본을 비배당체로 전환하는 고효율 플라므리나 베루티페스 에스에이치피21001 균주 및 이를 이용한 비배당체 전환법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식용미생물의 생변환법을 이용하여 배당체 이소플라본을 비배당체 이소플라본으로 전환하는 기술에 관한 것으로 보다 상세하게는 Flammulina velutipes SHP 21001 (KCTC11378BP)를 증자된 콩에 접종 및 배양 하여 비배당체 이소플라본 전환을 유도하는 것이다. 본 발명에 따르면 daidzein 이소플라본의 경우 전환율은 86%이며, genistein 이소플라본의 경우 95%의 높은 효율로 전환이 가능하기 때문에 이소플라본 비배당체의 제조에 효과적으로 사용될 수 있다. 또한 본 기술은 산가수분해법이 아닌 미생물의 생변환법을 이용하는 발명으로 산가수분해법의 부산물 유해성 논란을 불식시킬 수 있는 장점이 있다.
생변환법, 비배당체 이소플라본, 플라므리나 베루티페스

Description

배당체 이소플라본을 비배당체로 전환하는 고효율 플라므리나 베루티페스 에스에이치피21001 균주 및 이를 이용한 비배당체 전환법{High effective bio-transformation strain of aglycon isoflavones, Flammulina velutipes SHP21001, and it's transformation method}
본 발명은 식용미생물의 생변환법을 이용하여 배당체 이소플라본을 비배당체 이소플라본으로 전환하는 기술에 관한 것으로 보다 상세하게는 Flammulina velutipes SHP 21001 (KCTC11378BP)를 증자된 콩에 접종 및 배양 하여 비배당체 이소플라본 생성하는 균주 및 그 생성하는 방법에 관한 것이다.
발효식품은 다양한 원료를 생물전환 (Bio-transformation)에 의해서 영양, 기호성 및 기능성이 강화된 enriched foods, functional foods 및 health foods를 제조하는 것을 의미한다. 특히 대두발효제품은 두류를 곰팡이, 세균 등에 의해서 주로 고체배양방법에 의해서 발효되는 대부분의 전통발효 식품 및 효소식품을 포함한다. 대두에 다량 함유되어 있는 이소플라본은 천연으로 존재하는 식물성 에스트로겐으로 분자구조뿐 아니라 효능도 유사하여 폐경기 여성의 각종 증후군을 완화시켜주고, 골다공증 예방과 혈중 콜레스테롤을 저하시키는 작용을 한다. Flavonoid 계통 화합물의 한 종류로 알려진 이소플라본은 일반세포내에서 estrogen receptor와 결합할 수 있는 능력으로 인하여 phytoestrogen으로도 알려져 있음. 특히, 체내에서 여러 암과 심장병 그리고 골다공증의 발생빈도를 낮추어주며, 여러 갱년기 증상을 완화시켜주는 것으로 알려짐. 이소플라본은 12개의 유도체가 콩류에 존재하는 것으로 밝혀져있다. 이들 중 3가지 유도체 (daidzein, genistein, glycitein)는 aglycone의 형태이고 나머지 9가지 유도체는 당이 붙어있는 배당체(glycone)의 형태이다. 많은 이소플라본 유도체 중 식물체 내에서는 배당체 이소플라본이 비배당체보다 많이 존재하는 것으로 알려져 있으나 체내에서는 주로 비배당체의 형태로 흡수가 되는 것으로 보고 되어 있다. 이소플라본은 자연상태에서는 대부분이 이소플라본 배당체로 존재하는데, 배당체 형태의 이소플라본은 위산에 의해 분해 되지 않아 채내 에서 그대로 흡수되지 않고, 대장 내에 존재하는 미생물에 의해 분비되는 효소에 의해 가수 분해된 후에 흡수되기 때문에 흡수율이 낮다(미국 특허 제 5,506,211호). 반면에 발효나 효소반응에 의해 전환된 비배당체 형태의 이소플라본은 체내에서 부가적인 변환이 없이 위와 소장에서 직접 흡수되고, 그 흡수속도가 현저하게 빠르므로, 비발효식품에 존재하는 이소플라본 보다는 발효식품에 존재하는 이소플라본 비배당체가 이용성 측면에서 매우 유리한 것으로 알려짐. 따라서 이소플라본 배당체를 비배당체로 전환시키는 연구가 진행 되고 있다. 일반적으로 이소플라본 배당체를 비배당체로 전환시키는 방법에는 크게 2가지 방법이 있다. 첫 번째 방법은 산을 이용하여 이소플라본을 가수분해하는 방법으로, 이러한 산가수분해 방법들은 공정 후 발생되는 폐수가 처리가 문제되며, 부가적인 정제공정 등의 번거로운 공정이 필요한 단점이 있음. 두 번째 방법은 β-glucosidase를 이용한 효소가수분해 방법이다. 지금까지 알려진 이소플라본 배당체를 가수분해 하는 미생물은 Bifidobacterium longum, Lactobacillus bulgaricus, Aspergillus niger, 및 Saccharopolyspora erythraea 등의 연구가 있는 것으로 알려져 있다.
상기 산가수분해법은 이소플라본 aglycone의 각 성분을 고순도로 얻을 수 있는 장점이 있으나 추출 시 용매가 다량 사용되고 용리시 알콜의 농도를 조절함으로써 에탄올 회수에 따른 시간과 비용이 많이 발생할 수 있으며, 더욱이 산 처리를 함으로써 이소플라본의 구조변화가 예상될 수 있고 또한 순도를 높이기 위하여 중화하는 등의 별도 공정이 필요한 문제점이 있다.
또한 기존에 알려진 가수분해 미생물들은 배양이 까다로운 점 (Bifidobacterium속 및 Lactobacillus속 등의 경우), 식감이 떨어지는 점 (Aspergillus속의 경우), 또한 식용가능여부 확인이 안된 점 (Saccharopolyspora속의 경우)등의 문제점들이 야기된다. 따라서 본 발명에서는 배양법이 간편하고, 식감이 우수하며 가수분해 활성이 뛰어난 미생물 균주를 이용하여 이소플라본 비배당체로 전환하는 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 비배당체로 전환하는 고효율 플라므리나 베루티페스 균주(Flammulina velutipes SHP21001)를 제공한다. SHP21001 균주는 기존의 공시균주에 비해 생육이 빠르고 배당체 이소플라본을 비배당체 이소플라본으로 전환하는 능력이 뛰어남에 본 발명의 특징이 있다.
본 발명에서 사용된 Flammulina velutipes SHP21001 균주를 이용하여 전환 할 경우 비배당체 이소플라본 daidzein과 genistein이 각각 86%, 95%의 높은 전환율을 얻을 수 있는 장점이 있다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 비배당체로 전환하는 고효율 플라므리나 베루티페스 균주(Flammulina velutipes SHP21001)를 제공한다. 상기 SHP21001 균주의 18S rDNA 염기서열을 분석 수행한 결과 플라므리나 베루티페스(Flammulina velutipes)로 동정되었으며, 플라므리나 베루티페스 SHP21001이라 명명하여 2008년 8월 29일자로 KCTC에 특허균주 기탁을 하였다(기탁번호 KCTC11378BP).
또한 대조군으로 공시균주인 플라므리나 베루티페스 KCCM60233, KCCM60053, KCTC6367 균주를 각각의 미생물보존센터에서 구입 및 분양받아 1-2주일에 1회씩 PDA에 계대배양하고 본 실험에 사용하였다.
본 발명은 상기 SHP21001 균주를 이용하여 감자 액체배지에 배양하는 단계, 국산콩을 침지 및 고온고압 멸균(증자) 하는 단계, 각각의 균주를 국산콩에 접종하여 배양하는 단계를 포함하는 특징으로 한다.
이하, 실험예를 들어 본 발명을 상세히 설명하지만 본 발명이 이들 예로 한정되는 것은 아니다.
[실험예 1]
본 실험에 사용된 SHP21001균주의 생육을 측정하기 위해 감자한천배지에 미리 배양된 각 균주의 균사체를 직경 8 ㎜ 되도록 cork borer(Dia 8 ㎜)로 배지와 함께 조각낸 후 새로운 감자한천 배지에 1 조각씩 접종하였다. 접종된 각 균주는 24℃에서 7일간 배양한 후 균사의 직경을 ㎜ 단위로 측정하였으며, 또한 공중균사의 생육정도를 관찰하여 poor, medium 및 rich로 표기하였다.
Used strains Growth (㎜, Dia±STD) Aerial mycelia
Flammulina velutipes KCCM 60233 19.2±0.8 rich
Flammulina velutipes KCCM 60053 43.8±3.4 medium
Flammulina velutipes KCTC 6367 37.3±2.5 medium
Flammulina velutipes SHP21001 80.0±1 medium
상기 표에서 보는 바와 같이 기탁균주 SHP21001은 3종의 공시균주에 비해 생육이 매우 뛰어남을 알 수 있었다. 또한 공중균사의 생육도 KCCM 60233균주에 비해 떨어지긴 하나 다른 균주와 유사한 밀도를 관찰 할 수 있었다.
[실험예 2]
Isoflavone 성분의 정량은 HPLC 분석법을 사용하였다. 시료 0.5 g에 1 M HCl 2㎖을 첨가한 후 2시간 동안 항온수조에서 가열하였다(90-95℃). 냉각 후 8 ㎖의 acetonitrile을 첨가하여 완전히 교반한 다음 2시간 정치하여 상등액을 취했다. 상등액을 여과한 후 HPLC로 isoflavone 함량과 조성을 측정하였다. 또한 HCl을 첨가한 후 가열하지 않고 acetonitrile로 추출하여 분석한 genistein과 daidzein의 양을 유리 이소플라본, 즉 aglycone의 함량으로 하였다. 시료중에 함유된 이소플라본의 함량은 시료의 건조중량을 기준으로 표시하였다. 또한 HCl의 농도별 가수분해법을 통하여 daidzein과 genistein의 함량을 측정하였으며 적절한 isoflavone 분석을 위한 HCl의 농도를 결정하였다.
Consist of system Younglin SP930D Pump, M720 Absorbance Detector
Column Merck Co. RP-8 (250*4 ㎜ ID)
Mobile phase acetonitrile : 0.05M KH2PO4 (pH 2.0 with phosphoric acid) = 25:75
Detector UV (260 ㎚)
Flow rate 1 ㎖/min
Injection volume 20 ㎕
Isoflavone 분석에 사용된 mobile phase의 분석 조건은 표 1과 같다. 건강기능성 식품공전 대두단백질편에 분석 공시되어 있는 비배당체 isoflavone인 daidzein과 genistein을 표준품으로 사용하였다.
상기 분석법을 이용하여 분석된 결과는 표 2와 같다. Daidzein의 RT값은 12.25이었으며, genistein의 RT값은 30.65으로 분석하기에 충분한 RT 차이값을 보였기에 각 성분 peak의 간섭 없이 분석할 수 있었다.
Chemicals RT (min)
Daidzein 12.25
Genistein 30.65
[실험예 3]
국산 대두를 구입하여 세척 하고 12시간 물에 불렸다. 불린 콩을 각 삼각플라스크에 50 g 씩 나누어 놓고 121℃, 1.5 기압의 조건에서 20분간 살균 및 증자 하였다. 여기에 미리 PDB (Potato Dextrose Broth)에 7일간 배양된 각 균주의 균사체 5%(v/v) 접종을 하여, 24℃에서 2주간 배양하였다. 각 균주가 배양된 콩은 80℃에서 48시간 건조하고 분쇄하여 분말형태로 보관하고 실험에 사용하였다. 대조군으로는 생콩분말과 청국장 제조균인 Bacillus subtilis를 증자 후 접종하여 45℃에서 24시간동안 배양하고 건조한 청국장분말(natto powder)를 직접 제조하여 사용하였다.
2종의 균주배양 시료와 대조군 시료 2종을 상기 추출조건과 분석조건을 이용하여 정량 및 정성 분석하였으며, 분석 결과를 토대로 비배당체 isoflavone 생성 우수균주를 선발하였다.
Products Daidzein(㎎/㎏) Genistein(㎎/㎏) Aglycones, %
Free Total Free Total D G
Bean powder (raw powder) 20.98 421.46 12.90 294.92 5 4
Natto powder 102.62 483.34 175.83 329.42 21 53
F. velutipes KCCM 60233 190.36 326.36 236.89 456.26 58 52
F. velutipes KCCM 60053 176.58 386.26 175.65 235.68 46 75
F. velutipes KCTC 6367 146.56 245.12 145.65 236.56 60 62
F. velutipes SHP21001 200.13 231.60 513.44 542.16 86 95
대조군으로 사용된 콩분말의 경우 유리된 비배당체 daidzein과 genistein의 농도가 각각 20.98 및 12.9 ㎎/㎏ 이었으며, 청국장분말의 경우 각각 102.62 및 175.83 ㎎/㎏ 이었다. 그러나 발효된 콩의 경우 대부분 균주에서 대조군을 상회하는 비배당체 isoflavone 농도를 관찰할 수 있었다. 이는 발효된 콩의 비배당체 함량이 높아지며 균주발효의 경우 더 우수한 비배당체 전환 효과를 나타내었다. 또한 비배당체(aglycones) 전환율의 경우 공시균주 3종은 daidzein의 경우 46-60% 이며 genistein의 경우 52-75%이었으나, SHP21001균주의 86% 및 95%로 공시균주 보다 우수한 비배당체 전환율을 관찰할 수 있었다.

Claims (4)

  1. Flammulina velutipes SHP21001 균주를 이용하여 배당체 이소플라본을 비배당체 이소플라본으로 생변환하는 방법
  2. 콩의 배당체 이소플라본을 비배당체 이소플라본으로 전환하는 방법에 있어 daidzein과 genistein의 전환율이 각각 60% 및 75% 이상인 Flammulina velutipes SHP21001 균주 및 상기 균주를 이용한 비배당체 이소플라본 고체배양 전환방법
  3. 청구항 1항의 미생물을 이용하여 이소플라본 함유 식품체를 발효시킴으로써 배당체 이소플라본을 비배당체로 전환하는 방법
  4. 청구항 1항의 미생물을 이용한 이소플라본 함유 식물체의 발효분을 포함하는 기능성 식품
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