KR20110110882A - 플라보노이드 당전이 유도체의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 바실러스 리체니포르미스 균주에서 유래된 신규한 UDP-글리코실트랜스퍼라제 C의 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는, 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 균주 유래의 당전이 효소 UDP-글리코실트랜스퍼라제 C 를 이용한 플라보노이드 당전이 유도체의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법에 의해 제조된 플라보노이드 당전이 유도체는 열, 산화에 안정적이고 수용성이 높아 의약품, 식품 및 화장품 산업에 유용하다.

Description

플라보노이드 당전이 유도체의 제조방법 {Method for Preparing Glycosylated Flavonoids}
본 발명은 바실러스 리체니포르미스 균주에서 유래된 신규한 UDP-글리코실트랜스퍼라제 C의 용도에 관한 것으로, 더욱 자세하게는, 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 균주 유래의 당전이 효소 UDP-글리코실트랜스퍼라제 C 를 이용한 플라보노이드 당전이 유도체의 제조방법에 관한 것이다.
당전이 효소는 당 공여체와 폴리펩타이드, 플라보노이드, 항생제와 같은 아글리콘 요소(aglycon core)로 sugar moiety를 전이하는 것으로 알려져 있다 (J Microbiol Biotechnol 2007). 이러한 당전이 효소는 염기서열, 글루코사이드 연결부위, target specificity, signature motif 등에 따라서 92 패밀리로 분류된다. 이 중에서 덱스트란수크라제(dextransucrase)나 UDP-글리코실트랜스퍼라제(UDP-glycosyltransferase)를 사용한 당전이에 관한 연구가 진행되어왔다 (FEMS Microbiol Lett , 258:263, 2006; J Microbiol Biotechnol , 17:539, 2007; 한국공개특허 제2007-0073724호).
플라보노이드(flavonoids)는 식품에 널리 분포하는 노란색 계통의 색소로, 페닐기 2개가 C3 사슬에 매개하여 결합한 C6-C3-C6형 탄소 골격구조로 되어 있으며, 이것이 여러 당류와 에테르 결합을 통해 글루코시드의 형태로 존재하는 경우가 많은 폐놀계 화합물이다. 플라보노이드는 항균, 항암, 항바이러스, 항알레르기 및 항염증 활성이 있고, 많은 질병의 원인이 되는 생체 내 산화작용을 억제한다는 것이 알려지면서 물질의 개발 및 활용에 관한 관심이 커지고 있다 (J Microbio Biotechnol , 19:387, 2009). 식물에서는 UV-protectants, antimicrobial agents로써 작용을 하는 것으로 알려져 있다 (FEMS Microbiol lett , 258:263, 2006). 또한, 플라보노이드의 항산화 효과는 의약품, 화장품이나 식품 산업에도 이용될 수 있다 (Appl Environ Microbiol , 65:4141, 1999).
플라보노이드계 화합물들은 다양한 질병의 예방이나 치료에 중요한 것으로 여겨지고 있으나 열에 대한 불안정성, 산화 조건에 대한 불안정성, 및 물에 대한 불용성 등의 문제점이 있다.
따라서, 의약품, 식품, 화장품 등의 산업에 있어서 아피제닌, 카테킨, 다이드제인, 제니스테인, 캠페롤, 나린제닌 등을 포함하는 일반적인 플라보노이드가 갖는 열에 대한 불안정성, 산화에 대한 불안정성, 낮은 수용성 등의 문제점을 개선하는 연구가 요구되고 있으며, 당전이 효소인 UDP-글리코실트랜스퍼라제 C를 사용하여 상기의 플라보노이드가 갖는 문제점의 개선이 시급한 실정이다.
한편, 뉴클레오디드 당(UDP-글루코오스)을 당 공여체로 하여 당전이에 이용하는 방법이 공지되어 있고 (Soo In Ryu et al ., Biochemical and Biophysical Research Communications ., 329;429-436, 2005; Robert P. Gibson et al ., Chemistry & Biology , 9;1337, 2002; Anne M. Mulichak et al ., Structure , 9;547, 2001), 당전이 효소를 이용한 당전이 화합물 유도체의 제조방법이 공지되어 있으나 (한국등록특허 제800,506호; 한국등록특허 제347,789호; 한국공개특허 제2008-0072118호; 한국등록특허 제716,797호; 한국공개특허 제2008-0077913호; 한국공개특허 제2007-0028499호; 한국등록특허 제228,885호; 한국등록특허 제782,086호; 한국등록특허 제317,021호; 한국공개특허 제2008-0049490호), 상기 선행기술은 기질의 전환율이 낮고, 당전이 효소가 불안정하며, 기질 특이성의 범위가 좁다는 단점이 있다.
이에, 본 발명자들은 기질 전환율이 높고, 기질 특이성이 넓은 안정한 당전이 효소를 개발하고자 예의 노력한 결과, 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 균주가 UDP-글리코실트랜스퍼라제 C를 발현한다는 것을 확인하고, 상기의 당전이 효소를 이용하여 플라보노이드와 UDP-글루코오스를 반응시키는 경우, 높은 전환율의 글리코실레이션 반응을 통하여 당전이 플라보노이드 유도체가 제조된다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 주된 목적은 기질 전환율이 높고, 기질 특이성이 넓은 안정한 당전이 효소를 이용한 당전이 플라보노이드 유도체의 제조방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 플라보노이드 화합물과 UDP-글루코오스를 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 UDP-글리코실트랜스퍼라제 C의 존재하에 반응시켜, 플라보노이드 당전이 유도체를 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 플라보노이드 당전이 유도체를 수득하는 단계를 포함하는 UDP-글리코실트랜스퍼라제 C를 이용한 플라보노이드 당전이 유도체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 의해 제조된 플라보노이드 당전이 유도체는 열, 산화에 안정적이고 수용성이 높아 의약품, 식품 및 화장품 산업에 유용하다.
도 1은 바실러스 리케니포르미스 유래의 UDP-글리코실트랜스퍼라제 C의 생화학적 특성을 나타낸 그래프이다.
도 2는 UDP-글리코실트랜스퍼라제 C에 의한 플라보노이드의 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 (a) 플라보노이드 화합물과 UDP-글루코오스를 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 UDP-글리코실트랜스퍼라제 C의 존재하에 반응시켜, 플라보노이드 당전이 유도체를 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 플라보노이드 당전이 유도체를 수득하는 단계를 포함하는 UDP-글리코실트랜스퍼라제 C를 이용한 플라보노이드 당전이 유도체의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서는 플라보노이드 당전이 유도체 생성에 이용되는 글리코실트랜스퍼라제를 수득하기 위하여, 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 아나베나(Anabaena) 등의 미생물로부터 유래된 글리코실트랜스퍼라제를 사용하였다. 플라보노이드 화합물과 UDP-글루코오스를 상기의 균주 유래의 글리코실트랜스퍼라제 존재하에 반응시켰더니, 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 유래의 글리코실트랜스퍼라제를 이용하여 생성되는 플라보노이드 당전이 유도체가 열 및 산화에 안정적이고 수용성이 높은 것을 확인하였다.
본 발명에서 UDP-글리코실트랜스퍼라제 C를 수득하기 위하여 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 균주 유래의 UDP-글리코실트랜스퍼라제 C의 유전자를 발현 벡터에 재조합하기 위해 DNA를 분리하고, 상기 염색체 DNA를 템플레이트로 PCR을 통해 UDP-글리코실트랜스퍼라제 C 유전자를 확보하였다.
본 발명에서 획득한 UDP-글리코실트랜스퍼라제 C는 35℃에서 최적 활성을 나타내며 최적 pH는 8이었고, 30℃이하에서 잔존활성이 높은 것으로 확인되었다.
본 발명에 있어서, 상기 플라보노이드는 아피제닌, 카테킨, 다이드제인, 제니스테인, 캠퍼롤, 나린제닌, 케르세틴으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 플라보노이드 당전이 유도체의 제조방법 (a) 단계의 반응은 CaCl2 또는 MgCl2을 추가로 첨가하여 수행하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 UDP-글리코실트랜스퍼라제 C는 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 유래인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서는 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 균주 유래의 UDP-글리코실트랜스퍼라제 C를 사용하여 효소적인 방법으로 플라보노이드의 유도체를 제조하였으며, 본 발명에서 사용되는 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 균주 DSM 13, ATCC KCTC 1918 또는 이들 돌연변이주를 포함한다. 플라보노이드는 아피제닌, 카테킨, 다이드제인, 제니스테인, 캠퍼롤, 나린제닌, 케르세틴 등으로 당 전이 반응에 의해 당전이 화합물 유도체를 합성하였다.
본 발명에서 사용된 "아피제닌(Apigenin)"은 각종 과일과 채소류에 함유되어 있는 플라보노이드 성분의 일종으로 염증과 산화 스트레스 억제 및 탄수화물 대사 증진에 효과가 있으며, "카테킨(Catechin)"은 플로보노이드 그룹의 flavan-3-ols에 속하고 녹차의 떫은맛 성분으로 발암억제, 동맥경화, 혈압상승 억제, 혈전예방, 항바이러스, 항비만, 항당뇨, 항균, 해독작용, 소염작용, 충치예방, 장내 세균총 정상화 등 다양한 효과가 있다.
본 발명에서 사용된 "다이드제인(Daidgein)"은 플라보노이드의 아이소플라본의 일종으로 혈중 콜레스테롤 수치를 낮춰 각종 만성 질환이 예방과 치료에 효과적이 것으로 알려져 있으며, "제니스테인(Genistein)"은 대두로부터 분리된 아이소플라본 화합물로 대두 및 콩과 식품, 두부와 같은 콩 가공품, 식물 단백질 식품에 포함되어 있으며, "캠퍼롤(Kaempferol)"은 지방과 DNA의 산화 위험을 막고 강한 항산화 작용을 하며 암세포 형성을 억제하는 화학적 예방 작용제이며 사과, 양파, 부추, 감귤류, 포도, 레드와인, 고추나물 등에 포함되어 있는 화합물이다.
본 발명에서 사용된 "나린제닌(Naringenin)"은 플라본 무배당체로 2개의 벤젠고리가 있고, 암세포에서 손상된 DNA를 복구하는데 도움을 주며 발암물질인 아플라톡신 B1의 활성을 저해하는 효과가 있으며, "케르세틴(Quercetin)"은 플라보노이드계로 식품이 변질하는 것을 방지하기 위하여 산화방지제로 사용되는 식품 첨가물이다.
본 발명의 일 양태에서, 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 균주 유래의 UDP-글리코실트랜스퍼라제 C를 이용하여 아피제닌을 글리코실레이션 시키는 경우, 99.3%의 전환율로 아피제닌 글루코사이드 유도체가 적어도 2가지 이상 합성되었고, 당전이 반응에서 (+)-카테킨과의 반응에서는 19.5%의 전환율로 (+)-카테킨 글루코사이드 유도체가 적어도 한 가지 이상 합성되었다.
본 발명의 다른 양태에서, 다이드제인이 글리코실레이션 되는 경우, 94.3%의 전환율로 다이드제인 글루코사이드 유도체가 적어도 3가지 이상 합성되었고, 제니스테인이 글리코실레이션 된 경우, 97.8%의 전환율로 제니스테인 글루코사이드 유도체가 적어도 5가지 이상 합성되었으며, 나린제닌이 글리코실레이션 되었을 때는 97.8%의 전환율로 나린제닌 글루코사이드 유도체가 적어도 2가지 이상 합성되었다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 캠퍼롤이 글리코실레이션 되는 경우, 100%의 전환율로 캠퍼롤 글루코사이드 유도체가 적어도 4가지 이상 합성되었으며, 케르세틴의 경우 100%의 전환율로 케르세틴 글루코사이드 유도체가 적어도 5가지 이상 합성되었다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 글리코실트랜스퍼라아제 유전자의 확보
글리코실트랜스퍼라제의 유전자를 확보하기 위하여, 글리코실트랜스퍼라제 family 1(WWW.CAZY.org)에 해당하는 1114개의 박테리아에 속해 있는 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 아나베나(Anabaena)등을 무작위로 선별하고, 선별된 균주로부터 genomic DNA를 분리하고 accession number로부터 확보한 염기서열로부터 PCR을 실시하여 UDP-글리코실트랜스퍼라제 C (accession number, AAU40842) 유전자를 확보하였다.
실시예 2: 바실러스 리체니포르미스 ( Bacillus licheniformis ) 균주 유래의 당전이 효소 UDP - 글리코실트랜스퍼라제 C 유전자의 클로닝
바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 균주 유래의 UDP-글리코실트랜스퍼라제 C의 유전자를 발현벡터에 재조합하기 위하여 염색체를 분리하고, 상기 염색체 DNA를 주형으로 하여 PCR을 통해 글리코실트랜스퍼라제 C 유전자를 확보하였다. PCR을 위한 프라이머는 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)의 유전자 (GenBank accession Number AAU40482) 염기서열로부터 제작되었다.
PCR을 수행하기 위한 반응액은 20㎕에 100ng 염색체 DNA, 0.2μM 각각의 프라이머, 200nM dNTP, 2U Taq polymerase(Solgent), 1배 Taq DNA 중합효소 완충액 (MgCl2)이 되도록 조성하여 PCR 증폭에 사용하였다. PCR 반응은 94℃에서 3분간 변성(denaturaion)을 수행한 후, 94℃에서 30초 변성, 48℃에서 30초 어닐링(annealing), 72℃에서 30초 연장(extension)을 25회 반복하였다. 마지막으로 72℃에서 10분 연장을 수행하고, 4℃에서 유지시켰다. 확보된 증폭 단편은 pGEM-T easy 벡터에 클로닝하였고, 클로닝후 발현벡터인 pET302/NT-his의 XhoI과 BamHI 부위에 서브클로닝하여 재조합 벡터를 구축하였다.
서열번호 2: 5'-gaactcgagatgggacataaacatatcgcg-3'
XhoI
서열번호 3: 5'-ccggatccttattttactcctgcgggtg-3'
BamHI
실시예 3. 재조합 UDP - 글리코실트랜스퍼라제 C의 발현 및 정제
바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 균주 유래의 UDP-글리코실트랜스퍼라제 C의 과잉 생산을 위해서 재조합된 플라스미드를 대장균 BL21(DE3)에 도입하여 형질전환체를 구축하였고, 구축한 형질전환체를 100㎍/㎖ 앰피실린이 첨가된 LB 액체배지에서 37℃에서 16시간 동안 200rpm으로 진탕 배양하였다. 그 후, 새로운 LB 액체배지 50㎖에 진탕 배양한 형질전환체를 1% 농도로 넣은 후 진탕배양하여 37℃에서 배양하였고, 또한, 600㎚에서 흡광도 값이 0.5가 되었을 때 0.5mM 가 되도록 IPTG를 첨가하여 20℃에서 12시간 동안 호기적인 조건으로 배양하였다. 배양체를 원심분리하여 침전된 균체를 회수하고, 회수된 균체에 1mM PMSF와 protease inhibitor cocktail, 10mM imidazole이 첨가된 100mM Tris-Cl (pH 8.0)를 3㎖로 현탁한 후, 초음파로 파쇄한 후, 원심분리하여 상등액을 회수하고 다음 효소를 정제하였다. 상기 상등액을 Ni-NTA 아가로스 담체를 통과시켜 크로마토그래피를 수행하였다. 정제시 250mM imidazole, 300mM NaCl, 20mM Tris-Cl (pH 8.0)을 포함하는 용출액을 사용하여 효소활성 분획을 위하여 정제 여부를 SDS-PAGE로 확인하였다. 정제된 효소는 Amicon Ultra-15 (Millipore, 10K NMWL device)로 농축한 후, 20% 글리세롤을 포함한 100mM Tris-Cl (pH 8.0) 용액에 넣어 4℃에서 12시간 동안 투석을 수행하였다.
정제된 UDP-글리코실트랜스퍼라제 C의 활성을 확인하기 위한 표준반응액은 100mM Tris-Cl (pH 8.8), 1mM UDP-글루코오스, 0.2mM 4-Methylumbelliferone, 1mM MgCl2, 적절히 희석된 효소 용액 5㎕를 혼합하여, 총 100㎕가 되도록 하여 30℃에서 10분 반응시켰다. 그 후 100℃에서 5분 동안 열을 가하여 비활성이 되게 하고, 반응 산물인 4-methylumbelliferylglucopyranoside는 ZORBAX Eclipse XDB-C18 (4.6x150 5μm, Agilent) 컬럼이 장착된 HPLC를 사용하여 분석하였다. 이동상(mobile phase)으로는 0.01% (v/v) TFA (A 버퍼)와 아세토니트릴 (B 버퍼)을 사용하였다. 유속은 1㎖/min으로 0~5분은 B 버퍼 0%, 5~10분 B 버퍼 30%, 10~15분 B 버퍼 60%, 15~20분 B 버퍼 100%, 20~25분 B 버퍼 0%의 조건에서 분석하였으며 320㎚에서 흡광도를 측정하였다. 효소의 유닛(U)은 단위시간 당(1 min) 당 공여체의 1μ㏖당 수용체에 전이하는데 필요한 효소의 양으로 정의된다.
바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 균주의 UDP-글리코실트랜스퍼라제 C의 정제단계의 활성 및 회수율
Total
vol.(㎖)		 Total
protein(㎎)		 Total
activity(U)		 Specific activity(U/㎎) Purification
(Fold)		 Yeild
(%)
crude extract 3 8 1801.3 225.2 1 100
Ni-NTA affinity
chromatography		 0.7 2.3 867.5 375.3 1.67 48.2
실시예 4. 정제된 UDP - 글리코실트랜스퍼라제 C 생화학적 특성
바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 균주 유래의 UDP-글리코실트랜스퍼라제 C의 최적 반응 조건을 알아보기 위해 반응온도, 열안정성 및 pH의 영향을 조사하였다.
최적 반응온도를 알아보기 위해 정제된 효소를 사용하여 20~65℃에서 5℃ 간격으로 상대적인 활성을 측정하였으며, 35℃에서 최적 반응온도인 것을 알 수 있었다 (도 1의 가). 또한, 정제된 효소의 최적 pH를 조사하기 위해 100mM 구연산 버퍼 (pH 3.0-6.0), 100mM 인산염 버퍼 (pH 6.0-8.0), Tris-Cl 버퍼 (pH 8.0-10.0), 글리신/NaOH 버퍼 (pH 10.0-11.0)의 완충용액을 사용하였다. 각 버퍼에서 상대적인 활성을 조사한 결과 pH 8.0에서 최대 활성을 나타내었으며, 중성 및 알칼리 pH에서 비교적 안정된 것으로 확인되었다 (도 1의 나). 또한 열에 대한 안정성을 조사하기 위해서 25~65℃ 범위에서 5℃ 간격으로 잔존 활성을 측정하였다. 각 지정된 온도에서 3시간 방치 후에 잔존 활성을 확인한 결과 30℃ 이하에서 잔존 활성이 높게 남아있는 것을 확인하였다 (도 1의 다).
실시예 5. 정제된 UDP - 글리코실트랜스퍼라제 C의 키네틱 파라미터( kinetic parameters )
정제된 재조합 UDP-글리코실트랜스퍼라제 C의 키네틱 파라미터를 결정하기 위해 기질을 당 공여체로는 UDP-글루코오스, 당 수용체로는 4-methylumbelliferone을 사용하였고, Lineweaver-Burk plot 방법을 사용하여 정하였다. UDP-글리코실트랜스퍼라제 C의 Michaelis-menten constant(Km) 값은 0.8mM로 확인되었다.
실시예 6. 정제된 UDP - 글리코실트랜스퍼라제 C를 이용한 플라보노이드( flavonoids)의 글리코실레이션
정제된 UDP-글리코실트랜스퍼라제 C의 당전이 반응을 수행하기 위해 표준 반응액이 총 1㎖이 되도록 준비하고, 반응액 조성은 다음과 같이 100mM Tris-Cl (pH 8.8), donor substrate (1mM UDP-glucose), acceptor substrate (150μM 아피제닌, 1mM (+)-카테킨, 150μM 다이드제인, 150μM 제니스테인, 150μM 캠퍼롤, 150μM 나린제닌, 150μM 케르세틴), 1mM CaCl2 (또는 MgCl2), 적절히 희석된 효소 용액을 혼합하여, 30℃에서 3시간 반응시키고 HPLC 분석하였다. ZORBAX Eclipse XDB-C18 (4.6x150 5㎛, Agilent) 컬럼을 사용하고, 이동상(mobile phase)으로는 0.01% (v/v) TFA (A 버퍼)와 아세토니트릴 (B 버퍼)을 사용하였다. 유속은 1㎖/min으로 0~5분은 B 버퍼 0%, 5~10분 B 버퍼 30%, 10~15분 B 버퍼 50%, 15~20분 B 버퍼 70%, 20~25분 B 버퍼 100%, 25~30분 B 버퍼 0%의 농도의 조건이었고, post run time은 15분으로 HPLC 분석을 하였다.
바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 균주 유래의 UDP-글리코실트랜스퍼라제 C와 수용체로써 아피제닌이 글리코실레이션 되는 경우, 340㎚에서 흡광도를 측정한 결과, 99.3%의 전환율로 아피제닌 글루코사이드 유도체가 적어도 2가지 이상 합성되었고 (도 2의 가), 당전이 반응에서 (+)-카테킨과의 반응에서는 흡광도 280㎚에서 측정한 결과, 19.5%의 전환율로 (+)-카테킨 글루코사이드 유도체가 적어도 한 가지 이상 합성되었다 (도 2의 나).
또한, 흡광도 306㎚에서 측정한 결과, 다이드제인이 글리코실레이션 되는 경우, 94.3%의 전환율로 다이드제인 글루코사이드 유도체가 적어도 3가지 이상 합성되었고 (도 2의 다), 제니스테인이 글리코실레이션 된 경우, 97.8%의 전환율로 제니스테인 글루코사이드 유도체가 적어도 5가지 이상 합성되었으며 (도 2의 라), 나린제닌이 글리코실레이션되었을 때는 97.8%의 전환율로 나린제닌 글루코사이드 유도체가 적어도 2가지 이상 합성되었다 (도 2의 바).
370㎚에서 측정한 결과, 캠퍼롤이 글리코실레이션 되는 경우, 100%의 전환율로 캠퍼롤 글루코사이드 유도체가 적어도 4가지 이상 합성되었으며 (도 2의 마), 케르세틴의 경우 100%의 전환율로 케르세틴 글루코사이드 유도체가 적어도 5가지 이상 합성되었다 (도 2의 사).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> GeneChem Inc. <120> Method for Preparing Glycosylated Flavonids <130> P09-204 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 396 <212> PRT <213> Bacillus licheniformis <400> 1 Met Gly His Lys His Ile Ala Ile Phe Asn Ile Pro Ala His Gly His 1 5 10 15 Ile Asn Pro Thr Leu Ala Leu Thr Ala Ser Leu Val Lys Arg Gly Tyr 20 25 30 Arg Val Thr Tyr Pro Val Thr Asp Glu Phe Val Lys Ala Val Glu Glu 35 40 45 Thr Gly Ala Glu Pro Leu Asn Tyr Arg Ser Thr Leu Asn Ile Asp Pro 50 55 60 Gln Gln Ile Arg Glu Leu Met Lys Asn Lys Lys Asp Met Ser Gln Ala 65 70 75 80 Pro Leu Met Phe Ile Lys Glu Met Glu Glu Val Leu Pro Gln Leu Glu 85 90 95 Ala Leu Tyr Glu Asn Asp Lys Pro Asp Leu Ile Leu Phe Asp Phe Met 100 105 110 Ala Met Ala Gly Lys Leu Leu Ala Glu Lys Phe Gly Ile Glu Ala Val 115 120 125 Arg Leu Cys Ser Thr Tyr Ala Gln Asn Glu His Phe Thr Phe Arg Ser 130 135 140 Ile Ser Glu Glu Phe Lys Ile Glu Leu Thr Pro Glu Gln Glu Asp Ala 145 150 155 160 Leu Lys Asn Ser Asn Leu Pro Ser Phe Asn Phe Glu Asp Met Phe Glu 165 170 175 Pro Ala Lys Leu Asn Ile Val Phe Met Pro Arg Ala Phe Gln Pro Tyr 180 185 190 Gly Glu Thr Phe Asp Glu Arg Phe Ser Phe Val Gly Pro Ser Leu Ala 195 200 205 Lys Arg Lys Phe Gln Glu Lys Glu Thr Pro Ile Ile Ser Asp Ser Gly 210 215 220 Arg Pro Val Met Leu Ile Ser Leu Gly Thr Ala Phe Asn Ala Trp Pro 225 230 235 240 Glu Phe Tyr His Met Cys Ile Glu Ala Phe Arg Asp Thr Lys Trp Gln 245 250 255 Val Ile Met Ala Val Gly Thr Thr Ile Asp Pro Glu Ser Phe Asp Asp 260 265 270 Ile Pro Glu Asn Phe Ser Ile His Gln Arg Val Pro Gln Leu Glu Ile 275 280 285 Leu Lys Lys Ala Glu Leu Phe Ile Thr His Gly Gly Met Asn Ser Thr 290 295 300 Met Glu Gly Leu Asn Ala Gly Val Pro Leu Val Ala Val Pro Gln Met 305 310 315 320 Pro Glu Gln Glu Ile Thr Ala Arg Arg Val Glu Glu Leu Gly Leu Gly 325 330 335 Lys His Leu Gln Pro Glu Asp Thr Thr Ala Ala Ser Leu Arg Glu Ala 340 345 350 Val Ser Gln Thr Asp Gly Asp Pro His Val Leu Lys Arg Ile Gln Asp 355 360 365 Met Gln Lys His Ile Lys Gln Ala Gly Gly Ala Glu Lys Ala Ala Asp 370 375 380 Glu Ile Glu Ala Phe Leu Ala Pro Ala Gly Val Lys 385 390 395 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis <400> 2 gaactcgaga tgggacataa acatatcgcg 30 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis <400> 3 ccggatcctt attttactcc tgcgggtg 28

Claims (4)

  1. 다음의 단계를 포함하는 UDP-글리코실트랜스퍼라제 C를 이용한 플라보노이드 당전이 유도체의 제조방법:
    (a) 플라보노이드 화합물과 UDP-글루코오스를 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 UDP-글리코실트랜스퍼라제 C의 존재하에 반응시켜, 플라보노이드 당전이 유도체를 생성시키는 단계; 및
    (b) 상기 생성된 플라보노이드 당전이 유도체를 수득하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 플라보노이드는 아피제닌, 카테킨, 다이드제인, 제니스테인, 캠퍼롤, 나린제닌, 케르세틴으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, (a) 단계의 반응은 CaCl2 또는 MgCl2을 추가로 첨가하여 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 UDP-글리코실트랜스퍼라제 C는 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
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