KR20150082829A

KR20150082829A - 이소플라본 배당체로부터 이소플라본 아글리콘을 수득하는 방법

Info

Publication number: KR20150082829A
Application number: KR1020140002265A
Authority: KR
Inventors: 심재훈; 한승준; 변다혜; 최혜정; 고병민
Original assignee: 한림대학교 산학협력단; 서림바이오 주식회사
Priority date: 2014-01-08
Filing date: 2014-01-08
Publication date: 2015-07-16
Also published as: KR101602630B1

Abstract

본 발명은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 효소를 사용하여 이소플라본 배당체로부터 이소플라본 아글리콘을 수득하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법에 의할 경우, 이소플라본 배당체로부터 이소플라본 아글리콘을 효과적으로 분리할 수 있다.

Description

이소플라본 배당체로부터 이소플라본 아글리콘을 수득하는 방법{Method for production of isoflavone aglycone from isoflavone glucoside}

본 발명은 이소플라본 배당체로부터 이소플라본 아글리콘을 수득하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 효소를 사용하여 이소플라본 배당체로부터 이소플라본 아글리콘을 수득하는 방법에 관한 것이다.

배당체 (glucoside)는 단당이 고리 모양의 헤미-아세탈(hemi-acetal) 구조를 갖고, 히드록실기(hydroxyl group)가 다른 알코올 혹은 페놀성 화합물의 히드록실기 사이에서 물을 상실하고 축합하여 생긴 화합물을 통칭한다. 히드록실기를 갖는 천연물은 식물체 내에서 당과 글리코시드 결합을 이루어 배당체 형태로 많이 존재하는데, 당이 분리되어 떨어진 비배당체 형태를 아글리콘(aglycone)이라 부른다.

한편, 대두에 다량 함유되어 있는 이소플라본은 천연으로 존재하는 식물성 에스트로젠으로, 분자구조뿐만 아니라 효능도 에스트로젠과 유사하여 폐경기 여성의 각종 증후군을 완화시켜 주는데 사용되고 있다.

이소플라본은 약 12개의 유도체가 콩에 존재하는 것으로 알려져 있다. 이들 중 3가지 유도체 (daidzein, genistein, glycitein)는 아글리콘 (aglycone)의 형태이고, 나머지 9가지 유도체는 아글리콘에 당이 붙어있는 배당체 형태로 존재한다. 식물체 내에서는 배당체가 비배당체보다 많이 존재하는 것으로 알려져 있으나, 체내에서는 주로 비배당체의 형태로 흡수되는 것으로 보고되어 있다.

이소플라본은 자연상태에서는 대부분이 배당체로 존재하는데, 배당체 형태의 이소플라본은 위산에 의해 분해되지 않아 채 내에서 그대로 흡수되지 않고, 대장 내에 존재하는 미생물에 의해 분비되는 효소에 의해 가수 분해된 후에 흡수되기 때문에 흡수율이 낮은 것으로 알려져 있다 (미국 특허 제 5,506,211호). 반면, 발효나 효소반응에 의해 전환된 비배당체 형태의 이소플라본은 체내에서 부가적인 변환이 없이 위와 소장에서 직접 흡수되고, 그 흡수 속도가 또한 현저하게 빠른 것으로 알려져 있다.

결국, 비배당체인 아글리콘이 생체 이용성 측면에서 배당체에 비해 매우 유리하다 할 수 있는데, 이소플라본 배당체를 비배당체인 이소플라본 아글리콘으로 전환시키는 연구도 많이 진행되고 있다.

대한민국 특허공개번호 제10-2010-0035786호 (공개일자: 2010. 04. 07)에는, 식용미생물의 생변환법을 이용하여 배당체 이소플라본을 비배당체 이소플라본으로 전환하는 기술에 관한 것으로 보다 상세하게는 Flammulina velutipes SHP 21001 (KCTC11378BP)를 증자된 콩에 접종 및 배양 하여 비배당체 이소플라본 전환을 유도하는 것이 기재되어 있다.

본 발명은 이소플라본 배당체로부터 이소플라본 아글리콘을 효과적으로 분리할 수 있는 방법을 개발하여 제공하고자 한다.

본 발명은 이소플라본 배당체 (isoflavone glucoside)에 서열번호 1번에 기재되어 있는 아미노산 서열을 갖는 효소를 처리하는 것을 특징으로 하는 이소플라본 아글리콘 (isoflavone aglycone)의 수득방법을 제공한다.

본 발명의 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 효소는 특이하게도 당과 당이 베타-O-결합으로 이루어진 셀로바이오스 (cellobiose), 셀로트리오스 (cellotriose), 셀로테트라오스 (cellotetraose)가 기질일 경우 가수분해 작용을 하지 못하나, 당과 이소플라본 (isoflavone)이 베타-O-결합으로 이루어진 이소플라본 배당체 (isoflavone glycoside)의 경우, 즉 일 예로 다이드진 (daidzin), 제니스틴 (genistin), 글리시틴 (glycitin)을 기질로 했을 경우, 가수분해하여 아글리콘인 다이드제인 (daidzein), 제니스테인 (genistein), 글리시테인 (glycitein)을 효과적으로 생성함이 확인되었다. 이와 같은 결과는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 효소가 이소플라본 배당체 (isoflavone glycoside)를 특이적으로 가수분해하기 때문에 발생한 것이다.

한편, 본 발명 이소플라본 아글리콘의 수득방법에 있어서, 상기 효소 처리는 바람직하게 50℃의 온도로, pH 6.0에서 수행하는 것이 좋다. 이 조건에서 효소가 최적의 반응을 보이기 때문이다.

한편, 본 발명 이소플라본 아글리콘의 수득방법에 있어서, 상기 효소는 바람직하게 서열번호 2에 기재된 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)에 의해 암호화된 것일 수 있다.

한편, 본 발명 이소플라본 아글리콘의 수득방법에 있어서, 상기 이소플라본 배당체는, 일 예로 다이드진(daidzin), 제니스틴(genistin), 글리시틴(glycitin) 중 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.

본 발명의 방법에 의할 경우, 이소플라본 배당체로부터 이소플라본 아글리콘을 효과적으로 분리할 수 있다.

도 1은 btbg로 명명된 유전자의 PCR 산물에 대한 전기영동 결과이다. 도 2는 p6xHTKNd와 btbg 유전자가 라이게이션되어 제작된 플라스미드이다.
도 3은 발현된 BTBG 단백질 (효소)의 전기영동사진이다.
도 4는 서열번호 2에 기재된 BTBG 단백질 (효소)의 염기 서열이다.
도 5는 서열번호 1에 기재된 BTBG 단백질 (효소)의 아미노산 서열이다.
도 6은 BTBG 효소의 최적 pH와 최적 온도를 보여주는 그래프이다.
도 7의 A는 당과 당이 베타-O-결합으로 이루어진 것으로, 셀로바이오스 (cellobiose), 셀로트리오스 (cellotriose), 셀로테트라오스 (cellotetraose)에 본 발명의 BTBG 효소를 처리한 결과이고, 도 7의 B는 당과 아글리콘이 베타-O-결합으로 이루어진 이소플라본 배당체로서, 제니스틴 (genistin), 다이드진 (daidzin)에 본 발명의 BTBG 효소를 처리한 결과이다.
도 8은 기질인 글리시틴 (glycitin), 제니스틴 (genistin), 다이드진 (daidzin)에 본 발명의 BTBG 효소를 처리한 결과이다.
도 9는 기질인 글리시틴 (glycitin), 제니스틴 (genistin), 다이드진 (daidzin)에 상용효소인 노바롬 (Novarom)을 처리한 결과이다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예 및 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

[ 실시예 1: 유전자 조작]

박테로이데스 테타이오미크론(Bacteroides thetaiomicron) 균주에서 유전체 DNA (genomic DNA)를 추출하였고, C-말단에 His-tag이 붙게 프라이머(표 1)를 디자인하여 효소 발현 후 Ni-NTA 정제가 가능하도록 하였다.

프라이머	서열	비고
정방향	5- AAA ACC ATG GGC ATG AAA TGG ATA TTG GCA G -3	밑줄 친 서열은 NcoI
역방향	5- AAAA CTC GAG CAT AGA CAC CAT CTT GTA TTT GG -3	밑줄 친 서열은 XhoI

이렇게 만들어진 프라이머를 이용하여 PCR을 하였으며, PCR 조건은 다음과 같았다. 디네쳐레이션 스텝 (denaturation step)은 98℃에서 10초간 진행하였고, 어니얼링 스텝 (annealing step)은 55℃에서 30초, 이롱게이션 스텝 (elongation step)은 72℃, 2.9분간 진행하였으며 이것을 30회 반복하였다.

이렇게 하여 PCR 산물 ('btbg' 유전자로 명명함)을 수득하였는데, DNA 크기는 2853 bp이며, 이에 따른 PCR 결과는 도 1에서 확인할 수 있다.

한편, 증폭된 btbg 유전자와 벡터 P6xHTKNd를 NcoI과 XhoI의 제한효소 부위를 활용하여 라이게이션 (ligation)하였다. 이렇게 라이게이션된 벡터의 구조는 도 2와 같았다. 이후, btbg과 p6xHisTKNd 벡터를 라이게이션한 재조합 벡터를 E. coli (MC1061)에 트랜스포메이션하였다. 그리고 LB 배지에 접종하여 37℃에서 18시간 교반배양(200 rpm)하였다. 배양 후, 소니케이터를 이용하여 세포를 파쇄한 후 Ni-NTA 컬럼을 이용하여 정제하였고, SDS-PAGE를 통해 발현 및 정제를 확인하였다 (도 3). 발현된 단백질의 크기는 105 kDa이며, 이것은 염기 서열은 서열번호 2 (도 4)와 같았고, 아미노산 서열은 서열번호 1 (도 5)과 같았다. 발현된 단백질 (효소)은 BTBG라 명명하였다.

[ 실시예 2: BTBG 의 최적 pH 와 온도 분석]

발현된 BTBG 효소의 최적 pH와 최적 온도를 구하기 위해서 다음과 같이 실험하였다. 기질 0.5% β-pNPG (4-nitrophenyl β-D-glucopyranoside), 50 mM 소디움 아세테이트 버퍼 (sodium acetate buffer, pH 4.0-6.0), 50 mM 소디움 포스페이트 버퍼 (sodium phosphate buffer, pH 6.5-7.0), 50 mM Tris-HCl 버퍼 (pH 7.5-8.0)를 사용하여 효소의 역가를 측정하였다.

실험결과, 최적 pH는 6.0, 최적 온도는 50℃로 나타났다 (도 6).

[ 실시예 3: TLC 를 이용한 BTBG 효소처리 반응 산물의 분석]

0.35% 셀로바이오스 (cellobiose), 셀로트리오스 (cellotriose), 셀로테트라오스 (cellotetraose)를 기질로 하여, 40℃, pH 6.0에서 기질 1 mg 당 0.1 U의 BTBG 효소를 이용하여 20시간 동안 반응시켰고 'developing solvent n-BuOH : EtOH : Distilled water = 5 : 5 : 3 (v/v)'에서 분석하였다. TLC의 'developing solvent (v/v)'는 'chloroform : methanol : distilled water : acetic acid = 60 : 30 : 10 : 0.5 (v/v) '사용하였다.

실험 결과, 도 7의 A에서 보듯이, BTBG 효소는 당과 당이 β-O-결합으로 연결된 경우 효소작용을 하지 못한다는 것을 알 수 있었다. 그러나, 0.7% 이소플라본을 기질로 사용하여 위와 같이 반응시키면, 도 7의 B에서 보듯이, 이소플라본 배당체 (genistin, daidzin)의 β 결합에 효소가 특이적으로 작용하여 아글리콘 (genistein, daidzein)을 생성함을 확인할 수 있었다.

[ 실시예 4: 본 발명의 BTBG 효소와 상업효소 ' 노바롬 ( Novarom )'의 특성 비교]

기질인 글리시틴 (glycitin), 제니스틴 (genistin), 다이드진 (daidzin)의 최종 (final) 농도는 0.00875%(w/v)로 맞춰 사용하였으며, 상용화 효소인 노바롬 (Novarom) (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark)과 본 발명의 BTBG 효소는 기질 1 mg 당 0.1 U을 사용하여 실험하였다.

BTBG 효소로 반응시킨 글리시틴 (glycitin), 제니스틴 (genistin)은 20시간 후에 모두 글리시테인 (glycitein), 제니스테인 (genistein)으로 100% 전환되었으며, 다이드진 (daidzin)은 43시간 후 다이드제인 (daidzein)으로 전환되는 전환율 100%의 효율을 보였다 (도 8).

한편, 상용화된 효소인 노바롬 (Novarom)으로 반응시킨 다이드진 (daidzin), 제니스틴 (genistin)은 20시간 후 모두 다이드제인 (daidzein)과 제니스테인 (genistein)으로 100% 전환되었다. 하지만, 글리시틴 (glycitin)은 72시간 반응시킨 후에도 글리시테인 (glycitein)으로 26% 정도 밖에 전환되지 않음을 알 수 있었다 (도 9). 이는 글리시틴 (glycitin)이 일반적인 셀룰로오스 (cellulose) 계열의 기질이 아니며, 다른 이소플라본 (isoflavone)들과 달리 글리시틴 (glycitin)이 -OCH₃기를 지니고 있어 이것이 효소와 기질 간의 결합을 공간적으로 저해하여 발생한 것으로 사료된다.

이상의 결과를 종합할 때, 본 발명의 BTBG 효소는 이소플라본에 특이적으로 작용하는 효소라고 여겨진다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation, Hallym University <120> Method for production of isoflavone aglycone from isoflavone glucoside <130> AP-2013-0282 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 952 <212> PRT <213> Bacteroides thetaiotaomicron <400> 1 Met Gly Met Lys Trp Ile Leu Ala Val Gly Leu Leu Ser Cys Ser Val 1 5 10 15 Ala Met Ala Gln Gln Gln Ser Asp Ile Leu Ser Val Ser Ala Ser Ala 20 25 30 Asn Ala Glu Asn Ala Ala Leu Ala Phe Asp Arg Asn Val Lys Thr Met 35 40 45 Trp Thr Ile Pro Ser Gln Ala Leu Lys Ala Glu Gln Trp Leu Met Phe 50 55 60 Thr Ile Gln Gln Pro Gly Asp Val Cys Glu Leu Asp Leu Gln Met Gln 65 70 75 80 Gly Ile Asn Lys Asn Glu Leu Lys Glu Val Leu Asp Ile Phe Val Thr 85 90 95 Tyr Asp Pro Met Asn Leu Gly Thr Pro Val Asn Tyr Arg Ile Glu Gly 100 105 110 Ser Asp Lys Gln Met Lys Val Lys Phe Thr Pro Lys Tyr Gly Ala His 115 120 125 Val Lys Leu Asn Phe Lys Ser Gly Lys Leu Asp Lys Pro Phe Ser Leu 130 135 140 Lys Glu Ile Ser Val Leu Val Ala Glu Lys Val Leu Thr Asp Ser Gln 145 150 155 160 Gly Lys Val Thr Asp Arg Arg Tyr Met Asp Ala Ser Leu Pro Val Glu 165 170 175 Glu Arg Val Glu Ser Leu Leu Ala Val Met Thr Pro Glu Asp Lys Met 180 185 190 Glu Leu Ile Arg Glu Gly Trp Gly Ile Pro Gly Ile Pro His Leu Tyr 195 200 205 Val Pro Pro Ile Thr Lys Val Glu Ala Val His Gly Phe Ser Tyr Gly 210 215 220 Ser Gly Ala Thr Ile Phe Pro Gln Ala Leu Ala Met Gly Ala Thr Trp 225 230 235 240 Asn Arg Lys Leu Thr Glu Glu Val Ala Met Val Ile Gly Asp Glu Thr 245 250 255 Val Ala Ala Asn Thr Lys Gln Ala Trp Ser Pro Val Leu Asp Val Ala 260 265 270 Gln Asp Ala Arg Trp Gly Arg Cys Glu Glu Thr Phe Gly Glu Asp Pro 275 280 285 Val Leu Val Ser Gln Ile Gly Gly Ala Trp Ile Lys Gly Tyr Gln Ser 290 295 300 Arg Gly Leu Phe Thr Thr Pro Lys His Phe Gly Gly His Gly Ala Pro 305 310 315 320 Leu Gly Gly Arg Asp Ser His Asp Ile Gly Leu Ser Glu Arg Glu Met 325 330 335 Arg Glu Ile His Leu Val Pro Phe Arg His Ala Ile Arg Asn Tyr Asp 340 345 350 Cys Gln Ser Leu Met Met Ala Tyr Ser Asp Tyr Met Gly Val Pro Val 355 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Claims

이소플라본 배당체 (isoflavone glucoside)에 서열번호 1번에 기재되어 있는 아미노산 서열을 갖는 효소를 처리하는 것을 특징으로 하는 이소플라본 아글리콘 (isoflavone aglycone)의 수득방법.
제1항에 있어서,
상기 효소 처리는,
50℃의 온도로, pH 6.0에서 수행하는 것을 특징으로 하는 이소플라본 아글리콘 (isoflavone aglycone)의 수득방법.
제1항에 있어서,
상기 효소는,
서열번호 2에 기재된 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는 이소플라본 아글리콘 (isoflavone aglycone)의 수득방법.
제1항에 있어서,
상기 이소플라본 배당체는,
다이드진(daidzin), 제니스틴(genistin), 글리시틴(glycitin) 중 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 이소플라본 아글리콘 (isoflavone aglycone)의 수득방법.